CN104878065A - 一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法，包括：将灵芝接种到种子培养基中培养后，再接入发酵培养基中进行发酵培养，从发酵液中提取灵芝三萜；所述发酵培养基以麦芽汁为碳源、以酵母浸出粉为氮源，所述麦芽汁的重量百分数为2～5％，所述酵母浸出粉的重量百分数为0.8～2.8％。本发明采用以麦芽汁为碳源、酵母浸出粉为氮源的培养基作为发酵培养基培养灵芝菌体，可实现灵芝菌丝产量的最优最大化，同时获得尽可能多的活性物质，显著提高了发酵液中灵芝三萜和多糖的产量，有利于灵芝三萜的工业化生产。

Description

一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法

技术领域

本发明涉及真菌发酵领域，尤其涉及一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法。

背景技术

灵芝Ganoderma lucidum[(Leyss.ex.Fr.)Karst]是一种珍贵的药用真菌，作为药物在我国已有2000多年的历史。《本草纲目》将其列为上品药物，指出赤芝“苦，平，无毒，主治胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘”，紫芝“无毒，好颜色，治虚劳，治痔”。2000年《中华人民共和国药典》将灵芝补录，并将灵芝指定为赤芝Ganoderma lucidum(Curtis：Fr.)P.Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的子实体，明确指出灵芝具有“补气安神，止咳平喘”的功效，自此灵芝作为国家法定的药物进入我国的医药殿堂。

现代研究表明，灵芝的药理作用主要有：抗肿瘤、抗放疗与抗化疗、抗心肌缺血、抗缺氧、清除自由基、延缓衰老、保肝、镇静、免疫双向调节，调节血脂、降血糖、抑制组织胺释放、抑制血管紧张素转化酶、抑制胆固醇合成、抑制血小板聚集、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性等。

灵芝中所含的活性物质主要有：多糖类、三萜类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽类、微量元素、脂肪酸等，其中，灵芝多糖和三萜是灵芝主要的生物活性成分，同时也逐渐成为评价灵芝质量的重要指标。

与灵芝子实体和孢子粉相比，灵芝菌丝中所含的活性物质活性更高，并且液体发酵具有发酵时间短、污染可能性小等优点，更有利于菌丝的工业化生产。灵芝三萜是作为灵芝主要的生物活性成分，如何通过调整发酵培养基及培养条件使三萜产量达到最高，一直以来都是灵芝液体发酵的主要研究方向。而如何利用成本低廉、来源广泛的培养基质获得高含量灵芝三萜则是实现其工业化生产的重要前提。

授权公告号为CN101353689B发明专利文献公开了一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法，该方法使用灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr)Karst.的菌种，菌株保藏号为CCGMC 5.616，并通过如下步骤进行：

1)将灵芝菌种接种含有碳源、氮源、矿物元素成分的培养基，在温度为26～30℃、转速为130～180r/min条件下回转式深层发酵1～5天；培养基组成是以玉米粉、葡萄糖为碳源，以蛋白胨、豆饼粉为氮源，以KH₂PO₄和MgSO₄为矿物元素；培养基中玉米粉含量为5～10g/L、葡萄糖含量为25～40g/L；培养基中蛋白胨含量为3～5g/L、豆饼粉含量为2～4g/L；培养基中KH₂PO₄含量为1.5g/L、MgSO₄含量为0.75g/L)补加棕榈酸1.5-3.0g/L后，在温度为25～30℃、转速为100～180r/min条件下回转式深层发酵3～6天结束；3)从发酵液中提取灵芝三萜。

申请公布号为CN104017852A的发明专利申请文献公开了一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，该方法包括：取在斜面培养基中活化后的斜面菌丝体灵芝菌株，挑取菌丝块接入种子培养基中，接种后于20～30℃、50～200r/min下培养7～14天，得到种子培养液；将培养好的种子培养液，按照5～15％的接种量接入发酵培养基中，接种后于20～30℃、50～200r/min下培养3～10天，在发酵培养过程中添加1vol％～5vol％的油酸，最终获得灵芝菌丝体，进而提取菌丝体中的灵芝三萜。

发明内容

本发明提供了一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法，该方法能够显著提高发酵液中灵芝三萜以及多糖的产量。

一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法，包括：将灵芝接种到种子培养基中培养后，再接入发酵培养基中进行发酵培养，从发酵液中提取灵芝三萜；所述发酵培养基以麦芽汁为碳源、以酵母浸出粉为氮源，所述麦芽汁的重量百分数为2～5％，所述酵母浸出粉的重量百分数为0.8～2.8％。

碳源作为灵芝生长过程中主要的营养物质，不同的碳源对灵芝菌种次生代谢有不同的影响。

麦芽作为啤酒生产中主要的原料，其所含的主要成分包括：碳水化合物(70％-85％)、蛋白质(10.5％-11.5％)、无机物(2％-4％)、脂肪(1.5％-2％)、其他物质(1.0％-2.0％)；其中，碳水化合物主要包括：淀粉(50％-63％)、单糖(1.8％-2％)、纤维素(5％-6％)、半纤维素(β-葡聚糖80％-90％、戊聚糖10％-20％)。将麦芽按照EBC(European Brewery Cenvention)法糖化处理之后，干物质中75％-80％的成分溶解于糖化液中，并水解得到很多碳水化合物，包括麦芽糖、糊精、葡萄糖等，同时也得到可溶性的含氮物质、氨基氮、树胶及部分无机物。另一方面，麦芽成本低、来源广泛、容易获取，更有利于微生物培养及工业化生产。

本发明中，糖化后的麦芽汁使用糖度仪测定其含糖量，所述的麦芽汁的含量均以麦芽汁中糖分的含量来计。

作为优选，以重量百分比计，所述发酵培养基包括：3.5～4.5％的麦芽汁和1.5～2.3％的酵母浸出粉。

发酵培养基的pH会影响细胞膜的通透性、细胞形态及营养物质的吸收利用情况，作为优选，所述发酵培养基的pH值为5～6。

进一步优选，以重量百分比计，所述发酵培养基包括：麦芽汁3.5～4.5％，酵母浸出粉0.8～2.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH5.40。

更优选，以重量百分比计，所述发酵培养基为麦芽汁4.10％，酵母浸出粉1.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH5.40。

所述发酵培养的条件为：28℃下培养6～8天。

以重量百分比计，所述种子培养基包括马铃薯1％，葡萄糖2％，蛋白胨1.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH 5.5。

种子培养基的培养过程中，培养的条件为：28℃下培养7～9天。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用以麦芽汁为碳源、酵母浸出粉为氮源的培养基作为发酵培养基培养灵芝菌体，可实现灵芝菌丝产量的最优最大化，同时获得尽可能多的活性物质，显著提高了发酵液中灵芝三萜和多糖的产量，利于灵芝三萜的工业化生产。

附图说明

图1为不同碳源对灵芝液体发酵产生物量及胞内三萜(Intracellular Triterpenoids，IT)产量的影响。

图2为不同麦芽汁浓度对灵芝液体发酵产生物量及IT产量的影响。

图3为不同N源对灵芝液体发酵产生物量及IT产量的影响。

图4为不同酵母浸出粉浓度对灵芝液体发酵产生物量及IT产量的影响。

图5为不同发酵培养基pH对灵芝液体发酵产生物量及IT产量的影响。

图6为麦芽汁与酵母浸出粉交互作用对菌丝生物量的影响(A：等值线图；B：曲面图)。

图7为麦芽汁与酵母浸出粉交互作用对IT产量的影响(A：等值线图；B：曲面图)。

具体实施方式

1、培养基与溶液的配制

斜面培养基：马铃薯1％，葡萄糖2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，琼脂2％，121℃湿热灭菌20min，VB₁过滤除菌。

种子液培养基：马铃薯1％，葡萄糖2％，蛋白胨1.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH 5.5，121℃湿热灭菌20min，VB₁过滤除菌。

液体发酵培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH 5.5，121℃湿热灭菌20min，VB₁过滤除菌(该培养基为优化前的基础培养基)。

麦芽汁制备：取啤酒制备所用小麦芽，按照European Brewery Cenvention(EBC)方法糖化麦芽，于72℃加热10min以灭酶活，最后于3000rpm离心收集上清液，获得麦芽汁，利用手持糖度折光仪测定麦芽汁含糖量，后续实验中培养基中麦芽汁的含量均以含糖量(％)计。

2、灵芝菌株液体发酵培养方法

各菌株经斜面试管培养后，取4-5块1cm²菌丝块接种到种子培养液(250ml三角瓶，装液量100ml)，于28℃，180rpm培养8d后得灵芝液体种子液。然后按10％(v/v)接种量将种子液接种到发酵培养基(250ml三角瓶，装液量100ml)，于28℃，180rpm培养7d。

3、菌丝生物量(Mycelia Biomass)的测定

将菌株发酵液于2500×g离心25min，收集菌丝沉淀，并用蒸馏水洗涤、离心，重复3次，于60℃干燥至恒重，计算各菌株的生物量(以菌丝体干重g/100ml发酵液计)。

4、灵芝菌株液体发酵过程中三萜产量的测定

(1)胞内三萜(Intracellular Triterpenoids IT)的测定：

采用超声波提取方法：灵芝菌丝经离心、收集、烘干至恒重后，取适量菌丝按1g/50ml加入95％(v/v)乙醇并用细胞破碎仪破碎，于75℃，400W下提取1h，并重复一次，合并上清液，定容后待测。其IT含量(mg/g)采用香草醛-高氯酸方法测定。

IT产量(mg/100ml)＝IT含量(mg/g)×菌丝生物量(g/100ml)    (1)

香草醛-高氯酸测定方法：取待测样品溶液或样品稀释液0.1ml于试管中，60℃加热挥干溶剂，再加5％(m/v)香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.5ml，混匀后于60℃水浴中保温20min，取出后置于冷水中15min，最后加入冰醋酸5ml，于550nm下测定吸光值。

(2)胞外三萜(Extracellular Triterpenoids ET)的测定：

将各菌株发酵液2500×g离心20min，收集上清液并定容至100ml(记为A溶液)，取一定体积A溶液(V₁)用3倍体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液并减压浓缩蒸干，用甲醇复溶并定容至10ml，记为溶液B，其ET含量(mg/ml)采用香草醛-高氯酸方法测定。

总ET含量(mg/100ml)＝B溶液中ET含量(mg/ml)×100ml/V₁    (2)

5、灵芝菌株液体发酵过程中多糖产量的测定

胞内多糖(Intracellular Polysaccharides IPS)测定：

采用超声波提取方法：灵芝菌丝经离心、收集、烘干至恒重后，取适量菌丝按1g/20ml加入蒸馏水并用细胞破碎仪破碎，于65℃，800W下提取1h，并重复一次，合并提取液，用4倍体积的95％(v/v)乙醇于4℃下醇析24h，然后3000r/min离心20min收集沉淀，并用95％(v/v)乙醇清洗2次，再将沉淀悬浮于1M NaOH溶液中，于60℃下提取1h，离心收集上清，定容至100ml，即为胞内粗多糖。IPS含量(mg/ml)采用苯酚-硫酸法测定。

IPS产量(mg/100ml)＝IPS含量(mg/g)×菌丝生物量(g/100ml)    (3)

苯酚-硫酸测定方法：取样品溶液或样品稀释液1ml置于25ml试管中，用去离子水补到2ml，空白为2ml去离子水，各加苯酚溶液(50g/L)1ml，混匀后迅速加硫酸5ml，混匀后于沸水浴中煮沸15min，冷却至室温，于490nm下测定吸光值。

胞外多糖(Extracellular Polysaccharides EPS)测定：

将各菌株发酵液2500×g离心20min后收集上清液，50℃减压浓缩至发酵液体积的1/2，用4倍浓缩液体积的95％(v/v)乙醇于4℃下醇析24h，然后2500×g离心20min收集沉淀，并用95％(v/v)乙醇清洗2次，沉淀悬浮于1M NaOH溶液中，于60℃下提取1h，离心收集上清，定容至100ml，即为胞外粗多糖，总EPS含量(mg/100ml)采用苯酚-硫酸法测定。

6、灵芝液体发酵培养基的优化

(1)C源筛选及C源浓度的影响

作为灵芝生长过程中主要的营养物质，不同的C源对灵芝菌种次生代谢有不同的影响；常规的选择是以葡萄糖作为灵芝菌丝生长的C源物质。选取5种不同的C源(葡萄糖(C1)，玉米粉(C2)，麦芽汁(C3)，蔗糖(C4)，可溶性淀粉(C5))加入到液体发酵培养基中，且浓度均为2％。将灵芝发酵种子液按10％的接种量接种到发酵培养基中，于28℃，180rpm发酵6d，以菌丝生物量、IT产量作为检测指标，筛选适宜灵芝液体发酵的C源(图1)。

由图1可知，当C源为葡萄糖时，灵芝液体发酵所得生物量最高，可达到1.3833±0.04g/100ml，IT为37.9926±2.22g/100ml；而当麦芽汁作为C源时，IT产量最高，可达到49.6268±2.59mg/100ml，其生物量为1.2159±0.02g/100ml。

麦芽作为啤酒生产中主要的原料，其所含的主要成分包括：碳水化合物(70％-85％)、蛋白质(10.5％-11.5％)、无机物(2％-4％)、脂肪(1.5％-2％)、其他物质(1.0％-2.0％)；其中，碳水化合物主要包括：淀粉(50％-63％)、单糖(1.8％-2％)、纤维素(5％-6％)、半纤维素(β-葡聚糖80％-90％、戊聚糖10％-20％)。将麦芽按照EBC法糖化处理之后，干物质中75％-80％的成分溶解于糖化液中，并水解得到很多碳水化合物，包括麦芽糖、糊精、葡萄糖等，同时也得到可溶性的含氮物质、氨基氮、树胶及部分无机物。另一方面，麦芽成本低、来源广泛、容易获取，更有利于微生物培养及工业化生产。因此，麦芽汁是更适宜灵芝液体发酵的C源，此外，将麦芽糖化汁作为灵芝液体发酵C源以求获得高三萜产量至今未见报道。

为了确定灵芝液体发酵适宜的麦芽汁浓度，选取5种不同浓度(以麦芽汁含糖量计)(1％，2％，3％，4％，5％)，以菌丝生物量、IT产量作为检测指标，筛选适宜灵芝液体发酵的麦芽汁浓度(图2)。由图2可得，随着麦芽汁浓度的增加，菌丝生物量及IT产量均有提高，当麦芽汁浓度为4％时，菌丝生物量和IT产量达到最高，分别为1.4563±0.02g/100ml、61.5205±1.34mg/100ml，但当麦芽汁浓度为5％时，菌丝生物量和IT产量分别降至1.3875±0.01g/100ml、55.8006±1.28mg/100ml，主要是由于过高麦芽汁浓度会引起过高的细胞渗透压，不利于菌丝生长，因此，选取4％麦芽汁作为C源浓度。

(2)N源筛选及N源浓度的影响

选取5种不同的N源(豆粕汁(N1)，麸皮汁(N2)，蛋白胨(N3)，牛肉浸膏(N4)，酵母浸出粉(N5))加入到液体发酵培养基中，且浓度均为1.8％(均以含N量计)。将灵芝发酵种子液按10％的接种量接种到发酵培养基中，于28℃，180rpm发酵6d，以菌丝生物量、IT产量作为检测指标，筛选适宜灵芝液体发酵的N源(图3)。

由图3可知，当N源是豆粕汁时，灵芝菌丝生物量最高，可达到1.7154±0.02g/100ml，其IT产量为32.4671±2.68mg/100ml。而当酵母浸出粉为N源时，IT产量可达到最高，为60.3402±0.87mg/100ml，其生物量为1.3536±0.01g/100ml。由于IT为灵芝菌丝中主要的活性物质，其产量的高低直接影响灵芝菌丝的质量，因此，选取酵母浸出粉为灵芝液体发酵的N源。

为了确定灵芝液体发酵适宜的酵母浸出粉浓度，选取5种不同浓度(0.8％，1.3％，1.8％，2.3％，2.8％)，以菌丝生物量、IT产量作为检测指标，筛选适宜灵芝液体发酵的酵母浸出粉浓度(图4)。由图4可知，当酵母浸出物为1.8％时，IT产量达到最高；当酵母浸出物浓度为2.3％时，菌丝生物量达到最大，为1.4154±0.01g/100ml，其IT产量为55.7099±1.50mg/100ml；而当浓度为2.8％时，生物量及IT产量分别降至1.2613±0.01g/100ml，51.5334±3.41mg/100ml。因此，选取1.8％作为灵芝液体发酵的酵母浸出物浓度。

(3)pH对灵芝液体发酵的影响

发酵培养基的pH会影响细胞膜的通透性、细胞形态及营养物质的吸收利用情况，灵芝菌丝更适宜在酸性条件下生长。

将液体发酵培养基的pH调至3.5-7.5，于28℃，180rpm发酵6d，以菌丝生物量、IT产量作为检测指标，筛选灵芝液体发酵适宜的pH值(图5)。

由图5可知，当发酵培养基pH在4.5-6.5范围内时，菌丝生物量和IT产量相对稳定，当pH为5.5时，各指标均达到最高，而当pH在这个范围外时，各指标均显著降低。结果显示，灵芝菌丝更适宜在酸性环境下生长，选取5.5为灵芝液体发酵的pH。

(4)RSM优化灵芝液体发酵培养基

采用central composite design(CCD)优化灵芝液体发酵培养基，各变量的最低、最高水平分别为：麦芽汁，3.5％、4.5％；酵母浸出粉，1.5％、2.1％，pH，5、6(表1)，CCD实验设计及结果见表2。

表1 CCD实验因素水平表

表2 CCD实验设计及结果

由表2可知，对于菌丝生物量，Prob＞F为0.0034，而lack of fit(0.076)不显著；对于IT产量，Prob＞F小于0.001，lack of fit(0.0619)不显著；均表明模型极显著，实验设计能够很好的反映实验优化。菌丝生物量(Y₁)、IT产量(Y₂)的多项式回归方程如下：

Y₁＝1.85-0.011A+0.0093B-0.017C+0.012AB-0.041AC+0.017BC-0.059A²-0.045B²-0.067C²    (4)

Y₂＝92.46+3.5A+5.92B-3.96C+1.64AB+0.2AC-1.49BC-4.69A²-8.67B²-8.79C²    (5)

固定其中一个变量，研究其他2个变量的交互作用对各响应值的影响，麦芽汁与酵母浸出粉交互作用对菌丝生物量及IT产量影响的等高线图(a)和曲面图(b)分别见图6、7所示。由图6、7可知，二者交互作用对各响应值的影响并不显著，随着麦芽汁和酵母浸出粉浓度的增加，菌丝生物量和IT产量均会随之增加，但是过高的浓度会抑制菌丝生长，其三萜产量也会随之减少。

实验模型预测：当麦芽汁浓度为4.10％，酵母浸出粉浓度为1.8％，pH为5.40时，菌丝生物量及IT产量分别可达到1.8512g/100ml，94.5598mg/100ml。将预测结果进行验证实验(3次重复)，所得菌丝生物量及IT产量分别为1.8776±0.02g/100ml，93.2199±0.79m/g100ml，与预测值接近，表明该模型对于优化灵芝发酵培养基具有可行性。因此，将麦芽汁4.10％，酵母浸出粉1.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH 5.40作为灵芝液体发酵培养基条件。

Claims (8)

1.一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法，包括：将灵芝接种到种子培养基中培养后，再接入发酵培养基中进行发酵培养，从发酵液中提取灵芝三萜；其特征在于，所述发酵培养基以麦芽汁为碳源、以酵母浸出粉为氮源，所述麦芽汁的重量百分数为2～5％，所述酵母浸出粉的重量百分数为0.8～2.8％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述发酵培养基包括：3.5～4.5％的麦芽汁和1.5～2.3％的酵母浸出粉。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为5～6。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述发酵培养基包括：麦芽汁3.5～4.5％，酵母浸出粉0.8～2.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH5.40。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述发酵培养基为麦芽汁4.10％，酵母浸出粉1.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH5.40。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：28℃下培养6～8天。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述种子培养基包括马铃薯1％，葡萄糖2％，蛋白胨1.8％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁0.005％，pH5.5。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，种子培养基的培养过程中，培养的条件为：28℃下培养7～9天。