CN106244462A - 一种灵芝菌丝体液体发酵培养方法 - Google Patents

一种灵芝菌丝体液体发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

一种灵芝菌丝体液体发酵培养方法，包括以下步骤：（1）取地龙药材粉碎；（2）称取马铃薯葡萄糖肉汤培养基3‑5g，置于培养瓶中，加入蒸馏水和地龙细粉，煮沸，调整pH为7.0，灭菌；（3）制液体菌丝体；（4）移取步骤（3）所得液体菌丝体0.7‑0.9mL，转接到经步骤（2）处理的马铃薯葡萄糖肉汤培养基上，摇匀，在温度27‑29℃和180‑220r/min摇床振荡的条件下，培养4‑6天，之后转速降为100‑140r/min培养8‑10天，共培养12‑16天；再用4‑6层灭菌纱布过滤收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗，真空冷冻干燥，即成。采用本发明能提高灵芝菌丝体的生物产量和三萜类组分的含量。

Description

一种灵芝菌丝体液体发酵培养方法
技术领域
本发明涉及一种灵芝菌丝体液体发酵培养方法。
背景技术
蚯蚓蛋白质含量很高，约占鲜蚯蚓的8%～10%，干重的56％～66％，氨基酸以谷氨酸、赖氨酸、精氨酸的含量居多。其冻干粉和体腔内液脂肪酸含量分析表明，不饱和脂肪酸含量高，饱和脂肪酸含量低，这些符合当前人类健康食品结构的要求。近年来已兴起一个开发蚯蚓保健食品热。蚯蚓的年贸易额在20亿美元左右，而每年正以20％-25％的速度递增，尤其是发达国家都在大力发展蚯蚓养殖业，目前已发展到工厂化养殖和商品化生产，养殖蚯蚓成了前景广阔的新兴养殖事业。蚯蚓饼干、罐头、蚯蚓肉和牛肉制成的汉堡包，更是畅销欧洲各地。目前蚯蚓的加工品主要有蚯蚓粉、蚯蚓液等多种形式。蚯蚓粉即将鲜蚯蚓风干或烘干后粉碎即成。蚯蚓粉的蛋白质含量高达70％，与进口鱼粉相当。其中精氨酸含量比鱼粉高2-3倍，色氨酸含量是牛肝的7倍，还含有较多的胡萝卜素和多种维生素及微量元素。
蚯蚓不仅是一种理想的保健食品，同时也是一味珍贵的中药。蚯蚓的中药名字为地龙（Geosaurus）。地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaas pergilum(E Perrier)等的干燥体，习称“广地龙”，其性寒、味咸，具有清热定惊，痛经活络、平喘利尿等功效，可用于关节麻痹，肢体麻木，半身不遂，高血压症等病症。
灵芝Ganoderma lucidum为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，属我国名贵的药用真菌之一，具有悠久的临床用药历史。现代药理和营养学研究证明，灵芝子实体和菌丝体中含有多种相同的生物活性成分，如多糖、灵芝三萜、甾醇等，其中多糖和三萜是灵芝中关键的生物活性物质或有效成分。生产实际中多采用人工栽培的方法来获得灵芝子实体，但栽培的周期较长，约3个月左右。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种灵芝菌丝体液体发酵培养方法，以缩短培养时间并提高灵芝菌丝体生物产量及单位重量干菌丝体中总三萜组分含量。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种灵芝菌丝体液体发酵培养方法，具体包括以下步骤：
（1）取地龙药材粉碎，过7号药典筛，得地龙细粉；
（2）称取马铃薯葡萄糖肉汤培养基（Potato Dextrose Broth, PDB培养基）3-5g，置于培养瓶（培养瓶的大小根据试剂的多少来确定，此处优选250 mL培养瓶）中，加入75-125 mL蒸馏水和步骤（1）所得地龙细粉0.05-0.15g，煮沸，调整pH为7.0，灭菌，备用；
调整pH值，优选用氢氧化钠溶液，更优选用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液；
所述灭菌，优选在121-126℃下高压灭菌15-30 min；
（3）将灵芝斜面菌种转接成液体菌种，获得灵芝种子培养液，在无菌条件下4-6层纱布过滤，获得菌丝体，称取菌丝体2-3克，加入无菌水9-11mL，用组织匀浆器研匀成浆液，得液体菌丝体；
（4）移取步骤（3）所得液体菌丝体0.7-0.9mL，转接到经步骤（2）处理的马铃薯葡萄糖肉汤培养基上，摇匀，在温度27-29℃和180-220r/min摇床振荡的条件下，培养4-6天，之后转速降为100-140r/min培养8-10天，共培养12-16天；再用4-6层灭菌纱布过滤收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗（优选冲洗5～6次），真空冷冻干燥，即成。
研究证明，由于蚯蚓粉（地龙粉）主要成分与灵芝液体培养基的成分近似，蚯蚓粉的加入或许对灵芝液体发酵菌丝体的生物产量和有效组分含量带来一定的影响。本发明添加少量蚯蚓粉与马铃薯葡萄糖肉汤培养基（Potato Dextrose Broth, PDB）联合培养灵芝液体菌种。采用液体发酵技术来获取灵芝菌丝体可以极大地缩短培养时间并获得相同活性的有效成分，而蚯蚓粉的添加将进一步提高灵芝菌丝体的生物产量和有效组分的含量。
本发明得到的灵芝菌丝体生物产量（即干重）较对照组（现有技术，不添加地龙粉）提高1.78倍左右，单位重量干菌丝体中总三萜组分含量提高约1.58倍，由此可见添加少量蚯蚓粉与PDB培养基来联合培养灵芝液体菌种，与经典的液体培养相比，能进一步提高灵芝菌丝体的生物产量和三萜类组分的含量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例之灵芝菌丝体液体发酵培养方法，具体包括以下步骤：
（1）取地龙药材粉碎，过7号药典筛，得地龙细粉；
（2）称取马铃薯葡萄糖肉汤培养基（Potato Dextrose Broth, PDB培养基）3g，置于250mL培养瓶中，加入100 mL蒸馏水和步骤（1）所得地龙细粉0.05g，煮沸，调整pH为7.0，灭菌，备用；
调整pH值，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液；
所述灭菌，在121℃下高压灭菌20 min；
（3）将灵芝斜面菌种（市售）转接成液体菌种，获得灵芝种子培养液，在无菌条件下4层纱布过滤，获得菌丝体，称取菌丝体2克，加入无菌水9mL，用组织匀浆器研匀成浆液，得液体菌丝体；
（4）移取步骤（3）所得液体菌丝体0.7mL，转接到经步骤（2）处理的马铃薯葡萄糖肉汤培养基上，摇匀，在温度27℃和180r/min摇床振荡的条件下，培养4天，之后转速降为100r/min培养8天，共培养12天；再用4层灭菌纱布过滤收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗5次，真空冷冻干燥，即成。
实施例2
本实施例之灵芝菌丝体液体发酵培养方法，具体包括以下步骤：
（1）取地龙药材粉碎，过7号药典筛，得地龙细粉；
（2）称取马铃薯葡萄糖肉汤培养基（Potato Dextrose Broth, PDB培养基）5g，置于250mL培养瓶中，加入125 mL蒸馏水和步骤（1）所得地龙细粉0.15g，煮沸，调整pH为7.0，灭菌，备用；
调整pH值，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液；
所述灭菌，在121℃下高压灭菌20 min；
（3）将灵芝斜面菌种（市售）转接成液体菌种，获得灵芝种子培养液，在无菌条件下6层纱布过滤，获得菌丝体，称取菌丝体3克，加入无菌水11mL，用组织匀浆器研匀成浆液，得液体菌丝体；
（4）移取步骤（3）所得液体菌丝体0.9mL，转接到经步骤（2）处理的马铃薯葡萄糖肉汤培养基上，摇匀，在温度29℃和220r/min摇床振荡的条件下，培养6天，之后转速降为140r/min培养10天，共培养16天；再用6层灭菌纱布过滤收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗6次，真空冷冻干燥，即成。
方法评价
灵芝菌丝体液体发酵共做3个处理：空白组（不添加蚯蚓粉）、试验组（添加蚯蚓粉，即实施例1）和对照组（添加与实施例1相同量的大米粉），空白组、试验组和对照组其他条件都相同，每组各5个重复。为了考察是否由于固体小颗粒（如大米粉、蚯蚓粉）作为母核能促进菌丝球的形成，设置了过7号筛的等量大米粉对照组。将各组所得菌丝体经冷冻干燥后测定生物产量和三萜类组分的含量，并采用PASW Statistics 18对数据结果进行统计分析，结果如下。
1、生物产量：采用干重法。将培养的菌液用多层纱布过滤后，真空冷冻干燥，精确称重，计算每100 mL培养基菌丝粉质量。表1为不同处理方法与生物产量的结果。
2、三萜组分含量测定：参考2015年中国药典第一部中关于灵芝有效成分含量检测方法，如下。
（1）对照品溶液的制备。取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL含0.2 mg的溶液，即得。
（2）标准曲线的制备。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置15mL具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得）0. 2 mL高氯酸0.8 mL，摇匀，在 70℃水浴中加热15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出，精密加乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂为空白， 照紫外-可见分光光度法(通则 0401)，在546 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。
（3）供试品溶液的制备。取本品粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50mL，超声处理（功率140W，频率42 kHz)45 min，滤过，滤液置100 mL容量瓶中，用适量乙醇，分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。
（4）测定法。精密量取供试品溶液0.2 mL，置15 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起 ，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，计算，即得。表2为不同处理与灵芝三萜组分含量的结果。
表1和表2结果显示，对照组生物产量和三萜组分含量较空白组均无统计学差异（P>0.05），表明包括大米在内的固体小颗粒作为母核对灵芝菌丝球生物产量和有效组分含量的影响并没有直接影响。而试验组生物产量平均值达到2.76 g/100mL，是空白组1.55 g/100mL的1.78倍，两组比较，具有显著性差异（P<0.05）；同时三萜组分含量达到0.3942，为空白组的1.58倍（0.2494），两组相比较，具有显著性差异（P<0.05），说明少量蚯蚓粉的添加能够显著提高灵芝菌丝体的生物产量和三萜类组分的含量。综合上述，可以推测蚯蚓粉的添加并不是从提供母核的角度来显著提高灵芝液体发酵菌丝体的生物产量和有效组分含量，这或许是由于蚯蚓粉的所含有的特殊组成成分发挥了作用。

Claims (6)

1.一种灵芝菌丝体液体发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取地龙药材粉碎，过7号药典筛，得地龙细粉；
（2）称取马铃薯葡萄糖肉汤培养基3-5g，置于培养瓶中，加入75-125 mL蒸馏水和步骤（1）所得地龙细粉0.05-0.15g，煮沸，调整pH为7.0，灭菌，备用；
（3）将灵芝斜面菌种转接成液体菌种，获得灵芝种子培养液，在无菌条件下4-6层纱布过滤，获得菌丝体，称取菌丝体2-3克，加入无菌水9-11mL，用组织匀浆器研匀成浆液，得液体菌丝体；
（4）移取步骤（3）所得液体菌丝体0.7-0.9mL，转接到经步骤（2）处理的马铃薯葡萄糖肉汤培养基上，摇匀，在温度27-29℃和180-220r/min摇床振荡的条件下，培养4-6天，之后转速降为100-140r/min培养8-10天，共培养12-16天；再用4-6层灭菌纱布过滤收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗，真空冷冻干燥，即成。
2.根据权利要求1所述的灵芝菌丝体液体发酵培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述培养瓶为250 mL培养瓶。
3.根据权利要求1或2所述的灵芝菌丝体液体发酵培养方法，其特征在于，步骤（2）中，调整pH值，用氢氧化钠溶液。
4.根据权利要求3所述的灵芝菌丝体液体发酵培养方法，其特征在于，步骤（2）中，调整pH值，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液。
5.根据权利要求1或2所述的灵芝菌丝体液体发酵培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述灭菌，在121-126℃下高压灭菌15-30 min。
6.根据权利要求1或2所述的灵芝菌丝体液体发酵培养方法，其特征在于，步骤（4）中，收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗5～6次。
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