CN103461673B - 一种以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的方法，属于生物饲料领域。该方法具体是以甘油残渣为主要原料，加水稀释配制成一定浓度的甘油残渣溶液，用盐酸调节pH在6.5～7.5之间，再添加非蛋白氮源、磷酸盐、镁盐和氯化钠，采用微生物进行液体发酵，在30～32℃培养72～96h得菌体蛋白。该菌体蛋白添加到饲料中，可强化基础饲料营养价值，改善畜产品品质。本发明以廉价的甘油残渣为主要原料，通过微生物发酵将甘油蒸馏制备中产生的甘油残渣废弃物转化为菌体蛋白，一方面避免了甘油残渣带来的环境污染，另一方面增加了甘油残渣的经济效益。

Description

一种以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵菌体蛋白的制备方法及其应用，具体涉及一种以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的方法及其用于制备动物饲料中的应用，属于生物饲料领域。

背景技术

甘油残渣是甘油经过蒸馏工艺处理后产生的一种含有甘油、聚甘油、水、盐等成分混合物。由于甘油蒸馏残渣的组分复杂，其除杂、脱色非常困难，产生了后续处理工艺复杂繁琐，处理成本高的瓶颈。因此甘油残渣长久以来被作为废物稀释后排放或填埋，造成了严重的环境污染。

目前对甘油蒸馏残渣的处理利用，主要集中在提炼其中的聚甘油。2008年中国专利申请中公开了“从甘油渣中提取聚甘油的方法”，该方法采用添加有机溶剂萃取等多次工艺处理甘油残渣达到回收聚甘油的目的；魏代军等通过对甘油残渣预处理，脱盐，乙醇回收等多重工艺实现对甘油残渣的回收利用（魏代军等.甘油蒸馏残渣的回收利用，表面活性剂工业，2000，2，23～24）。上述方法都是通过采取复杂工艺处理甘油残渣，在二次回收利用甘油残渣中增加了各种成本的投入，同时产生二次污染。

环境中存在的许多有机物，都能找到可以使之降解或转化它的微生物。同时微生物处理技术因其生产费用低、无二次污染等特点被视为应用前景广阔的技术。甘油残渣中主要成分就是甘油和聚甘油，这两种有机物可以作为微生物的碳源。因此借助微生物转化技术，将甘油残渣作为微生物生长的原料，使其转化为菌体蛋白，一方面消除甘油残渣带来的环境污染问题，另一方面变废为宝实现菌体蛋白的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的制备方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明的一个目的是公开一种以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的方法，该制备方法具体包括如下步骤：

1）将甘油残渣用水稀释得甘油残渣稀释液，其中甘油残渣的质量分数为15～40%；

2）向甘油残渣稀释液中分别加入占甘油残渣稀释液质量分数为1～5%的非蛋白氮源，0.5～1.5%的磷酸盐，0.05～0.5%的镁盐，1～5%的氯化钠，混合均匀后用盐酸调节混合液的pH值为6.5～7.5，可得菌种的发酵培养基；

3）将发酵培养基装入摇瓶，并向发酵培养基中接入发酵菌种，菌种接种量为发酵培养基的4～8%，接种完成后将摇瓶置于摇床上，调整摇床转速为150r /min，发酵温度为30～32℃进行发酵培养72～96h；

4）发酵完成后，使用离心机将发酵液离心得到沉淀物，其中离心转速为4000 r/min，离心时间为20min；将沉淀物置于真空干燥箱中50～65℃烘至恒重得菌体蛋白粗品，将所得菌体蛋白粗品用粉碎机粉碎后即可得到本发明菌体蛋白。

上述所述制备方法中，所述的磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或焦磷酸中的一种或多种。所述的非蛋白氮源为酵母提取物、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、和硝酸钠的一种或多种。所述的镁盐为硫酸镁和氯化镁中一种或两种。

上述所述制备方法中，所述的菌种为热带假丝酵母（Candida tropicalis）、灰绿葡萄孢菌（Botrytiscinerea）和白地霉（Geotrichum candidum）中一种或多种。所述步骤3）中摇瓶的装液量为20%，如500 mL的三角瓶装入100 mL的发酵培养基，或者250mL的三角瓶装入100 mL的发酵培养基。

在此基础上，本发明的另一目的是请求保护一种采用上述制备方法制备得到的菌体蛋白。

本发明的再一目的是请求保护上述制备方法制备得到的菌体蛋白的一种具体用途，即所述菌体蛋白在制备动物饲料中的用途。所述菌体蛋白首先制备成菌体蛋白饲料，然后与普通饲料混合使用。其中：

作为本发明所优选的一种实施方式，所述的动物饲料为鸡饲料，所述菌体蛋白饲料的质量百分组成为玉米45%，豆粕43.7%，菌体蛋白粉4.2%，大豆油2.8%，碳酸钙1%，蛋氨酸0.2%，食盐0.5%，胆碱0.2%，多维0.4%，填充剂2%；所述菌体蛋白饲料和普通饲料的混合比优选为28：2。

作为本发明所优选的另一种实施方式，所述的动物饲料为犊牛饲料，所述菌体蛋白饲料的质量百分组成：玉米70%，豆粕16.6%，菌体蛋白粉6%，麦麸4%，磷酸轻钙1%，食盐0.4%，预混料 2%；所述菌体蛋白饲料和普通饲料的混合比优选为27：3。

作为本发明所优选的另一种实施方式，所述的动物饲料为猪饲料，所述菌体蛋白饲料的质量百分组成：玉米60%，豆粕9%，菌体蛋白粉5%，麦粉10%，磷酸氢钙1%，沸石粉1.5%，棉粕 9%，菜粕4.5%；所述菌体蛋白饲料和普通饲料的混合比优选为19：2。

本发明与现有技术相比，具有如下技术优势：

1）本发明通过液体发酵方式将甘油残渣转化为菌体蛋白，对甘油残渣不需要进行脱色、脱盐等繁琐处理工艺，不仅有效解决了甘油残渣废弃所引发的环境污染问题，而且甘油残渣来源丰富，成本低廉，降低了菌体蛋白的制备成本，提高了甘油残渣的经济效益。

2）本发明制备得到的菌体蛋白可用于动物饲料的制备，实施例证明，以其制备得动物饲料可以提高鸡、牛、猪等动物的生长发育速度，因此其具有显著的经济效益和社会效益。

具体实施例

以下通过具体实施例进一步说明本发明的内容，但本领域技术人员应该能够知晓，下述具体实施例并不以任何方式限定本发明。

实施例1 以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的方法

取甘油残渣80g，用水稀释至400mL制备得到甘油残渣稀释液，向其中分别加入占甘油残渣稀释液质量分数为1%的蛋白胨，1%的磷酸氢二钾，0.5%的磷酸二氢钾，0.05%的硫酸镁，5%的氯化钠，混合均匀后，用盐酸调节pH值为6.5。将培养基分装至四个500 mL的三角瓶，装液量为100 mL，剩余培养基作为种子培养基分装至50 mL的三角瓶，装液量为10 mL，121℃高压灭菌20 min，得到发酵培养基和种子培养基。

取1%质量分数的葡萄糖、0.5%质量分数的蛋白胨、1%质量分数的氯化钠及1.5%质量分数的琼脂制成斜面培养基。选取白地霉和灰绿葡萄孢菌置于斜面培养基中，培养出斜面菌种。取一环白地霉和两环灰绿葡萄孢菌培养出的斜面菌种于种子培养基中，在温度为30℃的条件下，置于150 r/min 摇床上培养50 h得到种子液。

取4 mL种子液转接到100 mL 发酵培养基中，30℃，150r /min 摇床上培养 80 h。将发酵液在4000 r/min条件下使用高速离心机离心20 min，将沉淀物置于50～65℃真空干燥箱中烘至恒重，即可得到菌体蛋白粗品。将所得菌体蛋白粗品用粉碎机粉碎，即得菌体蛋白粉。计算菌体干重并测定菌体中粗蛋白含量。菌体干重为经烘箱烘至恒重量减去原培养液中所含的固形物的干重。

原培养液中所含的固形物的干重测定方法：取100 mL 发酵培养基放于蒸发皿中，用水浴锅蒸干。已蒸干的水样残留物连同蒸发皿移入105～110℃的烘箱中，烘2h，取出蒸发皿，置于干燥室内冷却至室温，迅速称量，即为固形物的干重。

粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定。经计算测定，最终得8.97 g/L的菌体干重，菌体粗蛋白含量35%。

实施例2以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的方法

取甘油残渣72g，用水稀释至400mL，制备得到甘油残渣稀释液，向其中分别加入占甘油残渣稀释液质量分数为2%的硫酸铵，0.5%的硝酸铵，1%的磷酸氢二钾，0.5%的磷酸二氢钾，0.5%的硫酸镁，2.5%的氯化钠，混合均匀后，用盐酸调节pH值为7。将培养基分装至500mL的三角瓶，装液量为100 mL，剩余培养基作为种子培养基分装至50 mL的三角瓶，装液量为10 mL，121℃高压灭菌20 min，得到发酵培养基和种子培养基。

取2%质量分数的葡萄糖、1%质量分数的蛋白胨、1%质量分数的氯化钠及1.5%质量分数的琼脂制成斜面培养基。选取热带假丝酵母和灰绿葡萄孢菌置于斜面培养基中，培养出斜面菌种。取一环热带假丝酵母和两环灰绿葡萄孢菌培养出的斜面菌种于种子培养基中，在温度为30℃的条件下，置于150r /min 摇床上培养50 h。

取8 mL种子液转接到100 mL 发酵培养基中，32℃，150r /min 摇床上培养96 h。将发酵液在4000 r/min条件下使用高速离心机离心20 min，将沉淀物置于50～65℃真空干燥箱中烘至恒重，即可得到菌体蛋白粗品。将所得菌体蛋白粗品用粉碎机粉碎，即得菌体蛋白粉。计算菌体干重并测定菌体中粗蛋白含量。菌体干重为经烘箱烘至恒重量减去原培养液中所含的固形物的干重。

原培养液中所含的固形物的干重测定方法，取100 mL 发酵培养基放于蒸发皿中，用水浴锅蒸干。已蒸干的水样残留物连同蒸发皿移入105～110℃的烘箱中，烘干2h，取出蒸发皿，置于干燥室内冷却至室温，迅速称量，即为固形物的干重。

粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定。经计算测定，最终得7.89 g/L的菌体干重，菌体粗蛋白含量32.5%。

实施例3以甘油残渣为原料制备菌体蛋白的方法

取甘油残渣160g，用水稀释至400ml，制备得到甘油残渣稀释液，向其中分别加入占甘油残渣稀释液质量分数为0.25%的酵母提取物，0.25%的硝酸铵，1%的硫酸铵，0.5%的磷酸二氢钠，0.5%的氯化镁，1%的氯化钠，充分混合后，用盐酸调节pH值为7.5。将培养基分装至500 mL的三角瓶，装液量为100 mL，剩余培养基作为种子培养基分装至50 mL的三角瓶，装液量为10 mL，121℃高压灭菌20 min，得到发酵培养基和种子培养基。

取1.5%质量分数的葡萄糖、0.75%质量分数的蛋白胨、1%质量分数的氯化钠及2%质量分数的琼脂制成斜面培养基。选取热带假丝酵母和白地霉置于斜面培养基中，培养出斜面菌种。取两环热带假丝酵母和一环白地霉培养出的斜面菌种于种子培养基中，在温度为30℃的条件下，置于150 r /min 摇床上培养36 h。

取6 mL种子液转接到100 mL 发酵培养基中，30℃，150 r /min 摇床上培养72 h。将发酵液在4000 r/min条件下使用高速离心机离心20 min，将沉淀物置于50～65℃真空干燥箱中烘至恒重，即可得到菌体蛋白粗品。将所得菌体蛋白粗品用粉碎机粉碎，即得菌体蛋白粉。计算菌体干重并测定菌体中粗蛋白含量。菌体干重为经烘箱烘至恒重量减去原培养液中所含的固形物的干重。

原培养液中所含的固形物的干重测定方法，取100 mL 发酵培养基放于蒸发皿中，用水浴锅蒸干。已蒸干的水样残留物连同蒸发皿移入105～110℃的烘箱中，烘干2h，取出蒸发皿，置于干燥室内冷却至室温，迅速称量，即为固形物的干重。

粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定。经计算测定最终得8.15g/L的菌体干重，菌体粗蛋白含量36.4%。

试验一 本发明菌体蛋白饲料对于鸡生长发育的影响

用上述三个实施例进行验证。A组为对照组，用普通型饲料喂养；B组为试验组，用上述制备好的三种菌体蛋白制备的饲料喂养雏鸡。详见表1。

选用健康雏鸡，每个处理3次重复，每次重复20只，试验时间40天。

表1 菌体蛋白饲料喂养雏鸡实验设计表

其中菌体蛋白饲料的组分组成（质量百分数）：玉米45%，豆粕43.7%，菌体蛋白粉4.2%，大豆油2.8%，碳酸钙1%，蛋氨酸0.2%，食盐0.5%，胆碱0.2%，多维0.4%，填充剂2%。其中实验例1使用的菌体蛋白粉为本发明实施例1制备方法制备得到，实验例2使用的菌体蛋白粉为本发明实施例2制备方法制备得到，实验例3使用的菌体蛋白粉为本发明实施例3制备方法制备得到。

分别于第1天和第40天称重，统计各组饲料喂养后鸡的平均日增重（g/只）。

表2 鸡的平均日增重对比表

由表2可知，试验B组的鸡平均日增重大于对照组A，说明本发明的菌体蛋白添加到饲料后，喂养的鸡的生长速度显著快于普通型饲料喂养的鸡的生长速度。实施例2对应的菌体蛋白饲料的饲喂的鸡的日增重达到39.9g/只/天，其与实施例1和实施例3对应的菌体蛋白饲料的日增重具有显著性的差异，这表明本发明实施例2制备得到的菌体蛋白粉的与正常饲料配比效果最佳，其为本发明的更佳实施例。

试验二本发明菌体蛋白饲料对于犊牛生长发育的影响

用上述三个实施例进行验证。A组为对照组，用普通型饲料喂养；B组为试验组，用上述制备好的三种菌体蛋白制备的饲料喂养犊牛。详见表3。

选用健康初生的犊牛分组于试验A组和试验B组，每个处理3次重复，每次重复10头，公母各半，于180日龄测定牛的体重。

表3 菌体蛋白饲料喂养犊牛实验设计表

其中所述菌体蛋白饲料的组分组成（质量百分数）：玉米70%，豆粕16.6%，菌体蛋白粉6%，麦麸4%，磷酸轻钙1%，食盐0.4%，预混料 2%。其中实验例1使用的菌体蛋白粉为本发明实施例1制备方法制备得到，实验例2使用的菌体蛋白粉为本发明实施例2制备方法制备得到，实验例3使用的菌体蛋白粉为本发明实施例3制备方法制备得到。

犊牛出生后 0~10天喂初乳，第10天后进行基础日粮和菌体蛋白饲料的喂养。分别统计犊牛在30～90天平均日增重量、20～180天平均日增重量、第180天胸围和第180天体高四项指标。结果见表4。

表4 犊牛的生长指标测定

由表4可知，试验B组的犊牛生长速度好于对照组A，且在胸围和体高上比对照组A的有明显的优势，说明本发明的菌体蛋白添加到饲料后，利于犊牛生长。

试验三本发明菌体蛋白饲料对于猪生长发育的影响

用上述三个实施例进行验证。A组为对照组，用普通型饲料喂养；B组为试验组，用上述制备好的三种菌体蛋白制备的饲料喂养杜长大三元杂交生长猪。详见表5。

选用健康杂交猪，体重在30±2 kg，分组于试验A组和试验B组，每个处理3次重复，每次重复8头，公母各半，实验时间40天。

表5 菌体蛋白饲料喂养杂交猪实验设计表

所述菌体蛋白饲料质量组成为：玉米60%，豆粕9%，菌体蛋白粉5%，麦粉10%，磷酸氢钙1%，沸石粉1.5%，棉粕 9%，菜粕4.5%。其中实验例1使用的菌体蛋白粉为本发明实施例1制备方法制备得到，实验例2使用的菌体蛋白粉为本发明实施例2制备方法制备得到，实验例3使用的菌体蛋白粉为本发明实施例3制备方法制备得到。

表6 猪的平均日增重对比表

由表6可知，试验B组的猪的平均日增重大于对照组A，说明本发明的菌体蛋白添加到饲料后，喂养的猪的生长速度显著快于普通型饲料喂养的猪的生长速度。

Claims (10)

1.一种以甘油残渣为原料的菌体蛋白制备方法，其特征包括以下步骤：

1)将甘油残渣用水稀释得甘油残渣稀释液，其中甘油残渣的质量分数为15～40％；

2)向甘油残渣稀释液中分别加入占甘油残渣稀释液质量分数为1～5％的非蛋白氮源，0.5～1.5％的磷酸盐，0.05～0.5％的镁盐，1～5％的氯化钠，混合均匀后用盐酸调节混合液的pH值为6.5～7.5，可得菌种的发酵培养基；

3)将发酵培养基装入摇瓶，并向发酵培养基中接入发酵菌种，菌种接种量为发酵培养基的4～8％，接种完成后将摇瓶置于摇床上，调整摇床转速为150r/min，发酵温度为30～32℃进行发酵培养72～96h；

4)发酵完成后，使用离心机将发酵液离心得到沉淀物，其中离心转速为4000r/min，离心时间为20min；将沉淀物置于真空干燥箱中50～65℃烘至恒重得菌体蛋白粗品，将所得菌体蛋白粗品用粉碎机粉碎后即可得到菌体蛋白。

2.根据权利要求1所述菌体蛋白制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和焦磷酸中的一种或多种；所述的非蛋白氮源为酵母提取物、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、和硝酸钠的一种或多种；所述的镁盐为硫酸镁或氯化镁中一种或两种。

3.根据权利要求1所述的菌体蛋白制备方法，其特征在于，所述的菌种为热带假丝酵母(Candida tropicalis)、灰绿葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和白地霉(Geotrichumcandidum)中一种或多种。

4.根据权利要求1所述的菌体蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤3)中摇瓶的装液量为20％。

5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法制备得到的菌体蛋白。

6.权利要求5所述菌体蛋白在制备动物饲料中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述菌体蛋白首先制备成菌体蛋白饲料，然后与普通饲料混合使用。

8.根据权利要求7所述的应用，所述的动物饲料为鸡饲料，所述菌体蛋白饲料的质量百分组成为玉米45％，豆粕43.7％，菌体蛋白粉4.2％，大豆油2.8％，碳酸钙1％，蛋氨酸0.2％，食盐0.5％，胆碱0.2％，多维0.4％，填充剂2％；所述菌体蛋白饲料和普通饲料的混合比为28：2。

9.根据权利要求7所述的应用，所述的动物饲料为犊牛饲料，所述菌体蛋白饲料的质量百分组成：玉米70％，豆粕16.6％，菌体蛋白粉6％，麦麸4％，磷酸轻钙1％，食盐0.4％，预混料2％；所述菌体蛋白饲料和普通饲料的混合比为27：3。

10.根据权利要求7所述的应用，所述的动物饲料为猪饲料，所述菌体蛋白饲料的质量百分组成：玉米60％，豆粕9％，菌体蛋白粉5％，麦粉10％，磷酸氢钙1％，沸石粉1.5％，棉粕9％，菜粕4.5％；所述菌体蛋白饲料和普通饲料的混合比为19：2。