DE69732709T2

DE69732709T2 - Expressionsblockierung von virulenten faktoren in s. aureus

Info

Publication number: DE69732709T2
Application number: DE69732709T
Authority: DE
Inventors: P. Richard NOVICK; Guangyong Ji; Ronald Beavis
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 1996-05-22
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2017-05-23
Also published as: EP0932613B1; EP0932613A1; AU735283B2; CA2256465A1; PT932613E; EP0932613A4; WO1997044349A1; AU3211797A; DE69732709D1; JP2000511537A; ATE290548T1

Description

Die Realisierung der Erfindung wurde von dem Fördermittel NIH Grant Nr. A1-R01-30138 unterstützt. Deshalb hat die Regierung gewisse Rechte daran.
STAND DER TECHNIK FÜR DIE ERFINDUNG
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist Gram-positiv, aerobisch bakterienpathogen und unterscheidet sich von anderen Staphylokokkenspezies durch die Produktion des Enzyms Coagulase. Sa ist ein normaler Bewohner von Haut und Schleimhäuten des Menschen und anderer Tiere und dringt unter bestimmten Umständen in den Körper ein, wodurch es eine große Vielfalt krankhafter Zustände verursacht, die von oberflächlichen Abszessen (Beulen und Furunkeln) bis hin zu entstellenden und lebensbedrohlichen tiefen Infektionen wie Endocarditis, Lungenentzündung, Osteomyelitis, septische Arthritis, Meningitis, postoperative Wundinfektionen und Blutvergiftung reichen. Sa verursacht auch Erkrankungen wie das toxische Schocksyndrom.
Wie andere Gram-positive Pathogene verursacht Sa Krankheiten hauptsächlich durch die Produktion und Sekretion gesundheitsschädlicher Proteine. Diese gesundheitsschädlichen extrazellulären Proteine oder Virulenzfaktoren (VF) umfassen Toxine, die Wirtszellen schädigen oder auflösen und solche, die in das Immunsystem eingreifen, und Enzyme, die Gewebekomponenten wie Proteine, Nucleinsäuren, Lipide und Polysaccharide abbauen.
In Laborkulturen werden VF am Ende der exponentiellen Standardwachstumsphase innerhalb eines AbTrenngrenzes des Wachstumszyklus produziert und ausgeschieden, der als postexponentielle Phase bekannt ist. Die VF-Produktion ist koordiniert reguliert, und es wird angenommen, dass sie einen Versuch der Bakterien darstellt, in einer Zeit schnell abnehmender Ressourcen neue Nahrungsquellen zu erschließen. Im infizierten Lebewesen kann dies einen Angriff auf die Verteidigungsmechanismen des Wirts einschließen, die mobilisiert worden sind, die Infektion abzuwehren und in Schach zu halten.
Sa-Infektionen werden gegenwärtig mit Antibiotika behandelt, die natürliche oder halbsynthetische Chemikalien sind, die das Bakterienzellwachstum beenden oder hemmen. Leider sind Antibiotika aufgrund der erworbenen Widerstandsfähigkeit von Sa ihnen gegenüber bei der Behandlung von Sa-Infektionen immer weniger wirksam geworden. Zurzeit werden weltweit schwere Krankenhausepidemien von Sa-Stämmen verursacht, die gegenüber den meisten Antibiotika resistent sind. Das Antibiotikum Vancomycin ist bei der Behandlung verschiedener Sa-Stämme immer noch wirksam, obwohl die große Gefahr besteht, dass diese aus einem eng verwandten Gram-positiven Pathogen, Enterococcus faecalis, bald auch Resistenz gegenüber Vancomycin erwerben werden.
Da es wenig Grund dafür gibt, die Einführung neuer großer Antibiotikaklassen zu erwarten, besteht dringender Bedarf an der Entwicklung neuer Verfahren zur Bekämpfung von Sa-Infektionen wie des Eingriffs in die VF-Expression. Wenn die Bakterien "entwaffnet" werden könnten, wird angenommen, dass die Verteidigungsmechanismen des Wirts den Rest erledigen werden.
Bei S. aureus wird die Expression von Virulenzfaktoren von einem als agr bekannten globalen Regulator gesteuert (Peng, H. et al., J. Bacteriol., 179, 4365–4372 [1988], Regassa, L. B. et al., Infect. Immun., 60, 3381–3383 [1992]). Agr ist ein genetischer Locus, der einige Gene enthält. Von zweien davon, agrA und agrC, wird angenommen, dass sie einen Signalübertragungsweg (STR) bilden, der auf ein oder mehrere äußere Signalmoleküle durch Aktivierung der Transkription eines dritten Gens, agr-rnaIII, reagiert (Kornblum, J. et al., Molecular Biology of the Staphylococci, R. P. Novick, Hrsg. [VCH Publishers, New York, 1990], Bourret, R. B. et al., Annu. Rev. Biochem., 60, 401–441 [1991]). Das als RNAIII bekannte hauptsächliche Transkript von agr-rnaIII induziert die Transkription der 20 oder mehr unabhängigen Gene, die für Virulenzfaktoren kodieren, was in der VF-Synthese resultiert (Novick, R. P. et al., EMBO Journal, 12 [10], 3967–3975 [1993]).
Es hat sich gezeigt, dass im Labor erzeugte Mutantenstämme von Sa, die nicht in der Lage sind, VF zu exprimieren, eine stark verringerte Virulenz aufweisen (Foster et al., Molecular Biology of the Staphylococci, Hrsg.: R. P. Novick, VCH Publisher, New York, 403–420 [1990]). Ein Eingriff in die Aktivierung des agr-Systems würde deshalb ein einfaches Mittel zur Blockierung der Expression von VF ergeben und somit in den Infektionsvorgang eingreifen. Raychoudhury, S. et al., PNAS, 90, 965–969 (1993) beschrieben die Identifizierung synthetischer chemischer Verbindungen, welche die Expression von Alginat, einem VF für das Pathogen der cystischen Fibrose, Pseudomonas aeruginosa, blockieren. Es ist jedoch nicht gezeigt worden, ob diese Chemikalien eine Wirkung auf Sa und somit potenzielle klinische Nützlichkeit haben.
In PNAS, 92, 12055–12059 (1995) ist das Peptid YSTCDFIM zur Aktivierung der Expression des agr-locus, eines globalen Regulators der Virulenzantwort, offenbart.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung beruht auf der Identifizierung von Peptiden, die in die Aktivierung der rnaIII-Transkription eingreifen und somit die Expression von VF verhindern. Sie ist auf ein Arzneimittel gerichtet, das ein gereinigtes Peptid, das die agr-rnaIII-Transkripition in S. aureus inhibiert und sechs bis zwölf Aminosäuren in der Länge enthält, oder ein Analogon davon, das die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus inhibiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Weitere erfindungsgemäße Gegenstände sind die Verwendung dieses Peptids bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhütung einer von S. aureus verursachten Infektion oder Erkrankung sowie ein nichttherapeutisches Verfahren zur Hemmung der agr-rnaIII-Transkripiton in S. aureus.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
In 1 ist der agr-Locus von S. aureus gezeigt. Die schematische Karte des agr-Locus zeigt die großen Transkripte RNAII und RNAIII (Pfeile) und die umrandet dargestellten Gene.
In 2 ist ein Vergleich der vorhergesagten AgrD-Sequenzen der S.-aureus-Stämme RN6390B (Laborstamm), RN7690 (klinisches Isolat), RN6607 (klinisches Isolat), RN8463 (klinisches Isolat) und S. lugdunensis gezeigt. Die unterstrichene Region entspricht der Identifizierung des Aktivatorpeptids aus RN6309B und des Inhibitorpeptids aus S. lugdunensis.
In 3 sind die Wirkungen des gereinigten Peptids aus den S.-aureus-Stämmen RN6390B, RN6607 und RN8463 auf die RNAIII-Transkription der in der frühen exponentiellen Phase (EEP) und der mittleren exponentiellen Phase (MEP) kultivierten S.-aureus-Stämme RN6390B, RN6607 und RN8463 gezeigt. Die RNAIII-Transkription wurde, wie in Ji, G. et al., PNAS USA, 92, 12055–12059 (1995) beschrieben, mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, als Kontrolle gemessen.
In den 4A und 4B ist der Einfluss von S.-lugdunensis-Pheromon auf die RNAIII-Transkription verschiedener S.-aureus-Stämme gezeigt: RN6390B (Laborstamm), RN6596 (Laborstamm), RN6607 (klinisches Isolat), RN7690 (klinisches Isolat), RN7843 (klinisches Isolat), RN8462 (TSST) und RN8463 (TSST). Davon zeigt 4A Aktivierungsassays und 4B Inhibierungsassays.
SPEZIELLE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß werden gereinigte und isolierte Peptide bereitgestellt, welche die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus hemmen. Die erfindungsgemäßen Peptide sind cyclisch, umfassen etwa sechs bis etwa zwölf Aminosäuren in der Länge und schließen die Aminosäure Nummer 28 der AgrD-Region eines Staphylokokkenbakteriums ein. Hierbei entspricht die Aminosäure Nummer 28 der agrD-Region eines Staphylokokkenbakteriums dem in 2 gezeigten "Cystein", von welchem angenommen wird, dass es in den entsprechenden AgrD-Regionen verschiedener Staphylokokkenbakterien erhalten bleibt. Das Staphylokokkenbakterium umfasst beispielsweise S. aureus, S. capitis, S. caprae, S. carnosus, S. caseolyticus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. hyicus Subsp. hyicus, S. hyicus Subsp. chromo, S. kloosii, S. lentus, S. lugdunensis, S. sciuri, S. simulans und S. xylosus.
Die erfindungsgemäßen Inhibitorpeptide umfassen Sequenzen, die dem nativen Peptid aus dem Staphylokokkenbakterium entsprechen, sowie Analoge davon, die Aminosäuresubstitutionen enthalten, die auch in Peptiden resultieren, die in der Lage sind, die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus zu inhibieren. Die gereinigten erfindungsgemäßen Inhibitorpeptide können direkt aus dem Staphylokokkenbakterium isoliert, rekombinant produziert oder unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren chemisch synthetisiert werden. Vorzugsweise werden die Peptide chemisch synthetisiert. Spezielle Beispiele der Inhibitorpeptide umfassen folgende Aminosäuresequenzen: NH₂-Asp-Ile-Cys-Asn-Ala-Tyr-Phe-COOH, NH₂-Tyr-Ser-Thr-Cys-Asp-Phe-Ile-Met-COOH, NH₂-Gly-Val-Asn-Ala-Cys-Ser-Ser-Leu-Phe-COOH und NH₂-Tyr-Ile-Asn-Cys-Asp-Phe-Leu-Leu-COOH, wobei jedes Peptid eine cyclische Thioesterbindung zwischen dem Cystein und dem COOH-Ende enthält. Die Synthese von Peptiden, die cyclische Thioesterbindungen zwischen dem Cystein und dem COOH-Ende enthalten, liegt innerhalb der Kenntnisse des DurchTrenngrenzesfachmanns. Es befindet sich auch innerhalb des Erfindungsumfangs, dass die cyclische Bindung eine andere Bindung als eine Thioesterbindung wie eine Disulfidbindung sein kann, die durch Addition eines Cysteinrestes an das Carboxylende erhalten werden kann, solange eine solche Modifizierung in einem Peptid mit Inhibitorwirkung resultiert.
Erfindungsgemäß wird weiterhin eine Peptidzusammensetzung bereitgestellt, die ein oder mehrere der Inhibitorpeptide und einen pharmazeutisch oder physiologisch verträglichen Träger umfasst. Dabei muss der Träger in dem Sinne "verträglich" sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für deren Empfänger nicht nachteilig ist. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger umfassen Lactose, Sucrose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat, kristalline Cellulose, Methylcellulose, Carboxylmethylcellulose, Glycerin, Natriumalginat, Gummi arabicum, Pulver, Kochsalzlösung und Wasser. Die Wahl des Träger ist vom Verabreichungsweg abhängig. Die Formulierungen können bequemerweise in einer Dosiereinheit vorliegen und durch aus der Pharmazeutik bekannte Verfahren hergestellt werden, indem das/die Peptid/e mit einem Träger oder Verdünnungsmittel in Form einer Suspension oder Lösung und wahlweise mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen, beispielsweise Puffer und Tenside, zusammengebracht wird/werden.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer Infektion oder Erkrankung, die von S. aureus in einem Lebewesen verursacht wird, bereitgestellt, das die Verabreichung von einem oder mehreren der Inhibitorpeptide in einer Menge, die wirksam ist, um die von S. aureus verursachte Infektion oder Erkrankung zu behandeln oder zu verhüten, an das Lebewesen umfasst. Dabei kann das Lebewesen ein Mensch oder ein Tier sein und ist vorzugsweise ein Mensch. Das/die Peptid/e allein oder zusammen mit einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger kann/können durch dem Fachmann bekannte Verfahren verabreicht werden, einschließlich beispielsweise parenterale (d.h. intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung), orale, sublinguale und topische Verabreichung. Dabei hängt die tatsächliche Dosis des/der verabreichten Peptide/s von dem Verabreichungsweg, den pharmakokinetischen Eigenschaften des zu behandelnden Lebewesens sowie den gewünschten Ergebnissen ab und ist leicht vom Fachmann zu ermitteln. Ebenfalls befindet sich im Erfindungsumfang, dass das/die Peptid/e zusammen mit herkömmlichen Antibiotika, die zur Behandlung von von S. aureus verursachten Erkrankungen oder Infektionen verwendet werden, verabreicht werden kann/können.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Einfluss konditionierter Staphylokokken-Medien auf die Agr-Expression von S. aureus RN6390B
Verschiedene Kulturüberstände von 172 S. aureus und von 15 anderen Staphylokokken wurden in CYGP-Brühe 6 Stunden lang bei 37°C, beginnend mit einer Zelldichte von 2·10⁹ Zellen/ml, gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 4°C entfernt. Der Überstand wurde 10 Minuten lang gekocht, filtriert (0,22-μm-Filter), zentrifugiert und mit einem Centricon-3-Filter (3-kDa-Trenngrenze) filtriert. Der Überstand von diesen S.-aureus-Stämmen und anderen Staphylokokken wurde danach unter Anwendung der Vorschriften, die in Ji, G. et al., PNAS USA, 92, 12055–12059 (1995) beschrieben worden sind, auf seine Fähigkeit zur Aktivierung oder Inhibierung der agr-Transkription von S. aureus RN6309B analysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 mitgeteilt. Diese Stämme könne wie folgt in vier Gruppen unterteilt werden. In den Gruppen I, II und III (alle S. aureus) produzieren die Mitglieder jeder Gruppe eine Substanz, welche die Virulenzantwort (agr-Transkription) in einem beliebigen anderen Mitglied derselben Gruppe aktiviert, aber die Antwort in einem beliebigen Mitglied von jeder der zwei anderen Gruppen inhibiert. Dabei wird angenommen, dass diese Substanz Aktivierungs- oder Inhibierungseigenschaften in Abhängigkeit von dem getesteten Stamm haben kann. In Gruppe IV (einige Staphylokokkenspezies, die nicht S. aureus sind) produziert jedes der Mitglieder eine Substanz, welche die Antwort in RN6390B, dem Standardstamm aus Gruppe I, inhibiert. Die von den Stämmen der Gruppe IV produzierten Substanzen haben eine geringe oder keine agr-aktivierende Wirkung auf ein beliebiges Mitglied der Gruppe.
Beispiel 2: Reinigung von RN6390B-S.-aureus-Peptid unter Anwendung der C₁₈-Umkehrphasen-HPLC
Der S.-aureus-Stamm RN7668 (pRN6911) wurde im Tryptophan-Versuchsmedium plus 50 μg/ml L-Tryptophan und 5 μg/ml CBAP, ausgehend von 2·10⁹ Zellen/ml, gezüchtet. Vor Verwendung wurde das Medium mit einer 2-kDA-Trenngrenze-Membran dialysiert und der Inhalt des Membransacks verworfen. Nach 6 Stunden Züchtung bei 37°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und wurde der Kulturüberstand filtriert (0,22-μm-Filter), 10 Minuten lang gekocht, gefriergetrocknet und erneut in 2,5% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure (1/40 Volumen des Kulturüberstands) suspendiert. Dieses Material (3 ml) wurde auf eine HPLC-C₁₈-Säule in 2,5% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure aufgegeben und mit einem Acetonitrilgradienten (16 bis 48%) bei 0,27% Acetonitril pro Minute eluiert. Die gesammelten Fraktionen (1,5 ml pro Fraktion) wurden gefriergetrocknet und in 0,1 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) suspendiert. Fraktionen mit Aktivatorpheromonaktivität wurden gesammelt und durch einen Centricon-3-Filter mit 3-kDa-Trenngrenze filtriert. Das Filtrat (1 ml) wurde erneut durch die HPLC-C₁₈-Säule laufen gelassen und mit einem Acetonitrilgradienten bei 0,2% Acetonitril pro Minute über den interessierenden Bereich (20 bis 30%) eluiert.
Das Aktivatorpeptid, das bei einer Acetonitrilkonzentration von etwa 28,5% eluiert wurde, wurde durch Matrix-gestütze Laser-Desorptions/Ionisierungsmassenspektroskopie (MALDI-MS) (Hillenkamp, F. et al., Anal. Chem., 63, 1193A–1203A [1991]) analysiert und seine Aminosäuresequenz durch einen Procise Edman Sequencer (Perkin-Elmer) mit Tyr-Ser-Thr-Cys-Asp-Phe-Ile-Met bestimmt, die sich, wie in 2 gezeigt, in dem AgrD-Gen befindet. Die MALDI-MS wurde unter Verwendung eines linearen Flugzeitmassenspektrometers mit einer an der New York University maßgefertigten Stickstofflaserionenquelle durchgeführt. Die verwendete Matrix war α-Cyano-4- hydroxyzimtsäure und die Probe wurde unter Anwendung des Tröpfchenverfahrens hergestellt.
Anschließend wurde das gereinigte Aktivatorpeptid auf seine Fähigkeit zur Aktivierung und Inhibierung der RNAIII-Transkription von S.-aureus-Stämmen RN6390B, RN6607 und RN8463 wie in Ji, G. et al., PNAS USA, 92, 12055–12059 (1995) beschrieben analysiert. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt, die zeigt, dass das Aktivatorpeptid einen aktivierenden Einfluss auf den Stamm RN6390B und einen inhibierenden Einfluss auf die Stämme RN6607 und RN8463 hatte.
Beispiel 3: Reinigung von anderen S.-aureus-Peptiden unter Anwendung der C₁₈-Umkehrphasen-HPLC
Der S.-aureus-Stamm RN7667, der klonierte agrBD-Gene von entweder RN6607 oder RN8463 enthielt, wurde in Tryptophan-Versuchsmedium plus 50 μg/ml L-Tryptophan und 5 μg/ml CBAP, ausgehend von 2·10⁹ Zellen/ml, gezüchtet. Nach 6 Stunden Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und wurde der Kulturüberstand filtriert (0,22-μm-Filter), 10 Minuten lang gekocht, gefriergetrocknet und in Lösung A (2,5% Acetonitril plus 0,1% Trifluoressigsäure) suspendiert. Dieses Material wurde auf eine Sephasil-C₁₈-Säule (Pharmacia) (3 cm × 5 cm) aufgegeben, einmal mit Lösung A und einmal mit Lösung B (15% Acetonitril plus 0,1% Trifluoressigsäure) gewaschen und mit Lösung C (40% Acetonitril plus 0,1% Trifluoressigsäure) eluiert. Das eluierte Material wurde gefriergetrocknet, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) suspendiert und durch ein Cetricon-3-Filter (Amicon) filtriert. Das Filtrat wurde auf eine HPLC-C₁₈-Säule aufgegeben und mit einem Acetonitrilgradienten (16 bis 32%) bei 0,2% Acetonitril pro Minute eluiert. Die Fraktionen mit Aktivität wurden vereinigt, gefriergetrocknet, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) suspendiert und durch MALDI-MS analysiert und ihre Aminosäuresequenz durch einen Perkin-Elmer Procise Edman Sequencer bestimmt. Die Aminosäuresequenz für RN6607 und RN8463 wurde mit Gly-Val-Asn-Ala-Cys-Ser-Ser-Leu-Phe bzw. Tyr-Ile-Asn-Cys-Asp-Phe-Leu-Leu bestimmt, die sich in derselben Region von agrD wie das Aktivatorpeptid aus dem S.-aureus-Stamm RN6390B, wie in 2 gezeigt, befinden.
Die gereinigten Peptide wurden danach auf ihre Fähigkeit zur Aktivierung und Inhibierung der RNAIII-Transkription der S.-aureus-Stämme RN6390B, RN6607 und RN8463, wie in Ji, G. et al., PNAS USA, 92, 12055–12059 (1995) beschrieben, analysiert. Das Peptid aus RN6607 hatte eine Aktivatorwirkung auf den Stamm RN6607 und eine Inhibitorwirkung auf die Stämme RN6390B und RN8463, während das Peptid aus RN8463 eine Aktivierungswirkung auf den Stamm RN8463 und eine Inhibitorwirkung auf die Stämme RN6390B und RN6607, wie in 3 gezeigt, hatte.
Beispiel 4: Reinigung und Analyse des Inhibitorpeptids aus S.-lugdunensis
Der S.-aureus-Stamm RN7668 (pSLBD) wurde im Methionin-Versuchsmedium plus 50 μg/ml L-Methionin und 5 μg/ml CBAP, ausgehend von 2·10⁹ Zellen/ml, gezüchtet. Vor Verwendung wurde das Medium mit einer 2-kDA-Trenngrenze-Membran dialysiert und der Inhalt des Membransacks verworfen. Nach 6 Stunden Züchtung bei 37°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und wurde der Kulturüberstand 10 Minuten lang gekocht und filtriert (0,22-μm-Filter). Dieses Material wurde auf eine Sephasil-C₁₈-Säule (3,5 × 4 cm) aufgegeben und mit (I) 2,5% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure und (II) 10,5% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure gewaschen. Der Inhibitor wurde mit 42,5% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure eluiert, gefriergetrocknet, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) suspendiert und durch ein Centricon-3-Filter mit 3-kDa-Trenngrenze filtriert. Dieses Material wurde danach auf eine HPLC-C₁₈-Säule aufgegeben und mit einem Acetonitrilgradienten eluiert. Die Fraktionen mit Inhibitorpheromonaktivität wurden vereinigt, gefriergetrocknet, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst und bei –80°C aufbewahrt. Die Fraktionen wurden durch MALDI-MS analysiert, und unter Anwendung der Edman-Abbau-Vorschrift wurde dieses Peptid als eines bestimmt, das die Aminosäuresequenz Asp-Ile-Cys-Asn-Ala-Tyr-Phe hat, die sich in derselben Region von agrD wie das Aktivatorpeptid aus dem S.-aureus-Stamm RN6390B, wie in 2 gezeigt, befindet.
Das gereinigte S.-lugdunensis-Pheromon wurde danach auf seine Fähigkeit zur Aktivierung und Inhibierung der RNAIII-Transkription verschiedener S.-aureus-Stämme analysiert. Die S.-aureus-Stämme wurden zu 30 Klett-Einheiten (für die Aktivierungsversuche) und zu 60 Klett-Einheiten (für die Inhibierungsversuche) gezüchtet. Das gereinigte S.-lugdunensis-Pheromon wurde zugegeben, und die Gemische wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Es wurden Ganze-Zellen-Lysate aus diesen Kulturen hergestellt und durch Northern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung einer RN6390B-RNAIII-spezifischen Sonde analysiert. Das S.-lugdunensis-Pheromon inhibiert die agr-Antwort in 5 von 6 getesteten S.-aureus-Stämmen, wie in den 4A und 4B gezeigt.
Beispiel 5: Kommerzielle Synthese von synthetischen Peptiden, die der RN6390B- und der S.-lugdunensis-Sequenz entsprechen
Peptide mit denselben Aminosäuresequenzen wie die nativen Peptide aus RN6390B und S. lugdunensis wurden kommerziell synthetisiert (Male University, New Haven, CT) und durch MALDI-MS analysiert. Anders als die gereinigten Peptide hatten die synthetisierten Peptide keine Aktivität. Die Massenspektroskopie zeigte, dass die synthetischen Peptide Dimere waren, während die nativen Peptidmoleküle Monomere waren und Molmassen hatten, die 18 ± 1 Atommasseeinheiten kleiner als diejenigen waren, die für ihre jeweilige Aminosäuresequenz vorhergesagt worden waren. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Cysteine in den synthetischen Peptiden spontan intermolekulare Disulfide gebildet hatten, während diejenigen in den nativen Peptiden an einer intramolekularen Bindung beteiligt waren, sehr wahrscheinlich in einem cyclischen Thioester, der posttranslational eingebaut worden war und das C-terminale Carboxyl enthielt, da sich keine andere erhalten gebliebene Carboxylgruppe im Molekül befand. Übereinstimmend mit dieser Möglichkeit waren die Ergebnisse der Behandlung der nativen Peptide mit Iodessigsäure und Hydroxylamin. Iodessigsäure, von welcher erwartet worden war, dass sie mit freien -SH-Gruppen reagiert, hatte keinen Einfluss, während Hydroxylamin, von welchem erwartet worden war, dass es mit Thioestern reagiert, die Aktivität aufhob.
Beispiel 6: Synthese eines synthetischen Peptids, das der RN8463-Sequenz entspricht
Es wurde erfolgreich eine kleine Menge eines cyclischen Thioesterderivats des RN8463-Octapeptids synthetisiert und gezeigt, dass das synthetische Material die agr-Expression durch RN6390B inhibiert. Es wird erwartet, dass der Einbau der cyclischen Thioesterbindung in das andere Peptid einen ähnlichen Einfluss auf die Aktivität haben wird.
Tabelle 1. Einfluss von konditionierten Staphylokokken-Medien auf die agr-Expression von S. aureus RN6390B

Claims

Arzneimittel, das ein gereinigtes Peptid, das die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus inhibiert und sechs bis zwölf Aminosäuren in der Länge und Aminosäure Nummer 28 aus der AgrD-Region eines Staphylokokkenbakteriums enthält, oder ein Analogon davon, das die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus inhibiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei das Staphylokokkenbakterium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus S. aureus, S. capitis, S. caprae, S. carnosus, S. caseolyticus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. hyicus Subsp. hyicus, S. hyicus Subsp. chromo, S. kloosii, S. lentus, S. lugdunensis, S. sciuri, S. simulans und S. xylosus besteht.
Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei das Staphylokokkenbakterium S. lugdunensis ist.
Arzneimittel nach Anspruch 3, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Asp-Ile-Cys-Asn-Ala-Tyr-Phe-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei das Staphylokokkenbakterium S. aureus ist.
Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Tyr-Ser-Thr-Cys-Asp-Phe-Ile-Met-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Gly-Val-Asn-Ala-Cys-Ser-Ser-Leu-Phe-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Tyr-Ile-Asn-Cys-Asp-Phe-Leu-Leu-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Arzneimittel nach Anspruch 1, das mehr als ein Peptid umfasst, das die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus inhibiert.
Verwendung eines Peptids, das die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus inhibiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Verhütung einer von S. aureus verursachten Infektion oder Erkrankung, wobei das Peptid sechs bis zwölf Aminosäuren in der Länge und Aminosäure Nummer 28 aus der AgrD-Region eines Staphylokokkenbakteriums enthält, oder eines Analogons davon, das die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Staphylokokkenbakterium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus S. aureus, S. capitis, S. caprae, S. carnosus, S. caseolyticus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. hyicus Subsp. hyicus, S. hyicus Subsp. chromo, S. kloosii, S. lentus, S. lugdunensis, S. sciuri, S. simulans und S. xylosus besteht.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Staphylokokkenbakterium S. lugdunensis ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Asp-Ile-Cys-Asn-Ala-Tyr-Phe-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Staphylokokkenbakterium S. aureus ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Tyr-Ser-Thr-Cys-Asp-Phe-Ile-Met-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Gly-Val-Asn-Ala-Cys-Ser-Ser-Leu-Phe-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Tyr-Ile-Asn-Cys-Asp-Phe-Leu-Leu-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Arzneimittel mehr als ein Peptid umfasst, das die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus inhibiert.
Verfahren zum Inhibieren der agr-rnaIII-Transkription in S. aureus, das die Zugabe eines Peptids, das sechs bis zwölf Aminosäuren in der Länge und Aminosäure Nummer 28 aus der agrD-Region eines Staphylokokkenbakteriums enthält, oder eines Analogons zu den Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Staphylokokkenbakterium ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus S. aureus, S. capitis, S. caprae, S. carnosus, S. caseolyticus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. hyicus Subsp. hyicus, S. hyicus Subsp. chromo, S. kloosii, S. lentus, S. lugdunensis, S. sciuri, S. simulans und S. xylosus besteht.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Staphylokokkenbakterium S. lugdunensis ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Asp-Ile-Cys-Asn-Ala-Tyr-Phe-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Staphylokokkenbakterium S. aureus ist.
Verfahren nach Anspruch nach 23, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Tyr-Ser-Thr-Cys-Asp-Phe-Ile-Met-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Gly-Val-Asn-Ala-Cys-Ser-Ser-Leu-Phe-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz NH₂-Tyr-Ile-Asn-Cys-Asp-Phe-Leu-Leu-COOH und eine cyclische Thioesterbindung zwischen Cys und COOH besitzt.
Verfahren nach Anspruch 19, das mehr als ein Peptid umfasst, das die agr-rnaIII-Transkription in S. aureus inhibiert.