CN101892282B - 一种利用稀土元素提高灵芝三萜产量的液体发酵方法 - Google Patents

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本发明涉及了一种利用稀土元素提高灵芝三萜产量的液体发酵方法。该方法是利用灵芝细胞的液体培养，通过在培养基中添加稀土元素镨Pr3+、钕Nd3+或镧La3+，提高灵芝三萜的产量。所产灵芝三萜可用于抗肿瘤、保肝护肝、抗病毒等药物的开发。

Description

一种利用稀土元素提高灵芝三萜产量的液体发酵方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，具体涉及一种利用稀土元素提高灵芝三萜的液体发酵方法。 
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝菌属真菌。在中国古代被盛传为仙草，古代医学家发现灵芝通过扶正固本使人体处于平衡状态。灵芝三萜是灵芝最主要的生理活性物质之一，现代药理学研究表明灵芝具有抗肿瘤、抗衰老、防止动脉硬化等作用，以及护肝保肝、抗病毒、抗辐射等功能。在灵芝药用价值被广泛揭示的同时，灵芝三萜的产量成为抑制其应用的限制因素，因为在自然界中野生灵芝十分稀少，远不能满足人们的需要。采用灵芝液体发酵的方法生产灵芝三萜因为具有生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。 
但灵芝三萜的发酵水平不高，产量偏低限制了其工业化生产的发展。目前，国内外学者对灵芝三萜的发酵研究主要集中在培养基组成、溶氧、pH值及产物提取分离等工艺层面上，对灵芝三萜发酵水平提高有限，还不能满足现代工业化发酵生产的需要。 
CN101353689A(CN200810143120.1)公开了一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法，使用灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌种，菌株保藏号为CCGMC5.616，通过如下步骤进行：1、将灵芝菌种接种含有碳源、氮源、矿物元素成分的培养基，在温度为26-30℃、转速为130-180r/min条件下回转式深层发酵1～5天；2、补加棕榈酸1.5-3.0g/L后，在温度为25-30℃、转速为100-180r/min条件下回转式深层发酵3～6天结束；3、从发酵液中提取灵芝三萜，产量为396.2mg/L。该发明仅提取了发酵液中三萜(即胞外三萜)的产量，发酵菌丝体三萜(即胞内三萜)没有涉及，使产量部分损失。稀土元素是化学元素周期表中镧系元素及两个相关元素钪和钇的总称，我国稀土资源丰富，占世界贮量的80％。目前，稀土元素的应用越来越广泛，不仅应用于各工业部门，其在农业、医药、微生物等生物学领域的应用研究也越来越活跃。近年来有关利用稀土元素提高微生物发酵产物的研究也有报道，参见王怡平等.稀土元素对红酵母的生长及类胡萝卜素合成的影响.微生物学通报，1999，26(2)：117-119；以及李增利.稀土元素镨、钕、铒对红菇多糖深层发酵的影响.食品科学，2007，28(12)：312-316。目前，稀土元素在灵芝液体发酵上的应用研究尚未见报道。 
发明内容
本发明旨在提供稀土元素在灵芝三萜液体发酵中的应用，同时提供稀土元素在灵芝三萜发酵中的使用方法，从而提供一种工艺简单、成本低廉、效果显著，利用稀土元素提高 灵芝三萜产量的液体发酵方法，本方法可用于灵芝三萜的工业化生产。 
本发明所述的灵芝三萜产量包括灵芝胞外三萜和胞内三萜产量。 
本发明的技术方案如下： 
一种利用稀土元素提高灵芝三萜产量的液体发酵方法，包括以下步骤： 
(1)将灵芝菌种接种到PD液体发酵培养基中进行发酵培养，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天，得到灵芝种子液。 
所述的灵芝菌种为泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)，菌种编号为CGMCC No.5.644； 
所述的PD液体发酵培养基组成为马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL； 
(2)将步骤(1)制得的灵芝种子液按4-6％体积比接种量接入到含有浓度为0.001-0.15mmol/L稀土元素的PD液体培养基中进行发酵培养，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天，得发酵液和灵芝菌丝体混合物，分离出发酵液及灵芝菌丝体备用。 
所述的稀土元素为镨Pr3+、钕Nd3+或镧La3+； 
所述的PD液体发酵培养基组成为马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL。 
(3)从步骤(2)所得的发酵液中提取灵芝胞外三萜，从灵芝菌丝体提取灵芝胞内三萜，采用现有技术即可。 
灵芝胞外三萜和胞内三萜产量分别可达到610.1mg/L和398.5mg/L。添加镨Pr3+、钕Nd3+或镧La3+相对应地灵芝三萜总产量(胞外三萜和胞内三萜合并计算)可达到：700mg/L、830mg/L或840mg/L。本发明所得灵芝三萜可用于抗肿瘤、保肝护肝、抗病毒等药物的制备。 
根据上述方法，本发明进一步做以下优选： 
步骤(2)所述的稀土元素优选为镧La3+或钕Nd3+，最优选的稀土元素为镧La3+。 
步骤(2)所述的稀土元素在PD液体培养基中的浓度优选为镧La3+0.001-0.01mmol/L、钕Nd3+0.001-0.01mmol/L或镨Pr3+0.01-0.1mmol/L。 
步骤(2)所述的含有浓度为0.001-0.15mmol/L稀土元素的PD液体培养基是按以下方法制备的： 
称取纯度为99％的硝酸镨、硝酸钕或硝酸镧，用蒸馏水配制成浓度1mol/L的溶液；加入到所述PD液体发酵培养基中，制得含有浓度为0.001-0.15mmol/L稀土元素的PD液体培养基。 
步骤(2)所述的发酵液及灵芝菌丝体的分离是在15000r/min下离心分离。 
步骤(3)所述的灵芝三萜的提取，包括从发酵液中提取胞外三萜和从灵芝菌丝体中提取胞内三萜，步骤如下： 
胞外三萜的提取：取分离除去菌丝体的发酵液，加入4倍体积的95％乙醇，沉淀除去 多糖和其它大分子物质，再将上清液浓缩蒸馏去除乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，再浓缩蒸馏去除乙酸乙酯。 
胞内三萜的提取：取干重为0.5～1.0g的灵芝菌丝体研成粉末，加30～50mL甲醇超声提取2～5h，过滤，取上清，浓缩蒸馏去除甲醇。 
灵芝三萜含量的测定 
采用本领域常规的紫外比色法测定灵芝三萜(灵芝酸)含量，测定方法简述如下： 
a.将50～100mL从去除菌丝体的发酵液中提取出的胞外三萜，加1～2mL甲醇溶解，作为待测溶液。 
b.将从干重0.5～1.0g菌丝体中提取出的胞内三萜，加甲醇定容至2～5mL，作为待测溶液。 
加待测样品溶液0.1mL于试管中，再加香草醛0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴中保温20min，取出后置冷水中15min，再加入冰醋酸5mL，于550nm处测定吸光值，根据标准曲线计算三萜类物质含量。 
本发明同已有技术相比有如下积极效果： 
1、本发明将稀土元素镨Pr3+、钕Nd3+或镧La3+用于灵芝三萜的液体发酵，灵芝胞外三萜和胞内三萜产量分别可达到610.1mg/L和398.5mg/L，极大地提高了灵芝三萜的产量，具有很好的工业化应用前景。 
2、本发明所述稀土元素Pr3+、钕Nd3+或镧La3+来源广泛，均具有很好的促进效果，实验方法简便，重复性好。 
3、本发明所采用的灵芝液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，更为重要的是整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业化生产。 
附图说明
图1稀土元素对灵芝胞外三萜产量的影响曲线，根据实施例1-3及对比例1-2。 
图2稀土元素对灵芝胞内三萜产量的影响曲线，根据实施例4-6及对比例3-4。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，所用原料及培养基如下： 
实施例中所述的发酵用灵芝菌种为泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)，菌种编号为CGMCC No.5.644，购自中国普通微生物菌种保藏中心。纯度为99％的硝酸镨、硝酸钕和硝酸镧，购自天津市光复精细化工研究所。 
实施例中所用的含有稀土元素的PD液体培养基的配制： 
称取纯度为99％的硝酸镨、硝酸钕或硝酸镧，用蒸馏水配制成浓度1mol/L的溶液；加入到所述PD液体发酵培养基中，分别制得：i含有浓度为0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1mmol/L稀土元素镨Pr3+的PD液体培养基，ii含有浓度为0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1 mmol/L稀土元素钕Nd3+的PD液体培养基，iii含有浓度为0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1mmol/L稀土元素La3+的PD液体培养基，备用。 
实施例1-6中所用的PD液体发酵培养基组成均为马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。 
实施例1：一种利用稀土元素提高灵芝三萜产量液体发酵方法，步骤为： 
1.将灵芝菌种CGMCC No.5.644接种到PD液体发酵培养基中进行发酵培养，培养条件为摇床转速160r/min，温度25～30℃，时间6天，得到灵芝种子液。 
2.将上述获得的灵芝种子液按5％(V/V)的接种量分别接入到含有浓度为0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1mmol/L稀土元素镨Pr3+的PD液体培养基中进行发酵培养，培养条件为摇床转速160r/min，温度25～30℃，时间6天，得发酵液和灵芝菌丝体混合物，15000r/min离心分离，得发酵液和灵芝菌丝体。分别提取灵芝胞外三萜和胞内三萜。 
胞外三萜的提取：取50mL除去菌体的发酵液，加入用4倍体积的95％乙醇，沉淀除去多糖和其它大分子物质后，上清液浓缩去除乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，浓缩去除乙酸乙酯。得胞外三萜。加1mL甲醇溶解即为待测溶液。 
胞内三萜的提取：取干重为1.0g的灵芝菌丝体研成粉末，加50mL甲醇超声提取5h，过滤，取上清，浓缩蒸馏去除甲醇。得胞内三萜。 
三萜的测定：加待测样品溶液0.1mL于试管中，再加香草醛0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴中保温20min，取出后置冷水中15min，再加入冰醋酸5mL，于550nm处测定吸光值，根据标准曲线计算三萜类物质含量。结果如图1所示。 
实施例2：如实施例1所述，所不同的是步骤2中稀土元素镨Pr3+替代为钕Nd3+。结果如图1所示。 
实施例3：如实施例1所述，所不同的是步骤2中稀土元素镨Pr3+替代为镧La3+。结果如图1所示。 
对比例1：如实施例1所述，所不同的是步骤2中稀土元素镨Pr3+替代为铈Ce3+。结果如图1所示。其中含有稀土元素铈Ce3+的PD液体培养基，是用纯度为99％的硝酸铈按实施例的相同方法配制的。 
对比例2：如实施例1所述，所不同的是步骤2中稀土元素镨Pr3+替代为铒Er3+。结果如图1所示。其中含有稀土元素铒Er3+的PD液体培养基，是用纯度为99％的硝酸铒按实施例的相同方法配制的。 
根据以上实施例1-3及对比例1-2可知：稀土元素镧La3+、钕Nd3+和镨Pr3+对灵芝胞外三萜的产量具有显著的促进作用，胞外三萜的产量分别使可达到610.08mg/L、489.22mg/L和340.15mg/L；而作为对比的稀土元素铈Ce3+和铒Er3+对灵芝胞外三萜产量不但没有促进作用，甚至还体现一定的抑制作用。 
实施例4：一种利用稀土元素提高灵芝三萜产量液体发酵方法，步骤为： 
1.将灵芝菌种CGMCC No.5.644接种到PD液体发酵培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)中进行发酵培养，培养条件为摇床转速150r/min，温度25～30℃，时间7天，得到灵芝种子液。 
2.将上述获得的灵芝种子液按6％(V/V)的接种量分别接入到含有浓度为0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1mmol/L稀土元素镨Pr3+的PD液体培养基中进行发酵培养，培养条件为摇床转速150r/min，温度25～30℃，时间7天，过滤得发酵液和灵芝菌丝体，15000r/min离心分离，得发酵液和灵芝菌丝体。分别提取灵芝胞外三萜和胞内三萜。 
灵芝胞外三萜的提取如实施例1。 
胞内三萜的提取：取去除发酵液的1.0g灵芝菌丝体(干重)研成粉末，加50mL甲醇超声提取4h，过滤，取上清，浓缩蒸馏去除甲醇。得胞内三萜。 
取胞内三萜加甲醇定容至5mL作为待测液。 
胞内三萜的测定：加待测样品溶液0.1mL于试管中，再加香草醛0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴中保温20min，取出后置冷水中15min，再加入冰醋酸5mL，于550nm处测定吸光值，根据标准曲线计算三萜类物质含量。结果如图2所示。 
实施例5、6： 
将以上实施例4的步骤2中稀土元素镨Pr3+分别替换成钕Nd3+、镧La3+，重复实施例4的方法步骤，所得结果如图2所示。 
作为对比例3、4，将以上实施例4的步骤2中稀土元素镨Pr3+分别替换成铈Ce3+、铒Er3+重复实施例4的方法步骤，所得结果如图2所示。 
根据以上实施例4-6及对比例3-4可知：稀土元素镨Pr3+、镧La3+和钕Nd3+对灵芝胞内三萜的产量具有明显促进作用，可分别是产量达到398.49mg/L、347.59mg/L和341.05mg/L；而作为对比例的稀土元素铈Ce3+对灵芝胞内三萜的产量也具有一定的促进作用，可使产量达到298.10mg/L，但稀土元素铒Er3+却抑制灵芝胞内三萜的生产。 

Claims (4)

1.一种利用稀土元素提高灵芝三萜产量的液体发酵方法，包括以下步骤：
（1）将灵芝菌种接种到PD液体发酵培养基中进行发酵培养，培养条件为摇床转速100~180r/min，温度25~30℃，时间5~8天，得到灵芝种子液；
所述的灵芝菌种为泰山赤灵芝（Ganoderma lucidum），菌种编号为CGMCC No.5.644；
所述的PD液体发酵培养基组成为马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL；
（2）将步骤（1）制得的灵芝种子液按4-6%体积比接种量接入到含有浓度为0.001-0.01mmol/L稀土元素的PD液体培养基中进行发酵培养，培养条件为摇床转速100~180r/min，温度25~30℃，时间5~8天，得发酵液和灵芝菌丝体混合物，分离出发酵液及灵芝菌丝体备用；
所述的稀土元素为镨Pr3+、钕Nd3+或镧La3+；
所述的PD液体发酵培养基组成为马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL；
（3)从步骤（2）所得的发酵液中提取灵芝胞外三萜，从灵芝菌丝体提取灵芝胞内三萜。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的稀土元素为镧或钕。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的稀土元素为镧。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的稀土元素在PD液体培养基中的浓度为0.001mmol/L。
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