CN102618598B - 一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法，包括如下步骤：(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，得种子液；(2)将种子液接种于液体发酵培养基中，液体发酵培养，然后加入扩张蛋白溶液，继续培养，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；(3)从发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖。本发明将扩张蛋白应用于蛹虫草多糖的液体发酵生产，胞内多糖产量和胞外多糖产量分别比现有技术提高了1.5倍和6.9倍以上，具有很好的工业化应用前景。

Description

一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法
技术领域
本发明涉及一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法，属于生物发酵工程技术领域。
背景技术
蛹虫草为子囊菌亚门Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麦角菌科Clavicipitaceae、虫草属(Cordyceps)的模式种。学名为Cordyceps militaris，又名北冬虫夏草、北蛹虫草、虫草等，由子座(即草部分)与菌核(即虫的尸体部分)两部分组成的复合体，世界性分布但天然资源数量很少。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚、腰膝酸痛、病后虚弱、久咳痰血、盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。大量的现代药理研究表明蛹虫草不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值。其中虫草多糖是虫草体内含量最丰富、最重要的生物活性物质之一，因具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射及提高机体免疫功能、促进肾上腺的作用、增加人体胰岛素的分泌、降低糖尿病人的血糖水平等广泛的药理作用而倍受关注。虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，能够活化巨噬细胞刺激抗体产生，促进淋巴细胞转化，提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能力，临床已用于治疗恶性肿瘤。此外，虫草多糖还能改善呼吸系统，抗心律失常、抗心肌缺血、扩张外周血管、降压、降血脂、抑制血小板聚集等。目前世界范围内对蛹虫草及虫草多糖的需求增长迅速，而野生的蛹虫草中虫草多糖的含量不高，再加上人们的疯狂采摘，价格日益昂贵，蛹虫草多糖的广泛应用受到药源资源的严重制约，而且通过化学合成的途径工艺复杂且产量极低。采用液体发酵的方法生产蛹虫草多糖具有生产周期短、劳动力节省、受外部环境影响小等优点，而且研究发现从蛹虫草子实体、菌丝体及发酵液中得到的虫草多糖在生化结构上基本是相同的，因此被认为是一种有效的替代从天然蛹虫草提取多糖的生产方法。但目前蛹虫草多糖的发酵水平不高，产量偏低限制了其工业化生产的发展。与真菌多糖领域的大量研究相比，国内外对蛹虫草多糖的研究报道屈指可数，而且多集中在最近几年，主要集中在发酵及产物提取分离等工艺层面上。
如专利文献CN101067005(申请号200710052357)，公开了一种用大米生产虫草多糖方法，其包括配料、接种、培养、获取虫草多糖及辐照灭菌后包装步骤。所述配料中，各原料的配比是：按重量计，大米45.0～49.0％，玉米和豆饼混合粉0.9～2％，营养液49.0～54.1％；营养液配方为土豆180～220g，白糖18～22g，蛋白胨13～18g，磷酸二氢钾1.5～2.2g，硫酸镁0.8～1.2g，水900～1100g。目前，尚未有从蛹虫草多糖生物代谢的角度分析的研究，对蛹虫草多糖发酵水平的提高有限，发酵周期长，成本高，整体的生产效率较低，还不能远满足现代工业化发酵生产的需要。
扩张蛋白是近年在植物细胞壁中发现的一类新型蛋白，最先是从黄瓜下胚轴伸长区分离纯化得到，现已证明在燕麦胚芽鞘细胞壁、栝楼根尖细胞壁、番茄、烟草、拟南芥、水稻、棉纤维、玉米、大豆等细胞壁中也有扩张蛋白的存在，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中，与促进其细胞生理生长，影响营养生长、形态发生、授粉受精、果实软化等生理生长过程有关。利用重组细胞壁实验研究证实了扩张蛋白与以前发现的细胞壁蛋白不同，具有诱导热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，被推测能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，在植物生长过程中可能是生理调控和细胞壁松弛延伸的主要生理调节物质。但是，关于扩张蛋白的作用机制目前仍多是猜测和推断，国内外均未有明确的研究定论和机制阐明，因此对扩张蛋白的实际应用方面的报道甚少。将扩张蛋白应用于蛹虫草的液体发酵生产，用以提高虫草多糖产量等次生代谢产物产量的研究国内外尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法。
本发明技术方案如下：
一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法，包括如下步骤：
(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10～15％的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度20～25℃，摇床培养2～4天，得种子液；
(2)将步骤(1)制得种子液按5～10％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20～25℃的条件下，液体发酵培养1～6天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.01～0.85mg/mL，然后继续培养2～9天，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；
(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PD液体发酵培养基，每升组分如下：
马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化培养条件为：摇床转速100～160r/min，温度20～25℃，暗培养活化3～5天。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的种子发酵培养基，每升组分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1g MgSO4、0.03g CaCl2、0.1g KH2PO4、0.1gK2HPO4，2～5颗直径3～6mm的玻璃珠。经种子发酵培养基培养后，菌球数量可提高60％以上、菌球直径缩小40％以上，菌丝松散均匀。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1g MgSO4、0.03g CaCl2、0.1gKH2PO4、0.1g K2HPO4。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.15～0.7mg/mL；进一步优选0.25～0.5mg/ml。最优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.5mg/mL。
所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备，如采用McQueen-Mason等在McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove D J.Two endogenous proteins that induce cellwall ext ension in plants.Plant Cell，1992，4：1425～1433中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液：
将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15wt％HgCl2消毒4～6min，流水冲洗5～7h，然后，25～28℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，置-20℃预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，过滤，按0.3～0.5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置45～50h，4℃条件下25000g离心5～10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为：25mmol/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1.5mmol/L Na2S2O5，2mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，0.1wt％ Triton X-100，pH 7.0；所述提取液组分为：15mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L EDTA，1.5mmol/L Na2S2O5，0.5mol/L NaCl，pH 6.0；所述酸性缓冲液配制是：将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，蒸馏水定容至1L。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的分离是在15000r/min条件下离心分离5～10min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中提取蛹虫草胞外多糖的方法，步骤如下：
取步骤(2)制得的发酵液，加入4倍体积的95％乙醇，混匀后4℃静置5h，12000rpm离心10min，取沉淀，用6mL浓度为1M NaOH溶液60℃溶解1h，制得蛹虫草胞外多糖。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中提取蛹虫草胞内多糖的方法，步骤如下：
将步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体65℃烘干，研成粉末，按每克蛹虫草菌丝体粉末加6mL浓度为1M的NaOH溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min离心5min，取上清液，制得蛹虫草胞内多糖。
本发明与已有技术相比有如下优点：
1、本发明将扩张蛋白应用于蛹虫草多糖的液体发酵生产，胞内多糖产量可达1.73g/L，胞外多糖产量可达7.83g/L，分别比现有技术提高了1.5倍和6.9倍以上；本发明大大提高了整体蛹虫草的虫草多糖有效成分的生产量，具有很好的工业化应用前景；
2、本发明采用液体好氧发酵方法，一般为8～10天，相对于现有技术，产量高，周期短，无需静置培养及诱导合成产物等过程，生产效率较高，所生产的蛹虫草多糖可直接用于免疫力调节、抗肿瘤、降血糖等药物的制备；
3、本发明所述扩张蛋白可从大多数双子叶和单子叶植物中提取，来源广泛，成本较低，制备方法也相对简单，可规模提取生产，对蛹虫草虫草多糖类物质的发酵生产具有很好的促进和提升效果；
4、本发明所采用的蛹虫草液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，而且全发酵过程可控，不受外部环境条件限制，适合工业化生产及推广应用。
5、本发明对液体发酵培养基和种子发酵培养基的配方进行了优化，能够大幅度提高蛹虫草多糖的产量。
附图说明
图1是不同浓度的扩张蛋白溶液对蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖产量的影响曲线；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但本发明所保护范围不限于此。
原料及培养基
实施例中所述的蛹虫草(Cordyceps militaris)发酵菌种，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC No.5.699和CGMCC No.3.4655。
实施例中所述的扩张蛋白溶液的制备步骤如下：
将大豆(Glycine max L.Merr.CV.M40；购自济南伟丽种业有限公司)或黄瓜(Cucumissativus L.CV.Jinnian No.6；购自济南伟丽种业有限公司)种子经0.1wt％ HgCl2消毒5min，流水冲洗6h，然后，栽入湿蛭石中，27℃暗培养5d。剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，即生长区约100g，置-20℃冰箱预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，高速匀浆后，用70μm尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置2h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取48h，过滤，滤液按0.4g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置48h，4℃条件下25000g离心10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃条件下用截留分子量为3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(购自北京博润莱特科技有限公司)透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液，置4℃下保存。其他未描述步骤可参照McQueen-Mason等在McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove D J.Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants.Plant Cell，1992，4：1425～1433中的描述进行。
上述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1.5mmol/LNa2S2O5，2mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，0.1wt％ Triton X-100，pH 7.0；
上述提取液组分为：15mmol/LHEPES，1.0mmol/LEDTA，1.5mmol/L Na2S2O5，0.5mol/LNaCl，pH 6.0；
所述酸性缓冲液每升按如下方法配制：
将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。
扩张蛋白溶液浓度的测定方法采用考马斯亮蓝法检测，具体可参照(《精编蛋白质科学实验指南》，ISBN：703018086，出版日期1900-1-1)中记载的考马斯亮蓝法进行操作，以牛血清白蛋白作标准曲线，经检测上述扩张蛋白溶液中扩张蛋白浓度为0.27g/mL。
实施例中所述的PD液体发酵培养基，每升组分如下：
马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
实施例中所述的种子发酵培养基，每升组分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1g MgSO4、0.03g CaCl2、0.1g KH2PO4、0.1gK2HPO4，2～5颗直径3～6mm的玻璃珠。
实施例中所述的液体发酵培养基，每升组分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1g MgSO4、0.03g CaCl2、0.1gKH2PO4、0.1g/L K2HPO4。
实施例1：
一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法，包括如下步骤：
(1)将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种，菌种编号为CGMCC No.5.699，接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，在温度25℃、摇床转速150r/min的条件下暗培养96h，然后按体积百分数15％的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度25℃，摇床培养3天，得种子液；
(2)将步骤(1)制得种子液按10％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25℃的条件下，液体发酵培养1天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.15mg/mL，然后继续培养9天，15000r/min条件下离心分离10min，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；
(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖；
上述提取蛹虫草胞外多糖的步骤如下：
取步骤(2)制得的50mL发酵液，加入200mL的95％乙醇，混匀后4℃静置5h，12000rpm离心10min，取沉淀，用6mL浓度为1M NaOH溶液，60℃溶解1h，制得蛹虫草胞外多糖。
上述提取蛹虫草胞内多糖的步骤如下：
将步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体65℃烘干，研成粉末，称取0.1g蛹虫草菌丝体粉末，加6mL浓度为1M的NaOH溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min离心5min，取上清液，制得蛹虫草胞内多糖。
虫草多糖的测定
采用本领域常规的浓硫酸-苯酚法测定(参照科学出版社出版的《生物化学试验方法和技术》，ISBN：9787030106858，2009-07-01)：
(1)标准曲线的建立
以葡萄糖为基准的标准曲线制作：称取105℃干燥2h并冷却至室温的葡萄糖粉末，配成0.01wt％的标准溶液。精确吸取葡萄糖标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL置于11支25mL具塞试管中，分别加水至2.0mL、5％苯酚溶液1.0mL、浓硫酸5.0mL，放置10min，摇匀，置于20℃～30℃水浴中保温15min。在490nm下测定反应溶液的吸光度值，以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标，吸光度值A490为纵坐标，绘制得到标准曲线。
(2)蛹虫草胞外多糖产量的检测
取制得的蛹虫草胞外多糖5μL于试管中，用蒸馏水定容至1.0mL，摇匀。空白对照为1.0mL水。分别加入5％苯酚试液1.0mL，再迅速滴加浓硫酸各5.0mL，摇匀，冷至室温，于490nm处测OD值。根据标准曲线计算多糖含量获得多糖含量为241.26μg。
即每升发酵液胞外多糖产量为：241.26μg×(6mL/5μL)×20＝5.79g
(3)蛹虫草胞内多糖产量的检测
取制得的蛹虫草胞内多糖5μL于试管中，用蒸馏水定容至1.0mL，摇匀。空白对照为1.0mL水。分别加入5％苯酚试液1.0mL，再迅速滴加浓硫酸各5.0mL，摇匀，冷至室温，于490nm处测OD值。根据标准曲线计算多糖含量获得多糖含量为19.16μg。
每升发酵液对应菌丝体的胞内多糖产量为：19.16μg×(6mL/5μL)×10×5.87(每升发酵液对应的菌丝干重)＝1.35g。
结果如图1所示。因此，虫草多糖的总产量为每升发酵液5.79+1.35＝7.14g。
实施例2：
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25℃的条件下，液体发酵培养3天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.5mg/mL，然后继续培养7天，
经检测计算，每毫升发酵液中含有蛹虫草胞外多糖7.83mg，即每升发酵液中含有7.83g胞外多糖；每克菌丝体(干重)中含有蛹虫草胞内多糖260.15mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有1.73g蛹虫草胞内多糖。结果如图1所示。
因此，虫草多糖的总产量为每升发酵液7.83+1.73＝9.56g。
实施例3：
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25℃的条件下，液体发酵培养5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.85mg/mL，然后继续培养5天。
经检测计算，每毫升发酵液中含有蛹虫草胞外多糖4.91mg，即每升发酵液中含有4.91g胞外多糖；每克菌丝体(干重)中含有蛹虫草胞内多糖230.58mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有0.92g蛹虫草胞内多糖。结果如图1所示。
因此，虫草多糖的总产量为每升发酵液4.91+0.92＝5.83g。
实施例4
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于所采用发酵菌种为蛹虫草(Cordycepsmilitaris)菌种保藏号为CGMCC No.3.4655，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
所述步骤(2)中在温度25℃的条件下，液体发酵培养3天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.5mg/mL，然后继续培养7天。
经检测计算，每毫升发酵液中含有蛹虫草胞外多糖7.11mg，即每升发酵液中含有7.11g胞外多糖；每克菌丝体(干重)中含有蛹虫草胞内多糖243.99mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有1.58g蛹虫草胞内多糖。
因此，虫草多糖的总产量为每升发酵液7.11+1.58＝8.69g。
对比例1
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，所述步骤(2)中用不含扩张蛋白的酸性缓冲液替代实施例加入的扩张蛋白溶液，温度25℃的条件下，液体发酵培养10天。
经检测计算，每毫升发酵液中含有蛹虫草胞外多糖2.3mg，即每升发酵液中含有2.3g胞外多糖；每克菌丝体(干重)中含有蛹虫草胞内多糖193.21mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有0.74g蛹虫草胞内多糖。结果如图1所示。
因此，虫草多糖的总产量为每升发酵液2.3+0.74＝3.04g。
对比例2
按照专利文献CN101067005(申请号200710052357)中实施例中记载的方法发酵生产发酵液和蛹虫草菌丝体，其它虫草多糖的测定步骤同实施例1。
经检测，每毫升发酵液中含有蛹虫草胞外多糖0.99mg，即每升发酵液中含有0.99g胞外多糖；每克菌丝体(干重)中含有蛹虫草胞内多糖183.91mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有0.69g蛹虫草胞内多糖。
因此，虫草多糖的总产量为每升发酵液0.99+0.69＝1.68g。

Claims (2)

1.一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10～15%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度20～25 ℃，摇床培养2～4天，得种子液；
（2）将步骤（1）制得种子液按5~10 %体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20～25 ℃的条件下，液体发酵培养1～6天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.15～0.85 mg/mL，然后继续培养2～9天，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；
（3）从步骤（2）制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖；
所述步骤（1）中的种子发酵培养基，每升组分如下：
3 g 葡萄糖、1.5 g 酵母粉上清液、0.1 g MgSO4、0.03 g CaCl2、0.1 g KH2PO4、0.1 g K2HPO4，2～5颗直径3～6 mm的玻璃珠；
所述步骤（2）中的液体发酵培养基，每升组分如下：
3 g 乳糖、2 g 糖蜜、2 g 豆粕粉、1.5 g 蛋白胨，0.1 g MgSO4、0.03 g CaCl2、0.1 g KH2PO4、0.1 g K2HPO4；
所述扩张蛋白溶液按如下方法制备：
将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15 wt% HgCl2消毒4～6 min，流水冲洗5～7 h，然后，25～28 ℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4 cm，置-20 ℃预冷0.5 h，加预冷至4 ℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70 μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3 h，得静置液；向静置液中加入提取液，4 ℃下提取44～50 h，过滤，按0.3～0.5 g/mL的添加量向滤液中缓慢添加（NH4）2SO4，添加（NH4）2SO4过程中不断搅拌，防止（NH4）2SO4局部过饱和，然后静置45～50 h， 4 ℃条件下25000 g离心5～10 min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4 ℃下分子量3000 Da的透析袋透析，透析液经20000 g离心10 min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液；
上述匀浆缓冲液组分为：25 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.5 mmol/L Na2S2O5，2 mmol/ L EDTA，0.1 wt% Triton X-100，pH 7.0；
上述提取液组分为：15 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸，1.5 mmol/L Na2S2O5，0.5 mol/L NaCl，pH 6.0；
上述酸性缓冲液配制是：将2.05 g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1 L。
2.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤（1）中的活化培养条件为：摇床转速100～160 r/min，温度20～25 ℃，暗培养活化3～5天。
3. 如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，步骤（2）中所述的分离是在15000 r/min条件下离心分离5～10 min。
4. 如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞外多糖的方法，步骤如下：
取步骤（2）制得的发酵液，加入4倍体积的95 %乙醇，混匀后4 ℃静置5 h，12000 rpm离心10 min，取沉淀，用6 mL 浓度为1 M NaOH 溶液60 ℃溶解1 h，制得蛹虫草胞外多糖。
5. 如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞内多糖的方法，步骤如下：
将步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体65 ℃烘干，研成粉末，按每克蛹虫草菌丝体粉末加6 mL浓度为1 M 的NaOH溶液，60 ℃浸提2 h，然后12000 r/min离心5 min，取上清液，制得蛹虫草胞内多糖。
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