FI96211C - Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi - Google Patents

Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI96211C
FI96211C FI871948A FI871948A FI96211C FI 96211 C FI96211 C FI 96211C FI 871948 A FI871948 A FI 871948A FI 871948 A FI871948 A FI 871948A FI 96211 C FI96211 C FI 96211C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
tpa
column
cells
stranded
molecular weight
Prior art date
Application number
FI871948A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI871948A0 (fi
FI96211B (fi
FI871948A (fi
Inventor
Mitsuyoshi Morii
Masaharu Ohoka
Toshihiko Suzuki
Katsuyuki Suzuki
Nobuhiro Kawashima
Noriko Morii
Kunizo Mori
Original Assignee
Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP10320086A external-priority patent/JPH0779692B2/ja
Application filed by Mitsui Toatsu Chemicals filed Critical Mitsui Toatsu Chemicals
Publication of FI871948A0 publication Critical patent/FI871948A0/fi
Publication of FI871948A publication Critical patent/FI871948A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI96211B publication Critical patent/FI96211B/fi
Publication of FI96211C publication Critical patent/FI96211C/fi

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456Plasminogen activators
    • C12N9/6459Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y304/00Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069Protein C activated (3.4.21.69)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814Enzyme separation or purification
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815Enzyme separation or purification by sorption

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

96211
Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ia kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi
Keksinnön taustaa 1) Keksinnön ala: Tämä keksinnön kohteena on menetelmä yksisäikeisen ja/tai kaksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tästälähin merkittynä sc-TPA ja dc-TPA, vastaavasti) puhdistamiseksi seoksesta, Joka sisältää sc-TPA:ta ja dc-TPA:ta.
2) Kuvaus tekniikan tasosta tPA (kudosplasminogeeniaktivaattori) on proteiini, jota kehittyy korkeamman eläimen kudoksessa, ja Joka toimii aktivoimalla plasminogeenin, plasmiinin prekursorin, jonka tiedetään olevan proteolyyttinen entsyymi erityisesti fibriinil-le ja on nyt tuotu polttopisteeseen potentiaalisena trombo-lyyttisenä aineena.
tPA:11a on kaksi molekyyiimuotoa, yksisäikeinen tPA ja kakslsäikelnen tPA, joilla on sama molekyylipaino (noin 70000 daltonia), ja sitä saadaan seoksena tavallisissa tPA:n tuotantomenetelmissä. Kaksisäikeisellä muodolla on noin kymmenen kertaa korkeampi aktiivisuus plasminogeeniaktivointiin kuin yksisäikeisellä muodolla (patenttijulkaisu EP 112122A). Tiedetään kuitenkin, että sc-TPA:11a on voimak-kampi kyky sitoutua fibriiniin kuin dc-TPA:lla ja sitouduttuaan fibriiniin, se muuntuu dc-TPA:ksi (D.C. Rijken et ai., J. Biol. Chem. 257 (19Ö2) 2920 - 2925). Jotta saataisiin tehokas hoito verisuonitukoksiin (tromboosiin) tPA:11a, täytyy saada aikaan tPA:n lisääntynyt sitoutumiskyky fibriiniin veren hyytymisessä käyttämällä tPA:n seosta, joka sisältää lisääntyneen määrän sc-TPA:ta tai käyttämällä preparaattia, joka sisältää ainoastaan sc-TPA:ta.
2 96211 Näissä olosuhteissa ja kuu tarkoituksena on tutkia tPA:n ominaisuuksia ja toimintaa yksityiskohtaisemmin, on ollut suuri tarve parantaa menetelmiä, joilla saadaan yksinomaan yksisäikeistä muotoa ja joilla eristetään yksisäikeinen ja kaksisäikeinen muoto erikseen niiden seoksesta.
Ennestään tunnetussa menetelmässä tPA:n valmistamiseksi viljellään ... esimerkiksi sellaisia soluja, jotka ovat syntyjään kykeneviä tuottamaan tPA:ta tai manipuloitu kantamaan tPA-geeniä, ja sitten eristetään tPA saadusta soluviljelmästä ja/tai viljelmäliuoksen supernatantista. Esimerkiksi yllämainitussa patenttijulkaisussa EP 112122A on selitetty menetelmä tPA:n puhdistamiseksi käyttäen Erytrina-trypsiini-inhibiittoria (tästälähin merkittynä ETI) tai immobilisoi-tua Kunits -inhibiittoria, joka tuotetaan F.rytrina lai-iggjman ja muissa Ervtrina kasvien siemenissä ja toimii trypsii-nin, plasmiinin ja tPA:n inhibiittorina, mutta ei urokinaa-sin inhibiittorina. Tässä menetelmässä kuitenkaan ei ole otettu huomioon erillistä sc-TPA:n eristämistä dc-TPA:sta.
Aikaisemmin tunnetussa sc-tPA:n valmistusmenetelmässä pro-teinaasi-inhibittori, kuten aprotiniini, lisätään elatusnes-teeseen estämään tPA:n muuntumista yksisäikeisestä kaksisäi-keiseksi muodoksi <D.C.Rijken et ai., J. Biol. Chem 256 (1981) 7035 - 7041).
Eräässä toisessa sc-tPA:n puhdistusmenetelmässä käytetään immobi1isottua monokloonista vasta-ainetta, joka adsorboi spesifisesti sc-TPA:n (BioPoolin luettelo, Ruotsi). Tämä menetelmä on kuitenkin huonompi verrattuna menetelmään,jossa ETI vastaa tPA:n adsorbtiokapasiteetista ja käytetyn pylvään stabiilisuudesta. Valitettavasti tämä menetelmä ei voi poistaa epäpuhtautta, joka on proteiini, jonka molekyylipai-no on 110000 + 20000 daltonia ja potentiaalisesti toimii antigeeninä reagoidessaan anti-ihmis-tPA-vasta-aineen kanssa.
3 96211
Keksinnön yhteenveto
Useiden tutkimusten kuluessa, jotka käsittivät menetelmiä tPA:n puhdistamiseksi raaka-tPA preparaatista, neljä tämän keksinnön keksijää haki patenttia keksinnölle, joka sisältää menetelmän eristää ja poistaa proteiini, jolla on molekyyli-paino 110000 + 20000 daltonia ja joka reagoi anti-ihmis-tPA-vasta-aineen kanssa, Jota syntyy elatusnesteessä, joka sisältää sikiövasikan seerumia, ja menetelmän viljellä geeni-manipuloinnilla tuotettuja transformoituja soluja Ja erottaa selektiivisesti ihmissolusta peräisin oleva tPA isäntäsolus-ta peräisin olevasta tPA:sta (hakemusjulkaisu FI 863111).
Ja edelleen laajojen tutkimusten kuluessa, jotka koskivat se-TPA:n ja dc-TPA:n ominaisuuksia, tämän keksinnön keksijät ovat selvittäneet, että nämä kaksi tPA:n muotoa vaihtelevat affiniteetiltaan ETI:iin nähden ja ovat nyt loppuunsaattaneet tämän keksinnön kyseisen havainnon tuloksena.
Tämän keksinnön kohteena on kehittää menetelmä se-TPA:n ja dc-TPA:n eristämiseksi niiden seoksesta tehokkaasti ja helposti.
Toinen tämän keksinnön kohde on kehittää menetelmä sc-TPA:n ja /tai dc-TPA:n eristämiseksi raaka-tPA preparaatista, joka sisältää sc-TPA:ta ja dc-TPA:ta.
Menetelmät näiden tavoitteiden saavuttamiseksi koostuvat vaiheista, joissa sc-TPA:ta ja dc-TPA:ta sisältävä seos viedään läheiseen kosketukseen immobilisoidun ETI-pylvään kanssa tPA:n adsorboimiseksi ja sitten eluoidaan selektiivisesti haluttu sc-TPA ja/tai dc-TPA muuttamalla eluentin pH:ta tPA:n eluoimiseksi.
Eräässä tänän keksinnön sövellutusmuodossa voidaan eristää yhtä kahdesta muodosta yksinomaan tai kaksi muotoa toisistaan ja puhdistaa halutusti.
4 96211
Eräässä toisessa tämän keksinnön sovellutusmuodossa sc-TPA ja/tai dc-TPA voidaan tehokkaammin eristää ja puhdistaa lisäämällä guanidiini- tai amidiinijohdannaisia, kuten argi-niinia tai bentsamidiinia, eluenttiin eluoimaan tPA pylväästä.
Tämä keksintö on käyttökelpoinen riippumatta tPA:n tuottaneesta solutyypistä. Tarkemmin sanoen sc-TPA ja/tai dc-TPA voidaan eristää mistä tahansa nisäkässoluista kuten melanoo-masoluista ja ihmisen normaaleista soluista tai soluista, joihin on lisätty ihmisen tPA-geeni geenimanipuloinnilla. Lisäksi tämä keksintö tekee mahdolliseksi eristää ja puhdistaa sc-TPA ja dc-TPA seerumipitoisesta väliaineesta samoin kuin seerumivapaasta väliaineesta, siis riippumatta elatus-nesteen koostumuksesta.
Yksityiskohtainen kuvaus suositeltavista suoritusmuodoista
Eräässä tämän keksinnön muodossa sc-TPA:n ja dc-TPA:n seos ajetaan ensiksi tPA:n adsorboimiseksi pylvään läpi, jossa on kantajana immobilisoitu ETI,minkä Jälkeen sc-TPA eluoidaan eluentilla, jonka pH on vähintään 4,5 ja dc-TPA eluentilla, jonka pH on alle 4,5.
Toisessa tämän keksinnön muodossa sc-TPA:n ja/tai dc-TPA:n seos ajetaan läpi pylvään, jossa on kantajana immobilisoitu ETI, ja jos halutaan yksinomaan sc-TPA:ta, pylväs käsitel-.. lään eluentilla, jonka pH on vähintään 4,5, ja jos halutaan • yksinomaan dc-TPA:ta, pylväs käsitellään eluentilla, jonka pH on alle 4,5. Näin joko sc-TPA tai dc-TPA voidaan eristää ja puhdistaa tarvittaessa.
f 5 96211
Eräässä toisessa tämän keksinnön muodossa ylläesitetty eristys- ja puhdistusmenetelmä voidaan tehokkaammin suorittaa lisäämällä amidiinijohdosta tai guanidiinijohdosta, kuten ai— giniinia ja bentsamidiinia eluentin lisäaineeksi. Esimerkiksi eluointikuvaja, jossa on riittävän terävä tPA-affini-teettipiikki (piikit), voidaan aina saada erilaisissa eluointiolosuhteissa, joihin kuuluu vaihtelu pylvään koossa ja vastaavassa.
Suositeltavat tämän keksinnön mukaiset esimerkit ETI:n immo-bilisointikantajaksi ovat liukenematon agaroosi, dekstraani, selluloosa, polyakryyliamidi ja polyeteeniglysidyylimetakry-laattipolymeeri. Suositeltavat esimerkit menetelmistä ETI:n lmmobilisoimiseksi koostuvat tavallisista tunnetuista menetelmistä, kuten tyypillisesti menetelmästä sitoa ETI kantajaan, joka on eslaktlvoitu syaanibromidi 11a, hiili-inudokop- lausmenetelmästö, missä vapaa aminoryhmä sidotaan vapaaseen karbonyyliryhmään, ja glutaarialdehydikoplausmenetel- mästä, missä aminoryhmä sidotaan kantajaan, joka aikaisemmin on muunnettu aminoalkyylimuotoon. Eräs toinen esimerkki im-mobllisolduksi ETI:n kantajaksi on perjodaattiaktivoitu kantaja, missä muodostunut aldehydiryhmä reagoi ETI:n amino-ryhmän kanssa pH-välillä 4 - 6 Ja Schiffin emäkseksi ja sen jälkeen pelkistetään natriumboorihydridillä tai natriumsyaanlboorihydridlllä. Edelleen kantajamaterlaali voidaan muuntaa hydratsiinisukkinyylijohdokseksi, jossa karboksyyliligandi sidotaan aminoryhmään EDC:n (1-etyy-li-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi) tai diatsonoi-misen kautta. Selluloosakuidut ja hiukkaset muutetaan hyd-ratsiinijohdoksiksi, jolloin voidaan käyttää Parikh et ai.
' mukaista menetelmää (Methods in Enzymology 34_. 77 - 102, julkaisija V.B. Jakobi and Vilcheck, Academic Press, N.Y.). Polyakryyliamidihiukkaset voidaan sitoa suoraan glutaarial-dehydikopiausmenetelmällä tai p-aminobentsamidoetyylijoh-doksen tai hydratsiinijohdoksen diatsonoinnilla.
6 96211 Tämän keksinnön mukaisesti eluentit tPA.n eluoimlseksi ovat happoliuokset, joiden pH on alle 6, vesiliukoiset suolaliuokset ja puskuriliuokset.
Suositeltavina esimerkkeinä tällaisista happoliuoksista ovat sellaiset, jotka sisältävät vähintään yhden hapon, joka on valittu hapoista, joihin kuuluu tyypillisesti sitruunahappo, oksaalihappo, maitohappo, meripihkahappo, etikkahappo, ftaa-lihappo, glutamiinihappo, asparagiinihappo, adipiinihappo, fosforihappo ja vetykloridihappo.
Suositeltavina esimerkkeinä tällaisista vesiliukoisista suolaliuoksista ovat vesiliuokset, jotka sisältävät vähintään yhden suolan, joka on valittu suoloista, joita ovat tyypil-listi natriumkloridi, kaliumkloridi, litiumkloridi, ammo-niumkloridi, bariumkloridi, kalsiumkloridi, magnesiumkloridi, natriumsulfaatti, ammoniumsulfaatti, kaliumnitraatti, ka- liumtiosyanaatti, natriumtiosyanaatti, ammoniumtiosyanaatti.
Edelleen esimerkkinä suositeltavista puskuriliuoksista ovat natriumfosfaattipuskuri, kaliumfosfaattipuskuri, veronaali-puskuri, seokset yhdistelmistä kuten natriumfosfaatti - fosforihappo, kaliumfosfaatti - fosforihappo, sitruunahappo -natriumsitraatti, meripihkahappo - boraatti, maitohappo -natriumlaktaatti, etikkahappo - natriumasetaatti, oksaalihappo - natriumoksalaatti, glysiini - vetykloridihappo, ka-liumvetyftalaatti - natriuxnhydroksidi.
Nämä eluentit voivat edelleen sisältää yhden tai useamman vesiliukoisen orgaanisen liuottimen.
Käytettäessä lisäaineena amidiinijohdosta tai guanidiinijohdosta tPA:n eluoimlseksi suositeltava lisäainekonsentraatio \ on aluella 1 mM:sta maksimiliukoisuuteen. Esimerkiksi • t pH: ssa välillä 4,5 - 6,0 sopiva konsentraatio pienenee suh- 7 96211 teessä lähestyttäessä pH: ta 4,5,. kun taas korkeimpaa kon-sentraatiota tarvitaan lähestyttäessä pH: ta 6,0.
Tänä keksinnön eräs suoritusmuoto käsittää vaiheet, joissa ajetaan soluviljelmän supernatantti, jossa on ihmisen - tPA:ta ETI—pylvään läpi tPA:n adsorboimiseksi, poistetaan epätoivotut proteiinit pesemällä, seuraavaksl otetaan talteen pylväästä sc-TPA käyttäen eluenttia, Jonka pH on 4,5 - 6,0 lisäaineen kanssa Ja sitten otetaan talteen dc-TPA muuttamalla eluentin pH alle 4,5.
A}an ammattimiehet tietävät, että amidiiniJohdokset tai gua-*· nidiinijohdokset sitoutuvat kilpailevasti trypsiinityyppisen proteinaasin aktiiviseen keskukseen dissosioimaan entsyy-mi-inhibiittorikompleksin. Kuitenkin on täysin uutta tekniikkaa käyttää tätä ilmiötä tällaiseen spesifiseen tapaan eristää sc-TPA ja dc-TPA tarkoituksenmukaisimmissa eristys-o1osuhte1ssa.
Jos lähtöaine, jota käsitellään tämän keksinnön mukaan, sisältää mahdollisesti pieniä määriä epätoivottuja aineita, kuten trypsiinin tapaisia ensyymejä, jne., nämä aineet voidaan adsorboida tai desorboida ETI:stä ja ne toimivat intei— feroivina tekijöinä tämän keksinnön mukaisessa puhdistusprosessissa. Tarvitaessa suositellaan esikäsittelyä näiden epätoivottujen aineiden poistamiseksi.
Tämä poistamisprosessi suoritetaan käyttämällä immobilisoi-tua soijapaputrypsiini-inhibiittoria (josta tästälähin käytetään lyhennettä STI) tai jotain muuta Kunits-tyyppistä in hibiittoria, jota syntyy soijapavun siemenissä ja jolla on samanlainen molekyylipaino kuin ETI:llä ja aminohapposekvenssi 60 %:sti homologinen verrattuna ETI:in.
8 96211 STI on hyvin samanlainen kuin ETI speslfisyydessään, mutta se ei inhiboi tPA:ta. Näiden kahden inhibiittorin yhdistetty käyttö johtaa selektiivisyyteen, joka on verrannollinen siihen, joka saavutetaan käytettäessä immobilisoitua ei-ihmisen tPA monokloonista vasta-ainetta. Tämä menetelmä sisältää soluvlljelmälluoksen supernatantin, joka sisältää ihmisen tPA:ta, ajamisen immobilisoidun STI pylvään läpi sitomaan osan pientä määrää epätoivottua proteinaasia, joka sisältyy viljelmän supernatenttiin, ja sitten saadun effluent in ajamisen immobilisoidun ETI-pylvään läpi sitomaan tPA:n, ETI-pylvään pesun, jotta epätoivotut proteiinit poistuvat, Ja lopuksi sc-TPA:n ja dc-TPA:n eristämisen ja puhdistamisen erillisesti muuttamalla eluentin pH:ta.
Erään tämän keksinnön tärkeän muodon mukaisesti saadaan menetelmä, joka on käyttökelpoinen riippumatta tPA:ta sisältävän solun tyypistä. Tarkemmin sanoen, tämä keksintö tekee mahdolliseksi eristää ja puhdistaa sc-TPA:n ja/tai dc-TPA:n mistä tahansa solutyypistä kuten melanoomasoluista, ihmisen normaalisoluista ja soluista, jotka on transformoitu ihmisen tPA-geenillä geenimanipulaatiolla. Lisäksi tämä keksintö tekee mahdolliseksi eristää ja puhdistaa sc-TPA Ja/tai dc-TPA viljelmän supernatantista, johon on lisätty seerumia samoin kuin seerumivapaasta viljelmän supernatantista, siis riippumatta elatusnesteen koostumuksesta.
Erään toisen tämän keksinnön huomattavan suoritusmuodon mukaisesti kehitetty menetelmä on sopivasti käyttökelpoinen missä tahansa sc-TPA:n ja/tai dc-TPA:n eristys- ja puhdis-tusvaiheessa tPA:n erilaisissa käsittelyissä tai preparatii-visessa prosessissa tPA:n valmistamiseksi. Esimerkiksi halutun sc-TPA:n ja/tai dc-TPA:n eristäminen ja puhdistaminen suoritetaan viljelemällä soluja, jotka kykenevät tuottamaan tPA:ta ja sitten käsittelemällä saatua viljelmästä peräisin olevaa seosta tämän keksinön mukaisella menetelmällä. Vil-. jelmästä peräisin oleva seos tarkoittaa viljelysolujen raa- 9 96211 kauutosta, solutonta viljelmäsupernatanttia tai niiden prosessoitua materiaalia. Hikä tahansa näistä valitaan tarvittaessa.
Kuut tämän keksinnön tärkeät muodot tulevat ymmärrettäviksi seuraavista ihmisen tPA:n puhdistusmenetelmien kuvauksista.
Esimerkki 1.
Seuraavissa esimerkeissä käytetetyt pylväät, joissa on kantajana immobillsoitu affiniteettiagentti, ETI tai STI, valmistettiin seuraavalla tavalla.
Brytrina latissima:n siemenet koottiin Ja valmistettiin Jou-bert et ai. menetelmän mukaan (Hoppe-Seylers*s Z. Physiol. Chem. 362 <1981) 531 - 538). Jauhetut siemenet, Joista rasva oli poistettu, annettiin seisoa yli yön 10 °C lämpötilassa 0,5 M HaCl liuoksessa uuttumassa. Liuos siemenineen sentrifugoitiin supernatantin keräämiseksi ja aiottu aine kerättiin supernatantista ammoniumsulfaatilla seostamalla. Käin saatu materiaali kromatografoltiin onnistuneesti Sepha-dex G-50 (Pharmacia Fine Chemicals), DEAE-selluloosa (Phoenix Chemicals) ja DEAE-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) -geeleillä. Saatu puhdistettu valmiste antoi elektroforeesilla 15 X polyakryyliamidigeeIissä, jossa oli 0,1 X nat-riumdodekyylisulfaattia (SDS), yhden vyöhykkeen, jonka ilmeinen molekyylipaino oli 22000 daltonia.
Kaksikymmentäkuusi milligrammaa tätä puhdistettua valmistetta sidottiin 5 ml bromisyanidiaktivoituun agaroosiin (Sepha-rose, Pharmacia Fine Chemicals), joka oli tasapainoitettu fosfaattipuskurilla, pH 7,4, joka sisälsi 0,4 M NaCl, 0,1 % Triton X-100 (Vako Jun-yaku Co. , Japani) Ja 0,02 % natriumat- -sidia stabilisattorina, ja lopuksi pakattiin kertakäyttömuo-viruiskuun muodostamaan 5 ml pylvään (tästälähin merkittynä . ETI-Sepharosepylväs).
1β 96211
Kaksikymmentäviisi milligrammaa kromatografisesti - puhdasta STI:tä (Sigma Co.) sidottiin 5 ml br omi syanidiakt ivo ituun aga-roosiin, joka oli tasapainoitettu fosfaattipuskurilla, pH 7,4, joka sisälsi 4 M NaCl, 0,1% Triton X-100, ja lopuksi pakattiin kertakäyttömuoviruiskuun muodostamaan 5 ml pylvään (tästälähin merkittynä STI-Sepharosepylväs).
Esimerkki 2.
Kaksi litraa ihmisen melanoomasoluviljelmän supernotonttia (Bowes, ATCC CRL 1224 G361), Joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua (56 “*0 30 min) sikiövasikan seerumia ja 20 KIU (Kallikrein inhibittoriyksikköä)/ml aprotiniiniä stabiloitiin 0,02 % Tween 60:11a (Vako Jun-yaku Co, Japani) Ja 0,4
NaCl:11a Ja ajettiin STI-Sepharosepylvääseen.
STI-pylväästä saatu eluentti kerättiin ja plasminogeenistä riippuva fibrinolyyttinen aktiivisuus mitattiin. Hoin 98 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin. Eluentti stabiloitiin 0,1 M NaClrllä (lopullinen konsentraatio) ja sitten kohdistettiin ETI-Sepharosepylvääseen.
ETI-».pylväästä tullut eluentti kerättiin ja mitattiin plasminogeenistä riippuva fibrinolyyttinen aktiivisuus. Noin 10 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin. Anti-ih-mis-tPA-vasta-aineilla suoritetulla tsymografiällä, joka suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen, effluentti osoitti kaksi plasminogeeniaktivaattori-fraktiota, toisen, jolla oli molekyylipaino 110000 ;+ 20000 daltonia ja toisen jolla molekyylipaino oli 70000 daltonia. Kun kaikki eluentti oli ajettu pylvään läpi, pylväs pestiin 20 kertaisella pylvään tilavuudella nestettä, joka sisälsi 1,0 M NaCl ja 0,2 % Tween 80. Talteenotetulla nesteellä oli noin 5 % aktiviisuus pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta ja se osoitti kaksi plasminogeeniaktivaattori- 11 96211 fraktiota tsymografiällä, toisen, jonka molekyylipaino oli 110000 + 20000 daltonla, ja toisen, jonka molekyylipaino oli 70000 daltonla.
Pylvääseen adsorboituneet proteiinit eluoitiin käyttämällä lineaarista pH gradlenttia välillä 5,5 - 3,0 käyttäen 0,2 M sitruunahappopuskuria, joka sisälsi 0,15 M NaCl.
Tässä eluoinnista havaittiin kaksi aktiivisuuspiikkiä, toinen pH:ssa 5,2 - 4,5 eluoitunut, Ja toinen pH:ssa 4,5 - 3,7 ' eluoitunut piikki. Näillä kahdella fraktiolla oli yhteinen 70000 daltönin molekyylipaino SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesilla. Näiden yhdistettyjen fraktioiden aktiivisuus oli Θ0 - 85 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta.
Nämä kaksi fraktiota, sen jälkeen, kun ne oli pelkistetty β-merkaptoetanolilla, kohdistettiin SDS^polyakryyliamidigee-lielektroforeesiin ja hopeavärjäysanalyysiin. Paljastui, että fraktio, joka eluoitui pH-alueella 5,2 - 4,5, osoitti vyöhykkeen, Jossa molekyylipaino oli 70000 daltonla tai hitaammin migratoituvan vyöhykkeen geelillä pelkistyksen jälkeen, kun taas fraktio, joka eluoitui pH alueella 4,5 - 3,7, osoitti vyöhykkeen, jolla oli molekyylipaino 30000 - 40000 daltonla, mutta molekyylipainon 70000 daltonla molekyylipai-non vyöhyke katosi pelkistyksen jälkeen. Näiden tulosten perusteella puskurilla pH-välillä 5,2 - 4,5 eluoitunut tPA tunnistettiin sc-TPA:ksi ja pH-välillä 4,5 - 3,7 eluoitunut tPA tunnistettiin dc-TPA:ksl.
Esimerkki 3.
Kaksi litraa ihmisen sikiön esinahan solujen soluviljelmän supernatanttia (Flow 7000 (Flow Laboratories Inc. USA)), joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktloitua (56 ®C 30 minuuttia) sikiövasikan seerumia ja 20 KIU/ml aprotiniinia stabiloitiin 0,02 % Tween 80: llä ja 0,4 NaCl:lla ja kohdistettiin » 12 96211 STI-Sepharosepylvääseen samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 2.
STI-pylväästä tullut eluentti kerättiin ja plasminogeenis-tä riippuva fibrinolyyttinen aktiivisuus mitattiin. Noin 98 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin. Eluentti stabiloitiin 1,0 M NaClrllä (lopullinen konsentraatio) ja kohdistettiin sitten ETI-Sepharosepylvääseen.
ETI-pylväästä tullut eluentti kerättiin ja mitattiin plasminogeenistä riippuva fibrinolyyttinen aktiivisuus.
Noin 45 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen anti-ihmis- tPA-vasta-aineella tehdyllä tsymografiällä eluentti osoitti useita fraktioita tai vyöhykkeitä plasminogeeniakti-vaattorille muutamia vyöhykkeitä, joissa oli molekyylipai- no noin 100000 daltonia, useita vyöhykkeitä, joissa molekyyli-paino oli noin 50000 - 70000 daltonia, ja yhden vyöhykkeen, jossa molekyylipaino oli noin 35000 daltonia.
ETI-Sepharosepylväs pestiin 20 kertaisella pylvään tilavuudella 1.0 M NH^HCOa, pH 7,5, joka sisälsi 1,0 M NaCl ja 0,2 %
Tween 80. Talteenotetulla nesteellä oli noin 5 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta ja se osoitti samanlaisia tsymografisiä vyöhykkeitä kuin yllä on kuvattu.
Eluutio suoritettiin samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 2, paitsi että käytettiin puskuria, joka sisälsi o, 15 M NaCl ja 0,1 M glysiiniä, pH 4,5 ja 3,5.
' Tuloksena saatiin samanlainen eluutiokuvaaja, kuin havait tiin esimerkissä 2. Yhdistettyjen fraktioiden aktiivisuus oli 40-50 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta. Näillä kahdella fraktiolla oli keskimääräinen molekyylipaino 70000 daltonia SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Sen , jälkeen, kun nämä kaksi fraktiota oli pelkistetty β-merkap- » 13 96211 toetanolilla, niille suorittiin elektroforeesi ja hopeavär-jäysanalyysi. Paljastui, että pH 4t5;n puskurilla eluoitu-neella fraktiolla oli molekyylipaino 70000 daltonia eikä se osoittanut muutosta molekyylipainossa tai hitaammin migra-toituvan vyöhykkeen geelillä pelkistyksen jälkeen, kun taas fraktiolla, joka eluoitui pH 3,5:n puskurilla, osoitti vyöhykkeen, jolla oli molekyylipaino 30000 - 40000 daltonia, mutta ei sellaista vyöhykettä, joka vastaisi molekyylipainon 70000 daltonin vyöhykettä pelkistyksen jälkeen. Tästä tuloksesta pH:ssa 4,5 eluoitunut tPA tunnistettiin sc-TPA:ksi ja pH 3,5:ssa eluoitunut tPA tunnistettiin dc-TPA:ksi
Esimerkki 4.
Kaksi litraa hiiren fibroblastisolujen, joita oli transformoitu ihmisen tPA-geenillä (hakemusjulkaisu FI 864777), soluviljelmän supernatanttia, jota oli täydennetty 2 % lämmöllä inaktivoitua <56 °C 30 min) sikiövasikan seerumia ja 20 KIU/ml aprotiniiniä, stabiloitiin 0,02¾ Tween 80:11a Ja 0,4 NaCl:lla ja kohdistettiin STI-Sepharosepylvääseen.
STI-pylväästä tullut eluentti kerättiin Ja plasminogeenis-tä riippuva fibrinolyyttinen aktiivisuus mitattiin. Noin 98 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin. Eluentti stabiloitiin 1,0 M NaCl:llä (lopullinen konsentraa-tio) ja kohdistettiin ETI-Sepharosepylvääseen
Eluentti ETI-pylväästä kerättiin ja mitattiin plasminogee-nisyydestä riippuva fibrinolyyttinen aktiivisuus. Noin 10 % • pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin. Anti-ihmis- ' tPA-vasta-aineilla suoritetulla tsymografiällä, joka suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen, eluentti _ osoitti kaksi fraktiota plasminogeeniakti-vaattoria, toisen, jonka molekyylipaino oli 110000 + 20000 daltonia ja toisen, jonka molekyylipaino oli 70000 daltonia. Kun kaikki eluentti oli ajettu pylvään läpi, pylväs pes- 14 96211 tiin 20 kertaiselle pylvään tilavuudella nestettä, joka sisälsi 2,0 M NaCl ja 0,2 % Tween 60. Talteenotettulla nesteellä oli noin 5 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta ja se osoitti kaksi plaminogeeniaktivaattorifraktiota tsymogra-fialla, toisella molekyylipaino oli 110000 + 20000 daltonia, Ja toisella molekyylipaino oli 70000 daltonia.
Pylvääseen adsorboitunut proteiini eluoitiin o,2 M natrium-fosfaattiliuoksella, joka sisälsi 0,15 M NaCl, pH 4f5 ja pH
3,5. Havaittiin samanlainen eluutiokuvaaja kuin esimerkissä 2. Tuloksena saatujen kahden fraktion yhteinen aktiivisuus oli 80 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta. Näillä kahdella fraktiolla oli yhteinen 70000 daltonin molekyylipaino SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
Näille kahdelle fraktiolle, sen jälkeen, kun ne oli pelkistetty β-merkaptoetanolilla, tehtiin SDS-polyakryyliamidi-gee1ielektroforeesi ja hopeavärjäysanalyysi. Paljastui että pH:ssa4,5 eluoitunut liuos osoitti vyöhykkeen, jolla oli molekyylipaino 70000 daltonia ja siten se ei osoittanut muutosta molekyylipainossa tai hitaammin migratoituvan vyöhykkeen geelillä pelkistyksen jälkeen, kun taas pH 3,5 liuos osoitti vyöhykkeen, jolla oli molekyylipaino 30000 - 40000 daltonia, mutta ei sellaista vyöhykettä, joka vastaisi mole- ' kyylipainon 70000 vyöhykettä pelkistyksen jälkeen. Tästä tuloksesta pH:ssa 4,5 eluoitunut tPA tunnistettiin sc-TPA:ksi ja pH:ssa 31 5 eluoitunut tPA tunnistettiin dc-TPA:ksi.
. Esimerkki 5
Kaksi litraa ihmisen melanoomasoluviljelmän supernatanttia (Bowes, ATCC CHL 1224 G361), joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua (56 “C 30 min) sikiövasikan seerumia ja 20 KIU/ml aprotiniinia, stabiloitiin 0,02 % Tween 80:llä ja IM
NaCl:11a Ja ajettiin ETI-SepharosepylvääseenS
15 96211
Pylväästä kerättiin eluentti ja mitattiin plasminogeenis-tä riippuva fibrinolyyttinen aktiivisuus. Noin 10 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin. Anti-ih- mis-tPA-vasta-aineilla suoritetulla tsymografiällä, joka suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen, effluentti osoitti kaksi fraktiota plasminogeeniaktivaattoria, toisen jolla oli molekyylipaino 110000 + 20000 daltonia ja toisen, jolla molekyylipaino oli 70000 daltonia.
Kun kaikki eluentti oli ajettu pylvään läpi, pylväs pestiin 20 kertaiselle pylvään tilavuudella nestettä, joka sisälsi 2 H NaCl Ja 0,2 % Tween Θ0. Talteenotetulla nesteellä oli noin 5 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta ja se osoitti kaksi plasminogeeniaktivaattorifraktiota tsymogra-fialla, toisen, jonka molekyylipaino oli 110000 + 20000 daltonia ja toisen, jonka molekyylipaino oli 70000 daltonia.
Pylvääseen adsorboituneet proteiinit eluoitiin käyttämällä lineaarista pH-gradienttia 6,5 - 3,0 käyttäen 0*2 M veronaa-lipuskuria, joka sisälsi 0,2 M bentsamidiinia ja 0,15 K NaCl.
Tällä eluutiolla havaittiin kaksi aktiivisuuspiikkiä, yksi ’ piikki, joka eluoitui pH-alueella 6,0 - 4,5 Ja toinen pH- alueella 4,5 - 3,5. Näillä kahdella fraktiolla oli yhteinen 70000 daltonin molekyylipaino SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla. Näiden yhdistettyjen fraktioiden aktiivisuus oli 80 - 85 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta.
, »
Sen jälkeen, kun nämä kaksi fraktiota oli pelkistetty β-merkaptoetanolilla, niille tehtiin SDS-polyakryyllamidi-geelielektzoforeesi ja hopeavärjäysanalyysi. Paljastui, että pH-alueella 6,0 - 4,-5 eluoitunut fraktio osoitti vyöhykkeen, Jonka molekyylipaino oli 70000 daltonia ja siten ei muutosta molekyylipainossa, tai hitaammin migratoituvan vyö- 16 96211 hykkeen geelin pelkistyksen jälkeen, kun taas fraktio, joka eluoitui pH-alueella 4,5 _ 3,5 osoitti vyöhykkeen, jolla oli molekyylipaino noin 30000 - 40000 daltonia, mutta molekyyli-painon 70000 daltonia vyöhyke katosi pelkistyksen jälkeen. Näistä tuloksista puskurilla pH:ssa 6,0 - 4,5 eluoitunut tPA tunnistettiin sc-TPA:ksi ja pH aluella 4,5 - 3,5 eluoitunut tPA tunnistettiin dc-TPA:ksi.
Esimerkki 6.
Kaksi litraa ihmisen sikiön esinahan solujen (Flow 7000) soluviljelmän supernatanttia, joka sisälsi 10 % lämmöllä inak-tivoitua <56 “C 30 minuuttia) sikiövasikan seerumia ja 20 KIU/ml aprotiniinia stabiloitiin 0,02 % Tween 80:11a ja 1 M NaCl:lla ja kohdistettiin ETI-Sepharosqpylvääseen.
ETI-pylväästä kerättiin eluentti ja mitattiin plasminogeenis-tä riippuva - fibrinolyyttinen aktiivisuus. Noin 45 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin.
SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen tehdyn tsy- mografian mukaan effluentti osoitti useita fraktioita tai vyöhykkeitä plasminogeeniaktivaattorille; muutamia vyöhykkeitä, joissa oli molekyylipaino noin 100000 daltonia ja useita ' vyöhykkeitä, joissa molekyylipaino oli noin 50000 - 70000 daltonia ja yhden vyöhykkeen, jossa molekyylipaino oli noin 35000 daltonia.
ETI-Sepharosepylväs pestiin 20 kertaiselle pylvään tilavuudella nestettä, joka sisälsi o, 1 M dinatriumfosfaatti-nat-riumhydroks-idipuskuria, pH 9,5, joka sisälsi 2,0 M NaCl. Talteenotetulla nesteellä oli noin 5 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta ja se osoitti samat vyöhykkeet kuin yllä tsymografiällä kuvatussa.
„ 96211 - Eluutio suoritettiin 0,1 M natriumfosfaatti-fosforihappo- liuoksella. Joka sisälsi 0,3 M arginiinia ja 0,15· M NaCl <pH 5,5), ja 0,2 M sitruunahappopuskurilla <pH 3,0), joka sisälsi 0,15 M NaCl.
Tuloksena saatiin eluaatista kaksi fraktiota eri pH-pusku-reilla. Yhdistettyjen fraktioiden aktiivisuus oli 40 - 50 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta. Näillä kahdella fraktiolla oli yhteinen 70000 daltonin molekyylipaino SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
Näille kahdelle fraktiolle, sen jälkeen, kun ne oli pelkistetty β-merkaptoetanolilla, tehtiin SDS-polyakryyliamidigee-lielektroforeesi ja hopeavärjäysanalyysi. Paljastui, että pH 5,5-puskurilla eluaatilla oli molekyylipainon 70000 daltonin vyöhyke ja siten se ei osoittanut muutosta molekyyli-painossa tai osoitti hitaammin migratoituvan vyöhykkeen geelillä pelkistyksen jälkeen, kun taas pH 3,01 -puskurilla eluaatilla oli vyöhyke, jonka molekyylIpaino oli 30000 - 40000 dalto-nia, mutta molekyylipainon 70000 vyöhykettä vastaava vyöhyke katosi pelkistyksen jälkeen.
Tästä tuloksesta pH:ssa 4,5 eluoitunut tPA tunnistettiin sc-TPA:ksi ja pH:ssa3,5 eluoitunut tPA tunnistettiin dc-TPA:ksi.
Esimerkki 7.
Kaksi litraa hiiren fibroblastisolujen, joita oli transfoi— moitu ihmisen-tPA geenillä <hakemusjulkaisu FI 864777), su-pernatanttia, joka lisäksi sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua <56 eC 30 min) sikiövasikan seerumia ja 20 KIU/ml aprotinii-nia, stabiloitiin 1 M NaCl:11a Ja kohdistettiin ETI-Sepharo-sepylvääseen.
18 96211
Eluentti ETI-pylväästä kerättiin ja mitattiin plasminogee-nistä riippuva fibrinolyyttinen aktiivisuus. Noin 10 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin. Anti-ihmis-tPA-vasta-aineilla suoritetulla tsymograafiällä, joka suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen, effluentti osoitti kaksi fraktiota plasminogeeniaktivaatto-rille, toisen, jonka molekyylipaino oli noin 110000 + 20000 daltonia ja toisen, missä molekyylipaino oli noin 70000 dal-tonia. Kun kaikki eluentti oli ajettu pylvään läpi, pylväs pestiin 20 kertaiselle pylvään tilavuudella 2 M NaCl-liuosta. Talteenotetulla nesteellä oli noin 5 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta ja se osoitti tsymografiällä kaksi vyöhykettä plasminogeeniaktivaattorille, toisella oli molekyylipaino 110000 + 20000 daltonia, ja toisella molekyyli-paino 70000 daltonia.
Pylvääseen adsorboituneet proteiinit eluoitiin sitten 0,1 M nat-riumfosfaattipuskurilla <pH6,0), joka sisälsi 0,5 M bentsa-midiinia ja 0,15 M NaCl, ja 0,1 M sitruunahappopuskurilla (pH 3,0), joka sisälsi 0,15 M NaCl. Kaksi erilaista fraktiota saatiin kahdesta erilaisesta eluaatista. Saatujen kahden fraktion yhteinen aktiivisuus oli 80 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta. Käillä kahdella fraktiolla oli yhteinen 70000 daltonin molekyylipaino SDS-polyakryyl'iamidigeeli-elektroforeesilla.
Sen jälkeen, kun nämä kaksi fraktiota oli pelkistetty β-mer-kaptoetanolilla, niille tehtiin SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi ja sitten hopeavärjäysanalyysi. Paljastui, että pH 6,0 puskurilla eluaatti osoitti molekyylipainon noin 70000 daltonin vyöhykkeen ja siten ei muutosta muutosta molekyyl ipainossa tai hitaamiin migratoituvan vyöhykkeen geelillä pelkistyksen jälkeen, kun taas pH 3,0 puskurilla eluaatti osoitti vyöhykkeen, jolla oli molekyylipaino 30000 . - 40000 daltonia, mutta ei sellaista vyöhykettä, joka vas- 19 96211 talsi molekyy11painon 70000 vyöhykettä pelkistyksen jälkeen. * Tästä tuloksesta pH:ssa 6,0 eluoitunut tPA tunnistettiin sc- TPA:ksi ja pH:ssa 3,0 eluotitunut tPA tunnistettiin dc-TPA:ksi.
Esimerkki 8.
Kaksi litraa kiinanhamsterin munasarjasolujen, joita oli transformoitu ihmisen tPA-geenillä (CHO-cell C1271, ATCC CRL 1616), viljelyn supernatanttia, joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua <56 °C 30 min) sikiövasikan seerumia ja 20 KIU/ml aprotiniinia, stabiloitiin 1 M NaCl ja kohdistettin 5 ml ETI-Sepharosepylvääseen, joka oli tasapainoitettu 0,05 M natriumfosfaattipuskurilla <pH7,5), joka sisälsi 1,0 M NaCl·. Pylväs pestiin sen jälkeen 0,05 M Na2HPO*:11a (pH 9,5), joka sisälsi 2, OM NaCl Ja 10 mM arginiinia.
ETI-pylvään koko eluentilla oli noin 10 % pylvääseen käytetystä plasminogeenistä riippuvasta fibrinolyyttisestä aktiivisuudesta, ja sillä oli tsymograflalla vyöhyke, jonka molekyylipaino oli 110000 + 20000 daltonia ja vyöhyke, jonka molekyylipaino oli 70000 daltonia.
Pylvääseen adsorboituneet proteiinit eluoitiin ensiksi 0,05 M Na2HPCX* - NaOH puskurilla (pH 4,5), joka sisälsi 0,01 M arginiinia ja 0,1 M NaCl. Eluaatin fibrinolyyttinen aktiivisuus oli 60 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta. Pylvääseen jääneet proteiinit eluoitiin o,l M sitruunahappo-puskurilla (pH 3,0), joka sisälsi 0,1 M NaCl. Noin 25 % , . pylvääseen käytetystä aktivisuudesta saatiin talteen. Näil lä kahdella fraktiolla oli yhteinen 70000 daltonin molekyylipaino SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
Sen jälkeen, kun nämä kaksi fraktioita oli pelkistetty β-merkaptoetanolilla, niille tehtiin SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesi ja hopeavärjäysanalyysi. Paljastui, että 2* 96211 pelkistyksen jälkeen 4^5 pH:n eluaatti osoitti vyöhykkeen, missä oli molekyylipaino 70000 daltonia ja siten ei muutosta molekyylipainossa, tai hitaammin migratoituvan vyöhykkeen geelin pelkistyksen jälkeen, kun taas pH 3,0 puskurilla eluaatti osoitti vyöhykkeen, jolla oli molekyylipaino 30000 - 40000 daltonia, mutta molekyylipainon 70000 daltonia vyöhyke katosi pelkistyksen jälkeen. Tästä tuloksesta vahvistui, että pH:ssa 4,5 puskurilla eluoitunut tPA oli sc-TPA ja pH:ssa 3,0 eluoitunut tPA oli dc-TPA.
Kokeellisista tuloksista pH:n ja arginiinin konsentraation välinen suhde sc-TPA:n eluoimiseksi paljastui seuraavaksi. pH : ssa 4,5, 1 mM - 50 mM; pH: ssa 5,0, 0,03 M tai enemmän; pH:ssa 5,5, 0,10 M tai enemmän ja pH:ssa 6,0, 0,2 M tai enemmän.
Esimerkki 9.
Yksi mooli NaCl <lopullinen konsentraatio) lisättiin 2 litraan ihmisen sikiön amnionkalvon solujen supernatanttiin (FL, ATCC CCL-62), jotka oli transformoitu ihmisen tPA-gee-nillä, johon oli assosioitu ihmisen sytomegalovirus (HCMV) promoottorina ihmisen tPA-ekspressioon. Soluviljelmän supernatant ista puhdistettiin sitten yksisäikeinen tPA ja kak-sisäikeinen tPA käyttäen ETI-pylvästä samaan tapaan kuin kuvattiin esimerkissä 8.
pH:ssa4,5 ja3,0 eluoituneiden fraktioiden fibrinolyytinen aktiivisuus oli noin 70 % Ja noin 15 %, vastaavasti, pylvää-. seen käytetystä aktiivisuudesta.
Esimerkki 10.
Isäntäsolut Saccharomyces cerevisiae, jotka oli transformoitu ihmisen tPA geenillä, viljeltiin tavanomaisella menetel-, mällä (Principles and Practice of Recombinant DNA Research 21 96211 with Yeast in the Molecular Biology of Yeast Saccharomyces: . Metabolism and Gene Expression pp. 603 - 636, Cold Spring
Harbor Labratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
Solut rikottiin lasihelmillä ja upotettiin uutettavaksi 0,05 M natriumfosfaattipuskuriin (pH 7,5 ) , joka sisälsi 1 M NaCl ja o,02 % Tween 80. Suodatetulle uutteelle tehtiin tPA:n puhdistus samalla tavalla kuin esimerkissä 6.
Puskurilla pH 5,5 saadulla eluaatilla oli molekyylipaino 70000 daltonia, mikä ei muuttunut pelkistyksessä, joka tehtiin kuten yllä olevissa esimerkeissä 2-8, ja osoitti 85 % aktiivisuutta pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta. Puskurin pH 3,0 eluaatin molekyylipaino (70000 daltonia) muuttui pelkistyksessä, siis, vyöhyke, jolla oli molekyylipaino 70000 daltonia katosi Ja vyöhyke, jolla oli molekyylipaino 30000 - 40000 daltonia, ilmestyi sen sijaan. Noin 10 % pylvääseen käytetystä aktiivisuudesta havaittiin tässä eluaa-tissa.
i

Claims (18)

  1. 96211
  2. 1. Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaatto-rin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi erikseen niitä molempia sisältävästä seoksesta, tun- 5 nettu siitä, että menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: (a) seos, joka sisältää yksisäikeisiä ja kaksisäikeisiä tPAiita, viedään pylvääseen, jossa on immobilisoitua Erytrina trypsiini-inhibiittoria affiniteettiaineena näiden tPAiien adsorboimiseksi tähän pylvääseen; io (b) pylväs käsitellään eluentilla, jonka pH on alueella 4,5 - 6,0 yksisäikeisen tPA:n eluoimiseksi selektiivisesti, (c) pylväs käsitellään eluentilla, jonka pH on alle 4,5 kaksisäikeisen tPA:n eluoimiseksi selektiivisesti.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että eluentti sisältää amidiinijohdoksen tai guani- diinijohdoksen.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluentti sisältää amidiinijohdoksen tai guani-diinijohdoksen, jonka konsentraatio on vähintään 1 mM.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amidiinijohdos on bentsamidiini.
  6. 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että guanidiinijohdos on arginiini.
  7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 25 siitä, että seos on peräisin tPA:n tuottavien solujen solu viljelmästä. .. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelmän solut ovat melanoomasoluja.
  8. 8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että soluviljelmän solut ovat rekombinanttisoluja, jotka on transformoitu siirtämällä niihin ihmisen tPA-geeni.
  9. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelmän solut ovat kiinanhamsterin munasar-jasoluja, hiivasoluja tai hiiren fibroblastisoluja.
  10. 10. Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaatto- rin (tPA) puhdistamiseksi ja eristämiseksi seoksesta, joka sisältää yksisäikeistä tPA:ta ja kaksisäikeistä tPA:ta, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa tämä seos viedään pylvääseen, jossa on immobilisoitua Erytrina trypsiini- 96211 inhibiittoria affiniteettiagenttina tämän seoksen tPA:ien ad-sorboimiseksi tähän pylvääseen, ja sitten eluoidaan selektiivisesti tähän pylvääseen adsorboitu mainittu yksisäikeinen tPA eluentilla, jonka pH on alueella 4,5 - 6,0.
  11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluentti sisältää amidiinijohdoksen tai guani-diinijohdoksen.
  12. 12. Patenttivaatimuksen li mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluentti sisältää amidiinijohdoksen tai guani- 10 diinijohdoksen, jonka konsentraatio on vähintään 1 mM.
  13. 13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amidiinijohdos on bentsamidiini.
  14. 14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että guanidiinijohdos on arginiini.
  15. 15. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seos on peräisin tPA:n tuottavien solujen soluviljelmästä.
  16. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelmän solut ovat melanoomasoluja.
  17. 17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelmän solut ovat rekombinanttisoluja, jotka on transformoitu siirtämällä niihin ihmisen tPA-geeni.
  18. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelmän solut ovat kiinanhamsterin munasar- 25 jasoluja, hiivasoluja tai hiiren fibroblastisoluja. 96211
FI871948A 1986-05-07 1987-05-04 Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi FI96211C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10320086 1986-05-07
JP10320086A JPH0779692B2 (ja) 1986-05-07 1986-05-07 一本鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法
JP18685086 1986-08-11
JP18685086 1986-08-11

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI871948A0 FI871948A0 (fi) 1987-05-04
FI871948A FI871948A (fi) 1987-11-08
FI96211B FI96211B (fi) 1996-02-15
FI96211C true FI96211C (fi) 1996-05-27

Family

ID=26443851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI871948A FI96211C (fi) 1986-05-07 1987-05-04 Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4898825A (fi)
EP (1) EP0245100B1 (fi)
AU (1) AU590840B2 (fi)
CA (1) CA1284961C (fi)
DE (1) DE3780506T2 (fi)
DK (1) DK173151B1 (fi)
FI (1) FI96211C (fi)
NO (1) NO173287C (fi)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001355A (en) * 1982-12-14 1999-12-14 Dowdle; Eugene Bernard Davey Pro-tPA for the treatment of thrombosis, embolism and related conditions
JP2507339B2 (ja) * 1986-08-11 1996-06-12 三井東圧化学株式会社 粗tPAの精製方法
US4898826A (en) * 1987-12-10 1990-02-06 Invitron Corporation Method to solubilize tissue plasminogen activator
DE3832898A1 (de) * 1988-09-28 1990-04-12 Boehringer Mannheim Gmbh Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat
US5676947A (en) * 1989-02-07 1997-10-14 Boehringer Manneheim Gmbh Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins
US6326155B1 (en) 1995-03-20 2001-12-04 Dyax Corp. Engineering affinity ligands for macromolecules
US5612473A (en) * 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US5731186A (en) * 1996-02-05 1998-03-24 Schering Aktiengesellschaft Method for the production of rDSPA α1
ES2229347T3 (es) * 1996-03-20 2005-04-16 Dyax Corp. Purificacion del activador del plasminogeno tisular tpa.
JP6877340B2 (ja) 2014-11-06 2021-05-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド,ア ボディー コーポレイトTHE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF COLORADO,a body corporate 血栓溶解剤の存在下における粘弾性解析を用いた新規病態の確認
US11187710B2 (en) 2015-06-08 2021-11-30 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Time independent viscoelastic analysis parameter for prediction of patient outcome
US11169142B2 (en) 2016-05-11 2021-11-09 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Viscoelastic analysis in patients with disease associated with cardiovascular system

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766075A (en) * 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
EP0112122B1 (en) * 1982-12-14 1991-08-28 South African Inventions Development Corporation Plasminogen activator
EP0143081B1 (en) * 1983-11-21 1989-08-23 Ciba-Geigy Ag Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast
EP0238551A4 (en) * 1985-09-06 1988-02-01 Codon METHODS OF RECOVERING A TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR.

Also Published As

Publication number Publication date
CA1284961C (en) 1991-06-18
EP0245100B1 (en) 1992-07-22
DE3780506D1 (de) 1992-08-27
EP0245100A3 (en) 1988-01-07
DK233787A (da) 1987-11-08
US4898825A (en) 1990-02-06
EP0245100A2 (en) 1987-11-11
NO871883D0 (no) 1987-05-06
AU590840B2 (en) 1989-11-16
NO871883L (no) 1987-11-09
FI871948A0 (fi) 1987-05-04
DK233787D0 (da) 1987-05-07
FI96211B (fi) 1996-02-15
NO173287C (no) 1993-11-24
NO173287B (no) 1993-08-16
DE3780506T2 (de) 1993-01-07
DK173151B1 (da) 2000-02-14
FI871948A (fi) 1987-11-08
AU7241887A (en) 1987-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4752603A (en) Plasminogen activator and pharmaceutical composition having thrombolytic activity
RU2458067C2 (ru) Способ выделения плазминогена или плазмина в присутствии фибриногена из смеси
US4960702A (en) Methods for recovery of tissue plasminogen activator
US4902623A (en) Plasminogen activator
FI96211C (fi) Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi
Chibber et al. [48] Plasminogen
JP2001086984A (ja) アフィニティークロマトグラフィーによって血液凝固第vii因子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法
AU606582B2 (en) Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
EP0210870B1 (en) Method of purifying crude tissue plasminogen activator
EP0124613B1 (en) Novel plasminogen activator derived from human kidneys, process for its preparation, and thrombolytic drug containing the same
JPS62116600A (ja) 試薬および方法
EP0276328B1 (en) Process for separating single-strand human tpa and double-strand human tpa from each other
Gilbert et al. Characterization and partial purification of the plasminogen activator from human neuroblastoma cell line, SK-N-SH: A comparison with human urokinase
JPH0223158B2 (fi)
EP0139447A2 (en) A process for preparing urokinase zymogen
US4957864A (en) Novel plasminogen activator and its preparation process
CA1333163C (en) Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
JPH0779692B2 (ja) 一本鎖t−PAと二本鎖t−PAを分離する方法
JP2714817B2 (ja) ウロキナーゼ前駆体の製造方法
CA1335186C (en) Method for purifying tissue plasminogen activator
JPH0759191B2 (ja) ヒトプラスミン−α2−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法
Okabe et al. Studies on the purification of prothrombin from bovine plasma
JPH02156886A (ja) 組織プラスミノーゲンアクチベーターの精製法
EP0281579A1 (en) Cofactor of prourokinase

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: MITSUI CHEMICALS, INC.

MM Patent lapsed

Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT