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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Nisin ist ein Bakteriocin, eine antimikrobielle
Substanz, die von einem Organismus mit Lebensmittelqualität erzeugt
wird, und gehört
zu einer Gruppe ähnlicher
Substanzen, die als Lantibiotika (oder hier Lanthocine) bezeichnet
werden und zu denen unter anderem Subtilin, Epidermin, Gallidermin,
Pep 5, Cinnamycin, Duramycin und Ancovenin gehören.
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Nisin wird von Lactococcus lactis
subsp. lactis erzeugt, der zur sero- logischen Lancefield-Gruppe
N gehört
[Mattick, A. T. R. und A. Hirsch, 1947 Lancet, 2, 5]. Nisin ist
ein Peptid, das aus 34 Aminosäureresten besteht
und fünf
Ringstrukturen enthält,
die durch Thioether-brücken vernetzt
sind, die Lanthionin oder β-Methyllanthionin
bilden. Diese Thioether entstehen durch die Kondensation von Cystein-Sulfhydrilgruppen
mit Dehydro-Seitenketten, die als Ergebnis von Modifikationen eines
Nisinvorstufen-Peptids nach der Umwandlung entweder aus Serin- oder
Threoninresten erzeugt wurden.
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Es wurde berichtet, daß Nisin
als kationisches oberflächenaktives
Mittel wirkt und daß dessen
Aktivität durch
anionische Detergentien neutralisiert werden kann [Ramseier, H.
R. 1960 Arch. Mikrobiol. 37, 57], und daß Nisin auf molekularem Niveau
als Cytoplasmamembran wirkt und die Peptidoglycan-Biosynthese hemmt [Reisinger
et al. 1980 Arch. Microbiol. 127, 187]. Die Wirkung von Nisin gegen
vegetative Bakterien ist sehr wahrscheinlich das Ergebnis einer
spannungsabhängigen
Depolarisierung der Plasmamembran nach der Insertion des Peptids
in die Lipid-Doppelschicht, möglicherweise über die
Wechselwirkung benachbarter Nisinmoleküle, wodurch eine vorübergehende
Pore oder ein vorübergehender
Kanal gebildet wird. Die molekularen Eigen schaften von Nisin und
der Mechanismus seiner Biosynthese waren Gegenstand neuerer extensiver Überblicke
[Jung, G. und H.-G. Sahl 1991 Nisin and Novel Lantibiotics ESCOM
Science Publishers, Leiden] .
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Es wird vermutet, daß Nisin
ein enges Aktivitätsspektrum
hat und im allgemeinen nur gegen bestimmte grampositive Bakterien
aktiv ist, außer
wenn es mit einem Chelatbildner kombiniert ist, so daß Nisin
gegen gramnegative Bakterien überraschend
aktiv ist und eine stärkere
Aktivität
gegen grampositive Bakterien aufweist (US-Patente Nr. 5,135,910,
5,217,950 und 5,260,271 von Blackburn et al.). Nisin wurde als antimikrobielles
Konservierungsmittel für
Lebensmittel verwendet und ist von der JEFCA und verschiedenen nationalen Behörden, die
die Verwendung von Lebensmittelzusätzen regeln, einschließlich denen
der USA, von Großbritannien
und der EU, als sicher anerkannt worden.
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US-A-4980163 offenbart eine Zusammensetzung,
die Lysostaphin und ein Lanthionin enthaltendes Bakteriocin umfaßt, für die Verwendung
als Breitband-Bakteriocid.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die Erfindung betrifft Verfahren,
um Erkrankungen zu verhindern und zu behandeln, die einer Infektion mit
antibiotikaresistenten Pathogenen zugeschrieben werden können. Die
Verfahren verwenden Nisin und andere Lanthionin enthaltende Bakteriocine
(Lanthocine) so wie auch strukturelle Varianten davon, die durch Gentechnik
oder halbsynthetische Chemie erzeugt wurden. Die erfindungsgemäßen Verfahren
können
unter anderem geeignet gegen antibiotikaresistente Stämme der
Gattung Staphylococcus, Streptococcus und Enterococcus verwendet
werden.
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Insbesondere gibt die Erfindung die
Verwendung eines Lanthocins, das aus Nisin, Subtilin, Epidermin, Gallidermin
und Pep 5 ausgewählt
ist, als einzigen Wirkstoff bei der Herstellung eines Medikamentes
zur Behandlung einer Infektion mit einem gegen viele Medikamente
resistenten Stammes der Gattung Staphylococcus, Streptococcus oder
Enterococcus an.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Bakterielle Infektionen, besonders
jene, die in Krankenhäusern
erworben wurden, ließen
sich immer schwieriger behandeln, was teilweise das Ergebnis der
Auswahl klinischer Züchtungen
ist, die gegen jene Antibiotika resistent sind, die gegenwärtig für die Therapie
eingesetzt werden. Insbesondere wurden der gegen Methicillin resistente
Staphylococcus aureus (MRSA) und die gegenüber Methicillin resistenten
Koagulase-negativen Staphylocooci (MRSE) gegen die meisten gegenwärtig verfügbaren Antibiotika
mit Ausnahme von Glycopeptid-Antibiotika, Vancomycin und Teicoplanin,
resistent. Obwohl Vancomycin der für diese Infektionen ausgewählte Wirkstoff
ist, ist Vancomycin nicht immer klinisch wirksam [Karchmer, A. W.
1991 Annals of Internal Medicine 115; 739]. Enterococcus-Infektionen
ließen
sich herkömmlich
nur schwer behandeln, was teilweise darauf beruht, daß sie eigentlich
gegen viele antibakterielle Mittel resistent sind, und teilweise
auf deren Toleranz (Hartnäckigkeit
gegenüber
der Abtötung)
gegenüber
Mitteln zurückzuführen ist,
die für
andere Bakterienspezies normalerweise bakterizid sind [Murray, B.
E. 1990 Clin. Microbio. Rev. 3: 46]. Kürzlich haben Enterococci eine
Resistenz gegenüber
Vancomycin erworben und Infektionen mit gegenüber Vancomycin resistenten
Züchtungen
von Enterococci nehmen besonders in Intensivstationen mit alarmierenden
Geschwindigkeiten zu [Emori, T. G. und R. P. Gaynes 1993 Clin. Microbio.
Rev. 6: 428]. Es ist eine Konjugationsübertragung einer genetischen
Information zwischen Enterococci und Staphylococci möglich, und
im Labor ist die Übertragung
der Vancomycinresistenz aufgetreten [Noble, W. C. et al. 1992 FEMS
Microbiol. Lett. 72: 195]; es erscheint deshalb nur eine Frage der
Zeit, bis bei den im Krankenhaus erworbenen Infektionen auch gegenüber Vancomycin
resistente Staphylococci auftreten. Von den in der Gesellschaft
erworbenen Infektionen ist die auftretende Resistenz unter den Streptococci,
insbesondere unter den Pneumococci, ein Grund zur Sorge [Thornsberry,
G., et al 1993 Infections in Medicine 10 Stuppl. D: 15; Stutman,
H. R. 1993 Infections in Medicine 10 Suppl. D: 51]. Stark giftbildende
Stämme
der Gruppe A von Streptococci [Anonymous 1994 Morbidity Mortality
Weekly Report 43: 401] und Staphylococci (für Probleme, wie Nekrose erzeugende
Fasciitis und einem toxischen Schock ähnlicher Syndrome verantwortlich)
lassen sich schwer behandeln und führen häufig zum schnellen Tod des
Patienten. Es ist klar, daß neue
wirksamere und schneller wirkende antimikrobielle Mittel notwendig
sind, um diese Infektionen zu bekämpfen.
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Obwohl Nisin im Prinzip für die Verwendung
in bestimmten Fällen
in Betracht gezogen werden könnte, bei
denen antimikrobielle Mittel gefordert werden, und sich das Bakteriocin
bei vorläufigen
Untersuchungen bei einem Tiermodell als wirksam gezeigt hat [Mattick,
A. T. R. und A. Hirsch, 1947 Lancet. 2, 5; Bavin, E. M., et al 1952
Lancet 1: 127; Gowans, J. L., et al 1952 Brit. J. Pharmocol. 7:
438 ; Hirsch, A. und A. T. R. Mattick 1949 Lancet ii: 190], wurde
festgestellt, daß Nisin
nicht ausreichend nützlich
ist, um es in der Human- oder Veterinärmedizin therapeutisch weiterzuentwickeln.
Actagardin und Mersacidin sind neuere, Lanthionin enthaltende antimikrobielle
Peptide, die ausgewertet worden sind, es wurde jedoch festgestellt,
daß sie
im Vergleich mit gegenwärtig
verwendeten therapeutischen Mitteln nur eine mäßige Aktivität gegenüber Staphylococci
und Enterococci aufweisen [Arioli, V., et al 1976 J. Antibiotics
29: 511; Somma, S., et al 1977 Antimicrob. Ag. Chemother; Barrett,
M. S., et al 1992 Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 15: 641] und es
unwahrscheinlich ist, daß sie
von therapeutischem Wert sind.
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Wir haben jedoch festgestellt, daß Nisin
ein starkes bakterizides Mittel gegen pathogene Stämme von grampositiven
Bakterien ist. Insbesondere haben wir festgestellt, daß Nisin
gegenüber
gegenwärtigen
Züchtungen
von gegen viele Medikamente resistentem Staphylococcus aureus, gegenüber Methicillin
resistenten Koagulase-negativen Staphylococci, einem Necrose erzeugenden
Stamme der Gruppe A von Streptococci und gegen viele Medikamente
resistenten Pneumococci bakteriozid ist. Außerdem haben wir festgestellt,
daß Nisin
ein wirksames bakterizides Mittel für Enterococci, einschließlich gegenüber Vancomycin
resistente Enterococci, ist. Da Enterococci offensichtlich gegenüber antimikrobiellen
Mitteln hartnäckig
sind, ist diese Beobachtung überraschend
und legt sehr deutlich nahe, daß Nisin
einen ungewöhnlichen
therapeutischen Wert haben kann. Da anerkannt ist, daß die umfangreiche
Verwendung von antimikrobiellen Breitband-Mitteln, besonders bei
der oralen Verabreichung und in geringen Dosen, zum massiven Auftreten
von gegen viele Medikamente resistenten Pathogenen geführt hat,
ist es folglich überraschend,
weil Nisin in geringen Dosen in Nahrungsmitteln aufgenommen wird,
daß die
Nisinresistenz und die Kreuzresistenz gegenüber anderen antimikrobiellen
Mitteln nicht aufgetreten sind. Obwohl bei der früheren Entwicklung
von Nisin als antimikrobielles Konservierungsmittel für Lebensmittel
nicht gemäß der Kreuzresistenz
im Bereich der damaligen Antibiotika ausgewählt wurde [Hossack, D. J. N.,
6. April 1988, Federal Register Bd. 53, Nr. 66; Szybalski, W., 6.
April 1988, Federal Register Bd. 53, Nr. 66], ist nach vielen Jahren
seiner unkontrollierten Verwendung in Lebensmitteln die Aktivität von Nisin
gegenüber
heutigen, gegen viele Medikamente resistente Pathogene bis jetzt
noch nicht ausgewertet worden.
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Diese Erkenntnisse zeigen, daß nicht
nur Nisin, sondern andere verwandte Mitglieder dieser antimikrobiellen
Peptide der Lanthocine, einschließlich Subtilin, Epidermin,
Gallidermin, Pep 5, sowie auch strukturelle Varianten dieser Moleküle, die
durch Gentechnik oder halbsynthetische Chemie produziert worden
sind, bei der Verhinderung oder Therapie von Infektionen vorteilhaft
sein sollten, die durch antibiotikaresistente Bakterien beim Menschen
und bei Tieren verursacht werden.
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Wirksame pharmazeutische Formulierungen
dieser Peptide schließen
einfache wäßrige Lösungen ein,
die für
die parenterale Zufuhr des Wirkstoffs auf intravenösem (i.
v.), intramuskulärem
(i. m.), subkutanem (s. c.) oder intraperitonealem (i. p.) Weg geeignet
sind, so daß Werte
im Blut und im Gewebe erreicht werden können, die über der zu erzielenden hemmenden
Mindestkonzentration (MIC) des Wirkstoffs liegen, und somit eine
Verringerung der bakteriellen Titer bewirkt wird, um eine Infektion
zu verhindern, zu behandeln, zu heilen oder zu lindern. Es wird
in Betracht gezogen, daß das
antimikrobielle Mittel Lanthocin gleichzeitig oder nacheinander
zusammen mit anderen antimikrobiellen Mitteln verabreicht werden
kann, so daß wirksamer
für eine Breit-bandtherapie gesorgt
wird, die ohne eine spezifische Diagnose vor Beginn einer Therapie
besonders vorteilhaft ist. Es wird in Betracht gezogen, daß ein Dosierungsbereich
von etwa 2 bis 200 mg/kg/Tag eine wirksame Verringerung der bakteriellen
Titer bieten würde.
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Es wird auch in Betracht gezogen,
daß pharmazeutische
Formulierungen, die für
die topische Anwendung auf der Haut und/oder Schleimhautmembranen
geeignet sind, wie wäßrige oder
auf Petroleum basierende Salben, Lotionen, Emulsionen oder Gele,
für die
Kontrolle von antibiotikaresistenten Organismen vorteilhaft sind.
Eine auf Lanthocin basierende topische Formulierung, die für die Verabreichung
an der Vorderseite der Nasenlöcher
geeignet ist, mit Konzentrationert des Wirkstoffs oberhalb seiner
MIC und somit ausreichend, um die bakteriellen Titer zu verringern,
kann als besonders vorteilhaft für
die Kontrolle der Kolonienbildung von MRSA bei Patienten und Klinikpersonal
erwartet werden, wodurch die Gefahr des Erwerbs einer möglicherweise
lebensbedrohlichen antibiotikaresistenten Infektion vermindert wird.
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BEISPIELE
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Bakterienstämme. Gegenüber Methicillin resistenter
Staphylococcus aureus (MRSA) und Staphylococcus epidermidis (MRSE)
waren klinische Züchtungen;
die von verschiedenen europäischen
Krankenhäusern
bereitgestellt wurden, wobei der stark giftbildende Stamm Streptococcus
pyogenes und gegenüber
Vancomycin resistente Stämme
von Enterococcus faecalis klinische Züchtungen aus den USA waren.
Weitere getestete Proben von MRSA, MRSE und gegenüber Vancomycin
resistentem Enterococcus faecium waren klinische Züchtungen
aus den USA. In einem getrennten Satz von Versuchen wurden MRSA-Stämme aus
vier verschiedenen Ländern,
MRSE-Stämme
aus Spanien, gegenüber
Penicillin resistente Stämme
von Streptococcus pneumoniae aus sechs verschiedenen Ländern und
gegenüber
Vancomycin resistente Enterococci aus zwei New Yorker Krankenhäusern getestet.
Noch weitere getestete Züchtungen
kamen aus Züchtungssammlungen.
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Minimale hemmende Konzentration (MICH
Die MIC wurde unter Anwendung der Methode der Mikroverdünnung einer
Nährbouillon
gemäß NCCLS
(National Committee on Clinical Laboratory Standards) bestimmt.
In den Versuchen mit klinischen Züchtungen von MRSA und MRSE
und gegenüber
Vancomycin resistentem Enterococcus faecium aus den USA wurde eine
nicht ergänzte
Müller-Hinton-Nährbouillon
verwendet. Bei den Versuchen mit den MRSA- und MRSE-Züchtungen
aus verschiedenen europäischen
Krankenhäusern und
den klinischen Züchtungen
von Streptococcus pyogenes und gegenüber Vancomycin resistentem
Enterococcus faecalis aus den USA wurde die Nährbouillon Tryptic Soy verwendet.
In den letztgenannten Tests wurde 0,02% Rinderserumalbumin (Endkonzentration
0,01%) im Verdünnungsmittel
verwendet, um das Kleben des Nisins an den Mikrotiterwänden aus
Kunststoff zu verhindern.
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Minimale bakteriozide Konzentration
(MBC). Nach der Bestimmung der MIC wurden Vertiefungen, die kein
Wachstum zeigten, gesammelt und für die Koloniezählungen
plattiert. Die MBC wurde als die niedrigste Konzentration definiert,
bei der 99,9% der ersten Impfung innerhalb eines 24-stündigen Kontaktes
abgetötet wurden.
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Auflösung von Bakterienkulturen
und schnelle bakteriozide Aktivität. Die verwendeten Medien enthielten
die Nährbouillon
"C + Y" für
S. pneumoniae, die Nährbouillon
"Tryptic Soy" für
Staphylococci und die Nährbouillon
"Brain Heart Infusion" für
Enterococci. Verschiedene Bakterienspezies wurden unterschiedlich
lange bei 37°C
mit verschiedenen festgelegten Konzentrationen von Nisin inkubiert,
wie es in den folgenden Tabellen angegeben ist. Die Auflösung wurde
als Prozentsatz der Verringerung der optischen Dichte bei 600 nm
im Verhältnis
zu der der Kultur vor dem Einfluß von Nisin gemessen. Außerdem wurden
in einigen Versuchen Proben entnommen und die lebensfähige Anzahl
wurde im wesentlichen wie vorstehend bei der MBC beschrieben bestimmt.
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i. p.-Infektionsmodell bei der Maus.
Staphylococcus aureus NCTC 8325 wurde in einer Kalbfleisch-Infusionsnährbouillon
gezüchtet,
und Mäuse
wurden intraperitoneal mit jeweils 103 koloniebildenden
Einheiten (CFU), in Nährbouillon
+10% (Gew./Vol.) bakteriologischem Muzin von Difco, infiziert. Gruppen
von fünf
Mäusen
erhielten jeweils entweder keine Behandlung oder 10 mg/kg Nisin,
das innerhalb von 10 Minuten nach der Infektion intravenös verabreicht
wurde (über
die Schwanzvene in 0,5 ml einer wäßrigen Lösung, die auf pH = 5,0 eingestellt
worden war). Die Mäuse
wurden 48 Stunden lang beobachtet, um den Tot oder ungünstige Anzeichen
festzustellen.
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Beispiel 1. Bestimmung der
MIC und der MBC von Nisin gegenüber
heutigen gegenüber
vielen Medikamenten resistenten Pathogenen.
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Wie in Tabelle 1 angegeben, zeigte
Nisin eine hervorragende hemmende Wirkung (MIC) sowohl gegenüber ATCC-Stämmen aus
dem Labor als auch klinischen Züchtungen
verschiedener Spezies von Staphylococci, Enterococci und Streptococci,
wohingegen die gramnegativen Bakterien (Escherichia coli und Pseudomonas
aeruginosa) beträchtlich
weniger empfindlich waren. Zu den klinischen Züchtungen gehörten gegenüber Methicillin
resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) und Staphylococcus epidermidis
(MRSE), gegenüber
Mupirocin resistenter (mup-r) S. aureus und MRSA und gegenüber Vancomycin
resistenter (van-r) Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium.
Bei allen getesteten Organismen war die MBC (die Konzentration,
die mindestens 99,9% der Bakterien innerhalb von 24 Stunden abtötet) gleich
der oder in wenigen Fällen das
Doppelte der MIC, was darauf hinweist, daß Nisin für diese Bakterien stark bakteriozid
ist. Die Beobachtung, daß Nisin
für Enterococci,
einschließlich
gegenüber
Vancomycin resistenten Stämmen,
bakteriozid ist, ist unerwartet, da Ente-rococci gegenüber der bakterioziden Wirkung
der meisten antibakteriellen Mittel hartnäckig sind.
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Beispiel 2. Bestimmung der
bakterioziden Aktivität
von Nisin für
gegen viele Medikamente resistente Pathogene.
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Die Beobachtungen von Beispiel 1
wurden bestätigt
und auf weitere Versuche ausgedehnt, bei denen eine große Anzahl
von gegen viele Medikamente resistente klinische Züchtungen
von Staphylococci und Enterococci sowie auch gegen viele Medikamente
resistente Pneumococci für
Zeiträume
im Bereich von 20 Minuten bis 240 Minuten festgelegten Konzentrationen
von Nisin ausgesetzt wurden. Am Ende dieser kurzen Einflußzeiten
wurden zwei Parameter gemessen: Überleben
der Zellen (in einem Satz von Versuchen) und Auflösung der
Zellen (in beiden Sätzen
der Versuche). Wie in Tabelle 2 aufgeführt, zeigten die meisten Züchtungen
eine Auflösung
von mehr als 50%, die durch die Abnahme der Trübung der Kultur bei 600 nm
gemessen wurde; viele der restlichen Stämme zeigten eine meßbare Auflösung, jedoch
weniger als 50%. Außerdem wurden
Proben der mit Nisin behandelten Züchtungen auf ihre Lebensfähigkeit
hin ausgewertet, wie es ebenfalls in Tabelle 2 gezeigt ist. Es wurde
beobachtet, daß der
Prozentsatz der Verringerung der lebensfähigen Anzahl den Prozentsatz
der Verringerung der Trübung überstieg,
und einige Züchtungen,
die eine vergleichsweise niedrige Verringerung der Trübung zeigten,
trotzdem eine deutliche Verringerung der Lebensfähigkeit aufwiesen. Folglich
erfordert die bakteriozide Wirkung von Nisin gegenüber diesen
Bakterien keine Auflösung der
Zellen, statt dessen wird angenommen, daß die Auflösung ein späterer Vorgang bei der Reaktion
der Bakterien mit dem Mittel ist. Immerhin wurden zwei Züchtungen
(beide waren Pneumococci, die kurze Zeit einer geringen Konzentration
ausgesetzt worden waren) innerhalb der kurzen Einflußzeiten
dieser Versuche extensiv abgetötet.
Die schnelle bakteriozide Wirkung von Nisin gegenüber al-len Züchtungen
von Enterococcus (≥ 99%
innerhalb von vier Stunden) ist tatsächlich ein bemerkenswertes
Ergebnis für
diese Organismen.
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Beispiel 3. Die Wirksamkeit
von Nisin gegenüber
einer intraperitonealen Infektion mit Staphylococcus aureus bei
Mäusen.
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Die Wirksamkeit von Nisin gegenüber einer
Infektion wurde bei einem Infektionsmodell mit einer Maus nachgewiesen.
Bei diesem Modell führte
die intraperitoneale Infektion innerhalb von 18 Stunden nach der
Infektion zum Tod der unbehandelten Tiere. Wie in Tabelle 3 gezeigt,
starben fünf
von fünf
unbehandelten Tieren, wohingegen alle fünf infizierten Tiere, die i.
v. mit 10 mg/kg Nisin behandelt worden waren, die Infektion überlebten.
Dieses Ergebnis legt nahe, daß Nisin
eine starke Wirkung bei der Behandlung einer Infektion hat.
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Tabelle 3: Wirksamkeit von intravenösem Nisin
gegenüber
einer Infektion mit Staphylococcus aureus bei Mäusen
a Die unbehandelten Mäuse starben
innerhalb von 18 Stunden.
