DE3605908A1

DE3605908A1 - Verfahren zum reinigen von interferon

Info

Publication number: DE3605908A1
Application number: DE19863605908
Authority: DE
Inventors: Toshinori Koshigaya Saitama Kanamori; Ei Tokio/Tokyo Mochida; Masahiro Nobuhara; Kiyoshi Kawaguchi Saitama Yamaguchi
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-02-25
Filing date: 1986-02-24
Publication date: 1986-10-02
Also published as: DE3605908C2; JPH06800B2; JPS61197600A

Description

Verfahren zum Reinigen von Interferon
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen von Interferon. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zum Reinigen von Intei>feron unter Verwendung eines speziellen Adsorptionsmittels.
Interferone sind antivirale Substanzen, die von Nagano el al (Compt. Rend. Soc. Biol., Bd. 148, S. 1700, 1954) und Isaacs et al Cproc. Roy. Soc. Ser. B., Bd. 147, S. 258, 1957) entdeckt wurden und über die in neuerer Zeit berichtet wurde, wonach sie in einem weiten Bereich biologische Aktivitäten aufweisen, einschliesslich einer Antitumorwirkung (Gressor, I. et al, B.B.A, Bd. 516, S. 231, 1978). Ihre mögliche Anwendung als Arzneimittel hat deshalb an Bedeutung gewonnen.
Interferone werden im aLlgemeinen aus ZeLLkuLturen oder durch rekombinante DNA-Technologie gewonnen und der Gehalt an in dem Kulturmedium hergestellten Interferon ist im allgemeinen sehr niedrig. Um ein Interferon zu erhalten, welches als Medikament geeignet ist, ist es erforderlich, eine Reinigungsmethode zur Verfügung zu stellen, die es ermöglicht, ein hochgereinigtes Interferon aus einer rohen Interferonlösung zu gewinnen.
Verschiedene Verfahren zum Reinigen von Humaninterferon sind bekannt. Beispielsweise wurde als Reinigungsverfahren für Interferon-aL eine Zinkchelat-Säulenchromatografie (Rubinstein, M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 76, S. 640, 1979) und ein blaue Sepharose-Säulenchromatografie (Zoon, K.C. et al, Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, Bd. 76, S. 5601, 1979) beschrieben.
Für Interferon-ß wurden Aussalzverfahren mittels Ammoniumsulfat, eine Gelchromatografie und eine CM-Sephadex-Säulenchromatografie (Knight, E. Jr., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 73, S. 520, 1976), eine SP-Spehadex-Säulenchromatografie und eine Zinkchelat-Säulenchromatografie (Hosoi, Kazuo et al, JA-OS Nr.
64799-1980) beschrieben. Zum Reinigen von Interferon- t wurde eine Chromatografie über porösem Glas, eine Cocanavalin A-Agarose-Säulenchromatografie und eine Methode, bei welcher eine Kombination dieser Methoden angewendet wurde (Yip, Y.K. et al, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, Bd. 78, S. 1601, 1981) beschrieben.
Diese verschiedenen bekannten Reinigungsverfahren sind noch nicht befriedigend hinsichtlich des Reinigungsgrades alleine und um Interferon in einer Reinheit zu gewinnen, die für ein Arzneimittel ausreicht, ist es erforderlich, eine Mehrzahl von verschiedenen Reinigungsmethoden in Kombination anzuwenden. Aus diesem Grund ist das schliesslich erhaltene Interferon, selbst wenn es hochgereinigt ist, unvermeidlich nur in einer sehr geringen Ausbeute vorhanden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Reinigen von Interferon zur Verfügung zu stellen, bei dem man das Interferon in einer hohen Ausbeute gewinnt und wobei man spezielle Adsorptionsmittel verwendet.
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird eine rohe Interferonlösung mit einem Adsorptionsmittel unter Adsorption des Interferons auf dem Adsorptionsmittel in Berührung gebracht und anschliessend wird das Interferon mit einem Eluiermittel eluiert. Das Adsorptionsmittel umfasst eine wasserunlösliche Matrix aus einer organischen hochmolekulargewichtigen Substanz, die mit einem Liganden kombiniert ist. Der Ligand enthält mindestens ein Molekül einer Aminosäure mit einem aromatischen Ring oder eines Aminosäurederivats mit einem aromatischen Ring im Molekül und gleichzeitig enthält er eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe, die in der Lage ist, direkt mit der vorerwähnten wasserunlöslichen Matrix kombiniert zu werden oder die in der Lage ist, mit einem mit der Matrix kombinierten Abstandshalter zu kombinieren.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt. Eine Rohe Interferonlösung wird mit einem Adsorptionsmittel durch ein Säulenverfahren oder absatzweise unter Adsorption des Interferons auf dem Adsorptionsmittel in Berührung gebracht; dann wird das Adsorptionsmittel mit einem geeigneten Puffer gespült und anschliessend wird das Interferon mit einem geeigneten Eluiermittel eluiert.
Das erfindungsgemäss verwendete Adsorptionsmittel umfasst eine wasserunlösliche Matrix aus einer organischen, hochmolekulargewichtigen Substanz mit, gewünschtenfalls, einem Abstandshalter und einen Liganden.
Als wasserunlösliche Matrix, welche das Adsorptionsmittel bildet, kann man organische, hochmolekulargewichtige Substanzen, wie Agarose, Cellulose, Dextran, Polyacrylamid etc., verwenden. Besonders bevorzugt wird Agarose.
Der erfindungsgemäss verwendete Ligand ist eine Verbindung, die wenigstens ein Molekül einer Aminosäure mit einem aromatischen Ring oder eines Aminosäurederivats mit einem aromatischen Ring im Molekül umfasst. Der Ligand ist in der Lage, mit der wasserunlöslichen Matrix oder mit dem Abstandshalter, der mit der Matrix verbunden ist, über eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe in dem Liganden zu kombinieren.
Als Aminosäure mit einem aromatischen Ring können nicht nur d -Aminosäuren verwendet, sondern auch andere Aminosäuren, z.B. ß-Aminosäuren, t-Aminosäuren, -Aminosäuren etc., wobei ot-Aminosäuren im allgemeinen leicht zur Verfügung stehen und deshalb bevorzugt werden.
Von den d-Aminosäuren mit einem aromatischen Ring werden insbesondere L-Tryptophan, D-Tryptophan, L-Tyrosin, D-Tyrosin, L-Phenylalanin und D-Phenylalanin bevorzugt. Diese Aminosäuren können als Ligand in Form eines Monomers verwendet werden, es ist jedoch auch möglich, sie in Form eines Oligomers, das aus der gleichen Aminosäure oder wenigstens zwei Arten einer Aminosäure aufgebaut ist, zu verwenden. Als Oligomer wird ein Dimer oder Trimer bevorzugt.
Bei diesen Monomeren und Oligomeren von Aminosäuren ist es auch möglich solche zu verwenden, in welchen die enthaltene freie Carboxylgruppe alkyliert ist, und zwar vorzugsweise methyliert, ethyliert oder propyliert, z.B. ein Derivat des Monomers oder Oligomers der Aminosäuren.
Die als Liganden verwendeten Verbindungen können beispielsweise von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Kokusan Chemical Works und Nakarai Chemicals, Ltd., erhalten werden. Die Oligomeren kann man von Kokusan Chemical Works erhalten oder man kann sie durch eine Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid synthetisieren. Als Carbodiimid kann man N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodi imid-hydrochlorid (Nippon Bio-Rad Laboratories) etc. verwenden.
Die als Liganden verwendeten Verbindungen sind nicht auf die vorerwähnten Verbindungen beschränkt und man kann im wesentlichen jede Verbindung verwenden, die wenigstens ein Molekül einer Aminosäure mit einem aromatischen Ring oder eines Aminosäurederivats mit einem aromatischen Ring enthält und die gleichzeitig in der Lage ist, durch die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe im Molekül direkt mit der wasserunlöslichen Matrix oder indirekt über einen Abstandshalter zu kombinieren.
Das erfindungsgemäss verwendete Adsorptionsmittel ist ein solches, bei dem der Ligand mit der wasserunlöslichen Matrix kombiniert ist und die Mittel zum Kombinieren des Liganden mit der wasserunlöslichen Matrix vorhanden sind, wie oben angegeben, und schliesst eine direkte Kombinierungsmethode und eine indirekte Kombinierungsmethode über einen Abstandshalter (spacer) ein.
Bei einem Verfahren zum direkten Kombinieren des Liganden mit der wasserunlöslichen Matrix kann man beispielsweise Agarose als wasserunlösliche Matrix auswählen und die Agarose wird durch Bromcyan aktiviert und der Ligand kann in diese aktivierte Agarose über die in dem Liganden enthaltene Aminogruppe eingeführt werden. Alternativ ist es auch möglich, den Liganden in die Matrix unter Verwendung von Carbodiimid einzuführen, indem man eine Kondensationsreaktion zwischen der Aminogruppe des Liganden und der Carboxylgruppe der Matrix oder der Carboxylgruppe des Liganden und einer Aminogruppe der Matrix durchführt.
Als durch Bromcyan aktivierte Agarose kann man beispielsweise bromcyanaktivierte Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) verwenden.
Als Verfahren zum Kombinieren des Liganden mit der wasserunlöslichen Matrix über einen Abstandshalter kann man eine Kondensationsreaktion zwischen der Aminogruppe oder Carboxylgruppe in dem Liganden und der aminofunktionellen Gruppe oder carbonylfunktionellen Gruppe in dem Abstandshalter-Molekül verwenden.
Die Länge des Abstandshalter-Moleküls, mittels welchem der Ligand eingeführt wird, ist vorzugsweise derart, dass die Gesamtzahl der Atome in der geradkettigen Kette aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und/oder Schwefelatomen 2 bis 15 beträgt, wobei eine Kettenlänge von 5 bis 15 Atomen bei dem Abstandshalter besonders bevorzugt wird.
Man kann das Einführen der verschiedenen Abstandshalter in die wasserunlösliche Matrix durch chemische Synthese durchführen, jedoch kann man auch im Handel erhältliche wasserunlösliche Matrizes, die bereits einen Abstandshalter enthalten, verwenden. Beispielsweise kann man folgende Produkte verwenden: N-Hydroxysuccinimidester eines derivatisierten vernetzten Agarosegels, wie Affi-Gel 10

( ;-oCH2CoNH(CH2)2NHCo(CH2)2COONX ), Affi-Gel 15

0 O«s

CH3 >

( g-OCH2CONH(CH2)3N+(CH2)3NHCO(CH2) 2COONs )

H

o

(beide von Nippon Bio-Rad Laboratories), aktivierte

0

CH-Sepharose 4B ( -N H-(CH2) 5-C00N

0

) (Pharmacia Fine Chemicals); solche mit einer freien Carboxylgruppe oder Aminogruppe am Ende, wie Affi-Gel 202 (#-OCH2CONH(CH2)2NHCO(CH2)2COOH), Affi-Gel 102 ( #-OCH2CONH(CH2)2NH2) (beide von Nippon Bio-Rad Laboratories), AH-Sepharose 4B (#-NH-(CH2)6NH CH-Sepharose 4B ( t-NH-(CH2)6-COOH) (beide von Pharmacia Fine Chemicals) Die Menge des in die wasserunlösliche Matrix oder die wasserunlösliche Matrix, die mit dem Abstandshalter kombiniert ist, einzuführenden Liganden beträgt vorzugsweise 1 bis 10 umol pro ml der wasserunlöslichen Matrix im Falle einer bromcyanaktivierten wasserunlöslichen Matrix, z.B. bei bromcyanaktivierter Sepharose 4B, wobei 2 bis 4/umol/ml besonders bevorzugt werden. Wird der Ligand durch eine Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid eingeführt, dann bevorzugt man im aLLgemeinen 5 bis 20/umol/ml der wasserunlöslichen Matrix, wobei dies jedoch je nach der Art der wasserunlöslichen Matrix und dem Abstandshalter variieren kann.
Wird der Ligand in einen N-Hydroxysuccinimidester eines derivatisierten, vernetzten Agarosegels eingeführt, dann werden 5 bis 15/umol/ml der wasserunlöslichen Matrix bevorzugt.
Eine spezielle Methode zum Einführen des Liganden in die wasserunlösliche Matrix, und zwar entweder direkt oder über den Abstandshalter, wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt: Die direkte Einführung erfolgt, indem man die wasserunlösliche Matrix, die mit Bromcyan aktiviert wurde, und den Liganden in einen Carbonatpuffer oder Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8 bis 10 bei Raumtemperatur 1 bis 4 Stunden oder bei 4 0C über Nacht rührt. Das Einführen des Liganden durch die Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid wird durchgeführt, indem man über Nacht die Umsetzung in destilliertem Wasser durchführt und wobei man den pH-Wert von 4,5 bis 6 einstellt.
Die Einführung des Liganden über einen Abstandshalter, z.B. wenn der Ligand in einem N-Hydroxysuccinimidesterderivat eingeführt wird, erfolgt, indem man die Matrix und den Liganden bei einem pH-Wert von 5 bis 10 bei Raumtemperatur während 1 bis 4 Stunden oder bei 40C über Nacht umsetzt.
Wie bereits erwähnt, besteht das erfindungsgemässe Verfahren zum Reinigen von Interferon darin, dass man ein Adsorptionsmittel verwendet, bei dem eine wasserunlösliche Matrix aus einer organischen hochmolekulargewichtigen Substanz direkt mit einem Liganden kombiniert ist oder indirekt mit dem Liganden über einen geeigneten Abstandshalter kombiniert ist, wobei man es besonders bevorzugt, ein solches Adsorptionsmittel zu verwenden, bei welchemverwenden, bei welchem die wasserunlösliche Matrix und der Ligand über den Abstandshalter verbunden sind.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum Reinigen von Interferon umfasst das Kontaktieren einer rohen Interferonlösung mit dem wie oben angegeben hergestellten Adsorptionsmittel unter Adsorption des Interferons auf dem Adsorptionsmittel und anschliessendem Eluieren des adsorbierten Interferons mit einem Eluiermittel. Die jeweiligen Schritte können beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Der pH-Wert beim Kontaktieren des Adsorptionsmittels mit der Interferon enthaltenden Lösung (rohe Interferonlösung) beträgt vorzugsweise 4 bis 9; beispielsweise kann man als Lösungsmittel einen 0,01 M Phosphatpuffer bei dem pH-Wert 7 verwenden. Die Ionenstärke der rohen Interferonlösung braucht zu dieser Zeit nicht besonders beschränkt zu sein und wenn beispielsweise die Ionenstärke mit Natriumchlorid eingestellt wird, dann kann das Interferon auch dann, wenn die Endkonzentration 0,14 M beträgt, auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden. Wird die Ionenstärke weiter erhöht, z.B. wenn man Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 3 M zugibt, dann kann das Interferon immer noch ausreichend auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden. Der Kontakt zwischen dem Adsorptionsmittel und der rohen Interferonlösung kann entweder absatzweise erfolgen oder unter Verwendung einer Säule, wobei man die Säulenmethode bevorzugt, weil die Reinigungseffizienz grosser ist.
Das Adsorptionsmittel mit dem darauf adsorbierten Interferon wird dann vorzugsweise mit einer ausreichenden Menge eines Puffers, z.B. einen 0,01 M Phosphatpuffer mit dem pH-Wert 7, enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, gespült, bevor man das Interferon eluiert, um dadurch nicht-adsorbierte mit vorhandene Proteine etc. zu entfernen.
Anschliessend wird die Eluierung des Interferons von dem Adsorptionsmittel, auf dem das Interferon adsorbiert ist, durchgeführt unter Verwendung eines Puffers mit dem pH-Wert 4 bis 8, enthaltend 30 bis 80 % (W/V) eines flüssigen mehrwertigen Alkohols, wie Ethylenglykol oder Propylenglykol.
Interferone, die man nach dem erfindungsgemässen Verfahren reinigen kann, sind hauptsächlich Human-Interferon-oD, Human-Interferon-ß und Human-Interferon- t. Die zur reinigenden Interferone sind jedoch nicht auf diese Human-Interferone beschränkt, sondern schliessen auch Interferone ein, die von anderen Säugern stammen.
Beispielsweise kann man Mäuse-Interferon nach dem edfindungsgemässen Verfahren reinigen. Ebenso ist es möglich, nicht nur solche Interferone, die durch Zellkulturen gebildet wurden, zu reinigen, sondern auch Interferone, die unter Anwendung der Rekombinant-DNA-Technologie gewonnen wurden, z.B. Human-Interferone, die durch Escherichia coli, Hefen oder Säugetierzellen, enthaltend Human-Interferongene, erzeugt wurden.
Da das beim erfindungsgemässen Reinigungsverfahren verwendete Adsorptionsmittel Interferon adsorbieren kann, welches keine Zucker enthält und durch E. coli produziert wurde, nimmt man an, dass die Stellen in dem Interferon-Molekül, welche sich mit dem Adsorptionsmittelträger verbinden, keine Zuckerreste, sondern die Peptidreste sind. Man kann infolgedessen annehmen, dass das erfindungsgemäss verwendete Adsorptionsmittel nicht nur für natürliche Interferone geeignet ist, sondern auch für Interferone, in denen die Aminosäuresequenz etwas modifiziert ist, oder für Interferone, in welchen der Zuckerrest verändert wurde.
Man kann somit das erfindungsgemäss verwendete Adsorptionsmittel nicht nur für die Reinigung von rohen Interferonlösungen verwenden, sondern auch, um ein nach anderen Methoden teilgereinigtes Interferon weiter zu reinigen. Schliesslich ist es auch möglich, dass man durch eine Kombination von den verschiedenen erfindungsgemäss verwendeten Adsorptionsmitteln vollständig mitvorhandene Proteine, ausgenommen Interferone, entfernt.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Versuchsbeispielen und Beispielen näher beschrieben. Die in den Versuchsbeispielen und Beispielen angegebenen Aktivitäten wurden durch die CPE (Cytophatischer Effekt)-Methode unter Verwendung von FL-Zellen und Sindvis-Virus gemessen.
Die Aktivität von Human-Interferon-Ob und Human-Interferonwird ausgedrückt, basierend auf dem internationalen Standardprodukt von Human-Interferon-oS (G023-901-527) und die Aktivität von Human-Interferon-ß wird ausgedrückt, basierend auf dem internationalen Standardprodukt von Human-Interferon-ß (G023-902-527).
VERSUCHSBEISPIEL 1 40 ml Affi-Gel 15 wurden mit 4 1 kaltem destillierten Wasser gewaschen und dann weiter mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6) gewaschen und in dem gleichen Puffer bis zu einem Volumen von 40 ml suspendiert. Diese Suspension wurde in 10 ml-Anteile aufgeteilt und 10 ml von wässrigen Lösungen von D-Phenylalanyl-D-phenylalanin, eingestellt auf 1 mM, 5 mM, 20 mM bzw. 40 mM, wurden zu den jeweiligen Anteilen zugegeben und 18 Stunden bei 40C gerührt, wobei man Adsorptionsmittel erhielt, die mit unterschiedlichen Mengen von D-Phenylalanyl-D-phenylalanin als Liganden kombiniert waren. Die Menge des an den Träger gebundenen Liganden wurde berechnet, indem man den nicht-adsorbierten Liganden von der Gesamtmenge des für die Kombinationsreaktion verwendeten Liganden subtrahierte und wobei man die Werte erhielt, indem man die Absorption der Lösung nach der Ligandenkombinationsreaktion und die der Waschwässer mass. Die jeweils in der vorher erwähnten Weise hergestellten Adsorptionsmittel wurden mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, gewaschen und jeweils in Säulen mit einem Durchmesser von 1,5 cm gepackt. Anschliessend wurden 500 ml einer rohen Interferon-ß-Lösung, hergestellt von normalen humanen Fibroblast-MRC-5-Zellen nach der Methode von Vilcek et al (Antimicrob. Ag. Chemother., Bd. 2, S. 476, 1972) (spezifische Aktivität 6,3 x 104 Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 7,2 x 10 Einheiten) durch die jeweiligen Säulen laufen gelassen.
Anschliessend wurden die Säulen in denen das Interferon adsorbiert war, mit dem vorerwähnten Puffer mit einem pH-Wert von 7 gespült und dann wurde der vorerwähnte 0,01 M Phosphatpuffer, enthaltend 50 % (W/V) Ethylenglykol, zum Eluieren des adsorbierten Interferons durch die Säulen laufen gelassen.
Die Ergebnisse der Reinigung, unter Verwendung der jeweiligen Adsorptionsmittel mit unterschiedlichen Mengen an Liganden, werden in Tabelle 1 gezeigt.

TABELLE 1

Menge des pro ml Rückgewinnung spezifische Akti-

Matrix kombinier- % vität (Einheiten/

ten Liganden mg)

1 /umol 26 7,7 x 107

4 IU 63 2,6 x 108

15 " 83 1,8 x 108

22 22 " 88 1,2 x 108

VERSUCHSBEISPIEL 2 Um den Einfluss der Länge des Abstandshalters in dem Adsorptionsmittel auf den Grad der Reinigung und die Wiedergewinnung von Interferon zu untersuchen, wurden Adsorptionsmittel mit unterschiedlich langen Abstandshaltern hergestellt.

Ein Adsorptionsmittel, welches keinen Abstandshalter enthielt, wurde wie folgt hergestellt: Im Handel erhältliche, bromcyanaktivierte Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) wurde mit einer 1 mM Salzsäurelösung angequollen und mit der gleichen Lösung gewaschen.
Der Ligand (L-Trypthophyl-L-tryptophanmethylester), gelöst in einem Kupplungspuffer aus 0,1 M Carbonatpuffer (pH 8,3), enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, wurde in einer solchen Menge zugegeben, dass 10 /umol/ml der Matrix vorlagen. Nach dem Rühren über Nacht bei 40C wurden die nicht-umgesetzten Teile mit Glycin blockiert und das so erhaltene Adsorptionsmittel war für die weitere Verwendung in dem Versuch fertig.
Ein Adsorptionsmittel mit einem Abstandshalter von 6 Kohlenstoffatomen Länge wurde hergestellt, indem man den Liganden an im Handel erhältliche CH-Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) durch eine Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid kombinierte. Hierzu wurde ein trockenes Pulver von CH-Sepharose 4B in 0,5 M Natriumchloridlösung angequollen und dann weiter mit der gleichen Lösung gewaschen. Der Ligand wurde in destilliertem Wasser gelöst und dann wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt, unter Erhalt einer 20 mM-Lösung des Lignaden. 20 ml dieser Ligand-Lösung wurden mit 20 ml der zuvor erwähnten, gewaschenen CH-Sepharose 4B vermischt und weiterhin wurden 5 ml einer wässrigen 0,2 M Carbodiimidlösung, eingestellt auf pH 4,5, unmittelbar darauf zugegeben und unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht vermischt.
Die Adsorptionsmittel mit Abstandshaltern von 10 bzw.
15 Atomen Länge wurden hergestellt, indem man den Liganden in Affi-Gel 10 bzw. Affi-Gel 15, enthaltend ein N-Hydroxysuccinimidderivat, (beide von Nippon Bio-Rad Laboratories) einführte. 30 ml des jeweiligen Harzes wurden mit kaltem destillierten Wasser gewaschen und dann mit einem kalten Kupplungspuffer aus 0,05 M Phosphatpuffer mit dem pH-Wert 7 für Affi-Gel 10 oder einen 0,05 M Phosphatpuffer mit dem pH-Wert 6 für Affi-Gel 15, gewaschen. 20 ml der jeweiligen Matrix nach dem Waschen wurden mit 20 ml einer 20 mM-Ligandenlösung, die getrennt unter Verwendung des kalten Kupplungspuffers hergesteylt worden waren, vermischt und bei 4 0C über Nacht gerührt.
10 ml des jeweils so hergestellten Adsorptionsmittels wurden in eine Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm gepackt und mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht.
Nach der Methode von Zoon et al (J. Clin. Microbiol., Bd. 7, S. 44, 1979) wurden 500 ml einer rohen Human-Interferon-α-Lösung, hergestellt mit Namalwa-Zellen (spezifische Aktivität 8,3 x 104 Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 2,4 x 106 Einheiten) durch die jeweiligen Säulen laufen gelassen Die Säulen wurden dann mit dem vorerwähnten Puffer bei pH 7,5 gespült und das adsorbierte Interferon wurde mit dem vorerwähnten Puffer von pH 7,5, enthaltend 60 % (W/V) Propylenglykol, eluiert.
Die Reinigungswirkung von Interferon-α, die mit den jeweiligen Adsorptionsmitteln erzielt wurde, wird in Tabelle 2 gezeigt.

TABELLE 2

Träger Abstandshalter Rückgewinnung spezifische Akti-

% vität (Einheit/mg)

CNBr-aktivier-

te Sepharose --- 56 1,1 x 107

4B

CH-Sepharose 4B #-NH-(CH2)6-COOH 77 4,3 x 107

O

#

Affi-Gel 10 #-OCH2CONH(CH2)2NH(CH2)2COON # 83 7,7 x 107

#

O

CH3 O

# #

Affi-Gel 15 #-OCH2CONH(CH2)3N+(CH2)32NHCO(CH2)2COON # 80 6,2 x 107

# #

H O

VERSUCHSBEISPIEL 3 Affi-Gel 10 wurden mit kaltem destillierten Wasser und einem gekühlten 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und dann in 10 ml-Anteile aufgeteilt. Jeder Anteil wurde mit verschiedenen L-Aminosäuren, Oligomeren von L-Aminosäuren bzw. deren Methylestern umgesetzt, unter Erhalt von Adsorptionsmitteln mit unterschiedlichen Liganden, wobei die Umsetzung in gleicher Weise erfolgte wie im Versuchsbeispiel 2. Die Menge des jeweils bei der Umsetzung verwendeten Liganden betrug 20/ umol/ml Matrix. 10 ml des so hergestellten Adsorptionsmittels wurden jeweils in Säulen von 1,5 cm Durchmesser gepackt, mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 1 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht und 500 ml einer rohen Human-Interferon-ß-Lösung, hergestellt aus MRC-5-Zellen und eingestellt auf eine End-Natriumchlorid-Konzentration von 1M (spezifische Aktivität 8,5 x 104 Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 9,6 x 106 Einheiten) wurden durchlaufen gelassen. Die Säule wurde mit dem vorerwähnten Puffer, enthaltend Natriumchlorid, gespült und dann weiter mit dem gleichen Puffer, enthaltend 3 x (W/V) Propylenglykol, gespült und anschliessend wurde das adsorbierte Interferon mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 1 M Natriumchlorid, und dem 80 % (W/V) Propylenglykol zugegeben worden waren, eluiert. Die Wirkung der Reinigung des Interferon-ß mit den jeweiligen Adsorptionsmitteln wird in Tabelle 3 gezeigt.

TABELLE 3

Ligand Rückgewin- spezifische Aktivität

nung (%) (Einheiten/mg)

L-Tryptophan 73 8,9 x 107

L-Phenylalanin 71 9,2 x 107

L-Tyrosin 70 7,5 x 107

D-Phenylalanin 72 9,0 x 107

L-Tryptophanmethylester 81 1,3 x 108

D-Phenylalaninmethylester 80 1,2 x 108

L-Glycin 0 ---

D-Serin 0 ---

L-Tryptophyl-L-tryptophan 89 1,7 x 108

L-Phenylalanyl-L-phenylalanin 86 1,9 x 108

L-Tyrosyl-L-tyrosin 83 1,3 x 108

L-Tryptophyl-L-phenylalanin 85 1,9 x 108

L-Tyrosyl-L-tryptophan 86 1,6 x 108

D-Tyrosyl-D-tryptophan 84 1,9 x 108

D-Tyrosyl-L-tryptophan 88 1,6 x 108

L-Tryptophyl-L-tryptophanmethylester 90 2,4 x 108

L-Phenylalanyl-L-phenylalaninmethylester 92 2,7 x 108

FORTSETZUNG TABELLE 2 Ligand Rückgewin- spezifische Aktivität nung (%) (Einheiten/mg) D-Tyrosyl-L-phenylalaninmethylester 90 2,5 x 108 L-Seryl-L-glycin 0-L-Seryl-L-alaninmethylester 0-L-Tryptophyl-L-tryptophyl-L-tryptophan 68 3,1 x 108 L-Phenylalanyl-L-phenylalanin-L-phenylalaninmethylester 76 2,7 x 108 L-Trypttophyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin 73 2,9 x 108 L-Alanyl-L-seryl-L-glycin 0 --- VERSUCHSBEISPIEL 4 D-Tyrosyl-L-tryptophan wurde als Ligand in Affi-Gel 100, in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 2 beschrieben, unter Erhalt von 10 ml eines Adsorptionsmittels eingeführt. Dieses Adsorptionsmittel wurde in eine Säule mit 1,5 cm Durchmesser gepackt, mit einem 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht und dann wurden 100 ml einer Human-Interferon- t-Lösung, die unter Verwendung von humanen peripheren Lymphozyten nach der Methode von Langford (Infect. Immun., Bd. 26, S. 36, 1979) erhalten worden waren (spezifische Aktivität 1,3 x 104 Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 3,1 x 105 Einheiten) durch die Säule laufen gelassen.

Die Säule wurde mit dem vorerwähnten Puffer gespült und dann wurde das adsorbierte Interferon mit dem vorgenannten Puffer, enthaltend 50 % Ethylenglykol, eluiert. Die Wiedergewinnung an eluiertem Interferon betrug 66 % und die spezifische Aktivität betrug 2,7 x 106 Einheiten/mg.
VERSUCHSBEISPIEL 5 CH-Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) wurde in einer 0,5 M Natriumchloridlösung angequollen und mit der gleichen Lösung gewaschen. Anschliessend wurde durch eine Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 2 D-Tyrosin, D-Tyrosinmethylester, D-Tyrosinethylester bzw. D-Tyrosinpropylester in die Matrix als Ligand eingeführt. Die Menge des bei der Kondensationsreaktion eingeführten Liganden betrug 20/umol/ml der Matrix.
10 ml des jeweils mit dem Liganden versehenen Adsorptionsmittels wurden in eine Säule von 1,5 cm Durchmesser gepackt, mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht und dann wurden 500 ml einer rohen Mäuse-Interferon-Lösung, hergestellt unter Verwendung von L929-Zellen nach der Methode von Kronenberg (Virology, Bd. 76, S. 634, 1977) (spezifische Aktivität 2,2 x Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 1,3 x 106 Einheiten) durch die jeweiligen Säulen laufen gelassen.
Anschliessend wurde jede der Säulen mit dem vorgenannten Puffer gespült und dann wurde das adsorbierte Interferon mit dem vorgenannten Puffer, enthaltend 50 % (W/V) Ethylenglykol, eluiert. Die Reinigungswirkung bei dem Mäuse-Interferon mittels der speziellen Adsorptionsmittel wird in Tabelle 4 gezeigt.
TABELLE 4 Ligand Rückgewinnung spezifische Aktivität (%) (Einheiten/mg) D-Tyrosin 53 6,6 x 106 D-Tyrosinmethylester 72 9,7 x 106 D-Tyrosinethylester 67 7,8 x 106 D-Tyrosinpropylester 55 4,5 x 106 BEISPIEL 1 Ein trockenes Pulver aus AH-Sepharose 48 (Pharmacia Fine Chemicals) wurde in einer 0,5 M Natriumchloridlösung angequollen und anschliessend wurden 40 ml davon mit der gleichen Lösung gewaschen. L-Tryptophyl-L-phenylalanin wurde in destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert wurde unter Erhalt einer 20 mM-Lösung auf 4,5 eingestellt.
40 ml der Ligand-Lösung und 40 ml der gewaschenen Matrix wurden vermischt und dann wurden unmittelbar darauf 10 ml einer 0,2 M wässrigen Carbodiimidlösung zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das durch die vorgenannte Umsetzung erhaltene Adsorptionsmittel wurde in eine Säule von 2 cm Durchmesser gepackt, mit 0,01 M Phosphatpuffer, enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht und anschliessend wurden 4 1 einer rohen Interferon- &-Lösung, hergestellt durch Stimulierung von Human-Lymphozyten durch den Newcastle-Krankheitsvirus nach der Methode von Cesario et al (Antimicrob. Ag. Chemother., Bd. 11. S. 291, 1977) hindurchlaufen gelassen. Nach dem Spülen mit dem vorgenannten Puffer von pH 7 wurde das adsorbierte Unterferon mit dem vorgenannten Puffer von pH 7, enthaltend 50 x (W/V) Ethylenglykol, eluiert. Es wurden 72 % des adsorbierten Interferons wiedergewonnen und die spezifische Aktivität betrug 2,5 x 107 Einheiten/mg.
BEISPIEL 2 50 ml Affi-Gel wurden mit kaltem destillierten Wasser und einer gekühlten 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7) gewaschen und dann mit 50 ml einer D-Tryptophyl-D-tryptophan-Lösung eingestellt auf 20 mM, mit dem vorgenannten Puffer vermischt und bei einem pH-Wert von 7 bei 4°C über Nacht gerührt. Das auf diese Weise gebildete Adsorptionsmittel wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm gepackt und dann mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 8), enthaltend 1 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht. Zu 2 1 einer rohen Human-Interferon-ß-Lösung, hergestellt unter Verwendung von E. coli nach der Methode von Taniguchi et al (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 77, S. 5320, 1980> (spezifische Aktivität 4,8 x 104 Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 3,3 x 10 Einheiten) wurde Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1 M gegeben und diese Lösung wurde durch die Säule laufen gelassen. Die Säule wurde kontinuierlich mit dem vorgenannten Puffer mit einem pH-Wert von 8 und dem vorgenannten Puffer mit einem pH-Wert von 8, enthaltend 10 % (W/V) Propylenglykol, gespült und das adsorbierte Interferon wurde mit einem 0,01 M Phosphatpuffer, enthaltend 60 % (W/V) Propylenglykol und 1 M Natriumchlorid, eluiert. Die Rückgewinnung al eluiertem Interferon betrug 70 % und die spezifische Aktivität betrug 5,1 x 107 Einheiten/mg.
BEISP-IEL 3 50 ml Affi-Gel 10 wurden mit kaltem destillierten Wasser und einem gekühlten 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und dann mit 50 ml einer L-Phenylalanyl-L-phenylalaninmethylester-Lösung, eingestellt auf 20 mM mit dem vorgenannten Puffer, vermischt und bei 40C und einem pH-Wert von 7 über Nacht gerührt. Das so erhaltene Adsorptionsmittel wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm Durchmesser gepackt und mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 1 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht. Zu 2,5 1 einer rohen Human-Interferon-ß-Lösung, hergestellt aus MRC-5-Zellen (spezifische Aktivität 8,0 x 104 Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 4,2 x 107 Einheiten) wurde Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1 M gegeben und diese Lösung wurde durch die Säule laufen gelassen. Das Adsorptionsmittel wurde mit dem vorerwähnten, Natriumchlorid enthaltenden Puffer, und dann mit der gleichen Lösung, enthaltend weiterhin 3 % (W/V) Propylenglykol, gespült und das adsorbierte Interferon wurde mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 80 % (W/V) Propylenglykol und 1 M Natriumchlorid, eluiert.Die Rückgewinnung des eluierten Interferons betrug 89 % und die spezifische Aktivität 2,3 x 108 Einheiten/mg.

Claims

Verfahren zum Reinigen von Interferon PATENTANSPRUCHE 1Verfahren zum Reinigen von Interferon, bei dem man eine rohe Interferonlösung mit einem Adsorptionsmittel in Berührung bringt und das Interferon auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert und anschliessend das Interferon mit einem Eluiermittel eluiert, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass man als Adsorptionsmittel eine organische, hochmolekulargewichtige, wasserunlösliche Matrix, die direkt oder durch einen Abstandshalter mit einem Liganden kombiniert ist, verwendet, wobei der Ligand (a) wenigstens ein Molekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminosäure, enthaltend einen aromatischen Ring, und einem Aminosäurederivat, enthaltend einen aromatischen Ring, und (b) einer Aminogruppe oder Carboxylgruppe, die in der Lage ist, direkt mit der wasserlöslichen Matrix oder dem Abstandshalter kombiniert zu werden, umfasst.
2. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass der Ligand aus der Gruppe, bestehend aus einem Monomer einer Aminosäure, enthaltend einen aromatischen Ring, und einem Monomer eines Aminosäurederivates, enthaltend einen aromatischen Ring, ausgewählt ist.
3. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass der Ligand eine Oligomerverbindung von wenigstens einem Glied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren, enthaltend einen aromatischen Ring, und Aminosäurederivaten, enthaltend einen aromatischen Ring, ist.
4. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Oligomer ein Dimer oder Trimer ist.
5. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Aminosäurederivat mit einem aromatischen Ring eine Aminosäure, enthaltend eine alkylierte Carboxylgruppe, ist.
6. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 5, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die Carboxylgruppe mit einer Methyl-, Ethyl- und/oder Propylgruppe alkyliert ist.
7. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die Aminosäure, enthaltend einen aromatischen Ring, eine Aminosäure, ausgewählt aus L-Tryptophan, D-Tryptophan, L-Tyrosin, D-Tyrosin, L-Phenylalanin und D-Phenylalanin, ist.
8. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Aminosäurederivat, enthaltend einen aromatischen Ring, ein Derivat einer Aminosäure, ausgewählt aus L-Tryptophan, D-Tryptophan, L-Tyrosin, D-Tyrosin, L-Phenylalanin und D-Phenylalanin, ist.
9. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die wasserunlösliche Matrix aus Agarose, Cellulose, Dextran und Polyacrylamid ausgewählt ist.
10. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 9, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die wasserunlösliche Matrix Agarose ist.
11. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass der Abstandshalter eine geradkettige Kette mit 2 bis 15 Atomen, ausgewähit aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-und Schwefelatomen, ist.
12. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 11, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass der Abstandshalter eine geradkettige Kette mit 5 bis 15 Atomen enthält.
13. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Interferon Humaninterferon ist.
14. Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Interferon ein modifiziertes Interferon ist.