CN102242079B

CN102242079B - 一种生产蝉拟青霉孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用

Info

Publication number: CN102242079B
Application number: CN2011101220024A
Authority: CN
Inventors: 陈祝安; 孙长胜; 赵伟; 李成
Original assignee: Zhejiang Faya Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Pan Asia Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2031-05-12
Also published as: CN102242079A

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产蝉拟青霉分生孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用。该生产蝉拟青霉分生孢子的培养基包括固相培养基和液体培养基。本发明的培养方法能够产生大量蝉拟青霉分生孢子，且其培养产物中含有多糖、虫草酸、腺苷、三萜类、多种氨基酸等成分，具有免疫调节、解热镇痛、改善肾功能、降血压、抗辐射、抗肿瘤及降血糖等功能，可以应用于人们的健康生活领域，同时发酵过程能够产生大量孢子，且培养产生的孢子可以作为生物防治的有效手段，从源头上解决农产品农药残留超标的问题。

Description

一种生产蝉拟青霉孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产蝉拟青霉分生孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用。

背景技术

蝉花即蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)，是一种虫生真菌，因其与冬虫夏草一样同属虫菌复合体，且含有相近的化学、营养成分，所以常用被用作冬虫夏草的代用品。蝉花具有免疫调节、解热镇痛、改善肾功能、镇静催眠、抗辐射等多种药理作用，可被应用到食品、保健品、药品、化妆品等领域。研究发现，在蝉拟青霉孢子中检测出与其他部位如孢梗束、菌质中同样的营养成分，甚至含量更高。此外，蝉拟青霉作为拟青霉属的虫生真菌，其分生孢子同样可作为生物防治的有效手段，从源头上解决农产品农药残留超标的问题。

现有专利中蝉花的人工培育方法只是为了获得菌丝体、孢梗束或带虫体的子实体而设计的培养基和方法，并没有专门为了获得蝉花孢子粉而设计的培养基和培养方法。另外，现有的培养方法中，单纯的液体培养并不能获得蝉拟青霉分生孢子，而固体培养存在生产周期长、菌剂含孢量低、成本高等弊端。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种生产蝉拟青霉分生孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用。

本发明采用如下技术方案解决上述技术问题：

一种生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，所述固相培养基的原料组分包括：

麸皮 20～45重量份；

玉米粉 5～30重量份；

蔗糖 0.5～5重量份；

蚕蛹粉 0.5～5重量份；

KNO₃ 0.1～3重量份；

KH₂PO₄ 0.05～1重量份；

MgSO₄ 0.05～0.8重量份；

H₂O 25～70重量份。

或者，所述固相培养基的原料组分包括：

麸皮 40～70重量份；

营养液 30～60重量份；

贝壳粉 0.01～2重量份；

蚕蛹粉 0.01～5重量份；

其中，所述营养液中含有的组分名称及其重量百分比为：

KNO₃ 0.1～5％；

蔗糖 1～20％；

KH₂PO₄ 0.05～3％：

MgSO₄ 0.01～0.5％：

柠檬酸铵 0.01～0.1％；

H₂O 余量。

本发明还提供了一种生产蝉拟青霉分生孢子的液相培养基，所述液相培养基中含有的组分名称及其重量百分比为：

马铃薯 10～30％；

蔗糖 1～10％；

柠檬酸 0.01～1％；

H₂O 余量。

本发明还提供了一种蝉拟青霉孢子的培养方法，该培养方法采用上述固相培养基及液相培养基，且所述培养方法包括如下步骤：

1)斜面菌种制备：将蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)菌株接种到斜面培养基上，20～25℃下，培养3～5天；

2)种子液的制备：从斜面上刮取菌丝接种到以PDA液体为基础的三角瓶液体培养基中，20～25℃下，140～160rpm，培养3～5天即可制得蝉拟青霉种子液；

3)将步骤2)中制得的蝉拟青霉种子液按重量百分比为10～15％接入所述液体培养基中，在20～25℃下，140～160rpm，振荡发酵3～5天；

4)将步骤3)中制得的发酵液按重量百分比为3％～10％接入灭菌后的所述固相培养基中，在温度为18～23℃，湿度为50～90％的条件下，静置开放式培养15～25 天。

较佳的，步骤1)中，所述斜面培养基为PDA固相培养基，其制备可由本领域技术人员参考现有技术进行确认。

进一步优选的，所述PDA固相培养基的制备方法为：挑取新鲜马铃薯，去皮洗净并切碎后与水混合，其中，马铃薯和水的重量比例为1∶(3～7)，灭菌后过滤，其滤液为马铃薯煮汁，然后在所述马铃薯滤液中加入琼脂2％份，蔗糖2％份，加热溶解后加水补足使得体积至原来马铃薯滤液体积，然后分装至试管，在121℃，1.05Kg/cm²灭菌30min后摆斜面，冷却后使用。

优选的，步骤4)中，所述的生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，其特征在于，所述固体培养基的制备方法为：先将玉米粉和麸皮煮熟，将蔗糖、KNO₃、KH₂PO₄、MgSO₄在水中溶解，再与蚕蛹粉、煮熟后的玉米粉和麸皮按照比例混合均匀。

较佳的，步骤4)中，所述静置开放式培养过程中，周围环境为万级洁净空间，同时通无菌风保证培养室内空气交换流通；进一步优选的，在静置开放式培养过程中，还需要在培养基上面覆盖多层厚度为0.1～0.3mm/层，含水量为饱和的无菌吸水纸进行固相发酵。更佳的，所述静置开放式培养过程中，在培养基上面覆盖多层厚度为0.1～0.3mm/层，在所述固相培养基的营养液中浸泡至饱和的无菌吸水纸进行固体发酵。

本发明第三方面提供了一种由上述蝉拟青霉孢子的培养方法所产生的发酵产物，该发酵产物包括发酵过程产生的孢子、次生代谢产物以及剩余培养基等。

本发明的培养产物中含有多糖、虫草酸、腺苷、多种氨基酸等成分，具有免疫调节、解热镇痛、改善肾功能、降血压、抗辐射、抗肿瘤及降血糖等功能，可以应用于人们的健康生活领域，比如：用于制备功能食品、药品或日化洗护用品等。同时发酵过程能够产生大量孢子，且培养产生的孢子可以作为生物防治的有效手段，从源头上解决农产品农药残留超标的问题，因此，可以用于生物防治领域，比如生物农药等。

附图说明

图1：人工培养蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激或未刺激的淋巴细胞作用24小时时对淋巴细胞增殖的影响。

图2：人工培养蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激或未刺激的淋巴细胞作用48小时时对淋巴细胞增殖的影响。

图3：人工培养蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激或未刺激的淋巴细胞作用72小时时对淋巴细胞增殖的影响。

图4：蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激的人淋巴细胞细胞周期的影响试验结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

1、培养基的制备：

1.PDA斜面制备(固体)

挑取新鲜无发芽无病害的马铃薯，去皮洗净，切成小薄片，称200g，加水1000mL，煮沸30min后过滤，其滤液为马铃薯煮汁。然后加入琼脂20g，蔗糖20g，加热溶解后补足水至1000mL，分装试管，121℃，1.05Kg/cm²，灭菌30min后，摆成斜面，冷却后使用。

2.固相培养基的制备

称取麸皮800g，玉米粉150g，H₂O 720ml，混合蒸煮1h，蔗糖10g，KNO₃ 5g，KH₂PO₄3g，MgSO₄ 2g，用少量H₂O溶解后，与蚕蛹粉10g，与煮熟后的麸皮和玉米粉混合均匀，121℃，1.05Kg/cm²，灭菌30min后使用。

所述固体培养基还可为：

称取麸皮1200g，蚕蛹粉20g，贝壳粉15g，营养液1000mL，混合后，121℃，1.05Kg/cm²，灭菌30min后使用。其中，所述营养液具体组成如下：KNO₃为0.5％，蔗糖为10％，KH₂PO₄为1％，MgSO₄为1％，柠檬酸铵为0.05％，H₂O为余量。

3.液体培养基的制备

挑取新鲜无发芽无病害的马铃薯，去皮洗净，切成小薄片，称200g，加水1000mL，煮沸30min后过滤，其滤液为马铃薯煮汁。然后加入蔗糖20g，柠檬酸0.1g加热溶解后补足水至1000mL，混合后，121℃，1.05Kg/cm²，灭菌30min后使用。

2、蝉拟青霉孢子的培养过程

1.蝉拟青霉菌种的制备

将蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)接到PDA斜面固体培养基上，22℃恒温培养4～6天，备用。

2.液固双相发酵生产蝉拟青霉孢子

取斜面种，用接种环刮取少量带分生孢子的菌丝体接入液体培养基中，摇瓶装液量200mL/500mL，22℃下，140rpm，振荡发酵3～5天，再将发酵液按照3～5％的接种量接入固相培养基上，混匀，在培养基上面覆盖一层厚度为0.1～0.3mm，含水量为饱和的无菌吸水纸进行固体发酵，25℃，湿度为60％的条件下培养10～25天即得到大量蝉拟青霉孢子。

在所述含有营养液组分的固相培养基中培养时，在培养基上面覆盖一层厚度为0.1～0.3mm，在所述固相培养基的营养液中浸泡至饱和的无菌吸水纸，然后将液体发酵培养基中培养好的蝉拟青霉菌丝体按照3～5％的接种量喷洒在吸水纸表面，25℃，湿度为60％的条件下培养10～25天即得到大量蝉拟青霉孢子。

3.蝉拟青霉分生孢子的收集方法，具体包括以下步骤：

(1)菌种培养：实施例1

(2)培养物烘干：将培养物整体倒入沸腾干燥机，脱水烘干；

(3)培养物粗粉碎：将烘干的培养物进行粗粉碎，使孢子从培养物上脱落；

(4)孢子分离：开启旋风收集器，将孢子与培养物分离，使孢子从管道中进入收集室；

(5)孢子收集：孢子从管道中进入收集室，在收集室顶端通过微风装置将孢子吹至收集室底部收集袋，获得蝉拟青霉孢子粉。

4、培养产物的成分分析试验

1)多糖含量测定

精确称取实施例1中制得的蝉拟青霉孢子粉0.5g，加入10mL蒸馏水，超声萃取10min，然后放入90℃水浴锅，热水浸提2h，4000r/min离心10min，获得上清液。重复上述步骤一次，合并上清液，用紫外可见分光光度法在490nm的波长处测定吸光度：首先将样液稀释12.5倍；然后用加样抢精确吸取1mL稀释后样液，加入1mL蒸馏水，再加入5％苯酚溶液，摇匀；再加入5mL 98％浓硫酸，摇匀并冷却至室温后采用紫外可见分光光度计检测，波长为490nm。

其中，所述多糖含量测定计算公式为：多糖含量＝a·C·V/W；

上述公式中，a：稀释倍数，C：由回归方程计算得到的浸提液中糖浓度(mg·mL。)，V：体积(mL)；W：为样品的重量(mg)。结果见表1。

2)总三萜含量测定

称0.05g供试品于25mL容量瓶，超声20min，用无水乙醇定容到刻度。供试品溶液中取0.4mL，沸水浴挥去无水乙醇，冷却，加入5％香草醛冰乙酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，将容量瓶放人60℃水浴中加热15min，冷却至室温，用冰醋酸定容到刻度，摇匀。在548nm波长处测定吸光度值。以熊果酸作为对照品溶液。结果见表1。

3)腺苷含量测定

A.溶液的制备

对照品溶液：称取腺苷对照品适量，精密称定，加90％甲醇溶解制成含量为16.04μg/mL的腺苷对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液：称取蝉拟青霉孢子粉0.5g，精密称定，置于带塞锥形瓶中，加入90％甲醇10mL，闭塞，摇匀，称定重量，加热回流30min，冷却，再称定重量，用90％甲醇补足减少的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

B.色谱条件

Diamonsil C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液(PH6.5)-甲醇(17∶3)为流动相；流速为1mL/min，检测波长为260nm，理论塔板数以腺苷峰计不低于2000。磷酸盐缓冲液(PH6.5)制备：取0.01mol/L磷酸二氢钠68.5mL与0.01mol/L磷酸氢二钠31.5mL，混合，调PH至6.5。

C.测定法

按照色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表1。

4)虫草酸含量测定

称取0.500g样品加去离子水10mL，超声30min，4000r/min离心10分钟，获取上清液。两个循环，上清液定容到20mL。精密量取待测样品溶液1mL，加入10mL刻度试管中，加1mL高碘酸钾溶液，混匀，室温放置10min，加2mL 0.1％ L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐，混合后加4mL新鲜配制的NaSh试剂，53℃水浴加热15min使其呈色；之后快速冷却至室温，用分光光度计以蒸馏水代替待测样品溶液，用同样方法操作作为对照，测定其吸光度，其计算公式如下：M＝C＊V/m；其中，M：虫草酸含量(mg/g)；C：虫草酸浓度(mg/mlL)；V：提取溶液体积(mL)；m：测试样品量(g)。结果见表1。

表1 孢子和天然蝉花的成分比较

4、急性经口毒性试验

A.样品名称和性状：蝉拟青霉，散装，固体；

B.样品配制：称取样品10000mg，加蒸馏水至40ml，充分混匀后作为受试样品。

C.实验动物：昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重19-22克，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养室温度20-25℃，相对湿度：40-70％。实验室动物使用许可证号：SYXK(沪)2007-0008。小鼠饲料由苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司提供，登记证号：苏E饲生字(2002)006。

D.实验方法：

1.动物禁食(不禁水)16小时后，按体重要求选用雌、雄小鼠各10只，分放于两鼠笼内，同性别小鼠之间体重差不超过3g。

2.将受试样品采用最大耐受剂量法对实验动物染毒，小鼠逐只称重，灌胃容量按每次0.4ml/20g体重计，在24小时内二次对小鼠灌胃，灌胃间隔时间为6小时。

3.染毒后，观察动物的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等。观察期为一周。

4.实验末再次对动物称重。对死亡动物及到期处死的动物进行尸体解剖，肉眼观察大体病理改变情况。

5.实验全过程及观察内容均做详细记录，按最大耐受剂量法试验结果，求得小鼠急性经口MTD。

E.结果：

表雌雄小鼠急性经口毒性试验结果

1.主要体征表现：

试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒体征和死亡；到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。

2.雌性小鼠：MTD＞10000mg/kg

雄性小鼠：MTD＞10000mg/kg

F.结论：

样品对雌雄小鼠急性经口毒性试验的最大耐受剂量MTD均大于10000mg/kg。属于实际无毒级。

实施例2

1、培养基的制备

1)PDA斜面制备(固体)

同实施例1。

2)固相培养基的制备

称取麸皮900g45，玉米粉600g，H₂O1000ml，混合蒸煮1h，蔗糖100g，KNO₃ 60g，KH₂PO₄ 20g，MgSO₄ 16g，用少量H₂O溶解后，与蚕蛹粉100g，与煮熟后的麸皮和玉米粉混合均匀，121℃，1.05Kg/cm²，灭菌30min后使用。

3)液体培养基的制备

挑取新鲜无发芽无病害的马铃薯，去皮洗净，切成小薄片，称300g，加水1000mL，煮沸30min后过滤，其滤液为马铃薯煮汁。然后加入蔗糖200g，柠檬酸10g加热溶解后补足水至1000mL，混合后，121℃，1.05Kg/cm²，灭菌30min后使用。

2、蝉拟青霉孢子的培养过程

同实施例1，经培养后得到大量蝉拟青霉孢子。

实施例3

1、培养基的制备

1)PDA斜面制备(固体)

同实施例1。

2)固相培养基的制备

称取麸皮800g，玉米粉200g，H₂O 800ml，混合蒸煮1h，蔗糖20g，KNO₃ 4g，KH₂PO₄2g，MgSO₄ 2g，用少量H₂O溶解后，与蚕蛹粉20g，与煮熟后的麸皮和玉米粉混合均匀， 121℃，1.05Kg/cm²，灭菌30min后使用。

3)液体培养基的制备

挑取新鲜无发芽无病害的马铃薯，去皮洗净，切成小薄片，称300g，加水1000mL，煮沸30min后过滤，其滤液为马铃薯煮汁。然后加入蔗糖30g，柠檬酸0.3g加热溶解后补足水至1000mL，混合后，121℃，1.05Kg/cm²，灭菌30min后使用。

2、蝉拟青霉孢子的培养过程

同实施例1，经培养后得到大量蝉拟青霉孢子。

实施例4MTT法检测不同浓度的蝉拟青霉分生孢子对淋巴细胞增殖能力的影响

1、实验材料：

人工培养蝉拟青霉分生孢子(由实施例1所得)

实验用人外周血淋巴细胞(自主培养)

2、实验方法：

取处于指数增长期细胞接种至96孔板里，培养24h使细胞贴壁，去除上清，加100μL/孔带药新鲜培养基：当测试时用完全培养基稀释成所需浓度，每个浓度设6个复孔，并设空白对照组、正常的人外周血淋巴细胞和PHA(2.5μg/ml)刺激的人外周血淋巴细胞，同样设6个复孔。培养至24-72h，加10μl/孔(终浓度5mg/mL)的MTT，培养4h后，去除上清，加入100μl DMSO，振荡器上震荡溶解，在570nm波长下，酶标仪测定OD值，并计算刺激指数，用SI表示，空白对照SI＝1，刺激指数的计算公式如下：

3、实验结果[所有数据均采用平均值±标准差表示(n＝5)]如图1-3所示，结果表明，本发明获得的人工培养蝉拟青霉分生孢子具有刺激淋巴细胞增殖的作用。

实施例5 蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激的人淋巴细胞细胞周期的影响

1.实验对象：同实施例4

2.实验方法：

2.1将100μg/ml蝉拟青霉分生孢子加入正常淋巴细胞和PHA(2.5μg/ml)刺激的淋巴细胞中，即蝉拟青霉分生孢子组和蝉拟青霉分生孢子+PHA组，另设空白对照组及PHA对照组，4组细胞培养48h。

2.2 收集细胞：[数目约(1～5)×10⁶个/mL]，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

2.3 3mlPBS洗涤1次。

2.4 离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1-2h。

2.5 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。

2.6 400目的筛网过滤1次，500-1000r/min离心5min，弃去PBS。

2.7 用1mlPI染液染色，4℃避光30min，流式细胞仪检测

3.实验结果如图4及下表：

所有数据均采用平均值±标准差表示(n＝5)

*，与空白对照组比较P＜0.05；***，与空白对照组比较P＜0.001

+，与PHA对照组比较p＜0.05

试验表明，蝉拟青霉分生孢子具有双向免疫调节功能

蝉拟青霉分生孢子对静止T-淋巴细胞的作用：增强T细胞增殖，但对细胞周期进程无特异性作用

蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激的淋巴细胞的作用：抑制细胞增殖，诱导细胞周期停滞于G0/G1期，表现为G0/G1期的增加和S期的减少。

Claims

1.一种生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，所述固相培养基的原料组分包括：

2.如权利要求1中所述的生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，其特征在于，所述固相培养基由下列方法制得：先将玉米粉和麸皮煮熟，将蔗糖、KNO₃、KH₂PO₄、MgSO₄在水中溶解，再与蚕蛹粉按照比例混合均匀。

3.一种蝉拟青霉孢子的培养方法，该培养方法采用权利要求1所述固相培养基，且所述培养方法包括如下步骤：

1）斜面菌种制备：将蝉拟青霉菌株接种到斜面培养基上，20～25℃下，培养3～5天；

2）种子液的制备：从斜面上刮取菌丝接种到以PDA液体为基础的三角瓶液体培养基中，20～25℃下，140～160rpm，培养3～5天即可制得蝉拟青霉种子液；

3）将步骤2）中制得的蝉拟青霉种子液按重量百分比为10～15%接入液相培养基中，在20～25℃下，140～160rpm，振荡发酵3～5天；

所述液相培养基中含有的组分名称及其重量百分比为：

4）将步骤3）中制得的发酵液按重量百分比为3%～15%接入灭菌后的权利要求1所述固相培养基中，在温度为18～23℃，湿度为50～90%的条件下，静置开放式培养15～25天。

4.如权利要求3中所述的蝉拟青霉孢子的培养方法，其特征在于，步骤1）中，所述斜面培养基为PDA固体培养基。

5.如权利要求4中所述的蝉拟青霉孢子的培养方法，其特征在于，所述斜面培养基的制备方法为：马铃薯去皮洗净并切碎后与水混合，其中，马铃薯和水的重量比例为1∶（3～7），灭菌后过滤得到马铃薯煮汁，然后在所述马铃薯滤液中加入琼脂2%，蔗糖2%，加热溶解后加水补足使得体积至原来马铃薯滤液体积，然后分装至试管，在121℃，1.05kg/cm²灭菌30min后摆斜面，冷却后使用。

6.如权利要求3中所述的蝉拟青霉孢子的培养方法，其特征在于，步骤4）中，所述静置开放式培养过程中，周围环境为万级洁净空间，同时通无菌风保证培养室内空气交换流通。

7.如权利要求6所述的蝉拟青霉孢子的培养方法，其特征在于，步骤4）中，在静置开放式培养过程中，还需要在培养基上面覆盖多层厚度为0.1～0.3mm/层，含水量为饱和的无菌吸水纸进行固体发酵。