CN108220376A - 用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，其具体步骤为：向蚕蛹粉中加入脱脂剂脱脂，抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，烘干；向脱脂蚕蛹中加入磷酸缓冲液和中性蛋白酶，酶解，灭酶，冷却后离心，上清液喷雾干燥，即得蚕蛹提取物。有益效果为：本发明制备方法简单可行，脱脂效率高，提取物中蛋白得率高、纯度高、活性高、分子量较为集中、易于被革兰氏阳性菌吸收利用，易于工业化生产，安全性更高，提高蚕蛹附加值。

Description

用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及蚕蛹深加工技术领域，尤其是涉及用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法。

背景技术

食源性疾病是发展中国家和发达国家的首要食品安全问题，对人类健康危害严重，尤其是对儿童、孕妇和老人。食品在生产和贮藏过程中，易受细菌性微生物感染而腐败变质，并导致食物中毒和食源性疾病影响人类健康。采用防腐剂抑制腐败菌与食源性致病菌是贮藏食品的有效手段之一。常见的食源性致病菌种类繁多，其中包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中，是常见的革兰阳性球菌。在美国和加拿大由它产生的耐热肠毒素引起的食物中毒分别约占细菌性食物中毒事件33%和45%。由它引起的细菌性食物中毒仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌引起的食物中毒。随着生物学和微电子学发展，免疫学和分子生物学等方面都为金黄色葡萄球菌快速检测提供了更加高效的手段。但因需要其昂贵的仪器设备和专业的技术人才，遏制了国内对金黄色葡萄球菌检测的实际需求。显色培养基技术是近年来发展的具有操作简捷、经济实用等特点的生化快速检测方法，但培养基中添加的抑菌物质等经常会影响目标菌的生长及产生的特异性物质。因此，需要研究一种新型的培养基成分，为金黄色葡萄球菌快速检测培养基的研制奠定基础。

自古以来，桑蚕业就在中国的农业中占有着重要地位，我国是世界上最早且最大的养蚕缫丝的国家。2014年，我国蚕茧年产量据报道有65万吨左右，约占世界总产量的80%。蚕蛹是将蚕茧缫丝后的副产物，一般每生产1吨生丝会产出0.8吨的干蛹，因而蚕蛹产量十分巨大。现代科学研究发现，蚕蛹富含蛋白质、脂肪、甲壳素、糖类以及多种蛋白激素、维生素、微量元素等生物活性成分，具有很高的营养、药用价值和广阔的市场前景。蚕蛹中的蛋白质在所有成分中的含量最高，含水量在4-6%的干蚕蛹中，蛋白质含量为50-65%左右，油脂约占23-30%，甲壳素含量约为2-3%，并富含糖类、多种维生素、丰富的微量元素及抗菌肽等生物活性成分等。因而蚕蛹在食品、饲料、化工等领域有着广泛的应用。而由于缺少深加工技术，大部分蚕蛹被用于饲料及肥料，附加值一直较低。蚕蛹提出得到的提取物中含有蚕蛹蛋白，可制备皮革揩光剂、粘胶剂、微生物培养基等，使蚕蛹资源得到了进一步的开发与利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方法简单可行，脱脂效率高，提取物中蛋白得率高、纯度高、活性高、分子量较为集中、易于被革兰氏阳性菌吸收利用，易于工业化生产的用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，包括脱脂和酶解，其具体步骤为：

脱脂：按料液比为1:4-6（g/mL）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在35-45℃下脱脂20-30min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在50-70℃下烘干，备用，该脱脂步骤具有脱脂率高、溶剂无残留、无毒不易燃、蛋白质不变形等优点，同时脱脂剂容易回收，能够降低脱脂成本；

酶解：按料液比为1:20-30（g/mL）向脱脂蚕蛹中加入pH为7.5-8.5的磷酸缓冲液，再加入脱脂蚕蛹重量2-4%的中性蛋白酶，在45-55℃下酶解50-60min，然后将温度升至90-100℃，保温10-20min进行灭酶，冷却后在温度为1-5℃、转速为8000-10000rpm的离心机中离心8-10min，上清液喷雾干燥，即得蚕蛹提取物，酶法水解安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制，得到的蚕蛹提取物中含有大量的蚕蛹蛋白，该蚕蛹提取物松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，这种网状多孔结构适合于培养革兰氏阳性菌，能够为革兰氏阳性菌提供充足的碳源和氮源，加快革兰氏阳性菌的吸收利用，增强菌种的分裂能力，使菌种生长速度快，长势强，粗壮、密集，且能够避免革兰氏阴性菌的出现，提高革兰氏阳性菌的纯度。

作为优选，脱脂步骤中脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物，其比例为100:2.2-2.7，柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.3-0.4，该脱脂剂的脱脂效果好，能使得蚕蛹中的油脂迅速向外部表面扩散，在较短时间内快速溶出到脱脂剂中，脱脂效率高，不需要重复脱脂即可达到目的，而柠檬烯的加入能提高蚕蛹油在脱脂溶剂中的饱和度，进而减少脱脂剂的用量，而左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的合理比例可保证蛋白的结构不易变形，进而保证其活性不被破坏。

作为优选，酶解步骤中磷酸缓冲液中含有0.03-0.05%柠檬酸钠和0.01-0.02%苯甲酸钠，柠檬酸钠和苯甲酸钠的加入一方面能够协同磷酸缓冲液温度酶解体系的pH，能够使得酶与蚕蛹复合物快速分解，快速释放出蛋白和酶，保证酶分子活性部位上相关基团的稳定性，提高反应体系的反应速率，另一方面可使更多的酶深入到蚕蛹蛋白内部促进蛋白质的水解，提高蚕蛹蛋白的水解度，且使获得的蛋白的分子量较为集中，利于蛋白的吸收利用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1）本发明蚕蛹提取物的制备方法简单可行，脱脂效率高，提取物中蛋白得率高、纯度高、活性高、分子量较为集中、易于被革兰氏阳性菌吸收利用，易于工业化生产，安全性更高，大大提高蚕蛹附加值；2）该制备方法得到的提取物适合于培养革兰氏阳性菌，能够为革兰氏阳性菌提供充足的碳源和氮源，加快革兰氏阳性菌的吸收利用，增强菌种的分裂能力，使菌种生长速度快，长势强，粗壮、密集，且能够避免革兰氏阴性菌的出现，提高革兰氏阳性菌的纯度；3）本发明用脱脂剂的脱脂效果好，脱脂效率高，不需要重复脱脂即可达到目的，且脱脂剂的用量少，可保证蛋白的结构不易变形，进而保证其活性不被破坏；4）本发明用磷酸缓冲液能够使得酶与蚕蛹复合物快速分解，快速释放出蛋白和酶，保证酶分子活性部位上相关基团的稳定性，提高反应体系的反应速率，同时可使更多的酶深入到蚕蛹蛋白内部促进蛋白质的水解，且使获得的蛋白的分子量较为集中。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，包括脱脂和酶解，其具体步骤为：

1）脱脂：按料液比为1:6（g/mL）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在35℃下脱脂30min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在50℃下烘干，备用，该脱脂步骤具有脱脂率高、溶剂无残留、无毒不易燃、蛋白质不变形等优点，同时脱脂剂容易回收，能够降低脱脂成本；

2）酶解：按料液比为1:30（g/mL）向脱脂蚕蛹中加入pH为7.5的磷酸缓冲液，再加入脱脂蚕蛹重量4%的中性蛋白酶，在45℃下酶解60min，然后将温度升至90℃，保温20min进行灭酶，冷却后在温度为1℃、转速为10000rpm的离心机中离心8min，上清液喷雾干燥，即得蚕蛹提取物，酶法水解安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制，得到的蚕蛹提取物中含有大量的蚕蛹蛋白，该蚕蛹提取物松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，这种网状多孔结构适合于培养革兰氏阳性菌，能够为革兰氏阳性菌提供充足的碳源和氮源，加快革兰氏阳性菌的吸收利用，增强菌种的分裂能力，使菌种生长速度快，长势强，粗壮、密集，且能够避免革兰氏阴性菌的出现，提高革兰氏阳性菌的纯度。

步骤1中脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物，其比例为100:2.2，柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.4，该脱脂剂的脱脂效果好，能使得蚕蛹中的油脂迅速向外部表面扩散，在较短时间内快速溶出到脱脂剂中，脱脂效率高，不需要重复脱脂即可达到目的，而柠檬烯的加入能提高蚕蛹油在脱脂溶剂中的饱和度，进而减少脱脂剂的用量，而左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的合理比例可保证蛋白的结构不易变形，进而保证其活性不被破坏。

步骤2中磷酸缓冲液中含有0.03%柠檬酸钠和0.02%苯甲酸钠，柠檬酸钠和苯甲酸钠的加入一方面能够协同磷酸缓冲液温度酶解体系的pH，能够使得酶与蚕蛹复合物快速分解，快速释放出蛋白和酶，保证酶分子活性部位上相关基团的稳定性，提高反应体系的反应速率，另一方面可使更多的酶深入到蚕蛹蛋白内部促进蛋白质的水解，提高蚕蛹蛋白的水解度，且使获得的蛋白的分子量较为集中，利于蛋白的吸收利用。

实施例2：

用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，包括脱脂和酶解，其具体步骤为：

1）脱脂：按料液比为1:4（g/mL）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在45℃下脱脂20min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在70℃下烘干，备用，上述脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物，其比例为100:2.7，柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.3；

2）酶解：按料液比为1:20（g/mL）向脱脂蚕蛹中加入pH为8.5的磷酸缓冲液，再加入脱脂蚕蛹重量2%的中性蛋白酶，在55℃下酶解50min，然后将温度升至100℃，保温10min进行灭酶，冷却后在温度为5℃、转速为8000rpm的离心机中离心10min，上清液喷雾干燥，即得蚕蛹提取物，上述磷酸缓冲液中含有0.05%柠檬酸钠和0.01%苯甲酸钠。

实施例3：

用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，包括脱脂和酶解，其具体步骤为：

1）脱脂：按料液比为1:5（g/mL）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在40℃下脱脂25min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在60℃下烘干，备用，上述脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物，其比例为100:2.5，柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.35；

2）酶解：按料液比为1:25（g/mL）向脱脂蚕蛹中加入pH为8.0的磷酸缓冲液，再加入脱脂蚕蛹重量3%的中性蛋白酶，在50℃下酶解55min，然后将温度升至95℃，保温15min进行灭酶，冷却后在温度为2℃、转速为9000rpm的离心机中离心9min，上清液喷雾干燥，即得蚕蛹提取物，上述磷酸缓冲液中含有0.04%柠檬酸钠和0.015%苯甲酸钠。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，包括脱脂和酶解，其特征在于：所述酶解：向脱脂蚕蛹中加入含有柠檬酸钠和苯甲酸钠的磷酸缓冲液，再加入中性蛋白酶，酶解，灭酶，冷却后离心，上清液喷雾干燥，即得蚕蛹提取物。

2.根据权利要求1所述的用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，其特征在于：所述脱脂蚕蛹和磷酸缓冲液的料液比为1:20-30（g/mL），所述磷酸缓冲液的pH为7.5-8.5，磷酸缓冲液中含有0.03-0.05%柠檬酸钠和0.01-0.02%苯甲酸钠。

3.根据权利要求1所述的用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，其特征在于：所述中性蛋白酶的添加量为脱脂蚕蛹重量的2-4%，酶解温度为45-55℃、时间为50-60min。

4.根据权利要求1所述的用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，其特征在于：所述脱脂步骤为：按料液比为1:4-6（g/mL）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在35-45℃下脱脂20-30min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在50-70℃下烘干，备用。

5.根据权利要求4所述的用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，其特征在于：所述脱脂步骤中脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物。

6.根据权利要求5所述的用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，其特征在于：所述脱脂剂中正己烷和柠檬烯的比例为100:2.2-2.7。

7.根据权利要求5或6所述的用于革兰氏阳性菌培养基的蚕蛹提取物的制备方法，其特征在于：所述柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.3-0.4。