CN111154659A - 一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法 - Google Patents

一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法 Download PDF

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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

本发明公开了一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法，步骤：在PDA斜面固体培养基上于25℃条件下培养7d完成蝉拟青霉4606菌种活化；转接至装有50ml液体培养基的150ml三角瓶中，25℃，150r/min，振荡培养72h～96h；菌体呈球状且均匀分布于锥形瓶内时，将所得种子菌体按照相应的接种量需求接种到装有150ml液体培养基的500ml三角瓶中，25℃，150r/min，振荡培养72h～96h；菌体呈球状均匀分布于锥形瓶内时，离心取沉淀物称重获得生物量。本发明采用蝉拟青霉4606作为实验对象，结合响应面法验证影响蝉拟青霉液体培养下生物量变化的因素和参数设定范围，得到一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法。

Description

一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法
技术领域
本发明属于微生物液体培养条件优化，具体地涉及一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法。
背景技术
蝉拟青霉Paecilomyces cicadae是我国的一种传统中药材，在功效上与冬虫夏草极为相似，且与冬虫夏草的无性型同属。蝉拟青霉胞内含有多种具有应用价值的物质，比如虫草多糖、腺苷、氨基酸、虫草素、麦角甾醇以及必需氨基酸等，这些物质通常作为保健品以及部分药品的成分，因此蝉拟青霉具有滋补强壮、抗疲劳应激、解热镇痛、镇静催眠等多种医用效果，对该真菌进行更深层次的研究有助于开发出更多低成本保健品以及医用药品。通过优化液体培养条件，提升蝉拟青霉培养效率，增大其生物量，可以为其研究提供丰富的试验材料。
目前，关于蝉拟青霉液体培养条件优化的报道很少，在已有的研究报道中，大多以正交试验方法为基础展开对蝉拟青霉液体培养条件的优化。本申请以纯净无污染的高产菌株蝉拟青霉4606为原料，采用响应面法优化蝉拟青霉液体培养条件，确定液体培养的最佳条件，旨在为蝉拟青霉的进一步研究以及开发利用提供技术参数和理论指导。
发明内容
本发明的目的在于通过响应面法优化蝉拟青霉液体培养条件，确定最佳液体培养条件。
本发明的目的是采取以下技术方案达到的：
一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法，包括以下步骤：在PDA斜面固体培养基上于25℃条件下培养7d完成蝉拟青霉4606菌种活化；转接至装有50ml液体培养基的150ml三角瓶中，在25℃，150r/min条件下，振荡培养72h～96h；待菌体呈球状且均匀分布于锥形瓶内时，将所得种子菌体按照相应的接种量需求接种到装有150ml液体培养基的500ml三角瓶中，在25℃，150r/min条件下，振荡培养72h～96h；菌体呈球状均匀分布于锥形瓶内时，离心取沉淀物称重获得生物量；其中最佳液体培养条件为：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏2g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO40.5g/L、接种量6.65％、pH为6.00、温度24.01℃。
本发明是采用蝉拟青霉4606作为实验对象，结合响应面法逐步验证影响蝉拟青霉液体培养下生物量的因素和参数设定范围，最终得到一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法。
附图说明
图1是PH和接种量对蝉拟青霉生物量的影响结果。
图2是温度和接种量对蝉拟青霉生物量的影响结果。
图3是PH和温度对蝉拟青霉生物量的影响结果。
具体实施方式
本发明是通过以下实施例得出的：
一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法，包括以下步骤：
在PDA斜面培养基上于25℃条件下培养7d完成菌种活化；转接至装有50ml最适培养基的150ml三角瓶中，在25℃，150r/min条件下，振荡培养72h～96h；待菌体呈球状且均匀分布于锥形瓶中时，将种子按照不同的接种量需求接种到装有150ml最适培养基的500ml三角瓶中，在25℃，150r/min条件下，振荡培养72h～96h；菌体呈球状均匀分布于锥形瓶中时，将菌丝离心，取沉淀物称重获得生物量。
通过单因素试验确定葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、接种量、pH、温度作为试验影响因子。
1、Plackett-Burman试验
利用Minitab软件创建Plackett-Burman试验,将影响蝉拟青霉生物量的8个影响因子分别取高(1)低(-1)两个水平进行分析，然后比较各因素2个不同水平的差异和整体的差异性以确定各因素对培养条件的显著性。用于考察试验误差各因素所代表的参数和水平见表1，试验设计见表2。
表1 Plackett-Burman试验设计筛选因素和水平
Figure BDA0002365910770000021
表2 the Plackett-Burman试验设计表
Figure BDA0002365910770000022
Figure BDA0002365910770000031
表3筛选生物量的Plackett-Burman试验设计分析表
Figure BDA0002365910770000032
根据表3，接种量、PH、温度三个试验影响因素的P值均小于0.05，可作为可信度较大的试验影响因素进入下一步的优化。
2、最陡爬坡试验：
在PB两水平法基础上得出主要的影响因素有接种量、pH和温度，以这三个因素的变化为爬坡方向进行设计，根据各个因素的试验值变化的梯度方向和步长，逼近最佳值范围。设计试验表及结果见表4。
表4最陡爬坡试验设计表和结果
Figure BDA0002365910770000033
根据表3结果显示，显著影响因素条件组合为：接种量(7％)、pH(6.00)、温度(25℃)时，生物量达到最高值31.1386g，即最好的试验优化点就在接种量(7％)、pH(6.00)、温度(25℃)附近。在接下来的试验中，以该条件作为试验因素中心进行试验设计。
3、Box-Behnken试验
对接种量、pH和温度分别取三个水平进行变量分析，其余变量均取平均值，共设计17个点，试验设计表及结果见表5。
表5 Box-Behnken试验设计表和结果
Figure BDA0002365910770000034
Figure BDA0002365910770000041
利用Minitab对Box-Behnken试验结果进行统计分析，可以得到回归方程系数显著性检验结果和方差分析结果，详见表6、表7。基于表6根据Minitab软件可得到拟合的二阶模型公式，即：Y＝34.43-2.27*A-0.012*B-9.60*C-1.53*AB+3.79*AC+1.78*BC-4.99*A2-6.89*B2-16.68*C2。
表6 Box-Behnken试验回归结果分析
Figure BDA0002365910770000042
表7二元回归模型方差分析
Figure BDA0002365910770000043
根据表6，模型中的C-温度、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.050，表明模型的线性、平方对于试验的影响是显著的，但交互影响不显著。根据表7，模拟失拟检验的P值为0.1929，明显大于0.050，表明回归模拟没有失拟现象。确定系数R2值为0.9753，表明模型拟合情况较好，可以对试验结果进行预测。
4、各因素交互作用分析
基于以上拟合回归方程，通过Minitab进行分析得出响应曲面图。将其中一个因素固定于零水平，研究其余两因素的交互效应，结果见图1、图2、图3。由表5可知，接种量、pH值、温度对蝉拟青霉液体培养生物量均有较大影响，尤其是pH，根据二次回归方程，通过响应曲面分析法建立各因素与响应值之间的响应立体图，可以直观地反映局部参数值和整体响应值之间的交互对应关系，如图1、图2、图3所示。由图1可知，接种量和pH值均直接影响蝉拟青霉液体培养生物量。在中心位置即接种量为7.00％，pH为6.00时，蝉拟青霉液体培养生物量达到最高。从图2可以看出，温度对蝉拟青霉液体培养生物量影响较为明显，蝉拟青霉液体培养生物量随着温度的增加而增加，增加趋势明显，但一旦超过24℃，生物量又随着温度的降低而急剧减少，而接种量对于生物量的影响不明显。图3结果表明，温度和pH值的交互作用中，温度对蝉拟青霉液体培养下生物量的影响更为明显，而pH比对蝉拟青霉生物量的影响不大。
5、二次回归模型的检验
通过上述试验，得到初步最佳液体培养条件为：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏2g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO40.5g/L、接种量7.00％、pH为6.00、温度25℃。通过进一步计算，将其修正为：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏2g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO40.5g/L、接种量6.65％、pH为6.00、温度24.01℃，在该条件下的生物量理论值为36.4048g。为了验证响应面模型的可行性，按照前面修正后所得到的最优液体培养基条件下培养3天后，离心取沉淀称重分析，重复3次，取平均值，得到生物量为35.9213g，接近于模型预测值36.4048g。最优条件模型验证结果相较于前的生物量提高了162.79％。验证试验结果与理论预测值相差不大，且经优化后的培养方法进行培养的蝉拟青霉其生物量得到明显提升，表明响应面优化工艺参数具有可靠性。
本发明是采用蝉拟青霉4606作为实验对象，结合响应面法逐步验证影响蝉拟青霉液体培养下生物量的因素和参数设定范围，最终得到一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法。

Claims (1)

1.一种提高蝉拟青霉生物量的液体培养方法，包括以下步骤：在PDA斜面固体培养基上于25℃条件下培养7d完成蝉拟青霉4606菌种活化；转接至装有50ml液体培养基的150ml三角瓶中，在25℃，150r/min条件下，振荡培养72h～96h；待菌体呈球状且均匀分布于锥形瓶内时，将所得种子菌体按照相应的接种量需求接种到装有150ml液体培养基的500ml三角瓶中，在25℃，150r/min条件下，振荡培养72h～96h；菌体呈球状均匀分布于锥形瓶内时，离心取沉淀物称重获得生物量；
其中最佳液体培养条件为：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏2g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO40.5g/L、接种量6.65%、pH为6.00、温度24.01℃。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242079A (zh) * 2010-05-14 2011-11-16 浙江泛亚生物医药股份有限公司 一种生产蝉拟青霉孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用
CN103349286A (zh) * 2010-05-14 2013-10-16 浙江泛亚生物医药股份有限公司 一种蝉拟青霉的发酵产物的用途
CN104046570A (zh) * 2014-06-13 2014-09-17 浙江省林业科学研究院 一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242079A (zh) * 2010-05-14 2011-11-16 浙江泛亚生物医药股份有限公司 一种生产蝉拟青霉孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用
CN103349286A (zh) * 2010-05-14 2013-10-16 浙江泛亚生物医药股份有限公司 一种蝉拟青霉的发酵产物的用途
CN104046570A (zh) * 2014-06-13 2014-09-17 浙江省林业科学研究院 一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张学秋等: "蝉拟青霉液体发酵条件优化", 《微生物学杂志》 *
李忠等: "蝉拟青霉深层发酵的研究", 《河北大学学报(自然科学版)》 *
艾仁丽等: "蝉拟青霉液体培养条件优化", 《生物技术》 *
蒋宁 等: ""应用响应面法优化蝉花液体发酵培养基"", 《中国菌物学会2016年学术年会》 *
谭艾娟 等: ""蝉拟青霉产透明质酸最佳液体培养基的筛选"", 《食品科学》 *

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