FI107166B - Menetelmä entsyymien ottamiseksi talteen proentsyymeistä - Google Patents
Menetelmä entsyymien ottamiseksi talteen proentsyymeistä Download PDFInfo
- Publication number
- FI107166B FI107166B FI931553A FI931553A FI107166B FI 107166 B FI107166 B FI 107166B FI 931553 A FI931553 A FI 931553A FI 931553 A FI931553 A FI 931553A FI 107166 B FI107166 B FI 107166B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- prothrombin
- thrombin
- detergent
- protease
- treatment
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
107166
Menetelmä entsyymien ottamiseksi talteen proentsyymeistä
Keksintö koskee menetelmää proteiinien, etenkin proentsyymien 5 lohkaisemiseksi valvotusti ja rajoitetusti proteolyyttisesti entsyymien tai vastaavasti proteiinifragmenttien ottamiseksi talteen, jolloin proteiini käsitellään proteaasilla. Etenkin keksintö koskee menetelmää trombiinin ottamiseksi talteen protrombiinistä.
10 Tällainen menetelmä on tunnettu EP-hakemusjulkaisusta 0 378 798. Tämän menetelmän mukaisesti protrombiini adsorboidaan (immobilisoidaan) plasmasta tai plasmafraktiosta kiinteään kantoaineeseen ja adsorbaatti käsitellään Ca2+-ioneilla.
15 Ca2+-ioneja käytetään korkeintaan 30 mM:n konsentraatiossa ja ne saavat aikaan — yhdessä samoin plasmasta peräisin olevien ja kantoaineeseen adsorboitujen proteaasien kanssa — trombiinin lohkaisun adsorbaatista. Kiinteänä kantoaineena käytetään metakryyli- tai akryylikopolymeerejä.
20
Edelleen on tunnettua, että trypsiini hajottaa liuennutta protrombiinia fragmenteiksi, joilla on alhainen molekyylipai-no, jolloin voidaan todeta trombiiniaktiivisuuden täydellinen häviö (Biochim. Biophys. Act. 329. 221 - 232 (1973)); prot-25 rombiinin proteolyyttinen hajottaminen ei pääty siten trom biini in, minkä johdosta tämä menetelmä ei sovellu trombiinin *- talteenottamiseksi.
Kaikki alussa mainitun tyyppiset meentelmät johtavat käytetyn 30 proteaasin ja käsittelyolosuhteiden mukaan erilaisiin pro- trombiinilohkaisutuotteisiin, joita voidaan käyttää osittain . . terapeuttisesti (esim. trombiini), osittain diagnostisesti ja spesifisten vasta-aineiden talteenottamiseksi. Kaikkia näitä käyttötapoja varten on kuitenkin tarpeen, että proteiinifrag-35 mentit esiintyvät erittäin puhtaina, mikä on luonnostaan työteliästä, koska kaikki tunnetut lohkaisumenetelmät johtavat useihin fragmentteihin. Näiden monivaiheisten ja aikaa vievien puhdistusmenetelmien eräänä toisena haittana on se, että niihin liittyy väistämättä suuria saantohäviöitä.
2 107166
Keksinnön tarkoituksena on poistaa nämä epäkohdat ja sa$da aikaan parannettu menetelmä entsyymien tai vastaavasti prote-iinifragmenttien ottamiseksi talteen proteiineista, jolloin tämän menetelmän tulee sopia etenkin trombiinin ottamiseksi 5 talteen yksinkertaisella tavalla.
Tämä päämäärä saavutetaan alussa esitetyssä menetelmässä siten, että käsittely proteaasilla suoritetaan detergentin läsnäollessa tai kaotrooppisen aineen läsnäollessa lukuunot-10 tamatta hyytymisaktiivisia suoloja.
Keksintö perustuu siihen havaintoon, että proteiinien, etenkin proentsyymien, kuten protrombiinin proteolyyttinen loh-kaisu voi tapahtua määrätietoisesti tai vastaavasti sitä 15 voidaan ohjata määrätietoisesti silloin, kun se suoritetaan detergentin läsnäollessa tai kaotrooppisen aineen läsnäollessa. On osoittautunut, että proteiinien lohkaisumalli on erilainen riippuen näiden läsnä olevien aineiden laadusta ja konsentraatiosta. Tämä havainto avaa sen mahdollisuuden, että 20 reaktioympäristö voidaan valita siten, että muodostuu ainoas taan muutamia ja aivan määrättyjä proteiinifragmentteja.
Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa muunnelmassa käytetään proentsyymiä, joka on immobilisoitu kiinteään 25 kantoaineeseen, etenkin kaksiarvoisen metallin, edullisesti maa-alkalimetallin vaikeasti liukenevaan suolaan tai kejlaat-tiin. Tämä muunnelma mahdollistaa adsorboidusta proentsjyymis-tä lohkaistun proteiinifragmentin helpomman talteenoton;, koska proentsyymin loppuosa — kantoaineeseen adsorboitujneena 30 — voidaan erottaa kantoaineen kanssa yksinkertaisesti reak- ·.· tioliuoksesta.
EP-hakemusjulkaisussa 0 378 798 esitetyn menetelmän mukaisesti kantoaineina käytetään kopolymeereja, joissa on kjuiten-35 kin se haitta, että ne luovuttavat akryyli- ja metakryyjli- monomeerejä trombiinipitoiseen liuokseen, jotka voidaan poistaa jälleen ainoastaan vaivoin ja saastuttavat siten valmis- 3 107166 tettavan farmaseuttisen valmisteen. Tällainen leviäminen ("leakage") on tunnettua orgaanisten polymeeristen kantoai-neiden kaikkien tyyppien kohdalla. On kuitenkin osoittautunut, että proentsyymin, etenkin protrombiinin keksinnön mu-5 kainen, määrätietoinen lohkaisu ei onnistu ainoastaan kopoly- meerien, vaan myös muiden kantoaineiden, esim. vaikeasti liukenevien suolojen, kuten CA3(P04)2:n, CaS04:n, CaC03:n, Ba-S04:n, BaC03:n tai Ba-sitraatin avulla. Suolat voidaan lisätä joko protrombiinipitoiseen liuokseen tai ne voidaan muodostaa 10 myös saostamalla vasta protrombiinipitoisessa liuoksessa.
Kantoaineen kaksiarvoisten ionien eräänä erityisenä etuna on edelleen se, että ne sitovat protrombiinin selektiivisesti gamma-karboksipäänsä kautta. Proteiinifragmenteilla, jotka 15 muodostuvat käsiteltäessä proteolyyttisesti protrombiinia, ei ole puuttuvan gamma-karboksipään johdosta mitään affiniteet-tiä kaksiarvoisten ionien ja siten kantoaineen suhteen.
Muina kantoaineina sopivia ovat myös hydroksiapatiitti, hyd-20 roksiapatiittigeeli tai kaksiarvoisella kationilla varattu metallikelaatti-affiniteettikromatografinen kantoaine (esim. Pharmacia Chelating Sepharose®).
Proentsyymien lohkaisemiseksi proteolyyttisesti voidaan käyt-25 tää useita proteaaseja (esim. kymotrypsiini, dispaasi, endo- • · peptidaasi Arg-C, endoproteinaasi Lys-C, endoproteinaasi Glu-C, endoproteinaasi Asp-N, tekijä Xa, kallikreiini, papaiini, Pepsiini, plasmiini, pronaasi, proteinaasi K, stafylokoagu-laasi, subtilisiini, trombiini, trypsiini (etenkin ihmisen, 30 naudan, sian), trypsiinityyppiset proteaasit, jotka ovat peräisin niveljalkaisista tai mikro-organismeista, kuten esim. Streptomyces griseus-trypsiini, seriini-proteaasit, jotka ovat peräisin myrkkykäärmeistä, kuten Angkistrodon rhodostoma. Bothrops atrox. Dispholidus tvous. Echis carina-35 tus. Nana niorocollis. Qxvuranus scutellatus scutellatus.
mm.). Edullisesti käytetään proteaasina trypsiiniä, kymotryp- 4 107166 siiniä, kallikreiiniä, dispaasia tai endoproteinaaseja Gilu-C, Lys-C tai Asp-N. Voidaan käyttää myös yhdistelmäproteaaseja.
On osoittautunut, että proentsyymi voidaan lohkaista detjer-5 gentin läsnäollessa määrätietoisesti siten, että talteenjotet- tava entsyymi muodostaa fragmenttiseoksen pääosan. Detergen-tiksi soveltuu etenkin desoksikolaatti (DOC) , jota käytejtään etenkin edullisesti, ja myös muut, kuten dodekyylisulfaatti (SDS), CHAPS, polyoksietyleeni-johdannaiset, kuten Brij, 10 Tween, Triton ja Pluronic. Detergent in läsnäolo helpottaja edelleen muodostuneiden proteiinifragmenttien desorptiota kantoaineesta.
Tyypillisiä kaotrooppisia aineita, joita käytetään keksinnön 15 mukaisessa menetelmässä, ovat esimerkiksi virtsa-aine, gjuani- dinium-hydrokloridi sekä tiosynaatit, kuitenkaan hyytymijsak-tiiviset suolat, kuten esim. kalsiumsuolat, jotka vaikuttavat samoin kaotrooppisesti, eivät ole tarkoituksenmukaisia.
20 Saatu supernatantti, joka sisältää halutun entsyymin, vqidaan alistaa lisäpuhdistusvaiheisiin. Edullisesti tähän tarkoitukseen voidaan käyttää geelipermeaatiokromatografiaa tai af-finiteettikromatografiaa. Mahdollisimman konsentroitujen näytteiden talteenottamiseksi on suositeltavaa käyttää af-25 finiteettikromatografisiä menetelmiä. Ligandeja sisältävät • « triatsiiniaffiniteettikromatografiset kantoaineet, esim. Ci-bacron®-Blue F3GA (valmistaja Ciba Geigy) tai Procion®-#ed HE-3B (valmistaja ICI) tai läheiset väriaineet ovat osoittautuneet hyviksi. Proteiinifragmentit voidaan adsorboida $uo-30 raan erässä tai pakatussa pylväässä desorptiosupernatankista .· suoritetun kiintofaasiaktivoinnin jälkeen kulloinkin kyseessä olevaan af f initeettimatr iisiin (esim. Fractogel® TSK AF-^Blue (valmsitaja Merck), Blue-Sepharose® CL-6B (valmistaja Pharmacia) ). Tämän jälkeen proteiinifragmentit eluoidaan detetgen-35 tistä pesemällä puskurilla ja lopuksi suurimolaarisella (esim. 1 M) kaotroopilla (esim. KSCN tai NH4SCN).
• · 5 107166
Eluaatti vapautetaan kaotroopista geelipermeaatiokromatogra-fian (esim. Sephadex G25), diasuodatuksen tai dialyysin avulla ja laitetaan sopivaan puskuriin tai suolaliuokseen. Edel-leenpuhdistus homogeeniseksi voi tapahtua tunnetulla tavalla 5 käänteisfaasikromatografiän, affiniteettikromatografiän tai geelipermeaatiokromatograf iän avulla.
Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erityisen hyvin puhtaan trombiinin talteenottamiseksi. Keksintö koskee tästä syystä 10 myös trombiinipitoisen farmaseuttisen valmisteen valmistusta, jolloin eräälle edulliselle sovellutusmuodolle on ominaista, että - protrombiinipitoinen liuos saatetaan kosketuksiin kiinteän kantoaineen, etenkin kaksiarvoisen metallin, 15 edullisesti maa-alkalimetallin vaikeasti liukenevan suolan tai kelaatin kanssa protrombiinin imroobilisoimiseksi kantoa ineeseen, - immobilisoitu protrombiini käsitellään proteaasilla, etenkin trypsiinillä detergentin, etenkin desoksikolaatin 20 läsnäollessa, jolloin saadaan trombiinipitoinen liuos, joka erotetaan, puhdistetaan ja käsitellään farmaseuttiseksi valmisteeksi.
Todettiin, että detergenttikäsittelyllä saadaan aikaan vi-25 rusaktiivisuuden selvä väheneminen, mikäli käytetään lähtö- »· tuotetta, joka on peräisin viruksella saastuneesta lähteestä. Yhdessä tapauksessa havaittiin, että keksinnön menetelmän mukaisesti valmistetussa trombiinivalmisteessa ei voitu osoittaa yhtään Vaccinia-viruksia, vaikkakin lähtöaine (fer-30 mentointisupernatantti) sisälsi Vacciniaa. Tietenkin keksin- . ·, nön mukaisen menetelmän puitteissa voidaan suorittaa myös ylimääräisiä toimenpiteitä mahdollisesti esiintyvien infekti-oosisten aineiden inaktivoimiseksi, kuten esimerkiksi lyofi-lisoidun tuotteen höyry-lämpökäsittely.
35
Keksinnön mukainen menetelmä trombiinin ottamiseksi talteen ... suoritetaan tarkoituksenmukaisesti seuraavasti: 6 107166
Ensin protrombiinipitoinen liuos saatetaan kosketuksiin kiinteän kantoaineen kanssa protrombiinin adsorboimiseksi. prot-rombiinipitoisena liuoksena ei voida käyttää ainoastaan plasmaa tai plasmafraktioita, vaan myös yhdistelmäprotrombiinia 5 sisältävää soluviljelysupernatanttiväliainetta. Immobilisoin- nin jälkeen kantoaineeseen sidottu protrombiini erotetaan tarkoituksenmukaisesti liuoksesta ja pestään epäspesifi^esti sitoutuneiden proteiinien poistamiseksi, jotka saattaisivat saastuttaa myöhemmän lopputuotteen. Tämän jälkeen immobile) lisoitu protrombiini käsitellään desoksikolaatin läsnäollessa proteaasilla trombiinin lohkaisemiseksi protrombiinista, jolloin saadaan trombiinipitoinen liuos ja kiintoaine, joka erotetaan liuoksesta. Tämä tapahtuu sedimentoinnin tai suodattamisen avulla.
15
Trombiinipitoinen supernatantti voidaan alistaa yllä esitettyihin puhdistusvaiheisiin. Etenkin edullisesti suoritetaan affiniteettikromatografia Fractogel® TSK-AF-Blue'11a (Merck) ja tämän jälkeen Sephadex-G25-kromatografia.
20 Tämän jälkeen saatu puhdas trombiinipitoinen liuos konsentroidaan ultrasentrifugoimalla tai lyofilisoimalla ja viimeistellään farmaseuttiseksi valmisteeksi.
25 Keksintöä selitetään vielä lähemmin seuraavien esimerk-kien avulla.
Immobilisoidun protrombiinin valmistus 30 PCT-hakemuksen WO 91/11519 mukaiseen soluviljelysupernatant- ’.· tiväliaineeseen, joka sisältää ihmisen yhdistelmä protrombiinia, lisätään 5 g jauhettua Ca3(P04)2:ta/100 IE pro-trombiinia ja sekoitetaan kevyesti 4 °C:ssa tunnin ajan.
Tämän jälkeen kiinteä faasi sentrifugoidaan pois 5000 g:ssa, 35 saatu pelletti suspendoidaan uudelleen 40 ml:aan 20 mM |Tris/- HCl-puskuria (pH 7,4), sekoitetaan 10 minuutin ajan ja jsent-·· rifugoidaan uudelleen pois 5000 g:ssa. Tämä tapahtuma toiste- 7 107166 taan 40 ml:11a 5 %:sta (paino/tilavuus) ammoniumsulfaattia mainitussa puskurissa ja viimeiseksi jälleen 40 ml:11a puhdasta puskuria.
5 Samalla tavalla voidaan protrombiinipitoisena lähtöaineena käyttää esim. osittaista protrombiinikompleksia, siis tekijöiden II, IX ja X seosta immobilisoidun protrombiinin valmistamiseksi.
10 Esimerkki 1: Reaktioympäristön vaikutus immobilisoidun prot rombiinin tryptiseen lohkaisuun
Kaotrooppisten aineiden ja detergenttien vaikutuksen osoittamiseksi protrombiinin tryptiseen lohkaisuun valmistet-15 tiin ensin Tris/HCl-puskurin (20 mM, pH 8,3) neljä liuosta (A
- D), jotka sisälsivät seuraavia lisäaineita (neljäs puskuri-liuos (D) toimi vertailuna): liuos A: virtsa-ainetta (0,5 M), 20 liuos B: Na-desoksikolaattia (0,05 M), liuos C: Na-dodekyylisulfaattia (0,05 M), liuos D: ei lisäainetta.
1 ml:aan liuoksia A - D lisättiin tämän jälkeen kulloinkin 25 200 mg puskurikosteaa, pestyä pellettiä (valmistettu yllä esitetyllä tavalla) ja ravisteltiin huoneen lämpötilassa 20 mM Tris/HCl-puskurin (20 μΐ) kanssa, joka sisälsi 1 mg tryp- siiniä/ml. 1, 2 ja 3 tunnin kuluttua otettiin kulloinkin suspensioiden määräerät, kiinteä faasi sentrifugoitiin pois 30 ja supernatantit tutkittiin Immun-Western-Blot-menetelmällä . ·.1 kulloinkin kyseessä olevan fragmenttikoostumuksen suhteen.
«
Taulukossa on esitetty fragmenttikaistojen piikkialaintegraa-lit 12, 19, 23, 25,5, 33, 35 ja 44 kD:ssa densitometrisen 35 Immun-Western-Blot-mittauksen mukaisesti. Nähdään, että vali tun reaktioympäristön mukaisesti voidaan osoittaa erisuuruisia tryptisiä fragmentteja erilaisina määrinä. Verrattuna 3- 8 107166 tuntiseen inkubaatioon puhtaassa Tris-puskurissa (liuos O) kaikissa muissa liuoksissa (A - C) säilyvät fragmentit yli 30 kD:n molekyylimassa-alueella. Fragmentit 33 kD:ssa ja 3$ kDsssa vastaavat trombiinia, jolloin 33 kD voidaan laskea 5 aktiivisen muodon osalle.
Desoksikolaatin (liuos B) läsnäollessa muodostuu aktiivasta trombiinia pääfragmenttina, joka ei hajoa myöskään 3-tuhtisen trypsiinikäsittelyn jälkeen pienemmiksi oligopeptideiksi.
10 1 • · « 9 107166
II
- H — — — — — — —I — — — — — —
II
il <-i «n
Tr II <-l
II
- Il - - — - - ____ - - -
II
in n in o r~ o in m in σι es m li σι rs —< σι rs m en es li — n — — — — — — — — — — — —
II
m n -h *4* -h m m o r~~ «a· miii-i σι in tn vo Γ" ή m
Il (0 r-( f-H r—l «—I
— Il (0 — — — — — — — — — — — —
Il * in il O’
* II <D
in n -M rj- ,-ι rs II C <-i en II -h — Il (0 — — — — — — — — — — — —
Il m n C rs m (N o en
m n Ή m i—i i—i n n (N
n CU *-i <—i »—i <r- - Il Ή - - — - - - — — — - - -
Il M
O σι il ^<ί σι o r- X h li Ή «-s es rs
X II -H
3 — Il Oi — — — — — — — — — — — —
rH II
3 rs il vors^r in oo tnmrs 10 r-t n n N w . h h rsrs's·
Eh II
II
— Il — — — - _ — — — — - -
II
II
II
II
Il - ; « £
Il ~ ~~ Il Q II <0 X II ^ ~~ n
Il ro ·—icsmrHrsm·—itNm—(rsm
O n O
C II -H
Ti 11 +1 5 11 ^
Di il Λ -H II Φ
r-l il OS
· tl 11 >* » . -*|| — — — — — — — — — — — — — - - : £ Il
Ti n s 1
s II
H “ il 2
n 5 < tn u Q
— il — — — — — — —I — — —I — — — 10 107166
Esimerkki 2; Immobilisoidun protrombiinin lohkaisu eri prote-aaseilla (detergentin läsnäollessa)
Protrombiinia sisältävästä soluviljelysupernatanttiväliai-5 neesta adsorboitiin protrombiini Ca3(P04)2:ssa ja pestiin yllä esitetyllä tavalla.
8 näytettä, jotka sisälsivät kukin 250 mg puskurikosteaa adsorbaattia, suspendoitiin 1 ml:aan 20 mM Tris/HCl-puskuria, 10 pH 8,3, joka sisälsi 200 mM Na-desoksikolaattia, ja sitten lisättiin 50 ml seuraavia kahdeksaa entsyymi-liuosta: - kallikreiiniä, joka oli peräisin sian haimasta, 250 U/ml 20 mM TBS:ssä, pH 8,3, 15 - dispaasi I:tä, joka oli peräisin Bacillus polvmvxasta. l mg/ml 20 mM TBS:ssä, pH 8,3, α-kymotrypsiiniä, joka oli peräisin naudan haimasta, 350 U/ml 20 mM TBS:ssä, pH 8,3, trypsiiniä, joka oli peräisin sian haimasta, 0,76 mg/ml 20 20 mM TBStssä, pH 8,3, endoproteinaasi Glu-C:tä, joka oli peräisin Staphvlocjoccus aureus V8:sta, 1 ml/ml 20 mM TBStssä, pH 8,3, endoproteinaasi Lys-C:tä, joka oli peräisin Lvsobact^r enzvmoaenesistä. 0,1 mg/ml 20 mM TBS:ssä, pH 8,3, 25 - endoproteinaasi Asp-N:ää, joka oli peräisin Pseudomopas fraaista. 0,04 mg/ml 20 mM TBS:ssä, pH 8,3, tekijää Xa, ihmisperäistä, 20 U/ml.
Nimitys 20 mM TBS (TBS = tris buffered saline) tarkoittaa 20 30 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8,3), joka sisältää 0,9 % NaCl:ää.
11 107166
Taulukossa 2 on esitetty fragmenttikaistojen piikkipintäintegraalit 12, 18, 19, 20, 23, 33, 34, 35, 44, 47, 50, 52, 54, 55, 71 ja 75 kD:ssa densitometrisen Immun-Western-Blot-mit-tauksen mukaisesti.
5 Nähdään, että mainituilla proteaaseilla voidaan valmistaa joukko fragmentteja 12 - 71 kD:n molekyylimassa-alueella. Aktiivista trombiinia vastaava fragmentti (33 kD) voidaan ottaa talteen erittäin hyvällä saannolla tryptisen hajotuksen 10 avulla.
: · 12 107166 tn n —t σ> oo r- il m es <—< σ\
Il _ _ _ _ _ _ il
ή II 'T
r- li
II
- I, - - - - - - - -
II
tn il oo tn n —*
II
— n — — — — — — — —
II
Tf II to o\ 00 ·—I —· in il *h rn r-~ »-(ro
II
— i, — — — — — — — —
II
CS II 00 tn n
II
— n — — — — — — — — li «-i o n ZJ to r» σ\ ή m n $ *-< es tn _ !! «j ________ p — I n en t" Il m tn I" >-1 II --1 *-· ·-< li e — li .3 — — — — — — — — " ti <r II jj r» ro to «3· Il C 10 ·“!
H .H
— »a-- — — — — — — n -n m li S to r' no n ii y n »h oo »h J| -h ~ n «n ii J* li X — 11 ________
3 II
n n to ot ή 3 n n tn n «s «_!' ________ ^ Il n ii »s· es n ^
II
- Il - - - - - - - -
II
O II n cs ii n ... il _ · — n — — — — — — — — li en il ® n n es li — li — — — — — — — —
II
oo n es «n —I II ^ li _ _ _ _ _ _ _
II
es il o . h ii es • Il . — n — — — — — — — — — - · ii u u s q !! i e» iu § ii ö a s .
H Ή ·Η ·Η ·Η o n e tn to tn e II Ή ti ti ti •H II ·Η ·Η ti ti ti ti n e tn e e e
Οι II -H Qt -H -H -H
-H II -H -H >i -H <U <D tl) ti
H II ID CU -H l-l C -P -P -P X
>,n ti p tn -P -P o o o >, Il ti Ai ti o -h P P P :ti a: ii a) -h ti ε ω a (¾ α τη
CU II -P -H Cb >, Cb O O O -H
r-1 II O rH tn Ai >, Ό Ό Ό Ai OIIP ti -H | P e C C (1) S II Cb X O Ö E-t ω td td E-< — Il — — — — — — — - — 13 107166
Esimerkki 3: Immobilisoidun protrombiinin lohkaisu eri kon-sentraatioissa esiintyvän desoksikolaatin läsnäollessa
Yhdistelmäprotrombiini adsorboitiin ensin fermentaatio-super-5 natantista Ca3(P04)2:ssa yllä esitetyllä tavalla.
5 näytettä, jotka sisälsivät kukin 0,6 g kosteaa adsorbaat-tia, inkuboitiin ravistellen 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 20 mM Tris/HCl-puskurin (kulloinkin 3 ml) kanssa, pH 10 8,3, joka sisälsi Na-desoksikolaattia 50 mM:n, 100 mM:n, 250 mM:n, 350 mM:n ja 500 mM:n konsentraatioissa, liuoksen (60 μ1) lisäyksen jälkeen, jossa oli 0,76 mg/ml trypsiiniä/ml. Tämän jälkeen tutkittiin 0,9 %:n NaCl:ää suhteen uudelleen-puskuroidut näytteet niiden trombiiniaktiivisuuden suhteen.
15 Tällöin määritettiin kulloinkin fotometrisesti trombiiniaika
hyytymistestissä normaaliplasman kanssa sekä amidolyyttinen aktiivisuus kromogeenisen substraatin TH-1 kanssa (2 AcOH.H-D-CHG-Ala-Arg-p-nitroanilidi) kansainvälisen trombiinistan-dardin suhteen (kuvio 1). Kuvio 1 osoittaa, että aktiivisen 20 trombiinin (33 kD-fragmentti) saanto on maksimissa 350 mM
desoksikolaatin kohdalla.
Edelleen todettiin, että muodostunut trombiini ei ole hajonnut edelleen trypsiinin läsnäolosta huolimatta vähintään 20 25 tuntia kestäneen aikajakson kuluessa.
Lohkaistun protrombiinin proteiinifraomenttien puhdistus 1,5 ml protrombiinifragmentteja sisältävää, esimerkistä 3 30 peräisin olevaa liuosta (350 mM DOC), adsorboitiin käyttämäl- . ' lä 0,1 %:sta trifluorietikkahappoa H20:ssa (ajoaine A) kään- teisfaasi-HPLC-pylvääseen (Nucleosil 100-5C18, 125 x 4 mm) (virtausnopeus: 1,7 ml/min.). Tämän jälkeen eluoitiin käyttämällä 0,1 %:sta trifluorietikkahappoa asetonitriilissä (ajo-35 aine B) lineaarisella gradientilla, joka sisälsi 30 - 70 % B:tä, 30 minuutin kuluessa 1,7 ml:n/min. virtausnopeudella. Ilmaisemalla 220 nmrssa voitiin tunnistaa 6 pääpiikkiä (re- 14 107166 tentioajat: 10,01 min.; 11,96 min.; 12,68 min.; 13,47 min.; 13,94 min.; 14,47 min.); ne kerättiin erikseen ja lyofi]|isoi-tiin. Erotettujen fragmenttien edelleenanalysointi tapahtui SDS-PAGElla ilmaisemalla Coomassie-värjäyksellä sekä Imn|un-5 Western-Blot-menetelmällä käyttämällä kaniini-anti-ihmiäprot- rombiini-antiseerumia. Fragmenttien molekyylimassat määritettiin kuudelle pääpiikille ja ne olivat 9 kD, 16 kD, 21 kD, 23 kD, 12 kD ja 33 kD.
10 Esimerkki 4; Trombiinin talteenotto
Puskurikosteaa pellettiä (n. 10 g) inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa hieman sekoittaen liuoksen (50 μΐ) kanssa, joka sisälsi 0,76 mg sian trypsiiniä (Sigma T-0134) 15 ml:aa kohden 20 mM Tris/HCl-puskurissa (pH 8,3), joka sisälsi 200 mM Na-desoksikolaattia. Tämän jälkeen Ca-fosfaatti erotettiin sentrifugoimalla. Supernatantti sisälsi ensisijaisesti trombiinia protrombiinin muutamien harvojen muiden fragmenttien lisäksi.
20
Supernatantin puhdistamiseksi pylväs, jonka poikkipinta-ala oli 8 cm2, pakattiin Fractogel® TSK-AF-Bluella (Merck) 12 mm:n korkeuteen (geelitilavuus « 9,6 ml) 20 mM Tris/HCl-pus-kurissa (pH 8,3) ja pestiin samalla puskurilla. Tämä ja kaik-25 ki seuraavat vaiheet tapahtuivat 4 °C:ssa.
Trombiinia sisältävä supernatantti (n. 50 ml) pumpattiin adsorbointia varten 2 ml:n/min. virtausnopeudella geelin päälle. Tämän jälkeen eluoitiin epäspesifisesti sitoutuneet 30 protrombiinifragmentit 20 ml:11a 0,5 M NaCl-liuosta, 40 ml: 11a 1,0 M NaCl-liuosta ja 20 ml: 11a 20 mM Tris/HCl- ; puskuria (pH 7,4) virtausnopeuden ollessa 6 ml/min. Päinvas taisessa virtaussuunnassa nopeudella 1 ml/min. eluoitiin sitten protrombiinifragmentit 20 mM Tris/HCl-puskurilla, joka 35 sisälsi 1 M KSCN:ää. Eluaatti mitattiin fotometrisesti liäpi- virtauskennon avulla 280 nmissa, kaikkiaan kerättiin 15 ml.
15 107166
Eluaatin proteiinipitoisuus oli Bradfordin mukaisesti 188 mg/ml. Kuvio 2 esittää fragmenttikoostumuksen (densitometri-nen Immun-Western-Blot-Scan), jossa on vallitsevana 33 kD-fragmentti (aktiivinen trombiini). Trombiinin osalle tulee n. 5 30 % suhteessa proteiinipitoisuuteen. Trombiiniajan määrittä miseksi trombiinin spesifiseksi aktiivisuudeksi voitiin selvittää n. 2200 IE/mg proteiinia. Tryptisen kiintofaasiakti-voinnin avulla 1 IE:stä protrombiinia voitiin siten ottaa talteen n. 100 IE trombiinia.
10
Saatu trombiinipitoinen liuos voidaan tunnetulla tavalla puhdistaa edelleen, konsentroida ja käsitellä edelleen farmaseuttiseksi valmisteeksi.
15 Esimerkki 5: Liuenneen protrombiinin lohkaisu
Kahteen näytteeseen, jotka sisälsivät kumpikin 1 ml protrombiinia sisältävää fermentointisupernatanttia, lisättiin kumpaakin 1 ml 40 mM Tris/HCl-puskuria, pH 8,3, joka sisälsi 0,1 20 M Na-desoksikolaattia tai vastaavasti 0,1 M Na-dodekyylisul- faattia, niin että detergenttikonsentraatio oli liuoksessa 0. 05 M. Vertailuksi kolmanteen näytteeseen, jossa oli 1 ml protrombiinipitoista fermentointisupernatanttia, lisättiin 40 mM Tris/HCl-puskuria ilman detergenttiä. Lisättiin kulloinkin ?5 15 ml liuosta, joka sisälsi 1 mg trypsiiniä/ml 20 mM Tris/- HCl-puskurissa, pH 8,3, joka sisälsi 0,9 % NaCl:ää, ja sitten inkuboitiin ravistellen 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa.
1, 2, 3 ja 4 tunnin kuluttua laimennettiin kulloinkin 50 μ1:η 30 määräerä näytteitä Laemmli-puskurilla (1 : 1), keitettiin ja analysoitiin elektroforeettisesti. 12%:isen SDS-polyakryy-liamidigeelin Immun-Western-Blot (1. vasta-^aine: anti-ihmi-nen-tekijä II-kaniini-seerumi; 2. vasta-aine: vuohi-anti-kaniini-IgG-peroksidaasi-konjugaatti; kehitys 4-kloori-l-35 naftolin avulla) tutkittiin densitometrisesti päältä tulevas sa valaistuksessa fragmenttien kvantifioimiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa 3.
16 107166
Taulukko 3
Molekyylimassa (kD) 19 25,5 33 35
Lisäaine Reaktioaika Piikkipintaintegraali 5 (h) desoksiko- 1 10 laatti 2 9 3 7 10 4 6 dodekyyli- 18 68 sulfaatti 26 67 3 5 69 15 44 67 tyhjä 1 4 9 4 arvo 2 3 10 3 0 0 0 20__
Vaikkakin keksinnön mukaista menetelmää on selitetty yksityiskohtaisesti trombiinin ottamiseksi talteen protrombiinis-ta, alan ammattihenkilölle on selvää, että muiden proentjsyy-25 mien samanlaisia lohkaisuja kuin protrombiinin voidaan Suo rittaa vastaavalla tavalla; esimerkiksi tällä tavalla voidaan ottaa talteen plasmiini plasminogeenista tai vastaavasti aktivoituja veren hyytymistekijöitä niiden proentsyymeistä.
Claims (6)
1. Menetelmä proentsyymien valvotuksi ja rajoitetuksi proteolyyttiseksi lohkaisemiseksi entsyymien tai vastaavasti 5 proteiinifragmenttien talteenottamiseksi proteaasikäsit- telyllä, tunnettu siitä, että käsittely suoritetaan detergentin läsnäollessa tai sellaisen kaotrooppisen aineen läsnäollessa, joka ei ole hyytymisaktiivinen suola, ja detergentti tai kaotrooppinen aine erotetaan proteaasi-10 käsittelyn suorittamisen jälkeen.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään proentsyymiä, joka on immobilisoitu kiinteään kantoaineeseen, etenkin kaksiarvoisen metallin, 15 edullisesti maa-aikaiimetalIin vaikeasti liukenevaan suolaan tai kelaattiin.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteaasina käytetään trypsiiniä, 20 kymotrypsiiniä, kallikreiiniä, dispaasia tai endoproteinaa-seja Glu-C, Lys-C tai Asp-N.
4. Patenttivaatimusten 1-3 mukaisen menetelmän käyttö trombiinin talteenottamiseksi protrombiinista. * 25
5. Menetelmä trombiinipitoisen farmaseuttisen valmisteen tuottamiseksi, tunnettu siitä yhdistelmästä, että - saatetaan protrombiinipitoinen liuos kosketuksiin kiinteän kantoaineen, etenkin kaksiarvoisen metallin, edullisesti , ' 30 maa-alkalimetallin, vaikeasti liukenevan suolan tai kelaatin kanssa protrombiinin immobilisoimiseksi kantoaineeseen, - immobilisoitu protrombiini käsitellään proteaasilla, etenkin trypsiinillä detergentin, etenkin desoksikolaatin 18 107166 läsnäollessa, jolloin saadaan trombiinipitoinen liuos, joka erotetaan, puhdistetaan ja - käsitellään farmaseuttiseksi valmisteeksi.
6. Menetelmä plasminogeenin tai muiden veren aktivoitujen hyytymistekijöiden proentsyymien kontrolloiduksi, rajoitetuksi proteolyyttiseksi lohkaisemiseksi plasmiinin tai vastaavasti muiden veren aktivoitujen hyytymistekijöiden talteenottamiseksi proteaasikäsittelyllä, tunnettu 10 siitä, että käsittely suoritetaan detergentin läsnäollessa tai sellaisen kaotrooppisen aineen läsnäollessa, joka ei ole hyytymisaktiivinen suola. 19 107166
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0071292A AT397390B (de) | 1992-04-06 | 1992-04-06 | Verfahren zur spaltung von proteinen |
| AT71292 | 1992-04-06 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI931553A0 FI931553A0 (fi) | 1993-04-06 |
| FI931553A FI931553A (fi) | 1993-10-07 |
| FI107166B true FI107166B (fi) | 2001-06-15 |
Family
ID=3497819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI931553A FI107166B (fi) | 1992-04-06 | 1993-04-06 | Menetelmä entsyymien ottamiseksi talteen proentsyymeistä |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5432062A (fi) |
| EP (1) | EP0565511B1 (fi) |
| JP (1) | JP2832129B2 (fi) |
| AT (2) | AT397390B (fi) |
| AU (1) | AU670571B2 (fi) |
| CA (1) | CA2092776A1 (fi) |
| CZ (1) | CZ282519B6 (fi) |
| DE (1) | DE59309646D1 (fi) |
| DK (1) | DK0565511T3 (fi) |
| ES (1) | ES2134834T3 (fi) |
| FI (1) | FI107166B (fi) |
| HU (1) | HU217579B (fi) |
| NO (1) | NO307384B1 (fi) |
| PL (1) | PL298390A1 (fi) |
| SK (1) | SK280854B6 (fi) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4137996A1 (de) * | 1991-11-19 | 1993-05-27 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung eines virussicheren thrombinkonzentrates |
| US5792623A (en) * | 1992-04-06 | 1998-08-11 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing activated blood factors with a protease and a detergent |
| US5559000A (en) * | 1995-01-18 | 1996-09-24 | The Scripps Research Institute | Encoded reaction cassette |
| AT404597B (de) | 1995-11-24 | 1998-12-28 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen |
| AT404838B (de) * | 1995-11-24 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen |
| US6849398B1 (en) | 1996-01-18 | 2005-02-01 | The Scripps Research Institute | Use of encoded reaction cassette |
| DE19710190A1 (de) * | 1997-03-12 | 1998-09-17 | Immuno Ag | Aktivierter Vitamin K-abhängiger Blutfaktor und Verfahren zu dessen Herstellung |
| EP1103812B1 (en) * | 1998-08-07 | 2015-11-18 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Method for determining hemoglobins |
| GB0216002D0 (en) | 2002-07-10 | 2002-08-21 | Nat Blood Authority | Process and composition |
| US9238104B2 (en) | 2011-02-28 | 2016-01-19 | Injectimed, Inc. | Needle guard |
| CN113438928A (zh) * | 2019-03-06 | 2021-09-24 | 甘布罗伦迪亚股份公司 | 用于递送凝血酶激活的纤维蛋白密封剂的装置和方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2495298A (en) * | 1945-12-28 | 1950-01-24 | Szent-Gyorgyi Albert | Process for the preparation of thrombin |
| US4210580A (en) * | 1979-06-19 | 1980-07-01 | David Amrani | Process for separation and isolation of AHF and fibronectin from blood plasma |
| US4380511A (en) * | 1981-08-12 | 1983-04-19 | Miles Laboratories, Inc. | Purification of bovine thrombin |
| US4703001A (en) * | 1985-10-23 | 1987-10-27 | Synbiotics, Corporation | Immunoassay for the detection of serum analytes using pH dependent chastropic acids |
| US5200340A (en) * | 1987-05-22 | 1993-04-06 | Zymogenetics, Inc. | Thrombin-activated tissue plasminogen activators |
| US5158873A (en) * | 1987-05-28 | 1992-10-27 | Abbott Laboratories | Method and reagent for determining LD-1 isoenzyme |
| CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
| DE3834550A1 (de) * | 1988-10-11 | 1990-04-19 | Basf Ag | Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung |
| CA2003078A1 (en) * | 1988-11-18 | 1990-05-18 | Alan Sloma | Protease deletion |
| DE3843126C3 (de) * | 1988-12-22 | 1994-10-06 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Thrombinkonzentrates |
| IE73210B1 (en) * | 1990-01-24 | 1997-05-07 | Warner Lambert Co | Process for the production of thrombin and high purity thrombin preparation thereby obtained |
| GB9116315D0 (en) * | 1991-07-29 | 1991-09-11 | Genzyme Ltd | Assay |
| US5275945A (en) * | 1991-10-08 | 1994-01-04 | Vista Chemical Company | Alkaline proteases stable in heavy-duty detergent liquids |
-
1992
- 1992-04-06 AT AT0071292A patent/AT397390B/de not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-03-19 DK DK93890046T patent/DK0565511T3/da active
- 1993-03-19 HU HU9300788A patent/HU217579B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-03-19 DE DE59309646T patent/DE59309646D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-19 AT AT93890046T patent/ATE181358T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-03-19 ES ES93890046T patent/ES2134834T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-19 EP EP93890046A patent/EP0565511B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-26 CA CA002092776A patent/CA2092776A1/en not_active Abandoned
- 1993-03-30 US US08/040,261 patent/US5432062A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-30 CZ CZ93538A patent/CZ282519B6/cs unknown
- 1993-03-31 NO NO931224A patent/NO307384B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-03-31 AU AU35623/93A patent/AU670571B2/en not_active Ceased
- 1993-04-05 PL PL29839093A patent/PL298390A1/xx unknown
- 1993-04-06 JP JP5079491A patent/JP2832129B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-04-06 SK SK309-93A patent/SK280854B6/sk unknown
- 1993-04-06 FI FI931553A patent/FI107166B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0565511T3 (da) | 1999-12-06 |
| FI931553A (fi) | 1993-10-07 |
| JPH0698791A (ja) | 1994-04-12 |
| JP2832129B2 (ja) | 1998-12-02 |
| US5432062A (en) | 1995-07-11 |
| ES2134834T3 (es) | 1999-10-16 |
| ATE181358T1 (de) | 1999-07-15 |
| NO931224L (no) | 1993-10-07 |
| FI931553A0 (fi) | 1993-04-06 |
| SK30993A3 (en) | 1993-11-10 |
| AU3562393A (en) | 1993-10-07 |
| ATA71292A (de) | 1993-08-15 |
| HUT69604A (en) | 1995-09-28 |
| AT397390B (de) | 1994-03-25 |
| CZ53893A3 (en) | 1994-01-19 |
| PL298390A1 (en) | 1993-10-18 |
| CA2092776A1 (en) | 1993-10-07 |
| HU9300788D0 (en) | 1993-06-28 |
| SK280854B6 (sk) | 2000-08-14 |
| EP0565511A1 (de) | 1993-10-13 |
| NO931224D0 (no) | 1993-03-31 |
| EP0565511B1 (de) | 1999-06-16 |
| CZ282519B6 (cs) | 1997-07-16 |
| NO307384B1 (no) | 2000-03-27 |
| HU217579B (hu) | 2000-02-28 |
| DE59309646D1 (de) | 1999-07-22 |
| AU670571B2 (en) | 1996-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6670455B1 (en) | Process for the preparation in pure form of the protease activating blood clotting VII, its proenzyme or a mixture of both proteins by means of affinity chromatography | |
| Abuchowski et al. | Preparation and properties of polyethylene glycol-trypsin adducts | |
| US4748156A (en) | Thrombin-binding substance and process for preparing the same | |
| FI107166B (fi) | Menetelmä entsyymien ottamiseksi talteen proentsyymeistä | |
| JP2002518411A (ja) | 薬学的第ｖｉｉ因子調製物 | |
| IL201146A (en) | A process for preparing a thrombin preparation in which the viruses have been taken out of action | |
| CA2006684C (en) | Monoclonal antibody against protein c | |
| AU2003244850B2 (en) | Processes for the preparation of fibrinogen | |
| BG60916B1 (bg) | Химопапаин и метод за пречистването му | |
| AU737566B2 (en) | An immunotolerant prothrombin complex preparation | |
| KR20010049988A (ko) | 이온 교환 크로마토그래피에 의한 순수형 프로테아제활성화 혈액 응고 인자 ⅶ, 이의 전효소 또는 이들 단백질둘 다의 혼합물의 제조방법 | |
| JP2001095563A5 (fi) | ||
| US4137127A (en) | Process for the preparation of thrombin-like enzymes from snake venoms | |
| FI96211C (fi) | Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi | |
| España et al. | The role of prekallikrein and high-molecular-weight kininogen in the contact activation of Hageman factor (factor XII) by sulfatides and other agents | |
| EP0726311B1 (en) | Process for preparing human activated protein c | |
| CN112423782A (zh) | FX活化方法及其在FXa组合物制备中的用途 | |
| US5792623A (en) | Method for producing activated blood factors with a protease and a detergent | |
| JPH0556951B2 (fi) | ||
| RU2488403C1 (ru) | Способ получения особо чистого препарата ферроксидазы церулоплазмина и/или фактора свертывания крови протромбина. аффинный неомициновый сорбент для их получения | |
| Suzuki et al. | [49] Purification of prekallikrein with arginine-agarose | |
| AU781717B2 (en) | Process for the preparation in pure form of the protease activating blood clotting factor VII, its proenzyme or mixture of both proteins by means of ion-exchange chromatography | |
| NAGAMATSU et al. | Application of poly-L-lysine to purification of leukocyte cathepsin G by affinity chromatography | |
| Wu | Protein C separation from homologous human blood proteins, Cohn fraction IV-1, using immobilized metal affinity chromatography | |
| Clement | Purification and Characterization of Guinea PIG Anti Thrombin III |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |