CN113438928A - 用于递送凝血酶激活的纤维蛋白密封剂的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种止血用密封剂的分配器，包括被配置为接受纤维蛋白原溶液的容器和位于所述容器下游且包含功能化载体的活化室，凝血因子、优选凝血酶被固定在所述功能化载体上，使得在分配所述纤维蛋白原溶液时，其通过活化室，由此产生和分配作为密封剂的聚合纤维蛋白。本发明还涉及用于分配器的载体、可更换尖端和套件，以及用于将密封剂分配到所需位置的方法以及将密封剂分配到所需位置的分配器或其组件的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种止血用密封剂的分配器，包括被配置成接受纤维蛋白原溶液的容器和位于该容器下游且含有功能化载体的活化室，凝血因子、优选凝血酶固定在所述功能化载体上，使得在分配纤维蛋白原溶液时，其通过所述活化室，从而产生和分配作为密封剂的聚合纤维蛋白。本发明还涉及用于分配器的载体、可更换尖端和套件，以及用于将密封剂分配到所需位置的方法以及将密封剂分配到所需位置的分配器或其组件的用途。
背景技术
纤维蛋白密封剂是典型的外科止血剂，来源于血浆凝血蛋白。纤维蛋白密封剂被广泛应用于各种外科手术中以控制出血，并且由于微创外科手术的出现，微创外科手术需要细致的止血以充分显示外科手术区域，所以它们的使用已经增加。纤维蛋白密封剂可用于止血、伤口闭合和组织封闭，并且被认为是最接近理想的手术密封剂。与合成粘结剂相比，纤维蛋白密封剂具有生物相容性和可生物降解性的优点，并且它们与炎症、异物反应、组织坏死或广泛纤维化无关。根据手术类型、治疗部位的蛋白水解活性和所用密封剂的量，纤维蛋白凝块的再吸收在应用后数天到数周内的正常伤口愈合过程中实现。动物和人类的经验表明，使用纤维蛋白胶而不是合成塑料(例如，氰基丙烯酸酯)或缝合线的另一优点是，纤维蛋白胶促进局部凝血，从而防止出血(即使是在血友病患者中)。纤维蛋白胶似乎也支持新组织和细胞外基质的再生。
纤维蛋白密封剂通常来源于血浆蛋白，并且包含两种主要成分：纤维蛋白原和凝血因子如凝血酶。这两种成分分开存放，并且在应用过程中混合。在混合时，凝血酶诱导的纤维蛋白原活化导致纤维蛋白单体的形成。纤维蛋白单体的聚合导致形成半刚性纤维蛋白凝块，其能够与组织结构共价地和非共价地相互作用。在由活化因子XIII催化的反应中，该凝块可以进一步被纤维蛋白α链和γ链的交联来稳定。这种交联刺激成纤维细胞的粘附，并且促进其正常生长成血块。通过模拟后期的生理凝血系统，这些过程允许纤维蛋白密封剂停止失血和协助伤口愈合过程。
凝血速率和凝块的力学性质取决于纤维蛋白原和凝血酶的浓度。在以下国际申请中描述了传统的纤维蛋白胶制剂：巴克斯特国际有限公司(Baxter International,Inc.)申请的国际申请号WO93/05067；伐布拉特科公司(Fibratek Inc.)申请的国际申请号WO92/13495；以及克劳生命有限公司(Cryolife Inc.)的国际申请号WO91/09641。
大多数市售的纤维蛋白密封剂含有纯化的、经病毒灭活的人纤维蛋白原和人或牛凝血酶，可选地含有不同量的因子XIII和抗纤维蛋白溶解剂(例如，牛抑肽酶)。
例如，诸如Tisseel、Artiss、Prevleak、Evicel和Beriplast P等产品通常以双组分试剂盒销售：第一组分含有人纤维蛋白原/因子XIII浓缩物，其可以用抗纤维蛋白溶解溶液(抑肽酶)复原；以及第二组分是凝血酶，作为用例如CaCl2复原的凝血因子。
双组分纤维蛋白密封剂通常通过双筒注射器系统施用，该系统设计用于通过钝头针头或喷雾头施用等量的纤维蛋白原和凝血酶。Tisseel和Artiss采用预填充双组分的双注射器系统和涂抹器，在涂抹时，该涂抹器将两组分混合。Evicel同样使用了双注射器系统，但是以喷雾的形式释放纤维蛋白密封剂。
已知的双组分纤维蛋白密封剂在止血中表现非常好，即纤维蛋白密封剂很好地粘附在组织上并且作为有效的生物粘附剂可靠地阻止出血，在随后的伤口愈合过程中很容易被吸收。
然而，双注射器系统给医生和外科医生带来了实际的挑战。尤其是，解冻时各个成分的有限稳定性要求快速处理该系统，这可能导致纤维蛋白密封剂的不甚理想的沉积。此外，目前的递送系统转移大量凝血酶内容物在伤口位置，这可能会干扰封闭动力学、伤口愈合或纤维蛋白凝块的再吸收。
在现有技术中，例如，在US6121422中公开了用于简化纤维蛋白密封剂的递送系统的替代方法。然而，其中描述的系统需要进一步开发，因为分配器可能干扰各个成分的活性，从而损害密封剂功能。
发明内容
鉴于现有技术中的困难，本发明所要解决的技术问题是提供用于沉积纤维蛋白密封剂的改进或替代方法，其特别允许更简单、更精确和不易出错的处理以及对到达伤口部位的组分的增强控制。
在独立权利要求中提供了本发明技术问题的解决方案。从属权利要求中提供了本发明的优选实施方式。
因此，本发明涉及一种止血用密封剂的分配器，包括：
-配置为接受纤维蛋白原溶液的容器；以及
-活化室，
所述活化室位于所述容器的下游并且包含将凝血因子静电固定在其上的功能化载体，其中所述功能化载体是包含平均尺寸为150～300μm的颗粒的官能化树脂。
本发明的分配器允许特别容易地处理和精确地沉积双组分止血用密封剂。本发明的分配器还显示出凝血因子(例如，凝血酶)的优异活性，从而导致更有效地产生纤维蛋白单体、随后的聚合以及因此有效地形成密封剂。
所述容器被配置为用于接收纤维蛋白原溶液，并且在优选实施例中可以预先填充有纤维蛋白原溶液或冻干纤维蛋白原。在所述容器的下游，分配器包括活化室，凝血因子如凝血酶被固定在所述活化室。在分配之前，该设计确保了两种组分纤维蛋白原溶液和被固定的凝血因子(优选纤维蛋白原裂解的蛋白酶，例如，凝血酶)的分离。
在这种状态下，分配器因此可以被存储、自由移动或运输，而不会在分配之前存在所述组分混合的风险。在优选的实施方式中，所述分配器可以在活化室和容器之间包括额外的分离装置如膜，以减少纤维蛋白原进入活化室的被动扩散。
所述容器下游的所述活化室的位置确保在分配时所述纤维蛋白原溶液将通过所述活化室。为此，分配器可以包括配备有塞子的活塞，用于通过活化室从容器挤出纤维蛋白原溶液。在优选的实施方式中，分配器可以以具有下游活化室的单筒注射器的形式提供，该活化室可以通过推动柱塞容易地手动操作。因此，该装置的使用者在插入或分配密封剂方面没有任何困难，因为基本上只有一个腔室必须被去除，使纤维蛋白原通过下游活化室。在具有两个相邻腔室的现有技术的系统中经常出现困难，这要求在排出时对两个腔室施加相等的压力。
当纤维蛋白原溶液通过活化室时，所述纤维蛋白原溶液会被固定的凝血因子活化，用于止血并且产生聚合纤维蛋白作为密封剂。
与现有技术方案相比，所述分配器的组件数量的减少和设备复杂性的降低显著地提高了易用性。此外，凝血因子(如凝血酶)的固定化增加了成分的稳定性。另一个有价值的优点是，与典型的双筒注射器系统相比，在伤口区域沉积的凝血因子相对较少。本发明的活化室代表了对现有技术的显著改进，展示了协同工作以提供更有效的密封剂生产的多种益处。如本文所述的活化室使得固定化凝血因子具有优异的活性，同时在装置中保持更多凝血因子，从而在伤口部位沉积更少。这种优势的结合导致了更优异的装置。因此，可以更好地控制密封动力学，并将对内源性伤口愈合过程或再吸收的干扰最小化。
当凝血因子(优选凝血酶)被静电固定在包含平均尺寸为150～300μm的颗粒的功能化树脂上时，可以获得纤维蛋白密封剂沉积的最佳结果。
这些条件似乎产生协同效应，该协同效应确保凝血因子的高稳定性和活性以诱导纤维蛋白原裂解，同时防止凝血因子意外释放到沉积部位。
如以下数据所示的，与共价连接相比，静电固定的凝血酶对纤维蛋白原的切割活性显著增加。在不受理论约束的情况下，可以想象共价固定阻碍了裂解官能团所需的构象变化，而“较弱”的静电固定则不会。然而，令人惊讶的是，当固定在平均粒径在150～300μm之间的颗粒上时，静电固定不会导致从活化室到沉积位置的凝血因子浸出量的显著增加。
此外，官能化树脂的优选粒径导致初始固定产率升高并且促进凝血因子(例如，凝血酶)的纤维蛋白原裂解活性。
在典型的操作模式下，树脂颗粒的尺寸分布进一步对纤维蛋白原溶液在活化室中的流速、压力分布以及停留时间产生积极影响。
在一些实施方式中，典型的操作模式可以涉及作为注射器的分配器，该注射器包括可以手动操作以分配密封剂的活塞或柱塞。通常使用拇指施加5～50牛顿(K.Asundi等人，《人因子与人类工效学学会期刊》：67-75，2005年2月(K.Asundi et al.The Journal ofthe Human Factors and Ergonomics Society:67-75,February 2005))。对于这些力，平均粒径范围在150～300μm之间导致如下纤维蛋白原溶液在活化室中的流速和停留时间，其确保纤维蛋白原有效转化为单体聚合纤维蛋白。同时，防止过大的流体剪切力和压力积聚，否则可能会促进固定的凝血因子从树脂颗粒中分离。
有利地，所述分配器因此显示出具有所需止血性能的纤维蛋白密封剂的可重复沉积，而不考虑确切的操作模式。通过该设计，由于手动操作略有不同，纤维蛋白密封剂的质量变化被最小化。此外，操作该分配器不需要特殊的技能。
相反地，本发明提供了一种易于使用且通过设计确保纤维蛋白密封剂可重复地、精确地沉积到伤口区域或可能需要止血的任何其他所需部位的分配器。
有益的操作模式可以由活化室的优选设计和尺寸进一步辅助。使用具有1～20mm、优选4～15mm的长度和10～400mm2、优选25～100mm2的横截面积的活化室可以实现最佳结果。在一些实施方式中，活化室是圆柱形的。此处，活化室的长度是指沿纤维蛋白原溶液分配方向的尺寸，而横截面积是指与纤维蛋白原溶液分配方向正交的面积。在一些实施例中，可以优选上述尺寸的中间范围。
在一些实施例中，活化室可具有2～4mm、4～6mm、6～8mm、8～10mm、10～12mm、12～14mm、14～16mm、16～18mm的优选长度或所述中间范围的任何组合，但不限于此，例如，4～8mm或6～14mm。
在一些实施方式中，活化室的横截面积可以优选在10～25mm2、25～50mm2，50～75mm2、75～100mm2、100～150mm2、150～200mm2、200～250mm2、250～300mm2、300～350mm2或350～400mm2或所述中间范围的任何组合，但不限于，例如，50～200mm2或100～300mm2。
在一种实施方式中，凝血因子是纤维蛋白原裂解蛋白酶，优选凝血酶。
在一种实施方式中，官能化树脂是氨基官能化树脂，优选氨基甲基丙烯酸树脂。
氨基官能化树脂是指含有氨基或胺基作为官能团的树脂，其中，所述官能团可以是伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基。最优选地，氨基官能化树脂包含-NH2作为官能团。
氨基官能化树脂允许蛋白质的静电固定，例如，通过可电离表面氨基酸与树脂粒子上的带电氨基的离子相互作用来静电固化凝血因子。如下面的数据所示的，氨基官能化树脂表现出特别高的固定化产率和蛋白质活性的提高，如凝血酶的情况一样，如其对纤维蛋白原的裂解能力所示的。
在一种实施方式中，官能化树脂是甲基丙烯酸酯树脂。
在优选的实施方式中，官能化树脂是氨基甲基丙烯酸酯树脂。将甲基丙烯酸酯聚合物用于树脂并且提供用于静电固定的氨基在蛋白质活性和固定产率方面产生特别好的结果。
在一种实施方式中，官能化树脂包含与官能化基团连接的间隔部。
在一种实施方式中，所述间隔部包含有机部分或由有机部分组成，所述有机部分包含C2-C20、优选C3-C10、优选有支链的或无支链的烷基、烯基、炔基、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、酰胺和/或芳烷基、或它们的组合。
所述间隔部允许官能团如氨基更自由地围绕树脂颗粒的表面移动，从而促进固定的凝血因子的构象和过渡自由。此外，所述间隔部使固定的凝血因子与颗粒表面可能的空间相互作用最小化，这可能会剥夺蛋白质活性。
对于上述间隔部实现了特别好的结果，其中使用了六亚甲基或类似的C6长间隔部。
在一种实施方式中，每克(g)载体固定了至少2000单位(U)、优选至少5000单位、更优选至少10000单位的凝血因子。所述浓度的凝血因子(优选凝血酶)为纤维蛋白原溶液提供最佳转化率，以便产生高度粘合性和聚合的纤维蛋白密封剂。
在一种实施方式中，所述树脂颗粒是平均孔径为60～120nm、优选60～100nm、更优选70～90nm的多孔颗粒。孔径增大了反应表面，并且表示静电固定的一组最佳条件，特别是与平均粒径150～3000μm的组合。
在一种实施方式中，平均粒径大于150μm、160μm、170μm、180μm、190μm或更大；并且小于300μm、290μm、280μm、270μm、260μm、250μm、240μm、230μm、220μm、210μm或更小。优选地，平均粒径为180～220μm，最优选为大约200μm。
树脂通常通过悬浮法生产，当随后进行功能化时，即聚合过程导致大约平均的粒径扩展。
因此，优选的实施方式可以涉及平均粒径(例如，约200μm)的树脂，并且树脂中存在的粒径范围，例如，150～300μm。粒径分布的扩展可以用标准差来量化。
在一种实施方式中，所述颗粒的尺寸分布具有40μm以下、优选30μm以下的标准偏差。
在一种实施方式中，所述颗粒的尺寸分布具有5μm、10μm或更多的标准偏差。
如上述标准偏差所定义的平均粒径的微小变化允许改进活化室中颗粒的填充并延长纤维蛋白原溶液的停留时间。然而，过大的扩展可能导致固定产率和活性的降低，因为具有较不利尺寸的颗粒的比例增大了活化室的性质。
在一种实施方式中，所述分配器还包括配备有塞子的活塞，所述塞子被配置为容纳在容器中，并且用于从容器中挤出纤维蛋白原溶液并穿过所述活化室。所述塞子的尺寸优选是使塞子的外横截面积覆盖容器的内横截面积，从而使塞子下游容器中的第一体积和塞子上游容器中的第二体积分离(紧密材料或防水)的尺寸。通过移动与塞子相连的活塞，位于第一体积中的纤维蛋白原溶液被转移到下游活化室。只要保持活塞和塞子的插入功能，活塞和塞子可以由任何合适的材料制成，包括任何合成材料、挠性塑料、非挠性塑料、玻璃和/或橡胶。在优选的实施方式中，活塞和塞子是惰性材料，对该系统的生物成分没有任何影响。
在另一种实施方式中，所述分配器还包括位于活化室下游的过滤器，其中所述过滤器被配置为防止功能化载体的释放。
所述过滤器优选为物理过滤器，其允许包括诸如纤维蛋白之类的蛋白质的流体通过，但阻挡诸如树脂颗粒之类的固体。所述过滤器孔径可以适于所述功能化载体并且优选地选择为使得树脂的最小颗粒不能通过。例如，平均粒径为200μm的树脂且颗粒的扩展范围为150～300μm的树脂，过滤器孔径优选基本上小于150μm，以确保防止树脂的任何部分到达沉积位置。过滤器的优选孔径范围为0.2～10μm、优选0.5～5μm。本领域技术人员已知膜和合适的过滤器。
在一种实施方式中，所述分配器包括主体，所述主体包括容器和可更换的尖端，其中所述活化室包括在可更换的尖端或主体中。所述主体是指分配器的部件，其包括容器和可能的其他元件如活化室。
如本文所用的，在尖端的上下文中术语“可更换的”意指尖端可以可逆地连接到所述主体。为此，可更换的尖端和主体可以包括用于可释放地连接的装置。例如，可更换的尖端的主体接收端可以包括外螺纹，而主体尖端接收端可以包括反向内螺纹。然而，也可以设想用于可释放地连接的其它装置，包括卡口安装件、卡口安装件、夹子、回形夹等。
采用可更换的尖端允许灵活和资源有效地使用分配器。例如，相同主体可重复多次使用以分配纤维蛋白密封剂，其中，在每次使用之间，所述主体被消毒并且用纤维蛋白原溶液重新填充。
对于一些实施方式，还可优选的是提供具有不同挤出端的可更换的尖端用于沉积纤维蛋白密封剂。例如，可更换的的尖端可以在针直径或长度的大小上不同，以根据应用提供最佳的引导。
在该实施方式的第一备选方案中，活化室位于主体内，即容器的下游，但优选地位于形成所述主体的相同结构内。在这种情况下，可更换的尖端可释放地连接至活化室或刚好活化室下游的主体部分。在分配器包括过滤器的情况下，优选过滤器是所述主体的一部分。
在该实施方式的第二备选方案中，所述活化室位于可更换的尖端内。在这种情况下，优选过滤器位于在所述主体的接收端上的可更换的尖端内。有利地，在这样的实施方式中，具有适于接收纤维蛋白原溶液的容器的普通注射器的主体可以用于连接到包含如本文所述的固定凝血因子的可更换的尖端。因此，该实施方式允许资源的特别有效利用。
此外，通过分离用于接收纤维蛋白原溶液的容器和包含固定的凝血因子的活化室，获得了存储灵活性。例如，具有固定的凝血因子的可更换的尖端可以存储在4℃下，而该容器配备有预先填充的纤维蛋白原溶液并且储存在-20器下，或反之亦然。可以为每个组件定义最佳的存储条件。
在一种实施方式中，所述容器充满包含纤维蛋白原、优选人纤维蛋白原的溶液。
所述溶液中的纤维蛋白原含量的优选浓度范围为5～30重量％(重量百分比)。在一些实施方式中，中间范围为例如5～10重量％、10～15重量％、15～20重量％、20～25重量％、25～30重量％或其任何组合。纤维蛋白原溶液可以优选基于生理上可接受的流体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等，并且包含附加因子。
在一种实施方式中，所述纤维蛋白原溶液另外包含因子XIII。在纤维蛋白原转化为纤维蛋白后，因子XIII可以通过稳定和交联纤维蛋白α和γ链来支持纤维蛋白密封剂功能。
在一种实施方式中，纤维蛋白原溶液另外包含抗纤维蛋白溶解因子，优选抑肽酶。在将纤维蛋白密封剂分配到所需部位后，内源性纤维蛋白溶解(例如，由纤溶酶介导)可以导致新形成的纤维蛋白凝块的部分溶解。在纤维蛋白原溶液中添加抑肽酶等抗纤维蛋白溶解因子有助于延缓纤维蛋白溶解。
在一种实施方式中，所述纤维蛋白原溶液还包含氯化钙。氯化钙允许提供Ca2+离子，其增强纤维蛋白原裂解的蛋白酶如凝血酶的裂解活性。
在另一实施方式中，所述容器充满冻干纤维蛋白原。冷冻干燥的纤维蛋白原可以通过添加适当的溶液而容易地复原成纤维蛋白原溶液。例如，冷冻干燥的纤维蛋白原可以使用含有抑肽酶、氯化钙和/或其他添加剂的盐水溶液进行复原。在优选的实施方式中，在容器中提供冻干形式的因子XII或在重组时添加。
在另一方面，本发明涉及一种用于产生密封剂并将密封剂分配到所需位置的方法，包括
-提供一种分配器，包括：
о装满纤维蛋白原溶液的容器，以及
о活化室，
所述活化室位于所述容器的下游并且包含功能化载体，凝血因子、优选凝血酶被静电固定在所述功能化载体上；以及
-将纤维蛋白原溶液分配到所需部位，其中在分配时，所述纤维蛋白原溶液通过所述活化室，从而产生和分配作为密封剂的聚合纤维蛋白。
在优选的实施方式中，所述方法可以涉及生成密封剂并将密封剂分配到所需部位用于止血。可能特别优选的是，在需要止血的受试者中原位使用该方法，例如，在正在进行手术的受试者中。该方法特别适用于微创外科手术，在微创外科手术中，快速和精确的止血对于充分显示外科领域至关重要。
然而，该方法也可以非原位应用于例如密封或组合医用植入物和/或医用植入装置。该方法也可用于非医疗环境，其中，可以有利地利用聚合纤维蛋白形成密封剂的性质。
在另一方面，本发明涉及用于分配器的活化室中的载体，其中所述载体是功能化树脂，优选是氨基官能化树脂，其包含平均尺寸为150～300μm的颗粒，其中，凝血因子、优选凝血酶被静电固定在所述颗粒上。
在一种实施方式中，本发明涉及一种用于分配器的活化室的载体，该载体可通过包括以下步骤的方法来生产：
-提供功能化载体，其为官能化树脂，优选是氨基官能化树脂，其包含平均尺寸为150～300μm的颗粒，
-提供包含凝血因子、优选凝血酶的溶液，以及
-将含有凝血因子的溶液与功能化载体一起孵育。
所述载体优选以允许容易地安装到如本文所述的分配器的活化室中的形式提供。例如，所述载体可以是官能化树脂，其可以容易地成形和使尺寸适合于分配器的活化室。
制备功能化载体的方法简单，并且导致凝血因子、优选凝血酶的高固定产率。在一些实施例中，可以优选在培养前使用官能化树脂的洗涤步骤，例如，用磷酸盐缓冲盐(PBS)进行洗涤。在所述溶液中凝血因子(优选凝血酶)的浓度为1mg/mL至100mg/mL、优选10mg/mL至50mg/mL可以实现最佳孵育。优选的孵育时间大于1小时，优选大于3小时、6小时、12小时，并且小于48小时，优选小于36小时、24小时。
在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的用于分配器的可更换的尖端，其中所述可更换的尖端包括活化室，所述活化室包括将凝血因子静电固定在其上的功能化载体和用于可释放地连接到所述分配器的主体的装置。
用于可释放地连接到分配器的主体的装置可以涉及任何可释放地连接装置，例如，螺纹紧固件、卡口安装件、卡扣、夹子、回形夹等。
在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的分配器、载体和/或可更换的尖端用于将密封剂分配到所需位置，优选用于止血的用途。
在一种实施方式中，本发明涉及一种套件，包括：
-分配器、载体和/或可更换的尖端；
-包含纤维蛋白原的溶液；和
-任选地用于分配密封剂(优选用于止血)的方法的说明书。
如本文所述的针对分配器公开的技术特征也适用于所述载体、可更换的尖端、所述方法和/或所述套件。本领域技术人员认识到，如本文所述的分配器的优选特征可以有利地应用于载体、可更换的尖端、方法和/或套件的上下文中，并且传达相同的有益效果。
具体实施方式
本发明涉及止血用密封剂的分配器，其包括用于接收纤维蛋白原溶液的容器和将凝血因子、优选凝血酶固定在其上的活化室。本发明还涉及用于活化室的载体、包括活化室的可更换的尖端以及用于产生和分配密封剂的方法和套件。
从本文呈现的数据可以明显看出，将凝血因子固定在活化室中的功能化载体上允许分配有效聚合的纤维蛋白作为密封剂，同时使凝血因子释放到沉积部位最小化。
本发明与传统分配器相比具有以下优点：本发明的分配器、组件、方法和套件快速、易于使用、可靠地且精确地将密封剂分配到所需位置，特别是用于止血。
如本文所用的，“止血”是指阻止潜在受损组织或血管出血并且由此防止出血的过程。止血是伤口愈合的第一阶段，并且包括凝血以阻止进一步出血。本发明的分配器允许纤维蛋白密封剂的沉积，该纤维蛋白密封剂有效地促进止血以及伤口愈合，并且容易被吸收。
内源性伤口愈合作为一种自然过程，几乎在受伤后立即开始，并且需要各种细胞的连续协调功能以及降解和再生步骤的密切调节。细胞的增殖、分化和迁移是伤口愈合的重要生物学过程，也涉及纤维蛋白凝块的形成、凝块的再吸收、组织重塑，例如，纤维化和内皮化。伤口愈合包括形成高度血管化的组织，其包含许多毛细血管、许多活跃的成纤维细胞和丰富的胶原纤维。创伤愈合过程可以由凝血活酶启动，凝血活酶从受损细胞和血浆因子VII中流出，以形成因子X活化剂，然后与因子V和磷脂、钙络合，将凝血酶原转化为凝血酶。凝血酶催化纤维蛋白原释放纤维蛋白肽A和B以产生纤维蛋白单体(即纤维蛋白I和纤维蛋白II)，其聚集形成纤维蛋白丝。凝血酶还激活转谷氨酰胺酶因子XIIIa，该酶催化异肽键的形成以共价交联纤维蛋白丝。
本发明的装置允许应用支持止血和促进伤口愈合的组织密封剂。含有血浆蛋白的外科粘合剂和组织密封剂通常用于封闭内外部伤口，以减少失血和维持止血。典型的组织密封剂含有凝血因子和其他血蛋白质。
如本文所使用的，“密封剂”优选为纤维蛋白密封剂。纤维蛋白密封剂是一种与从血浆中制备的天然凝块相似的凝胶。纤维蛋白密封剂的精确成分取决于用作起始材料的特定血浆部分。血浆成分的分离可以通过标准的蛋白质纯化方法来实现。例如，乙醇、聚乙二醇、硫酸铵沉淀、离子交换和凝胶过滤层析。典型的纤维蛋白密封剂含有蛋白质混合物，其包括微量白蛋白、纤维连接蛋白和血纤维蛋白溶酶原，有些还含有抑肽酶作为稳定剂。
本发明实践中使用的“纤维蛋白原”包括将在人体内形成纤维蛋白的任何纤维蛋白原。
“纤维蛋白原溶液”是指包含大量纤维蛋白原和任选的其它数量的刺激纤维蛋白形成的其他因子的水溶液，当其与固定的活化化合物(优选凝血酶)接触时，使得纤维蛋白形成和交联发生，从而赋予组合物组织密封剂的性质。纤维蛋白原溶液可以基于生理上可接受的流体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。纤维蛋白原溶液可以替代地或另外包含优化反应条件的其它物质，例如，pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇酐单月桂酸酯、油酸三乙醇胺。
通常，纤维蛋白原以冻干形式提供，并且在使用前复原以形成纤维蛋白原溶液。纤维蛋白原也可以是冷冻的或新鲜的、自体来源(来自待治疗的受试者)、人体来源(包括汇集的人纤维蛋白原)、重组的和牛来源或其他非人类来源如鱼(例如，鲑鱼和海鳟鱼)。冻干的纤维蛋白原可以使用通常含有抑肽酶和氯化钙的溶液进行复原。纤维蛋白原可以用包含至少一种添加剂的溶液复原。例如，冻干纤维蛋白原可以使用例如含有麻醉剂或添加剂的生理盐水；含有抑肽酶和麻醉剂或添加剂的生理盐水溶液；含有麻醉剂、任选的添加剂和钙离子(Ca2+)(例如，可以由氯化钙供应)的生理盐水溶液；或含有麻醉剂、抗生素或其他和/或添加剂的混合物的溶液。
纤维蛋白原可以与其他蛋白质紧密混合，这些蛋白质通常存在于抗凝全血、富含血小板的血浆、血浆、冷沉淀物或通过诸如血浆的科恩沉淀(Cohn precipitation)等方法获得的血浆沉淀物中。这种额外的蛋白质组分可以包括纤维连接蛋白、免疫球蛋白，特别是IgG、因子XIII、血纤维蛋白溶酶原和白蛋白。本文所设想的纤维蛋白原溶液可以在应用于本发明之前通过一种或多种方法进行病毒灭活。
还可以设想人类纤维蛋白原的替代来源。例如，通过重组技术制备的纤维蛋白原也可以用于纤维蛋白密封剂中。可以用于生产重组纤维蛋白原的分子技术包括使用转染含有编码正常或突变人类纤维蛋白原的分离基因的DNA载体的COS-1或Hep G2细胞(RoyS.N.et al.,1991,J.Biol.Chem.,266:4758-4763)。
本文所用术语“凝血因子”表示通过切割凝血途径中的下游蛋白质而起作用的凝血因子或血液凝结因子。优选地，凝血因子因此是“纤维蛋白原裂解发蛋白酶”，其将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性链。最优选的凝血因子是凝血酶。
如本文所用，术语“凝血酶”是指将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白链并且催化许多其它凝血相关反应的丝氨酸蛋白酶。除非另有规定，否则该术语不是物种特有的。该术语包括α化凝血酶和γ-凝血酶，α-凝血酶是凝血酶的天然形式，γ-凝血酶是由保留大部分血小板活化能力的α-凝血酶生产的不凝结的衍生物。凝血酶是常见的生理促凝剂。许多哺乳动物来源(最常见的是牛来源)的凝血酶通常用于商用纤维蛋白密封剂。
纤维蛋白原和凝血酶都可以通过血浆分离从血浆中分离得到。对每种制备技术的综合评述已经发表，并且是本领域技术人员所使用的并且适合于在本发明中使用的大多数商业血浆分离程序的基础(对于纤维蛋白原：Blomback,B.和Blomback,M.,1956年,ArkKemi,10:415-443；Stryker,M.H.&Waldman,A.A.,1978年,Kirk-Othmer Encyclopedia ofChemical Technology,第4卷第3辑,pp25-61,John Wiley；Lowe G.D.O.等,1987年,Fibrinogen 2:Biochemistry,Physiology and Clinical Relevance.Excerpta Medicus,Elsevier Science Publishers；对于凝血酶：Fenton II,J.W.等,1977,J.Biol.Chem.,252:3587-3598；Gaffney P.J.等,1992年,Thrombos.Haemostas.,67:424-427；Ward,G.,1991年,欧洲专利申请号EP 0 439 156A1；和Kraus等人的美国专利申请号US 5,143,838。
如本文所用的表达“载体”是指基质部分，其用作固定凝血因子(优选凝血酶)的“基板”或“支持材料”。根据本发明的合适载体应当具有亲水性以及在相关pH范围和温度上的机械和化学稳定性。
优选地，所述载体是树脂。如本文所使用的“树脂”是指包含聚合物颗粒的不溶性材料，其典型地呈球形珠或珍珠的形式，其可由本领域公知的悬浮聚合方法形成。因此，所述树脂的颗粒也可以称为树脂颗粒。
这种树脂可以是天然或生物聚合物、合成聚合物和无机材料。琼脂糖、葡萄糖和纤维素珠是常用的天然载体。合成聚合物或有机载体主要基于丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯衍生物，而多孔二氧化硅和玻璃是一些常用的无机载体。下文描述了可以根据本发明使用的其它材料。
如本文所用，术语“聚合物”是指由通常通过共价化学键连接的重复结构单元组成的分子。术语“聚合物”也意指包括术语共聚物和低聚物。
根据本发明的实施方式，所述树脂由选自海藻酸盐、壳聚糖、几丁质、胶原蛋白、卡拉胶、明胶、纤维素、淀粉、果胶和琼脂糖中的聚合物组成；从沸石、陶瓷、硅藻土、二氧化硅、玻璃、活性炭和煤焦中选择的无机材料；或选自以下的合成聚合物：聚乙烯(PE)、聚甲醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚醋酸乙烯酯(PVA)、聚偏二氯乙烯(PVDC)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酸酯(PAA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚丙烯腈(PAN)、聚酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰胺、聚芳酰胺、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PEAS)、乙烯基乙酸乙烯酯(EVA)、乙烯乙烯醇共聚物(EVOH)、聚酰胺酰亚胺、聚芳醚酮(PAEK)、聚丁二烯(PBD)、聚丁烯(PB)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚己内酯(PCL)、聚羟基烷酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酮酮(PEKK)、聚醚酰亚胺(PEI)、聚酰亚胺、聚乳酸(PLA)、聚甲基戊烯(PMP)、聚对苯醚(PPE)、聚氨酯(PU)、苯乙烯-丙烯腈(SAN)、聚丁烯酸、聚(4-烯丙基苯甲酸)、聚丙烯酸缩水甘油酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)、聚二乙烯基苯(PDVB)、聚烯丙基缩水甘油醚、聚乙烯基缩水甘油醚、聚乙烯基缩水甘油氨基甲酸酯、聚烯丙胺、聚乙烯胺、所述聚合物的共聚物和通过引入官能团而改性的任何这些聚合物。根据本发明的一个具体实施方式，所述载体选自苯乙烯-二乙烯基苯(DVB)及其衍生物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)及其衍生物、甲基丙烯酸聚缩水甘油酯(PGMA)及其衍生物。
最优选地，所述树脂由甲基丙烯酸酯聚合物、优选聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)组成。
优选地，所述树脂是多孔树脂。在一些实施方式中，所述树脂可以是大孔、介孔或凝胶型树脂。
本文中使用的术语“孔”是指作为固体目标物的颗粒中任何尺寸或形状的凹陷、狭缝或孔。孔可以贯穿整个颗粒或部分穿过颗粒。孔可以与其他孔相交。
术语“大孔”(也被称为大孔网状)在本领域中是众所周知的，并且通常是指由共聚物珠制备的树脂，所述共聚物珠具有表现出分子大小孔隙的密集堆积的聚合物链区域，所述孔隙由无共聚物空隙(通常被称为介孔
和大孔隙
隔离。相反，微孔或凝胶型树脂通常具有分子大小的孔(通常小于
)并且由不使用惰性稀释剂的单体混合物制备。美国专利申请号US 4224415和US 4382124中进一步描述了大孔树脂和凝胶树脂，其教导通过引用并入本文。
“颗粒尺寸”或“树脂尺寸”优选地指组成树脂的聚合物颗粒的特征尺寸。对于聚合物珠粒，所述粒径优选与珠粒直径有关。
一般而言，官能化树脂(例如，离子交换树脂)包含由悬浮聚合方法形成的多个聚合颗粒，并且具有多个当与含有这种蛋白质的液体接触时能够保持蛋白质如凝血因子的离子或分子的连接官能团。悬浮聚合过程的性质使得所得共聚物珠可以表现出不同的粒径，即，所述珠共同地适合粒径分布。当共聚物珠被官能团基本上功能化时，这种分布被保留，并且在大多数情况下被加宽。
“粒径的平均值”优选地涉及算术平均值，而“粒径的标准偏差”优选地量化树脂中存在的粒径的变化。
给定树脂或共聚物珠或树脂颗粒样品的粒径平均值和标准偏差可以使用设计用于测量离散颗粒样品粒径分布的任何商用仪器进行测定。这种仪器的例子是岛津或和田提供的粒度分析仪。
存在几种类型的载体，如上文和下文所述的，所述载体优选地可有利地用于固定诸如凝血因子之类的蛋白质。所述载体可以基于多糖等材料。合适的多糖是例如纤维素；硝化纤维素；壳聚糖；胶原；淀粉和交联多糖凝胶如琼脂、葡聚糖凝胶(Sephadex)或琼脂糖凝胶(Sepharose)。制备多糖基质衍生物的方法早已为人所知，并且例如在US 4411832或US3947352中描述。所述载体还可以基于合成的有机载体。合成的聚合物基质包括亲水性和疏水性合成聚合物及其组合。合成的载体包括例如选自由聚丙烯酰胺载体或其衍生物；聚甲基丙烯酸酯载体或其衍生物；聚苯乙烯载体或其衍生物；或聚醚砜载体或其衍生物所组成的载体组中的载体。否则，衍生的二氧化硅、玻璃或吖内酯(azlactone)珠可以用于根据本发明的装置中。此类装置优选利用有机载体。在本发明的上下文中，使用珠是特别有利的。
功能化载体(优选官能化树脂)是指包含允许固定或结合凝血因子的官能团的载体(优选树脂)。
将凝血因子到载体(优选树脂)的“固定”、“结合”或偶联(用于提供用于本发明的活化室)的表述是指将分子固定在一起的非共价或静电结合。非共价或静电固定可以用作同义词并且包括但不限于氢键、金属离子结合、带电基团之间的离子相互作用、范德华相互作用以及非极性基团之间的疏水相互作用。
这些相互作用中的一个或多个可以介导将凝血因子固定到功能化载体(优选树脂)上。所述结合可以是特异性的、或者选择性的或非特异性的。
所述固定可以通过常见的官能团进行，包括胺、醇、羧酸、醛和环氧基。制备载体的方法在本领域是已知的，并且例如在US 8142844B2、US 2015/0111194 A1和US 2014/0166580 A1中所描述的。这些参考文献还描述了可以用于生成功能化载体的间隔基团(或“连接体”基团)。
然而，对于在本发明中使用，特别优选在特定条件下考虑非共价或静电相互作用的官能团。
例如，特别优选使用包含氨基的氨基官能化树脂，其可以通过可电离表面氨基酸(例如，Lys、Arg、His、Asp、Glu)与聚合物上的带电胺的离子相互作用来用于蛋白质固定。
此类氨基官能化树脂也可以例如通过戊二醛预活化，并提供反应基团以形成共价键。然而，如上所述的，已发现例如基于离子相互作用的静电固定特别适合于维持高蛋白质活性。因此，当使用氨基官能化树脂时，凝血因子的固定将优选地在实现静电结合而不是共价结合的条件下进行。为此，例如，可能需要在固定反应期间调节pH值。
许多功能化树脂是市售的，并且是本领域技术人员所熟知的，其适合于蛋白质如凝血因子的静电固定。特别优选的示例包括
LifetechTM，用氨基官能化的甲基丙烯酸酯聚合物，其中可以选择不同的间隔部分。然而，也可以设想其他特定功能化树脂，例如，
LifetechTM，甲基丙烯酸十八酯、大孔苯乙烯或DVB/甲基丙烯酸酯，用于介导蛋白质吸收；以及苯乙烯叔胺或苯乙烯季胺，用于介导离子固定。
根据一个方面，
LifetechTMECR8409F甲基丙烯酸氨基酯微球用作功能化树脂，其携带氨基作为可静电固定凝血因子如凝血酶的官能团。它们的粒径为150～300μm、平均粒径为198μm、孔径为
(平均孔径：
)以及六亚甲基(C6)间隔部分。
如本文所用，术语“氨基官能化树脂”或“氨基封端树脂”是指包含氨基或胺基作为用于静电固定蛋白质如凝血因子的官能团的树脂。
本文优选使用术语“氨基”或“胺基”来指代基团-NZ1Z2，其中Z1和Z2中的每个独立地选自氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、甲硅烷基及其组合。
术语“伯氨基”在本文中用于指-NH2，其是最优选的氨基。
术语“仲氨基”在本文中用于指代-NZ1H，其中Z1选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、甲硅烷基及其组合。
术语“叔氨基”在本文中用于指代-NZ1Z2，其中Z1和Z2中的每个独立地选自氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、甲硅烷基及其组合。
术语“季氨基”在本文中用于指代–NZ1Z2,Z3+，其中Z1、Z2和Z3中的每个独立地选自氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、甲硅烷基及其组合。
进一步优选的功能性树脂可以从已知的离子交换树脂中选择，所述离子交换树脂可以在多种市场上购买到。如本文所用的，术语“离子交换树脂”意指其常规含义，即包含交联聚合物珠和使其适于在离子交换工艺中使用的官能团的树脂。
离子交换是众所周知的商业实践过程，并且在公开文献中广泛报道。离子交换技术的综述参见《柯克-奥瑟默化学技术百科全书》(第3版，第13卷，第678-705页，由R.M.Wheaton和L.J.Lefevre，由Wiley和Sons出版设出版)(Kirk-Othmer Cyclopedia ofChemical Technology(3rd ed.,Vol.13,p.678-705,by R.M.Wheaton and L.J.Lefevre,published by Wiley and Sons))。如上述Kirk-Othmer参考文献中公开的，常规离子交换树脂通常具有磺酸官能团，但是已知制备具有其它类型官能团的离子交换树脂。
离子交换包括可逆化学反应，其中流体介质中的离子被交换为连接在不溶于所述流体介质的不可移动固体颗粒上的类似带电离子。术语离子交换树脂用来指这种物质。由于离子交换基团连接在聚合物载体上的交联性质，使得树脂变得不可溶。离子交换树脂分为酸性阳离子交换树脂和碱性阴离子交换树脂，前者具有带正电荷的可交换离子，后者具有带负电荷的可交换离子。
本发明中可以使用酸性阳离子交换树脂和碱性阴离子交换树脂来固定凝血因子。在一种实施方式中，酸性阳离子交换树脂包含有机酸阳离子交换树脂，例如，磺酸阳离子交换树脂。预期用于本发明实践中的磺酸阳离子交换树脂可包含选自磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、磺化交联苯乙烯聚合物、酚醛磺酸树脂、苯甲醛磺酸树脂以及它们的混合物中的至少一种。
在另一实施方式中，酸性阳离子交换树脂包含至少一种有机酸阳离子交换树脂，例如，羧酸、丙烯酸或磷酸阳离子交换树脂及其混合物。此外，可以使用不同阳离子交换树脂的混合物。在许多情况下，可以使用碱性离子交换树脂将pH调节至所需水平，以确保凝血因子的静电固定。在某些情况下，可以使用碱性水溶液(例如，氢氧化钠、氢氧化铵、四甲基氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铯及其混合物等的溶液)进一步调节pH值。
市售阳离子交换树脂包括但不限于例如具有磺酸基的阳离子交换树脂(例如，来自GE医疗保健公司的MonoS、MiniS、Source 15S和3OS、SP Sepharose Fast FlowTM、SPSepharose High Performance；来自日本东曹公司的Toyopearl SP-650S和SP-650M；来自伯乐公司(BioRad)的Macro-Prep High S；来自颇尔技术公司(Pall Technologies)的Ceramic HyperD S、Trisacryl M和LS SP以及Spherodex LS SP)；具有磺乙基基团的阳离子交换树脂(例如，来自EMD公司的Fractogel SE、来自应用生物系统公司(AppliedBiosystems)的Poros S-10和S-20)；具有磺丙基基团的阳离子交换树脂(例如，来自日本东曹公司的TSK Gel SP 5PW和SP-5PW-HR；来自应用生物系统公司的Poros HS-20和HS 50)；具有磺异丁基基团的阳离子交换树脂(例如，来自EMD公司的Fractogel EMD SO3)；具有亚砜乙基(sulfoxyethyl)基团的阳离子交换树脂(例如，来自Whatman公司的SE52、SE53和Express-Ion S)；具有羧甲基基团的阳离子交换树脂(例如，来自GE医疗保健公司的CMSepharose Fast Flow；来自Biochrom Labs公司的Hydrocell CM；来自BioRad公司的Macro-Prep CM；来自颇尔技术公司(Pall Technologies)的Ceramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM；来自Millipore公司的Matrx Cellufme C500和C200；来自Whatman公司的CM52、CM32、CM23和Express-Ion C；来自日本东曹公司的ToyopearlCM-650S、CM-650M和CM-650C)；具有磺酸和羧酸基团的阳离子交换树脂(例如，来自J.TBaker公司的BAKEPVBOND羧基砜)；具有羧酸基团的阳离子交换树脂(例如，来自J.T Baker公司的WP CBX；来自陶氏液体分离公司的DOWEX MAC-3；来自Sigma Aldrich公司的Amberlite弱阳离子交换剂、DOWEX弱阳离子交换剂、和Diaion弱阳离子交换剂)；具有磺酸基团的阳离子交换树脂(例如，来自Biochrom Labs公司的Hydrocell SP；来自陶氏液体分离公司的的DOWEX细网强酸阳离子树脂；来自J.T Baker公司的UNOsphere S、WP Sulfonic；来自Sartorius公司的Sartobind S膜；来自Sigma-Aldrich公司的Amberlite强阳离子交换剂、DOWEX强阳离子交换剂和Diaion强阳离子交换剂)；以及具有正磷酸盐基团的阳离子交换树脂(例如，来自Whatman公司的Pl 1)。
在另一实施方式中，碱性阴离子交换树脂包含至少一种叔胺阴离子交换树脂。预期用于本发明实践中的叔胺阴离子交换树脂可以包含选自以下所组成的组中的至少一种：叔胺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、叔胺化交联的苯乙烯聚合物、叔胺化酚醛树脂、叔胺化苯甲醛树脂及其混合物。在另一实施方式中，碱性阴离子交换树脂包含至少一种季胺阴离子交换树脂或其混合物，以及其它交换树脂。
市售阴离子交换树脂包括DEAE纤维素；来自应用生物系统公司(AppliedBiosystems)的Poros PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50；来自Sartorius公司的Sartobind Q；MonoQ、MiniQ、Source 15Q和3OQ、Q、DEAE和ANX Sepharose Fast Flow、QSepharose高性能、QAE SEPHADEXTM和FAST Q-SEPHAROSETM(来自GE医疗保健公司)；来自J.T.Baker公司的WP PEI、WP DEAM、WP QUAT；来自Biochrom Labs公司的Hydrocell DEAE和Hydrocell QA；来自Biorad公司的UNOsphere Q、Macro Prep DEAE和Macro Prep High Q；来自颇尔技术公司(Pall Technologies)的Ceramic HyperD Q、Ceramic HyperD DEAE、Trisacryl M和LS DEAE、Sphereodex LS DEAE、QMA Sphereosil LS、QMA Sphereosil M和Mustang Q；来自陶氏液体分离公司的DOWEX细网强碱I型和II型阴离子树脂和DOWEXMonosphere E 77弱碱阴离子；来自Millipore公司的Intercept Q膜、Matrex CellufmeA200、A500、Q500和Q800；来自EMD公司的Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE和Fractogel EMD DMAE；来自Sigma-Aldrich公司的Amberite I型和II型弱强阴离子交换剂、DOWEX I型和II型弱和强阴离子交换剂、Diaion I型和II型弱和强阴离子交换剂、Duolite；来自日本东曹公司的TSK gel Q和DEAE 5PW和5PW-HR、Toyopearl SuperQ-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M和650C；来自Whatman公司的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D和Express-Ion Q。
优选的功能化树脂可以通过选择平均粒径为150～150μm并且允许凝血因子、优选凝血酶的静电固定的功能化的树脂，从上述离子交换树脂或其它市售离子交换树脂中选择。
根据一个优选的实施方式，所述载体包括间隔部分，所述间隔部分上连接有可介导静电固定的官能化基团。
术语“间隔部分”、“连接基”或“连接体”在本文中用于指任选地用于例如通过共价连接将官能团连接到树脂的聚合物颗粒的原子或原子集合。间隔部分或连接体可以水解稳定或可以包括生理上可水解或酶降解的连接基。如本文所用的连接体不是单个共价键。连接体的结构并不重要，只要它能使官能团从树脂的聚合颗粒的表面物理分离。
在某些实施方式中，间隔有机部分包含C2-C40、C2-C20，优选C3-C10、优选有支链或没有支链的烷基、烯基、炔基、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、杂芳基、酰胺和/或芳烷基或其组合。
术语“烷基”是指优选1～24个碳原子的有支链或没有支链的饱和烃基，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十四基、十六基、二十烷基、二十四烷基等。优选的烷基具有1～12个碳原子、1～6个碳原子、更优选1～4个碳原子。任何一个或多个本文所述的烷基可以是“被取代的烷基”，其中一个或多个氢原子被诸如卤素、环烷基、烷氧基、氨基、羟基、芳基或羧基等取代基取代。
术语“芳基”指任何基于碳的芳香族基团，包括但不限于苯、萘等。术语“芳基”还包括“杂芳基”，其被定义为具有至少一个杂原子引入芳香基团的环内的芳香基团。杂原子的示例包括但不限于氮、氧、硫和磷。所述芳基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于烷基、炔基、烯基、芳基、卤化物、硝基、氨基、酯、酮、醛、羟基、羧酸或烷氧基，或者所述芳基可以不被取代。
术语“烷氧基”在本文中用于指代-OZ1基团，其中Z1选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、甲硅烷基及其组合，如本文所述的。合适的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、苄氧基、叔丁氧基等。相关术语为“芳氧基”，其中Z1选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基及其组合。合适的芳氧基的实例包括苯氧基、取代的苯氧基、2-吡啶氧基、8-喹啉氧基等。
本文所使用的“分配器”是指允许分配流体的任何装置。通常，分配器将包括配置用于接收所述流体的容器以及用于通过位于容器下游的出口或尖端将流体从容器中排出的装置。分配器的优选实例是自动或手动操作的注射器，其包括容器(也称为筒)、柱塞(作为排出流体的装置，其典型形式为带有塞子的活塞)以及用于精确引导和沉积流体的尖端和/或针。
如本文所使用的，“配置成接收纤维蛋白原溶液的容器”优选是指任何适于接收和保持水溶液(例如，纤维蛋白原溶液)的容器。容器的材料不受特别限制，优选是防水的。合适材料的实例包括玻璃、塑料、优选硬质塑料或其它耐用材料。在优选的实施方式中，所述材料是透明的，使得纤维蛋白原溶液的颜色和/或填充状态可见。
所述容器的形状可以是锥形、长方体或圆柱形。优选的体积范围为0.1～100ml，优选0.5～10ml。
所述活化室是指配置用于接收和保持载体的分配器的室。所述活化室优选与容器流体连通，以允许纤维蛋白原溶液在分配时进入活化室。
在本发明的上下文中，上游和下游涉及分配的方向。在其典型操作模式下，分配器中的流体在分配时将首先通过上游部件，然后通过下游部件。
所述活化室和所述容器可以是相同的、优选刚性结构的一部分，并且优选由相同的材料制成以形成所述分配器的主体。所述活化室和所述容器还可以位于两个分开但可连接的组件中。这种情况，例如是活化室是可更换的尖端的一部分。
所述活化室和所述容器可以具有任何横截面形状(圆形、椭圆形、三角形、不规则形、方形或矩形等)。然而，优选所述活化室和所述容器在其接触位置处具有相似的横截面形状和尺寸。
如本文所使用的，“尖端”是指分配器的最下游挤出部分。在其分配端，与其更上游端相比，所述尖端通常表现出显著减小的横截面积，以便允许密封剂的精准沉积。所述尖端可以具有至少部分锥形的特征，并且在优选的实施方式中，包括钝端针或喷雾尖端部分。
如本文所使用的，术语“包括”和“包含”或其语法变体应该被视为指定所述特征、整数、步骤或组件，但不排除添加一个或多个附加特征、整数、步骤、组件或其组。该术语包括“由……组成”和“基本上由……组成”两个术语。
因此，术语“包括”/“包括”/“具有”意味着能够/可以存在任何进一步的组件(或类似的特征、整数、步骤等)。术语“由……组成”表示不存在另外组件(或类似的特征、整数、步骤等)。
当在本文中使用时，术语“基本上由……组成”或其语法变体将被视为指定所述特征、整数、步骤或组件，但不排除添加一个或多个附加特征、整数、步骤、组件或其组，但仅当附加特征、整数、步骤、其组件或组不会实质性地改变所要求保护的组合物、装置或方法的基本和新颖的特征。
因此，术语“基本上由……组成”意指那些特定的另外组件(或类似的特征、整数、步骤等)可以存在，即那些不会实质性地影响所述组合物、装置或方法的基本特征的组件。换言之，术语“基本上由……组成”(可在本文中与术语“基本上包括”互换使用)允许除了必要组件(或类似的特征、整数、步骤等)之外，在组合物、装置或方法中存在其他组件，前提是设备或方法的基本特性不受其他组件的存在的实质性影响。
附图说明
参照以下附图进一步说明本发明。附图例示了非限制性和潜在优选的实施方式，这些实施方式是为了进一步说明本发明而呈现的。
图1表示20μL的用环氧树脂(黑色)或氨基树脂(红色和绿色)固定的凝血酶的活性，固定条件为20mg/mL的凝血酶以及树脂：缓冲液之比为1:2。实线表示原始数据，而下面的虚线表示从未改性树脂中减去荧光信号后的校正值(底部虚线)。
图2表示荧光实验中所使用的典型标准品的凝血酶活性。
图3表示60分钟后标准品的荧光信号，包括用于计算固定的凝血酶表观活性的回归线。
图4表示在不同平均直径的氨基封端树脂上固定的凝血酶的活性。
图5表示分配器的优选实施方式的示意图。
实施例
通过参考以下非限制性实施例来进一步描述本发明。这些实施例描述了非限制性和实际的实施方式，这些实施例是为了进一步说明本发明而呈现的。
实施例的方法：
凝血酶固定
通过使用玻璃过滤器和中等负压以及用过量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(比利时韦尔维耶市Lonza公司)洗涤，从而平衡环氧基-(无间隔基)和氨基-(长C6间隔基)功能化树脂(Purolite公司，德国拉廷根市)，其孔径为
(平均孔径分别为：
和
)以及直径为150～300μm(平均直径分别为：222μm和198μm)。经过三次洗涤步骤后，添加树脂以分离PBS中的10～50mg/mL凝血酶溶液(BioPharm Laboratories LLC Bluffdale，USA)，树脂：缓冲液之比为1:2～4，并且在室温下放置在摇床上过夜。在固定之后，使用PierceBCA分析试剂盒(德国赛默飞世尔科技股份有限公司)对固定溶液进行检测，以确定固定化率。使用50mL的PBS清洗树脂三次，一次清洗用50mL的0.5M的NaCl和50mL的PBS，并且在PBS中以树脂：缓冲液之比为1:2储存。保存收集的洗涤液并且用于测定最终的固定化率。
凝血酶活性
使用荧光凝血酶底物(苯甲酰苯丙氨酸-精氨酸-AMC·HCl，德国达姆施塔特市默克股份有限公司)测定固定的凝血酶的活性，并且与标准量的凝血酶进行比较。简而言之，将标准的200μL尖端移液管的尖端在距离末端约5mm处切断，以扩大开口，并且将20μL的树脂悬浮液用移液管移入至黑色平孔96孔板(德国德雷奇纽克赛默飞世尔科学股份有限公司)中。向相同的孔，添加30μL的PBS，同时将50μL的每个凝血酶标准液(0～500U/mL)添加至96孔板。作为对照，测定背景荧光信号。将20μL未改性的树脂与30μL的PBS也添加至所述多孔板。当每个孔总共含有50μL的液体(标准品)或液体树脂混合物(固定的凝血酶)时，加入100μL的1mM凝血酶底物，立即将多孔板转移至酶标仪(德国奥尔滕贝格市BMG Labtech公司的Fluostar Optima)，并且开始测量。使用分别为350nm和430nm的激发波长和发射波长进行荧光测量。每150描述测量一次荧光信号，持续1小时。
纤维蛋白原活化和凝胶形成
将200μL的凝血酶固定树脂悬浮于200浮L的0.4M的CaCl2中，在5分钟之后，将树脂添加到含有1.5μm孔过滤器的改良注射器尖端。使用1mL注射器抽吸500μl的90mg/mL纤维蛋白原在超纯H2O中的溶液(德国达姆施塔特市默克股份有限公司)，并且将注射器连接到含有树脂的尖端。然后，将纤维蛋白原溶液通过含有凝血酶固定的树脂的尖端挤压在玻璃显微镜载玻片上，并在1分钟内观察凝胶形成。
例1：凝血酶的固定化产率
使用500毫克氨基封端的树脂在2mL不同凝血酶浓度的PBS中测定固定化率。通过测定固定溶液的蛋白质含量来计算初始产率，而最终产率包括洗涤后丢失的凝血酶量。
表1显示了氨基封端的树脂上固定的凝血酶的产率和最终产率，并证明对于这些树脂，在不同凝血酶浓度下可以获得高产率。
例2：凝血酶活性测定
测定环氧基和氨基封端的树脂的凝血酶活性(图1)，而在氨基封端的树脂情况中，使用低纯度(工业级)和高纯度凝血酶(工业级：90～250U/mg，高纯度：>1500U/mg)。固定在环氧基封端的树脂上的凝血酶的活性最低，并且在测量期间导致荧光信号增加，达到最大约10000au。当固定在氨基封端的树脂上时，凝血酶活性相当高，并且在测量的最初几分钟内呈指数级增加，此后在30分钟后继续线性增加。在于工业级凝血酶的情况下，获得的最大值约为20000au，而使用高纯度凝血酶的结果是数值超过25000au。
为了比较固定的凝血酶的活性和游离的凝血酶的活性，每个实验中包括了几个标准样品(图2)。
用凝血酶标准品计算固定的凝血酶的表观凝血酶活性，并在60分钟后获得荧光信号。
表2显示了不同树脂类型固定的凝血酶的表观活性结果。对于氨基封端的树脂，尤其是在凝血酶等级高的情况下，获得了特别好的结果。
还测定了具有不同平均树脂颗粒直径的氨基封端的树脂的凝血酶活性(图4)。在平均直径为388μm的树脂上固定的凝血酶的活性是最低的，并且在测量期间导致缓慢的线性荧光信号增加，达到约7000au的最大值。当使用平均粒径为59μm或116μm的树脂时，凝血酶活性更高，在60分钟时缓慢近似线性增加达到15000au。
相比之下，在平均粒径为198μm的树脂上的凝血酶活性呈快速指数增长，在最初10分钟内增长超过4倍，达到约18000au，并且在观察持续时间内持续线性增长，在60分钟达到25000au以上。
在含有凝血酶的树脂中加入底物后，荧光信号呈指数级快速增加，可以作为在固定后凝血酶活性保持的可靠指标。
标准样品表明，游离凝血酶导致荧光信号的快速增加，因为大量的底物被转化为其荧光产物。通过共价固定在环氧基封端的树脂上抑制凝血酶的自由运动导致信号随时间线性增加和/或粒径次优的树脂。虽然通过静电作用将氨基封端的树脂的氨基固定，但并不限制凝血酶的自由运动，并且产生与游离凝血酶相似的信号分布，特别是当使用平均直径约为200μm的颗粒时。
表3总结了不同粒径树脂的凝血酶活性结果，其表明粒径在150～300μm范围内的优选树脂的凝血酶活性显著增加。
例3：分配器设计
图5描绘了分配器1的优选实施放手的示意图，分配器1采用单筒注射器的形式。分配器1包括填充有纤维蛋白原溶液8的容器3，其位于活化室5的上游。在活化室5内，功能化载体7位于其中，凝血因子、优选凝血酶固定在所述功能化载体7上。配备有塞子13的活塞11允许分配密封剂。通过推动活塞11，纤维蛋白原溶液8从容器3中挤出并被迫通过所述活化室5。在此过程中，固定的凝血因子(优选凝血酶)的纤维蛋白原裂解活性产生聚合纤维蛋白。尖端9允许所产生的纤维蛋白密封剂精确沉积在所需部位。在活化室5的下游，分配器1优选地包括过滤器15，以防止功能化载体7的任何部分释放到尖端9中，由此释放到沉积位置。
表1.凝血酶的固定化率
表1在氨基封端的树脂上固定凝血酶的产量和最终产率。
表2.不同树脂类型凝血酶的表观活性
表3.不同尺寸树脂颗粒的凝血酶活性比较
附图标记清单
1 分配器
3 容器
5 活化室
7 功能化载体
8 纤维蛋白原溶液
9 尖端
11 活塞
13 塞子
15 过滤器
Claims (15)
1.一种止血用密封剂的分配器(1)，包括：
-被配置为接受纤维蛋白原溶液(8)的容器(3)；和
-活化室(5)，
所述活化室(5)位于所述容器(3)的下游，并且包含将凝血因子静电固定在其上的功能化载体(7)，其中所述功能化载体(7)是包含平均尺寸为150～300μm的颗粒的官能化树脂。
2.根据前述权利要求所述的分配器(1)，其中，所述凝血因子是纤维蛋白原裂解的蛋白酶，优选是凝血酶。
3.根据前述权利要求中任一项所述的分配器(1)，其中，所述官能化树脂是氨基官能化树脂，优选是氨基甲基丙烯酸酯树脂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分配器(1)，其中，所述官能化树脂包括附着有官能化基团的间隔部，其中所述间隔部优选包含有机部分或者由有机部分组成，所述有机部分包括C2-C20、优选C3-C10、优选有支链或无支链的烷基、烯基、炔基、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、酰胺基和/或芳烷基或其组合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的分配器(1)，其中，每克所述载体(7)固定有至少2000单位、优选至少5000单位、更优选至少10000单位(U)的凝血因子。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分配器(1)，其中，所述树脂颗粒是平均孔径在60nm至120nm之间的多孔颗粒。
7.根据前述权利要求中任一项所述的分配器(1)，还包括装备有塞子(13)的活塞(11)，所述塞子(13)被配置成被接纳在所述容器(3)中，并且用于从所述容器(3)挤出纤维蛋白原溶液(8)且通过所述活化室(5)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分配器(1)，还包括位于所述活化室(5)下游的过滤器(15)，其中所述过滤器(15)被配置成防止所述功能化载体(7)的释放。
9.根据前述权利要求中任一项所述的分配器(7)，其中，所述分配器(1)包括主体，所述主体包括所述容器(3)和可更换的尖端，其中所述活化室(5)包括在所述可更换的尖端或所述主体中。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分配器(1)，其中，所述容器(3)填充有包含纤维蛋白原(8)的溶液。
11.用于产生密封剂并将密封剂分配到所需位置的方法，包括：
-提供分配器(1)，所述分配器(1)包括：
o装满纤维蛋白原溶液(8)的容器(3)；和
o活化室(5)，
所述活化室(5)位于所述容器(3)的下游并且包含功能化载体(7)，凝血因子、优选是凝血酶静电固定在所述功能化载体(7)上；以及
-将纤维蛋白原溶液(8)分配到所需位置，其中在分配时，所述纤维蛋白原溶液(8)通过所述活化室(5)，从而产生和分配作为密封剂的聚合纤维蛋白。
12.用于根据权利要求1-10中任一项所述的分配器(1)的活化室(5)中的载体(7)，通过包括以下步骤的方法来生产：
-提供功能化载体(7)，所述功能化载体(7)是官能化树脂，优选是氨基官能化树脂，包含平均尺寸在150μm至300μm之间的颗粒；
-提供包含凝血因子、优选凝血酶的溶液；以及
-将包含凝血因子的溶液与功能化载体(7)孵育。
13.用于根据权利要求1-10中任一项所述的分配器(1)中的可更换尖端，其中，所述可更换尖端包括用于可释放地连接到分配器的主体的装置和包括功能化载体(7)的活化室(5)，凝血因子被静电固定在所述功能化载体(7)上，其中，所述功能化载体(7)是包含平均尺寸在150μm至300μm之间的颗粒的官能化树脂。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的分配器(1)、根据权利要求12所述的载体(7)和/或根据权利要求13所述的可更换尖端用于将密封剂分配到所需位置的用途。
15.一组套件，包括：
-根据权利要求1-10中任一项所述的分配器(1)、根据权利要求12所述的载体(7)和/或根据权利要求14所述的可更换尖端；
-包含纤维蛋白原(8)的溶液；和
-任选的根据权利要求11所述的用于分配止血用密封剂的方法的说明书。
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