CN101518265A

CN101518265A - 蝉拟青霉生物菌剂及制备方法以及在防治植物线虫中的应用

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Publication number: CN101518265A
Application number: CN200910127816A
Authority: CN
Inventors: 刘伟平; 王建玲
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-04-08
Filing date: 2009-04-08
Publication date: 2009-09-02
Also published as: WO2010115335A1

Abstract

本发明涉及一种利用生物菌制备的防治植物线虫制剂的生产方法及其应用，具体说是蝉拟青霉生物菌剂及制备方法以及在防治植物线虫中的应用。该制剂为蝉拟青霉及其培养基、辅料及承载物的混合物体。采用蝉拟青霉进行菌种培养，采用液体发酵，大量繁殖后，直接加工或者用辅料和承载物吸附方法制备生物杀线虫菌剂。对植物线虫防效显著，性能稳定，适用地域广，达到生物农药保质期标准，对环境友好和人类健康安全，符合有机食品和绿色食品的生产要求，是一种易于规模化工业生产，防治植物线虫广谱的生物杀线虫菌剂。

Description

蝉拟青霉生物菌剂及制备方法以及在防治植物线虫中的应用

技术领域

本发明涉及一种利用生物菌制备的防治植物线虫制剂的生产方法及其应用，具体说是蝉拟青霉生物菌剂及制备方法以及在防治植物线虫中的应用。

背景技术

根结线虫病害在世界范围内普遍发生，其中以南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫4个种发生最为普遍，对农作物的为害最大。根结线虫通常没有明显的寄主专化性，能够侵染的作物大约有114科，3000多种，据估计全世界每年由植物线虫造成的损失达1000多亿美元。特别是近年来，随着我国农业保护地种植面积的扩大，复种指数增加，根结线虫造成的危害有逐年增加的趋势。

目前，防治根结线虫主要采用化学农药，大多对人畜毒性较高，尤其是使用不当，造成环境污染，破坏生态平衡，有不少化学杀线虫剂已经禁用，或即将禁用。例如在美国，溴甲烷、二溴甲烷已经被禁用；在我国二溴氯丙烷已经被禁用，苯线磷、涕灭威、灭线磷等被禁止在蔬菜、果树等作物上使用。轮作、抗线虫品种、转基因作物等在根结线虫的防治中，虽然起到一定作用，但因土地资源紧张、种植效益、植物品种多样性等方面的要求，均有一定的局限性。因此，人们除了继续开发高效低毒、低残留、对环境友好的化学杀线虫剂外，开始用生物方法防治根结线虫。由于线虫能耐受许多杀虫剂，容易对化学杀线虫剂产生抗药性，用生物方法防治线虫已经成为研究的热点，引起各国的高度重视和大规模投资。例如，日本投资8亿美元用于巴氏杆菌的研究，美国国家科学基金会给予北卡罗莱纳州和OrionGenomics LLC的科学家159万美元的经费，以用于绘制世界上最常见、破坏性最大的植物寄生虫——微小的、宿于土壤的根结线虫的基因图谱，以便发现控制这种普遍存在的害虫的新方法。目前，有许多线虫生防商品制剂问世，尽管这些生防制剂，在很大范围内取得了成功，但因土壤性质差别，在不同国家或地域使用的最大问题是防效不稳定，还有的存在存储期短的问题，达不到生物农药要求的18个月的保质期。

由于环境保护要求和食品安全等方面的要求，化学杀线虫剂在农业生产中受到越来越严格的限制，目前各种生防杀线虫剂的存在的种种缺陷和不足，如应用地域范围小，产品货架期短，效果不够稳定等。

蝉花，是一种药用价值与冬虫夏草相当的古老中药，天然蝉花是蝉的若虫受到蝉拟青霉真菌(Paecilomyces cicddae(Migud)Samson)寄生的蝉菌复合体，有“南方冬虫夏草”之美誉，以往主要靠采摘稀有的天然蝉花用于加工保健品或作为配伍用药等。安徽科学技术出版社1996年出版的《昆虫真菌学》中有详细介绍。

发明内容

本发明的目的是培养出一种对植物线虫防效显著，性能稳定，适用地域广，符合生物农药保质期标准，对环境友好和人类健康安全，符合有机食品和绿色食品的生产要求，易于规模化工业生产，防治线虫广谱的生物杀线虫菌剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的蝉拟青霉生物菌剂，其特征在于：该制剂为蝉拟青霉及其培养基以及辅料、承载物的混合物体；

所述培养基为蛋白质粉、蚕蛹粉、柳树皮粉、茶叶粉、水的混合物，其重量份数比如下

蛋白质粉100——300，蚕蛹粉100——300，

柳树皮粉10——40，茶叶粉5——10，

水1000——1500；

所述辅料是蛋白质粉、蚕蛹粉的混合物，承载物是杨树皮粉、柳树皮粉、梨树皮粉、榆树皮粉、刺槐树皮粉、柿子树皮粉、柑橘树皮粉中的一种或多种的混合物；上述蛋白质粉是鸡蛋粉或者蛋白胨粉，或者鸡蛋粉和蛋白胨粉任意比例的混合物。

上述蝉拟青霉生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

A)种子制备

用水、醇沉淀法提取蝉拟青霉菌，即得蝉拟青霉菌种；

在培养基上以液体摇瓶法或斜面试管液态培养种子，每1千克培养基使用0.01——5克蝉拟青霉菌种；

将上述培养基的成分与蝉拟青霉菌种充分混合后，放置在温度为0一30℃的环境中，通气的条件下培养6——12天，得到蝉拟青霉种子；

B)、一级种子罐发酵

将上述步骤A)取得的蝉拟青霉种子与水按照1：1000——1500的重量份数比混合，再按照水的重量份的40％——70％加入一级培养基，在温度为-15——45℃环境下，培养6——12天，得到一级种子；

所述一级培养基包含如下重量份数比的成分

蛋白质粉或蚕蛹粉10—35，柳树皮粉1—4，茶叶粉0.2—1；其中，蛋白质粉是鸡蛋粉或者蛋白胨粉，或者鸡蛋粉和蛋白胨粉任意比例的混合物；

C)二级种子罐发酵

将上述步骤B)得到的一级种子与水按照1：3——40的重量份数比混合，再按照水的重量份的40％——70％加入二级培养基，在温度为-15——45℃环境下，培养6——12天，得到二级种子，

所述二级培养基包含如下重量份数比的成分

蛋白质粉或蚕蛹粉100—350，柳树皮粉5—30，茶叶粉1—15；其中，蛋白质粉是鸡蛋粉或者蛋白胨粉，或者鸡蛋粉和蛋白胨粉任意比例的混合物；

D)制剂的生产

将上述步骤C)取得的二级种子按照如下方法之一生产制剂，

方法一

在发酵罐中加入水12000—16000重量份，二级种子100—200重量份，蛋白质粉或蚕蛹粉1500—3500重量份，柳树皮粉200—1200重量份，茶叶粉40—100重量份，培养温度10—45℃，通气培养时间6—12天；其中，蛋白质粉是鸡蛋粉或者蛋白胨粉，或者鸡蛋粉和蛋白胨粉任意比例的混合物；然后分装，可得所述的蝉拟青霉生物菌剂的液体剂；

方法二

将二级种子用辅料和载体吸附，在温度为10—50℃条件下烘干或者采用冷冻干燥的方法，制成粉剂、颗粒剂；可得所述的蝉拟青霉生物菌剂的粉体剂；

上述辅料是蛋白质粉、蚕蛹粉的混合物，承载物是杨树皮粉、柳树皮粉、梨树皮粉、榆树皮粉、刺槐树皮粉、柿子树皮粉、柑橘树皮粉中的一种或多种的混合物；其中，蛋白质粉是鸡蛋粉或者蛋白胨粉，或者鸡蛋粉和蛋白胨粉任意比例的混合物；

方法三

将二级种子按5-20％的比例加入水中，得到二级种子混合物，将二级种子混合物与制剂培养基按照1：0.8——1.2的重量份数比混合，在温度为10—45℃的环境下培养8—20天，然后在温度为10—50℃条件下烘干或者采用冷冻干燥的方法干燥成固态，即得到所述的蝉拟青霉生物菌剂的固态剂；

制剂培养基包含如下重量份数比的成分

蛋白质粉或蚕蛹粉30—68，柳树皮粉1—4，茶叶粉0.05—1；其中，蛋白质粉是鸡蛋粉或者蛋白胨粉，或者鸡蛋粉和蛋白胨粉任意比例的混合物。

上述蝉拟青霉生物菌剂在防治植物线虫中的应用，是用于制备具有杀灭寄居性和半寄居性植物线虫或杀灭蛴螬、韭蛆的杀虫剂的作用。

本发明生产的防治线虫的真菌剂，从产品效能、产品货架期、防治线虫范围、适用地域范围、对环境的影响、生产工艺及成本、原料来源等方面，具有以下特点：

1、防治作物线虫病害的高效性

根结线虫病害是一类有土传特性的重要病害，具有高传染性和高抗药性，防治难度很大，根治的难度更大，一般防治方法的防治效果在30％—70％之间。本发明的制剂，田间防效可达400天以上，防治效果达到90％以上。如果杜绝外来传染源，连续应用三年，可基本消除线虫对作物造成的产量损失。

2、线虫防治范围广谱

目前现有的防治线虫的微生物农药，一般仅对某一类线虫有效。本发明的制剂，能同时防治多类线虫对作物的为害，可防治根结线虫、大豆胞囊线虫、小麦胞囊线虫、马铃薯胞囊线虫、甘薯茎线虫、香蕉穿孔线虫、柑橘半穿刺线虫、肾形肾状线虫、异皮线虫、短体根结线虫等寄居性和半寄居性线虫。

3、防治作物线虫病害的长效性

根结线虫病害是一类有土传特性的重要病害，具有高传染性和高抗药性，防治难度很大，根治的难度更大，一般防治方法不能达到长效防治的要求，也不能达到同时防治多种线虫的目的。本发明的制剂，一个种植季节一次用药，田间防效可达150天以上，一年内两次用药，田间防效可达400天以上，防治效果达到90％以上，可用于对桔梗、葡萄、柑橘等多年生植物线虫的防治。

4、产品货架期的长效储存性

目前现有的防治线虫的微生物农药，一般达不到18个月保质期的要求。本发明的制剂，生产的商品制剂微生物，在南北纬55°之间的区域，常温下存放，货架保质期一般可存放24个月，货架保质期最长可达36个月。

5、适用地域广

由于土壤性质的差异，气候条件有别，耕作制度不同，目前现有的防治线虫的微生物农药，因土壤抑菌性等方面的因素，田间防治效果会发生很大差异。本发明的制剂，采用的是适应性强的广布种，在南北纬55°之间均可使用，田间效果差异小于10％。

6、对环境和人类健康友好

本发明的制剂，所采用的蝉拟青霉菌是广布菌种，在我国是常用的人体保健用中药，对环境、人类、禽畜鱼类安全，符合有机食品和绿色食品生产对生物杀线虫菌剂要求。

7、易于规模化生产、生产成本较低

液态条件下深层发酵生产，可建设自动化流水线，采用容积50000升容器的连续生产，生产所用的培养基等原料，相对价格低廉且容易获得，在实际应用中，若以保护地黄瓜、西红柿为例，其价格仅相当于化学农药溴甲烷的40—60％。

8、生产过程无污染

本发明在生产过程中，无工业废水、渣排放，对环境安全、无污染。

9、防治作物的其它地下害虫

本发明对蛴螬、韭蛆、菜蛾等害虫的地下蛹有一定的杀灭作用。

具体实施方式

实施例1

本发明所述的利用生物菌制备的蝉拟青霉生物菌剂采用蝉拟青霉进行菌种培养，采用液体发酵，大量繁殖后，直接加工或者用载体吸附方法制备生物杀线虫菌剂，商品制剂为该制剂为蝉拟青霉及其培养基以及辅料、承载物的混合物体；

蛋白质粉100——300，蚕蛹粉100——300，

柳树皮粉10——40，茶叶粉5——10，

水1000——1500；

上述鸡蛋为生鸡蛋的蛋清和蛋黄，也可以是熟鸡蛋粉碎后的鸡蛋粉，蚕蛹粉就是生蚕蛹粉碎后的粉末状的粉体，柳树皮粉就是柳树皮粉碎后的粉末状的粉体，其他各种粉体的含义类似。

包括蛋白质粉在内的各种粉体均粉碎为80——300目。

本发明所述的蝉拟青霉生物菌剂的生产方法，包括菌种取得，菌种培养，液体发酵，或固体培养。所述菌种为蝉拟青霉Paecilomycescicddae(Migud)Samson，该菌种为广布种，见于蝉的成虫，称为“蝉花”，安徽科学技术出版社1996年出版的《昆虫真菌学》中有详细介绍。

具体说，该生产方法包括如下步骤：

A)种子制备

用水、醇沉淀法提取蝉拟青霉菌，即得蝉拟青霉菌种。详细步骤已有多种公开文献叙述，如《中国农业科学》等学术期刊，在此不再重复。

将商品蝉拟青霉菌种在培养基上以液体摇瓶法培养种子或斜面试管液态培养种子。每1千克培养基使用0.01——5克蝉拟青霉菌种。

将上述培养基的成分与蝉拟青霉菌种充分混合后，放置在温度为0—30℃的环境中，通气的条件下培养6——12天，得到蝉拟青霉种子；

B)、一级种子罐发酵

所述一级培养基包含如下重量份数比的成分

C)二级种子罐发酵

所述二级培养基包含如下重量份数比的成分

D)制剂的生产

将上述步骤C)取得的二级种子按照如下方法之一生产制剂，

方法一

方法二

方法三

将二级种子按5-20％的比例加入水中，得到二级种子混合物，将二级种子混合物与制剂培养基按照1：0.8——1.2的重量份数比混合，在温度为10—45℃的环境下培养8—20天，然后在温度为10—50℃条件下烘干或者采用冷冻干燥的方法干燥成固态，即得到所述的蝉拟青霉生物菌剂的固态剂；冷冻干燥的方法在化学工业出版社2002年12月出版的《微生物制药》一书中有详细介绍，在此不再重复。

制剂培养基包含如下重量份数比的成分

该实施例中各成分的比例以及温度、时间等条件可以根据需要在规定的范围内适当调整，并根据情况确定辅料和载体的用量。选择不同的参数只回影响最终产品的质量和效果，并不影响本发明目的的实现。

实施例2

生产方法包括如下步骤：

用水提醇沉淀法提取蝉拟青霉。

再以液体摇瓶法培养种子，将蝉拟青霉0.01-5重量份与培养基混合，培养基为混匀的鸡蛋与蚕蛹粉的混合物300—680重量份，柳树皮10—40重量份，茶叶5—10重量份，水1000重量份。其中，鸡蛋与蚕蛹粉的混合物是生鸡蛋与蚕蛹粉的混合物，也可以是熟鸡蛋粉与蚕蛹粉的混合物，鸡蛋与蚕蛹粉的重量比例为1—9：1或1：1—9。培养温度为0—30℃，通气的条件下培养6——12天。得到蝉拟青霉种子。

一级种子罐发酵

在50升全自动发酵罐中，加入水20—35升，蝉拟青霉种子20毫升，混匀的鸡蛋与蚕蛹粉的混合物为水的重量份的40％——70％，柳树皮粉1—4公斤，茶叶粉0.2—1公斤。根据环境温度的不同，适当调整培养的时间，例如：环境温度为15—30℃时，培养6—7天；环境温度为-15—10℃时，培养24—72小时；环境温度为0—45℃时，培养5—6天。培养完成后，发酵罐中的混合物即为一级种子。

二级种子罐发酵

在500升全自动发酵罐中，加入水200—350升，一级种子5—50升，鸡蛋与蚕蛹粉的混合物100—350公斤，柳树皮粉5—30公斤，茶叶粉1—15公斤。根据环境温度的不同，适当调整培养的时间，例如：培养温度10—45℃时，培养时间6—12天。培养为温度-15—10℃时，培养24—72小时。培养完成后，发酵罐中的混合物即为二级种子。

将上述步骤取得的二级种子按照如下方法之一生产制剂，

液体剂的制备方法

方法一

用20000升容积的容器发酵，在发酵罐中加入水12000—16000升、二级种子100—200升、鸡蛋与蚕蛹粉的混合物1500—3500公斤、柳树皮粉200—1200公斤、茶叶粉40—100公斤，培养温度10—45℃，通气培养时间6—12天。然后直接分装，可得蝉拟青霉生物菌剂的商品制剂。

方法二

将二级种子，用辅料和载体吸附，根据需要制成粉剂、颗粒剂等不同剂型的生物杀线虫制剂。

浓缩或添加辅料后和承载物后，在温度为10—50℃条件下干燥或真空冷冻干燥或即可得到蝉拟青霉生物菌剂的商品制剂。。

上述辅料是鸡蛋，即生鸡蛋或熟的鸡蛋粉，承载物是杨树、柳树、梨树、榆树、刺槐树、柿子树、柑橘树等树皮的粉末。

50000升容积以上的发酵时间为8—20天，温度10—45℃。

方法三

将二级种子，按5-20％的比例加入水中，再加入与水等重的培养基，温度在10—45℃，培养8—20天，烘干或真空冷冻干燥。培养基的组成为混匀的鸡蛋与蚕蛹粉、树皮粉、茶叶，其重量比为30—68：1—4：0.05—1。树皮粉为杨树、柳树、梨树、榆树、刺槐树、柿子树、柑橘树等树皮的粉末。

防治根结线虫试验结果表

(一)实验结果测算方法

1、病株分级标准如下：

0级：根系完整，无根结；

I级：有少量根结(占根系量的11％-25％)；

II级：根结形成中等数量(占根系量的26％-50％)；

III级：根结数量较多(占根系量的51％-75％)；

IV级：根结特多且较大(占根系量的76％-100％)。

2、根结指数及防治效果计算：

(二)各项试验结果

在山东省潍坊市、青岛市等地区，选择根结线虫为害严重，对涕灭威、噻唑磷等化学杀线虫剂已经产生抗药性的蔬菜大棚、早春西瓜田、大田桔梗、大田牛蒡、大田大姜，连续三年进行防治效果和根结线虫的抗药性随机试验，防治效果显著。其中，黄瓜、番茄、西瓜的试验结果如下：

1、黄瓜大棚，根结线虫已经连续发生六年

生防菌制剂施用后160天对黄瓜根结线虫的防治效果

2、番茄大棚，根结线虫已经连续发生七年

生防菌制剂施用后150天对番茄根结线虫的防治效果

3、早春西瓜，根结线虫已经连续发生十年

生防菌制剂施用后120天对嫁接西瓜根结线虫的防治效果

4、黄瓜与苦瓜套种大棚，根结线虫已经连续发生八年，在黄瓜定植前，已经进行了线虫防治处理，黄瓜的生长期为140天，苦瓜在黄瓜定植后的90—100天后定植，在苦瓜定植前3——5天或定植后30天内进行防治线虫处理。

生防菌制剂施用后120天对大棚套种苦瓜根结线虫的防治效果

Claims

1、蝉拟青霉生物菌剂，其特征在于：该制剂为蝉拟青霉及其培养基以及辅料、承载物的混合物体；

蛋白质粉 100——300，蚕蛹粉 100——300，

柳树皮粉 10—40，茶叶粉 5——10，

水 1000——1500；

2、如权利要求1所述的蝉拟青霉生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

A)种子制备

用水、醇沉淀法提取蝉拟青霉菌，即得蝉拟青霉菌种；

B)、一级种子罐发酵

所述一级培养基包含如下重量份数比的成分

C)二级种子罐发酵

所述二级培养基包含如下重量份数比的成分

D)制剂的生产

将上述步骤C)取得的二级种子按照如下方法之一生产制剂，

方法一

方法二

方法三

制剂培养基包含如下重量份数比的成分

3、权利要求1所述的蝉拟青霉生物菌剂在防治植物线虫中的应用，其特征是用于制备具有杀灭寄居性和半寄居性植物线虫或杀灭蛴螬、韭蛆的杀虫剂的作用。