CN114836331A

CN114836331A - 一株产朊假丝酵母及其应用

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Publication number: CN114836331A
Application number: CN202210446390.XA
Authority: CN
Inventors: 刘占英; 余静; 崔金娜
Original assignee: Inner Mongolia University of Technology
Current assignee: Inner Mongolia University of Technology
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2042-04-26
Also published as: CN114836331B

Abstract

本发明公开了一株产朊假丝酵母及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供了产朊假丝酵母(Candida utilis)，其菌株号为Y‑4‑2，在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.62196。本发明还提供了所述产朊假丝酵母在制备单细胞蛋白中的应用。所述产朊假丝酵母的单细胞蛋白含量约为63％，较出发菌株提高了20.60％，通过性能稳定性试验发现连续传代12次后该突变株单细胞蛋白含量变化幅度不显著，证明其蛋白产量的遗传稳定性能良好，有望应用于发酵生产单细胞蛋白、菌体蛋白饲料或酵母培养物。

Description

一株产朊假丝酵母及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，主要涉及一株产朊假丝酵母及其应用。

背景技术

随着畜牧业的发展，我国蛋白饲料资源短缺的现象越来越严重，每年需从国外进口大量豆粕和鱼粉等蛋白饲料，导致饲料成本大幅度增加，粮食安全受到影响。因此急需一种蛋白饲料的替代品。单细胞蛋白(Single cell protein，SCP)由于其蛋白含量高达50％～85％，富含赖氨酸、蛋氨酸等多种必需氨基酸、营养物质丰富、生产不受季节和气候影响等特点被广泛用于食品加工和饲料行业，是解决蛋白饲料资源短缺和实现蛋白饲料资源替代的重要方式。目前生产饲用菌体蛋白的微生物多见于细菌、酵母、藻类、霉菌等微生物，细菌生产的菌体蛋白核酸含量较高且易受噬菌体污染；霉菌生产菌体蛋白产量较低且生产过程中可能会产生真菌毒素；藻类生产菌体蛋白的生产成本较高、工艺复杂且易被病原菌污染；而酵母菌生产菌体蛋白产量较高、菌体体积较大、易分离回收且生产成本较低。目前，酵母菌是生产单细胞蛋白的微生物类群中最受关注的一类，也是应用最为广泛的一类。其中产朊假丝酵母作为美国FDA认证的安全生物(Generally Regarded as Safe，GRAS)，菌体蛋白含量较高、生长速度较快，对生长条件要求较低，适应性较强且富含多种营养物质，可用作饲料添加剂酵母应用于蛋白饲料的生产。

产朊假丝酵母生产单细胞蛋白具有良好的市场前景，为提高产朊假丝酵母菌体蛋白含量，可以利用基因重组、定点诱变等现代生物技术以及传统的诱变育种手段。与基因工程等方法相比，诱变育种具有安全性高、突变率高和操作简便等优点，同时，最重要的是通过诱变育种改造的菌种可以直接应用于饲料工业，而基因工程改造的菌种则不可以直接应用。目前，诱变育种在产朊假丝酵母中的研究较多，如张立宏等通过紫外诱变产朊假丝酵母，得到一株蛋白产量高达8.43g/L的突变菌株。王程等通过紫外诱变酿酒酵母，得到1株高产SCP的诱变菌株SY-5-7，比出发菌株高7.84％，达到48.67％。传统的物理诱变和化学诱变虽然在菌体蛋白含量提高方面取得了一定的效果，但由于紫外线、x射线、γ射线、激光和化学诱变剂等传统诱变源的反复利用，导致许多工业菌株产生了“耐受性”，再无提高的空间。重离子束作为一种新的辐射诱变育种源，为探索高效育种，提升育种技术，开创了一条新途径，可以克服传统诱变方式对菌种造成的“耐受性”。此外，重离子辐照诱变具有突变率高、突变谱广、不易回复突变等优点，已经在一些微生物诱变育种方面取得较好的效果。本研究利用¹²C⁶⁺重离子束流对产朊假丝酵母进行诱变选育，最终获得高蛋白含量且性能稳定的正突变株，以期对高蛋白含量酵母菌株的选育和应用提供新思路，同时为产朊假丝酵母作为生产单细胞蛋白和蛋白饲料等的菌种奠定理论及应用基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何通过新型诱变剂的诱变选育获得高菌体蛋白含量的产朊假丝酵母并制备单细胞蛋白。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供产朊假丝酵母，所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母(Candida utilis)，其菌株号为Y-4-2，在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：62196。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供应用，所述应用可为A1)或A2)：

A1)上述的产朊假丝酵母在制备单细胞蛋白中的应用；

A2)上述的产朊假丝酵母在制备产生单细胞蛋白的产品中的应用，例如菌体蛋白饲料；

A3)上述的产朊假丝酵母在制备酵母培养物中的应用。

单细胞蛋白，也叫微生物蛋白或菌体蛋白，是以可再生碳源等为原料通过发酵培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。单细胞蛋白中重要的是酵母蛋白、细菌蛋白和藻类蛋白，它们的化学组成中一般以蛋白质为主。

为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供用于制备单细胞蛋白的菌剂，所述菌剂含有上述的产朊假丝酵母。

上述菌剂的活性成分可为上述产朊假丝酵母或/和上述产朊假丝酵母的代谢物(如发酵产物)，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。

术语“发酵产物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。

所述菌剂可为制备单细胞蛋白的菌剂。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供菌剂的制备方法，所述方法可包括用培养基培养上述的产朊假丝酵母，收集发酵产物，将所述发酵产物作为菌剂的成分的步骤。

上述制备方法中，所述发酵产物是将上述产朊假丝酵母Y-4-2在微生物培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。

进一步地，上述的制备方法中，所述培养基可为YPD培养基，所述YPD培养基的组成可为：胰蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、酵母提取粉5g/L，其余为水。

为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供上述的产朊假丝酵母或上述的菌剂在制备单细胞蛋白中的应用。

为解决上述技术问题，第六个方面，本发明提供上述的产朊假丝酵母或上述的菌剂在制备饲料中的应用。

所述饲料可为蛋白饲料。

为解决上述技术问题，第七个方面，本发明提供制备单细胞蛋白的方法，所述方法可包括用培养基培养上述的产朊假丝酵母或上述的菌剂，收集发酵产物，从发酵产物中收集菌体的步骤。

进一步地，上述的方法中，所述培养基为YPD培养基，所述YPD培养基的组成可为：胰蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、酵母提取粉5g/L，其余为水。

进一步地，上述的方法中，所述培养条件可为30℃、180r/min培养48小时。

上述方法中，所述发酵产物是将上述产朊假丝酵母Y-4-2或上述菌剂在微生物培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。

所述单细胞蛋白可为酵母蛋白。所述酵母蛋白可为来源于酵母菌体的蛋白质。

本发明取得的有益技术效果如下：

本发明以产单细胞蛋白的9株产朊假丝酵母为出发菌株，从生长速度、单细胞蛋白含量、木糖利用情况等多方面进行综合筛选，最终选择CGMCC 2.2878作为出发菌株进行¹²C⁶ ⁺离子束辐照诱变，通过初筛和复筛选育出稳定性好、蛋白含量高的目的菌株Y-4-2，菌株Y-4-2的蛋白含量为63％，较出发菌株提高了20％。选育出的菌株适用于单细胞蛋白、酵母培养物和蛋白饲料的生产。

保藏说明

菌种名称：Candida utilis Y-4-2

拉丁名：Candida utilis

菌株编号：Y-4-2

保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心

保藏机构简称：GDMCC

地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼

保藏日期：2022年01月10日

保藏中心登记入册编号：GDMCC No:62196

附图说明

图1为9株产朊假丝酵母的生长曲线。

图2为菌株致死率和正突变率曲线。

图3为诱变选育的产朊假丝酵母Y-4-2菌体蛋白产量性能稳定性实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中，编号分别为CICC 32834、CICC 32618、CICC 31856、CICC 31188、CICC31494的产朊假丝酵母(Candida utilis)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；编号分别为CGMCC 2.2878、CGMCC 2.2951、CGMCC 2.569、CGMCC2.615的产朊假丝酵母(Candida utilis)购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

本发明中，葡萄糖，分析纯；胰蛋白胨，生化试剂；酵母提取粉，生化试剂；尿素，化学纯；木糖，分析纯；(NH₄)₂SO₄，化学纯；KH₂PO₄，分析纯；MgSO₄·7H₂O，分析纯；NaCl，分析纯；琼脂，分析纯；以上试剂购自国药集团化学试剂有限公司；工业硫酸铵为工业级药品，购自内蒙古阜丰生物科技有限公司。

培养基的配制方法如下：

YPD培养基由下述原料制成(g/L)：胰蛋白胨10、葡萄糖10、酵母提取粉5，其余为水。YPD固体培养基添加2％的琼脂。

基础培养基由下述原料制成(g/L)：葡萄糖2、胰蛋白胨2、磷酸二氢钾0.1、七水合硫酸镁0.05、氯化钠0.01，其余为水。

发酵培养基由下述原料制成(g/L)：葡萄糖10、胰蛋白胨10、酵母提取粉5、硫酸二氢钾0.1、七水合硫酸镁0.05、氯化钠0.01，其余为水。

以上培养基pH均为自然，葡萄糖单独115℃灭菌30min，其余成分121℃灭菌20min，使用之前混合。

下述实施例中，如无特殊说明，每组实验3个平行样，数据结果均用平均值±标准偏差表示，实验数据采用SAS 9.4进行方差分析，以P＜0.05和P＜0.01为依据判断差异显著性；同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)，同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

实施例1、出发菌株的筛选

9株产朊假丝酵母出发菌株的编号分别为CICC 32834、CICC 32618、CICC 31856、CICC 31188、CICC 31494、CGMCC 2.2878、CGMCC 2.2951、CGMCC 2.569、CGMCC 2.615。

1.1、生长曲线

将9株产朊假丝酵母的菌种分别活化后，以体积比1％的接种量接至YPD液体培养基中，30℃、180r/min培养24小时，期间每隔2h测定样品在波长600nm处的OD值。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制菌体生长曲线。

通过测定9株产朊假丝酵母在YPD培养基发酵不同时间的OD₆₀₀(在波长600nm处的OD值)，发现9株产朊假丝酵母生长趋势基本一致。即在0-6h左右为菌株生长的延迟期；在6-20h菌株OD值大幅增加，表明菌株生长进入对数期；在20h后菌株生长趋势平缓进入稳定期，且24h后尚未进入衰亡期，因此确定9株酵母菌最佳培养时间为24h，结果见图1。通过生长曲线的测定，可以判断菌株的生长代谢规律，以便更好地调控发酵过程，以及确定最佳接种时间等。在相同培养条件下，菌株生长速度越快且菌体浓度越大，则在产菌体蛋白方面和应用上越具有优势。

1.2、氮源种类对菌体蛋白含量的影响

基础培养基的配方为(g/L)：葡萄糖2、胰蛋白胨2、磷酸二氢钾0.1、七水合硫酸镁0.05、氯化钠0.01。

将基础培养基中胰蛋白胨的氮元素根据等量换算关系，分别用相同氮含量的化学纯硫酸铵、工业级的工业硫酸铵、化学纯尿素分别代替，其余条件不变，获得的培养基命名为氮源筛选培养基。

将9株产朊假丝酵母的菌种分别活化后，以1％的接种量分别接种至选择培养基和氮源筛选培养基中。于30℃、180r/min培养24h，以未接种培养基作空白，测定样品的OD₆₀₀值。

不同氮源对9株产朊假丝酵母发酵24h的OD₆₀₀(在波长600nm处的OD值)的影响见表1。9株酵母菌初始OD₆₀₀均在0.038-0.055之间。由表1可知，无机氮和有机氮产朊假丝酵母均能利用，9株产朊假丝酵母在化学纯硫酸铵和工业级的工业硫酸铵中均生长良好，二者之间无显著差异(P＞0.05)，当以工业硫酸铵为唯一氮源的时候，Candida utilis CGMCC2.2878生长最好。由于工业级的工业硫酸铵一吨900元，化学纯的硫酸铵一吨15600元，选择以工业硫酸铵利用效果作为菌株筛选的指标。

表1.不同氮源对9株产朊假丝酵母的OD₆₀₀的影响

注：因分析纯硫酸铵和工业硫酸铵纯度不同，添加时需要换算(工业硫酸铵纯度为80％)，同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)，同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，下表同。

1.3、木糖利用情况

基础培养基的配方为(g/L)：葡萄糖2、胰蛋白胨2、磷酸二氢钾0.1、七水合硫酸镁0.05、氯化钠0.01，其余为水。

将基础培养基中葡萄糖用木糖代替，其余条件不变，命名为木糖培养基。

将9株产朊假丝酵母的菌种分别活化后，以1％的接种量分别接种至基础培养基和木糖培养基中。于30℃、180r/min培养24h，以未接种培养基作空白，测定样品的OD₆₀₀(在波长600nm处的OD值)。

由表2可知，9株产朊假丝酵母在葡萄糖和木糖中均能生长，当以木糖为唯一碳源的时候，Candida utilis CGMCC 2.2878生长最好。在蛋白饲料生产中，原料中半纤维素和纤维素被降解为木糖和葡萄糖，既可以作为碳源供酵母菌生长利用，又达到改善饲料原料的适口性使其易被消化以及提高营养价值的目的。所以，在菌株筛选时以木糖利用效果作为菌株筛选的指标。

表2.葡萄糖和木糖作为碳源时9株产朊假丝酵母菌的生长情况(OD₆₀₀)

注：表中肩标含义同表1。

1.4、菌体生物量及蛋白含量

将9株产朊假丝酵母菌分别活化后，以体积比1％的接种量接种至YPD液体培养基中，30℃、180r/min培养48小时，测定菌体生物量和菌体蛋白含量。

将菌悬液在8000r/min离心5min，弃去上清液，用无菌水洗涤菌体，在8000r/min离心5min，弃去上清液，连续洗涤3次，收集菌体，90℃烘至恒重，测定样品质量(干重)，该质量即为产朊假丝酵母的生物量。

根据GB/T 6432-2018方法检测样品中粗蛋白含量，该蛋白含量即为单细胞蛋白含量(菌体蛋白含量)。

式中：V₂—滴定样品消耗的标准盐酸溶液体积mL；V₁—空白对照所需的标准盐酸溶液体积mL；C—标准盐酸溶液的浓度；m—试样的质量g；V—试样消解液总体积mL；V＇—蒸馏用消解液体积mL；0.0140—每毫克当量氮的克数；6.25—氮换算成蛋白质的平均系数。

9株产朊假丝酵母的生物量和粗蛋白含量见表3。由表3可知，9株酵母菌的粗蛋白含量均在45％-60％之间，Candida utilis 2.2951粗蛋白含量最高，为57.85％。

表3.9株产朊假丝酵母的生物量和粗蛋白含量

1.5、综合评分

考虑到实验目标以菌株粗蛋白含量为指标，木糖和工业硫酸铵利用能力为次要，所以采用加权平均数的方法对9株产朊假丝酵母菌进行评价。由表4可知，在9株产朊假丝酵母中，CGMCC 2.2878排名第一，表明其在木糖、工业硫酸铵利用及单细胞蛋白含量综合评分最好，确定为后续诱变育种的出发菌株。

由表2可知，酵母在以木糖为唯一碳源时的生长情况差异较大，赋予0.3的权重；研究发现，产朊假丝酵母对硫酸铵、尿素等无机氮均能利用，且由表1可知，9株酵母在以工业硫酸铵为唯一氮源时的生长情况差异不大，则赋予0.2的权重；实验主要以筛选高蛋白含量菌株为主要目标，则对粗蛋白含量情况赋予0.5的权重。设计加权平均数＝0.3A+0.2B+0.5C(木糖利用能力用A表示，工业硫酸铵利用能力用B表示，粗蛋白含量用C表示)，对9株产朊假丝酵母进行综合评分，从而选择最优的菌株。

由表4可见，排名较高的产朊假丝酵母菌株分别是CGMCC 2.2878、CGMCC 2.2951和CICC 31856。

表4.9株产朊假丝酵母在生产单细胞蛋白方面的潜质排名

实施例2、辐照诱变获得突变株

2.1、辐照诱变

使用中科院近代物理研究所兰州重离子加速器国家实验室的兰州重离子研究装置(HIRFL)进行辐照诱变。将培养11h(OD₆₀₀＝4)的CGMCC 2.2878菌液，分别取2mL装入无菌辐照皿，封口膜密封，经80MeV/u的¹²C⁶⁺离子束辐照，辐照剂量依次为0Gy、40Gy、80Gy、120Gy、160Gy、200Gy。每个剂量3个平行，1个空白对照。

2.2、致死率和正突变率的计算

将不同剂量的菌液稀释到最适浓度10^-5涂布到YPD固体培养基上，30℃培养24h后菌落计数，按以下公式计算致死率：

将诱变后的菌液，稀释至最适浓度10^-5，吸取菌液40μL，在YPD固体培养基上涂布，30℃培养36-48h。挑选菌落直径较大的菌落转接至YPD液体培养基，于30℃、180r/min培养48h，测定最大菌体浓度(OD₆₀₀)，菌体浓度高于原始菌株的计为正突变株。

不同辐照剂量下产朊假丝酵母的致死率和正突变率如图2所示。由图2可知，随着辐照剂量的增加，Candida utilis CGMCC 2.2878致死率曲线随着辐照剂量的增大而先增大后降低，呈典型的“马鞍形”，当辐照剂量为120Gy时，致死率最大，为77.67％，同时正突变率在120Gy时最高，为28％。当低剂量的重离子辐照产朊假丝酵母时，细胞内DNA会受到损伤致使双键断裂，致死率增大。但随着辐照剂量的增加，细胞及其损伤DNA又在其修复系统的作用下能够得到不同程度的修复，所以致死率逐渐降低。

实施例3、突变菌株的初筛和复筛

3.1、突变菌株初筛

对不同剂量诱变处理后的菌液，稀释至最佳梯度10^-5，吸取菌液40μL，滴加到YPD固体培养基上均匀涂布，倒置培养36-48h。挑选出菌落直径大的菌落转接至YPD液体培养基，于30℃、180r/min培养48h，通过测定菌液OD₆₀₀(在波长600nm处的OD值)判断菌体生长速度，选出生长速度较快及菌体蛋白较高的菌株留待复筛。

从2650株中筛选出26株比原菌株直径大的菌株，液体培养结果如表5所示，筛选出20株诱变菌株用作进一步的复筛。

表5.初筛菌落直径及OD₆₀₀

3.2、复筛

将初筛得到的20株菌株按照实施例1.4的方法进行生物量及粗蛋白含量的测定，结果见表6所示。由表6可以看出，发生正突变的5株诱变菌株的粗蛋白含量较出发菌株的粗蛋白含量均有不同程度的提高。其中，在辐照剂量达到120Gy时，得到一株粗蛋白含量最高的正突变菌株，将其命名为产朊假丝酵母Y-4-2，简称为Y-4-2，其粗蛋白含量达到63.06％，与出发菌株CGMCC 2.2878粗蛋白含量52.29％相比，该菌株粗蛋白含量提高了20.60％。

筛选出的产朊假丝酵母Y-4-2于2022年01月10日在广东省微生物菌种保藏中心进行了专利程序的保藏，其保藏编号为GDMCC No.62196。

表6.复筛菌落生物量及其在发酵液中单细胞蛋白含量

3.3、诱变菌株遗传稳定性测试

对诱变菌株Y-4-2进行性能稳定性分析，连续培养12代，每隔2代按照GB/T6432-2018的方法检测粗蛋白含量(单细胞蛋白含量)。

连续培养12代的方法为：将筛选出的菌种记为0代。将0代菌液以1％的接种量接种于YPD液体培养基，在30℃、180r/min条件下培养11h(OD₆₀₀＝4)得到第一代种子液。将第一代种子液在以1％的接种量接种于YPD液体培养基，在30℃、180r/min条件下培养11h(OD₆₀₀＝4)得到第二代种子液，将第二代种子液以5％的接种量接种于YPD液体培养基，在30℃、转速180r/min条件下培养48h，测定粗蛋白含量。以此类推，测定0、2、4、6、8、10、12代的粗蛋白含量，并将每一代种子液甘油保存。

将待测定蛋白含量的菌悬液在8000r/min条件下离心5min，弃去上清液，用无菌水洗涤菌体3次后放入90℃烘箱内，烘至恒重，用恒重干燥法测定其重量，并测菌株粗蛋白含量(单细胞蛋白含量)。

测定菌体蛋白含量的结果见图3。由图3可知，菌株Y-4-2的单细胞蛋白含量约为63％，通过差异显著性分析可知，其差异不显著，证明菌株Y-4-2产单细胞蛋白的性能具有良好的稳定性。通过性能稳定性实验可知，重离子诱变选育的产朊假丝酵母Y-4-2的菌体蛋白含量具有很好的稳定性。

在单细胞蛋白生产中，菌体蛋白含量和菌体生长速度影响着最终单细胞蛋白的产量，同时培养基中的碳、氮源是制约菌体蛋白成本的关键因素，筛选出可高效利用廉价碳、氮源的菌株对菌体蛋白工业化生产至关重要。产朊假丝酵母繁殖速度较快，菌体蛋白含量较高，且能较好地同化五碳糖和无机氮源，因此是良好的单细胞蛋白生产菌种。本研究通过对9株产朊假丝酵母进行木糖利用能力比较时发现，9株酵母菌均能在以木糖为唯一碳源培养基中生长，说明产朊假丝酵母可以利用木糖。本研究通过比较9株酵母菌对不同氮源的利用情况发现，菌株在有机氮源中生长情况明显优于无机氮源。其中，以无机氮为唯一氮源时，9株菌工业硫酸铵和分析纯硫酸铵利用情况无差异但均优于尿素。在实际生产中，在保证产量最大化的同时控制生产成本至关重要，就两种硫酸铵的价格而言，一吨工业硫酸铵价格约为分析纯硫酸铵的1/25，说明在实际生产中以工业硫酸铵为氮源更适合。

同时，本研究考虑到实验目标以菌株蛋白含量为主要，木糖和工业硫酸铵利用能力为次要，则对不同影响因素赋予不同的权重，采用加权平均数的方法系统地对9株产朊假丝酵母进行评分，筛选出Candida utilis CGMCC 2.2878为后续诱变育种的出发菌株。本筛选方法在确定后续诱变育种的出发菌株的同时，也客观的评价了不同筛选条件对实验目标的影响。因此，此方法可以运用在今后菌株筛选的研究中。

重离子诱变在提高产朊假丝酵母菌体蛋白含量中发挥了重要作用，本研究通过重离子诱变选育得到一株高产单细胞蛋白菌株，其单细胞蛋白含量达到63.06％，与原始菌株52.29％相比，菌株蛋白含量提高了20.60％。

本研究通过对9株产朊假丝酵母出发菌株生长速度、木糖利用、工业硫酸铵利用及蛋白含量的综合评分，筛选出1株综合性能较好的菌株，为Candida utilis CGMCC 2.2878。通过重离子辐照诱变育种得到出一株遗传性状稳定的较出发菌株单细胞蛋白有明显提高的产朊假丝酵母突变菌株Y-4-2，其单细胞蛋白含量较出发菌株提高了20.60％，通过性能稳定性试验发现连续传代12次后该突变株单细胞蛋白含量变化幅度不显著，证明其稳定性较好，可用于单细胞蛋白、酵母培养物和蛋白饲料的生产。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims

1.产朊假丝酵母，其特征在于，所述为产朊假丝酵母(Candida utilis)，其菌株号为Y-4-2，在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：62196。

2.应用，其特征在于：所述应用为A1)或A2)：

A1)权利要求1所述的产朊假丝酵母在制备单细胞蛋白中的应用；

A2)权利要求1所述的产朊假丝酵母在制备产生单细胞蛋白的产品中的应用；

A3)权利要求1所述的产朊假丝酵母在制备酵母培养物中的应用。

3.用于制备单细胞蛋白的菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的产朊假丝酵母。

4.菌剂的制备方法，其特征在于：包括用培养基培养权利要求1所述的产朊假丝酵母，收集发酵产物，将所述发酵产物作为菌剂的成分的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述培养基为YPD培养基，所述YPD培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、酵母提取粉5g/L，其余为水。

6.权利要求1所述的产朊假丝酵母或权利要求3所述的菌剂在制备单细胞蛋白中的应用。

7.权利要求1所述的产朊假丝酵母或权利要求3所述的菌剂在制备饲料中的应用。

8.制备单细胞蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括用培养基培养权利要求1所述的产朊假丝酵母或权利要求2所述的菌剂，收集发酵产物，从发酵产物中收集菌体的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述培养基为YPD培养基，所述YPD培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、酵母提取粉5g/L，其余为水。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述培养条件为：30℃培养48小时。