CN109893547B - 一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从灵芝中提取灵芝三萜酸和灵芝多糖的方法,包括:(1)原材料预处理:将粉碎后的灵芝子实体放于氢氧化钠‑水溶液浸提,经过超声处理后过滤,得到过滤物和浸提液;(2)调节pH:调节所述浸提液的pH为2.0~4.5;(3)动态回流吸附:将步骤B中得到的提取液进行动态回流吸附,吸附完成后,收集流出液Ⅰ;(4)分段洗脱:洗脱过程分为四阶段,合并收集前三阶段洗脱液Ⅱ,收集第四阶段洗脱液Ⅲ,洗脱液Ⅲ为灵芝三萜提取液;5.合并流出液Ⅰ、洗脱液Ⅱ,加入乙醇进行醇沉后进行过滤、烘干、粉碎后得到灵芝粗多糖。本发明有效提高了灵芝三萜酸和灵芝多糖的提取率和灵芝三萜的纯度,且提取方案易于实施,提取的产品安全有效。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分提取方法技术领域,具体涉及一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法。
背景技术
灵芝为层菌纲非褶菌目灵芝菌科灵芝属真菌的总称;习惯所称灵芝是指灵芝属中赤芝的子实体部分,灵芝始载于《神农本草经》,历代医书将其列为上品,具有补中益血、滋阴强壮、扶正固本、延年益寿等功效,灵芝是《中国药典》收录的一种中药材,是食药兼用的一种真菌,灵芝中的多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分是其药效物质基础,其中主要成分之一是三萜类化合物;该类化合物有较高的脂溶性,分子量一般为400~600,化学结构较复杂,目前已知有7种不同的母核结构,在母核上有多个不同的取代基,常见有羧基、羟基、酮基、甲基、乙酰基和甲氧基等。
由于化学结构的多样性,使三萜类化合物又较广泛的药理活性,如ganodericacid β,ganolucidic acid A和lucidumol B等可明显抑制HIV-1蛋白酶活性;ganodermicacid S可明显抑制血小板的聚集;lucidenic acid O和lucidenic lactone可抑制真核细胞DNA多聚酶活性等,具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-I及HIV-I蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、抗氧化等作用。
人体肿瘤细胞60%为增殖细胞,是肿瘤发展、长大、转移的基础,对人体危害极大,但对化疗敏感,易杀灭;40%为GO细胞,又叫休眠期细胞,不分裂,不生长,但对放化疗不敏感,难以被化疗等药物杀死。当某些因素使增殖期细胞大量死亡时(如化疗时),GO期肿瘤细胞即可进入增殖周期,成为肿瘤复发的根源。
灵芝三萜最大的特点表现为可激活化疗药物难以杀死的GO期肿瘤细胞,驱使其进入细胞生长期,然后联合化疗或单独毒杀它,防止其结束休眠期后大量繁殖和转移,灵芝三萜对GO期细胞的独特作用弥补了传统肿瘤治疗(手术、放疗、化疗)的不足,成为肿瘤免疫治疗中的主力军。
20世纪80年代,国内外研究者开始深入研究灵芝化学成分,并取得一定的成效,迄今为止,已成功分离出200多种化合物,并进行了分子结构鉴定;但是这些工作都是在实验室进行的,得到的化合物量非常少,极大影响灵芝三萜的开发与利用,因此,研究三萜化合物的提取纯化的产业化工艺技术具有重要的理论意义和实践意义。
目前工业常用的提取方法有水提法、醇提法、超声处理法、树脂吸附法等。
传统的醇提法通常需要消耗大量的提取溶剂,大量的有机溶剂的使用会给人体和环境带来不利的影响。
专利号为CN1560072A的专利公开了一种从灵芝中制备灵芝三萜和灵芝多糖的方法,将干燥的灵芝实体破碎后采用超临界CO2提取技术提取灵芝三萜,然后使用低温提取和快速浓缩技术获得灵芝多糖,但是采用超临界CO2提取技术所需的设备投入较大,操作难度高,生产成本高昂。
灵芝子实体区别于其它菌类相比,实体木质化程度高,结构复杂紧密,而三萜和灵芝多糖分布在细胞内侧,通过传统的提取方法提取率低,大部分活性成分都滞留在残渣内,造成资源浪费。
专利号为CN105294875B的专利公开了一种从灵芝子实体中提取灵芝多糖的方法,将灵芝子实体粉碎后通过与亚氯酸钠-冰醋酸的氧化体系反应,将组成细胞壁的纤维素和木质素消解断裂,使更多的活性物质释放出来,大大提高了多糖的提取效率,但是灵芝三萜与多糖多用于医药保健用途,亚氯酸钠具有强致癌性,用该方法提取产品易产生安全隐患。
发明内容
针对上述存在的问题,本发明的目的是提供一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,通过采用氢氧化钠-水溶液进行预处理,动态回流吸附的手段,有效提高了灵芝三萜和灵芝多糖的提取率,且提取方案易于实施,提取的产品安全有效。
为了实现上述目的,本发明的技术方案如下:
一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,主要包括以下步骤:
A.原材料预处理:对灵芝子实体进行干燥、粉碎后,将粉碎后的灵芝子实体放于0.2~1.0wt%的氢氧化钠-水溶液中于50~75℃条件下浸提,经过超声处理后过滤,得到过滤物和浸提液;
B.调节pH:用高纯盐酸调节所述浸提液的pH为2.0~4.5;
C.动态回流吸附:将步骤B中得到的提取液进行动态回流吸附,吸附完成后,收集流出液Ⅰ;
D.分段洗脱:洗脱过程分为四阶段第一阶段洗脱液为水,第二阶段洗脱液为10~20%乙醇(v/v),第三阶段洗脱液为30~40%乙醇(v/v),第四阶段洗脱液为90~95%乙醇(v/v),合并收集前三阶段洗脱液Ⅱ,收集第四阶段洗脱液Ⅲ,洗脱液Ⅲ为灵芝三萜提取液;
E.合并流出液Ⅰ、洗脱液Ⅱ,加入95%的乙醇(v/v)进行醇沉后进行过滤、烘干、粉碎后得到灵芝粗多糖。
在原料预处理步骤中,灵芝子实体木质化程度高,结构复杂紧密,而三萜和灵芝多糖分布在细胞内侧,活性成分难以提取出来,采用氢氧化钠-水溶液体系对灵芝子实体进行碱处理,可以削弱纤维素和半纤维素间的氢键及皂化半纤维素和木质素间的酯键,使木质素和纤维素具有更多更大的孔性,使活性成分易于提取;三萜酸类易溶于热水,加热利于提取;超声处理也可进一步加强提取效果;因此,采用该方法可大大提高灵芝三萜和灵芝多糖的提取量。
调节pH采用的是高纯盐酸,高纯盐酸是一种经过提纯后,酸度大于95%的液体,可用于精细度高的食品、医药加工方面来调节水流pH,本发明中酸性条件有利于吸附过程中弱酸性的灵芝三萜的吸附,提高灵芝三萜的吸附率;另一方面,高纯盐酸也可中和预处理过程中多余的氢氧化钠,使得到的产品杂质更少,减少提取中所用试剂对产品的影响。
动态回流吸附可增大提取液与吸附柱的接触面积,提高吸附柱对有效成分的吸附率,从而提高提取效率。
优选地,步骤A中,对灵芝子实体进行超微粉碎,本发明中对灵芝子实体进行超微粉碎,更有利于其与氢氧化钠-水溶液体系反应,进而更有效地使灵芝子实体中的纤维素和木质素产生更多的通孔,使更多的活性成分释放出来,最大化地提高提取效率。
优选地,步骤A中,所述灵芝子实体与氢氧化钠-水溶液的重量比为1:20~30。
优选地,步骤A中,所述超声处理条件为:功率100~250w,时间20~30min。
优选地,步骤C中,所述动态回流吸附中所用吸附柱为大孔树脂AB-8吸附柱;大孔树脂具有物理化学稳定性高,吸附选择性强,富集效果好,解吸条件温和,再生简便,使用周期长等优点,采用大孔树脂吸附植物有效成分的技术已有报道;而AB-8为弱极性吸附树脂,对弱极性的灵芝三萜吸附能力强,且AB-8针对灵芝子提取液具有合适的比表面积,比表面积过大会吸附杂质,使杂质占据了较多的吸附位点,不利于有效成分的吸附,比表面积过小使得有效成分易被解吸,有效成分易流失。
采用分段洗脱的方法可有效提高灵芝三萜的提取纯度,对于本发明中使用的AB-8树脂,前三阶段用水和较低体积分数10~20%、30~40%的乙醇溶液洗脱后,可以先将杂质洗脱下来,而灵芝三萜不会被解吸,第四阶段采用高浓度90~95%的乙醇可将灵芝三萜全部解吸下来,以此可大大提高洗脱液中灵芝三萜的纯度。
进一步地,大孔树脂吸附柱在使用前需进行预处理,所述预处理步骤为:(1)将大孔树脂用乙醇浸泡24~36h后,用水洗涤至无醇味;(2)用5%HCl溶液浸泡2~4h后用水洗涤至中性;(3)用2%NaOH溶液浸泡2~4h后用水洗涤至中性备用。
优选地,所述动态回流吸附的条件为:流速20~50ml/min,回流时间50~90min。
优选地,所述分段洗脱中第一至第三阶段的条件为:流速1~10ml/min,洗脱时间30~50min;第四阶段的条件为:流速0.5~5ml/min,洗脱时间60~110min。
优选地,本发明中所用水为蒸馏水或纯化水,蒸馏水或纯化水宝成提取过程中不受其他因素的影响,确保提取纯度。
为了实现本发明中大剂量提取液动态回流吸附的目的,本发明的一种动态回流吸附装置,包括大孔树脂柱,树脂柱进液口端连接有多通进液器,填充柱出液口端连接有多通储液器,多通进液器和多通储液器通过回流管连接从而实现回流的目的,多通进液器与树脂柱进液口连接端额外设置有流速阀,多通储液器和多通出液器各管道处都安装有阀门负责管道的开闭,从而实现不同浓度的溶剂的加入及不同用途的流出液的收集。
综上所述,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明采用氢氧化钠-水溶液体系对灵芝子实体进行碱处理,可以削弱纤维素和半纤维素间的氢键及皂化半纤维素和木质素间的酯键,使木质素和纤维素具有更多更大的孔性,使更多的灵芝多糖和灵芝三萜释放出来,大大提高了提取效率。
(2)采用动态回流吸附可增大提取液与吸附柱的接触面积,提高吸附柱对有效成分的吸附率,从而提高提取效率。
(3)采用弱极性AB-8大孔树脂进行吸附,对弱极性的灵芝三萜吸附能力强,且AB-8对于灵芝子提取液具有合适的比表面积,可有效提高提取的灵芝三萜的纯度。
(4)采用分段洗脱的方法,先将杂质去除,再将灵芝三萜洗脱下来,可大大提高灵芝三萜的提取纯度。
(5)本发明中采用的试剂无害或易被去除,得到的产品安全有效。
(6)本发明易于实施,操作简单,成本较低,易于工业化生产。
附图说明
附图1为本发明的流程图。
附图2为本发明采用的动态回流吸附装置示意图。
附图说明:进液器1、管道11、管道12、储液器2、出液管21、出液管22、树脂柱3、回流管4、流速阀5、电机6、阀门7、保护层8。
具体实施方式
实施例1
一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,主要包括以下步骤:
A.原材料预处理:对灵芝子实体进行干燥、超微粉碎后,将粉碎后的灵芝子实体放于0.2wt%的氢氧化钠-蒸馏水溶液中于50℃条件下浸提,灵芝子实体与氢氧化钠-蒸馏水溶液的重量比为1:20,经过超声处理后过滤,超声条件为:功率100w,时间20min,得到过滤物和浸提液;
B.调节pH:用高纯盐酸调节所述浸提液的pH为2.0;
C.动态回流吸附:将步骤B中得到的提取液通过管道11注入至进液器1,调节流速阀流速为20ml/min,提取液以预定流速进入树脂柱,开启进液器1与回流管4及储液器2与回流管4连接处的阀门7,其余管道阀门均关闭,回流时间50min,从管道21处收集流出液Ⅰ;
D.分段洗脱:洗脱过程分为四阶段,第一阶段洗脱液为蒸馏水,流速1ml/min,洗脱时间30min;第二阶段洗脱液为10%乙醇(v/v),流速5ml/min,洗脱时间35min;第三阶段洗脱液为30%乙醇(v/v),流速5ml/min,洗脱时间40min;第四阶段洗脱液为90%乙醇(v/v),流速0.5ml/min,洗脱时间60min;合并收集前三阶段洗脱液Ⅱ,收集第四阶段洗脱液Ⅲ,洗脱液Ⅲ为灵芝三萜提取液;动态回流吸附装置的具体使用步骤:关闭回流管4上的电机6及回流管与进液器及储液器连接处的阀门7,每阶段洗脱剂都从管道12注入,调节每阶段所需流速,第一至第三阶段的洗脱液通过出液管21流出收集,第四阶段的洗脱液通过出液管22流出单独收集,洗脱过程中当进液器或储液器中有一处管道开启,则其余管道关闭。
E.合并流出液Ⅰ、洗脱液Ⅱ,加入三倍体积的95%的乙醇(v/v)进行醇沉后进行过滤、烘干、粉碎后得到灵芝粗多糖。
在本发明中,大孔树脂采用AB-8,使用前需进行预处理:(1)将大孔树脂用乙醇浸泡24h后,用蒸馏水洗涤至无醇味;(2)用5%HCl溶液浸泡2h后用蒸馏水洗涤至中性;(3)用2%NaOH溶液浸泡2h后用蒸馏水洗涤至中性备用。
实施例2
一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,主要包括以下步骤:
A.原材料预处理:对灵芝子实体进行干燥、超微粉碎后,将粉碎后的灵芝子实体放于0.5wt%的氢氧化钠-纯化水溶液中于60℃条件下浸提,灵芝子实体与氢氧化钠-纯化水溶液的重量比为1:25,经过超声处理后过滤,超声条件为:功率200w,时间25min,得到过滤物和浸提液;
B.调节pH:用高纯盐酸调节所述浸提液的pH为3.0;
C.动态回流吸附:将步骤B中得到的提取液通过管道11注入至进液器1,调节流速阀流速为35ml/min,提取液以预定流速进入树脂柱,开启进液器1与回流管4及储液器2与回流管4连接处的阀门7,其余管道阀门均关闭,回流时间70min,从管道21处收集流出液Ⅰ;
D.分段洗脱:洗脱过程分为四阶段,第一阶段洗脱液为纯化水,流速3ml/min,洗脱时间30min;第二阶段洗脱液为15%乙醇(v/v),流速7ml/min,洗脱时间30min;第三阶段洗脱液为30%乙醇(v/v),流速8ml/min,洗脱时间35min;第四阶段洗脱液为90%乙醇(v/v),流速2.5ml/min,洗脱时间80min;合并收集前三阶段洗脱液Ⅱ,收集第四阶段洗脱液Ⅲ,洗脱液Ⅲ为灵芝三萜提取液;动态回流吸附装置的具体使用步骤:关闭回流管4上的电机6及回流管与进液器及储液器连接处的阀门7,每阶段洗脱剂都从管道12注入,调节每阶段所需流速,第一至第三阶段的洗脱液通过出液管21流出收集,第四阶段的洗脱液通过出液管22流出单独收集,洗脱过程中当进液器或储液器中有一处管道开启,则其余管道关闭。
E.合并流出液Ⅰ、洗脱液Ⅱ,加入三倍体积的95%的乙醇(v/v)进行醇沉后进行过滤、烘干、粉碎后得到灵芝粗多糖。
在本发明中,大孔树脂采用AB-8,使用前需进行预处理:(1)将大孔树脂用乙醇浸泡28h后,用纯化水洗涤至无醇味;(2)用5%HCl溶液浸泡3h后用纯化水洗涤至中性;(3)用2%NaOH溶液浸泡3h后用纯化水洗涤至中性备用。
实施例3
一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,主要包括以下步骤:
A.原材料预处理:对灵芝子实体进行干燥、超微粉碎后,将粉碎后的灵芝子实体放于1.0wt%的氢氧化钠-纯化水溶液中于75℃条件下浸提,灵芝子实体与氢氧化钠-纯化水溶液的重量比为1:30,经过超声处理后过滤,超声条件为:功率250w,时间30min,得到过滤物和浸提液;
B.调节pH:用高纯盐酸调节所述浸提液的pH为4.5;
C.动态回流吸附:将步骤B中得到的提取液通过管道11注入至进液器1,调节流速阀流速为50ml/min,提取液以预定流速进入树脂柱,开启进液器1与回流管4及储液器2与回流管4连接处的阀门7,其余管道阀门均关闭,回流时间90min,从管道21处收集流出液Ⅰ;
D.分段洗脱:洗脱过程分为四阶段,第一阶段洗脱液为纯化水,流速10ml/min,洗脱时间30min;第二阶段洗脱液为15%乙醇(v/v),流速5ml/min,洗脱时间20min;第三阶段洗脱液为30%乙醇(v/v),流速6ml/min,洗脱时间50min;第四阶段洗脱液为90%乙醇(v/v),流速5ml/min,洗脱时间110min;合并收集前三阶段洗脱液Ⅱ,收集第四阶段洗脱液Ⅲ,洗脱液Ⅲ为灵芝三萜提取液;动态回流吸附装置的具体使用步骤:关闭回流管4上的电机6及回流管与进液器及储液器连接处的阀门7,每阶段洗脱剂都从管道12注入,调节每阶段所需流速,第一至第三阶段的洗脱液通过出液管21流出收集,第四阶段的洗脱液通过出液管22流出单独收集,洗脱过程中当进液器或储液器中有一处管道开启,则其余管道关闭。
E.合并流出液Ⅰ、洗脱液Ⅱ,加入三倍体积的95%的乙醇(v/v)进行醇沉后进行过滤、烘干、粉碎后得到灵芝粗多糖。
在本发明中,大孔树脂采用AB-8,使用前需进行预处理:(1)将大孔树脂用乙醇浸泡36h后,用纯化水洗涤至无醇味;(2)用5%HCl溶液浸泡4h后用纯化水洗涤至中性;(3)用2%NaOH溶液浸泡4h后用纯化水洗涤至中性备用。
根据《中国药典》2015年版一部中灵芝多糖含量和总三萜含量的测定方法分别测定实施例1~3含量;
设置对比例1和2,树脂柱分别为HP-20和S-8,其余条件与实施例1相同;
设置对比例3,原材料预处理中用蒸馏水替代氢氧化钠-蒸馏水溶液,其余条件与实施例1相同;测定对比例1~3含量,测定结果见表1:
表1.灵芝多糖及灵芝三萜含量测定表
如表1所示,实施例1~3的灵芝多糖含量大于28.32%,灵芝三萜含量大于19.87%;对比例1~2中灵芝多糖的含量比较实施例1略低,而灵芝三萜含量却大大降低,这表明无极性的HP-20和极性的S-8不适用本发明中灵芝三萜的吸附,证明弱极性的AB-8树脂柱为最优选择;对比例3中灵芝多糖和灵芝三萜的含量大大降低,这表明未采用氢氧化钠-水溶液进行预处理的灵芝子实体中灵芝多糖和灵芝三萜大部分都残留在了过滤物中未被提取出来,证明经氢氧化钠-水处理后,可大大提高活性成分的提取率。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (5)
1.一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,主要包括以下步骤:
A.原材料预处理:对灵芝子实体进行干燥、粉碎后,将粉碎后的灵芝子实体放于0.2~1.0wt%的氢氧化钠-水溶液中于50~75℃条件下浸提,经过超声处理后过滤,得到过滤物和浸提液;
B.调节pH:用高纯盐酸调节所述浸提液的pH为2.0~4.5;
C.动态回流吸附:将步骤B中得到的提取液进行动态回流吸附,吸附完成后,收集流出液Ⅰ;所述动态回流吸附中所用吸附柱为大孔树脂AB-8吸附柱;所述动态回流吸附的条件为:流速20~50ml/min,回流时间50~90min;
D.分段洗脱:洗脱过程分为四阶段,第一阶段洗脱液为水,第二阶段洗脱液为10~20%乙醇(v/v),第三阶段洗脱液为30~40%乙醇(v/v),第四阶段洗脱液为90~95%乙醇(v/v),合并收集前三阶段洗脱液Ⅱ,收集第四阶段洗脱液Ⅲ,洗脱液Ⅲ为灵芝三萜提取液;所述分段洗脱中第一至第三阶段的条件为:流速1~10ml/min,洗脱时间30~50min;第四阶段的条件为:流速0.5~5ml/min,洗脱时间60~110min;
E.合并流出液Ⅰ、洗脱液Ⅱ,加入95%的乙醇(v/v)的乙醇进行醇沉后进行过滤、烘干、粉碎后得到灵芝粗多糖。
2.根据权利要求1所述的一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,其特征在于,步骤A中,对灵芝子实体进行超微粉碎。
3.根据权利要求1所述的一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,其特征在于,步骤A中,所述灵芝子实体与氢氧化钠-水溶液的重量比为1:20~30。
4.根据权利要求1所述的一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,其特征在于,步骤A中,所述超声处理条件为:功率100~250w,时间20~30min。
5.根据权利要求1所述的一种从灵芝中提取灵芝三萜和灵芝多糖的方法,其特征在于,所述大孔树脂吸附柱在使用前需进行预处理,所述预处理步骤为:(1)将大孔树脂用乙醇浸泡24~36h后,用水洗涤至无醇味;(2)用5%HCl溶液浸泡2~4h后用水洗涤至中性;(3)用2%NaOH溶液浸泡2~4h后用水洗涤至中性备用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: A Method for Extracting Ganoderma Triterpenoids and Ganoderma Polysaccharides from Ganoderma lucidum Effective date of registration: 20230828 Granted publication date: 20210820 Pledgee: Bank of Huzhou Limited by Share Ltd. Nanxun branch Pledgor: HUIZHOU LIUYIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2023980054042 |
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