DD301903A9

DD301903A9 - Neue Bakteriozinzusammensetzungen zur Verwendung als verstaerkte Breitspektrumbakterizide und Verfahren zum Verhindern und Behandeln mikrobieller Infektionen

Info

Publication number: DD301903A9
Application number: DD33828290A
Authority: DD
Inventors: Peter Blackburn; Sara-Ann Gusik; June Polak; Stephen D Rubino
Original assignee: New York Health Res Inst
Priority date: 1989-03-01
Filing date: 1990-03-01
Publication date: 1994-06-30
Also published as: IL93527A0; PL284095A1; FI103861B1; AU618714B2; FI103861B; CZ279273B6; JPH03504864A; NO304721B1; FI905378A0; ZA901499B; IL93527A; CA2028140C; IE900721L; PL163940B1; DK0424484T3; US4980163A; NO904729D0; HUT55607A; KR0145738B1; KR920700003A

Abstract

Es werden Bakteriozinzusammensetzungen mit einem breiten Bereich geschaffen. Die Zusammensetzungen können in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst oder in einer geeigneten Matrix zur Suspension gebracht werden und sind aktiver gegenüber einem breiteren Bereich von Bakterien als die einzelnen Komponententeile. die aufgelösten oder suspergierten Zusammensetzungen stellen erweiterte Breitbereichsbakterizide dar. Die Zusammensetzungen enthalten Lysostaphin und ein lanthioninhaltiges Bakteriozin; Lysostaphin, ein lanthioninhaltiges Peptidbakteriozin und ein chelatbildendes Mittel und Lysostaphin, ein lanthioninhaltiges Peptid, ein chelatbildendes Mittel und ein oberflächenaktives Mittel. Jede Komponente ist in dem erweiterten Breitbereichsbakterizid in ausreichender Menge vorhanden, so daß das Bakterizid wirksamer gegenüber Staphylokokken als Lysostaphin allein und wirksamer bei der Behandlung und Verhinderung eines breiten Bereichs von Mikrobeninfektionen ist. Gegeben werden auch Methoden zur Behandlung von bakteriellen Infektionen unter Verwendung dieser Zusammensetzungen und Bakterizide.

Description

Ausgangssituation der Erfindung

Die Anwendung betrifft Bakteriozinzusammensetzungen zur Verwendung als Bakterizide mit erweitertem Breitenbereich und Methoden zur Verhinderung und Behandlung von Mikrobeninfektionen.

Bakteriozine, wie Lysostaphin und Nisin, sind von Bakterien produzierte Proteine, welche das Wachstum von Bakterien, die eng mit der Ursprungsspezies verwandt sind, unterbinden und diese manchmal abtöten. Lysostaphin ist ein Bakteriozin, das praktisch alle bekannten Spezies von Staphylococcus lysiert und abtötet, aber gegen Bakterien anderer Gattungen inaktiv ist. Lysostaphin, das aus Kulturfiltraten von Staphylococcus simulans (NRRL B-2628), die nach den veröffentlichten Literaturangaben gezogen wurden, isoliert wird, ist eine Endopeptidase, welche die Querverbindungen des Peptidoglykans schneidet, das in den Zellwänden von Staphylococcus gefunden wird. Kulturen von S. simulans, die unter Bedingungen gezogen werden, welche die Produktion von Lysostaphin induzieren, sind gegenüber dem Bakteriozin immun, während die gleichen Kulturen, die unter Bedingungen gezogen werden, bei denen kein Lysostaphin erzeugt wird, sensitiv gegenüber dem Bakteriozin sind.

Lysostaphin ist ein natürlich vorkommendes Bakteriozin, das durch einen einzigen bekannten Stamm von S.simulans sekretiert wird, der ursprünglich von Schindler und Schuhardt isoliert und als Staphylococcus staphylolyticus bezeichnet wurde. Die Produktion von Lysostaphin durch S.staphylolyticus wurde bereits in US-PS 3 278 378 vom 11. Oktober 1966 offengelegt und in Proceedings of the National Academy of Sciences, 51:414-421 (1964), beschrieben. Der einzige Organismus S. staphylolyticus (NRRL B-2628), der Lysostaphin produziert, wurde kürzlich als Biovar von S. simulans durch Sloan u.a.. Int. J. System. Bacteriol., 32:170—174 (1982), identifiziert. Da der Name S. staphylolyticus nicht in der bestätigten Liste von Bakteriennamen enthalten ist, wurde der Organismus, der Lysostaphin erzeugt, in S.simulans umbenannt.

Es wurde bereits gezeigt, daß die Wirkung von Lysostaphin durch Penicillin und andere Antibiotika potenziert werden kann. Siehe die hiermit im Zusammenhang stehende US-Patentanmeldung 188 183 von Blackburn u. a., eingereicht am 28. April 1988. Nisin wird zwar gelegentlich als Peptidantibiotikum bezeichnet, verdient aber eher die Bezeichnung Bakteriozin. Nisin wird in der Natur von verschiedenen Stämmen von Streptococcus lactis produziert. Es ist ein Lebensmittelpräservativ, das zur Unterbindung der Herausbildung von Sporen bestimmter Spezies von Gram-positiven Bazillen eingesetzt wird, einschließlich der von den Stämmen von Clostridium stammenden, von denen bekannt ist, daß sie für die Lebensmittelvergiftung bei Fleischerzeugnissen verantwortlich sind. Eine Zusammenstellung der Eigenschaften von Nisin wird von Hurst, Advances in Applied Microbiology, 27:85-123 (1981), gegeben. Die Publikation beschreibt, was allgemein über Nisin bekannt ist. Nisin, das durch Streptococcus lactis produziert wird, ist kommerziell als unreines Präparat, Nisaplin™ (Aplin & Barret Ltd., Dorset, England), erhältlich.

Nisin gehört zu der Klasse von Peptiden, die Lanthionin enthalten. Zu dieser Klasse gehören auch Subtilin, Epidermin, Zinnamycin, Duramycin, Ancovenin und Pep 5. Diese Bakteriozinpeptide werden jeweils durch verschiedene Mikroorganismen produziert. Subtilin aber, das von bestimmten Kulturen von B.subtilis gewonnen wird, und Epidermin, das von bestimmten Kulturen von Staphylococcus epidermidis gewonnen wird, haben Molekularstrukturen, die denen von Nisin sehr nahekommen, Hurst, S. 85-86, und Schnell u.a., Nature 333:276-278. Da sie strukturell ähnlich sind, wird in der vorliegenden Erfindung angenommen, daß lanthioninhaltige Peptidbakteriozine anstelle von Nisin wirksam sind.

Nisin wurde erfolgreich als Präservativ bei Käseprodukten und Molkereierzeugnissen eingesetzt. Der Einsatz von Nisin in Käseprodukten war Gegenstand kürzlich veröffentlichter Patente. Siehe US-PSn 4 584 199 und 4 597 972. Der Einsatz von Nisin zur Unterbindung der Herausbildung von bestimmten Gram-positiven bakteriellen Sporen wurde ausführlich dokumentiert. Siehe, Taylor, US-PS 5 584199, und Taylor, US-PS 4 597 972, Tsai und Sandin, „Conjugal Transfer of Nisin Plasmid Genes from Streptococcus lactis 7962 auf Leuconostoc dextranicum 181" (Konjugale Übertragung von Nisinplasmidgenen vom Streptococcus lactis 7962 auf Leuconostoc dextranicum 181), Applied and Environmental Microbiology, S. 352 (1987); „A Natural Preservative" (Ein natürliches Präservativ), Food Engineering International, S.37-38 (1987); „Focus on Nisin" (Konzentration auf Nisin), Food Manufacture, S. 63 (1987). Nisin kommt gelegentlich in niedriger Konzentration in Milch und Käse vor, und es wird angenommen, daß es für Menschen vollkommen ungiftig und nichtallergen ist. Nisin wurde kürzlich von der FDA als sicher als direkter Lebensmittelbestandteil in pasteurisiertem Streichkäse, pasteurisiertem Schmelzkäse und pasteurisiertem oder pasteuerisiertem, sterilisiertem Käse mit Früchten, Gemüse oder Fleischbestandteilen anerkannt. Da Nisin proteinhaltig ist, werden alle Rückstände in aufgenommenen Lebensmitteln schnell durch Verdauungsenzyme abgebaut. Die allgemeine Akzeptanz von Nisin als Lebensmittelpräservativ wurde durch Lehre eingeschränkt, daß die Aktivität von Nisin als einem Bakteriozin auf nur die Gram-positiven Bakterien beschränkt ist, die eng mit den bakteriellen Ursprungsspezies verwandt

sind. Außerdem wurde bisher keine bakterizide Aktivität von Nisin gegenüber Gram-negativen Bakterien nachgewiesen. Da die Kontamination und der Verderb von Lebensmitteln auf einer Vielfalt von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien basieren, ist es daher nicht überraschend, daß Nisin nur begrenzt als Lebensmittelpräservativ akzeptiert wurde. Außerdem wurde die Verwendung von Nisin auf Grund seiner bisher begrenzten Aktivität als Bakteriozin außerhalb des Lebensmittelbereiches bisher nicht angegeben.

Kürzlich wurde nachgewiesen, daß eine Zusammensetzung aus Nisin und nichtbakterioziden Mitteln, wie chelatbildenden Mitteln und Oberflächenmitteln, bakterizide Aktivität gegenüber einem breiten Bereich von Gram-negativen bakteriellen Spezies und eine verstärkte Aktivität gegenüber einem breiten Bereich von Gram-positiven bakteriellen Spezies aufweist. Beispielsweise sind Gram-negative Bakterien, für die Sensitivität gegenüber dem erweiterten Bakterizid nachgewiesen wurde. Salmonella typhirmirium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gingivalis und Actinobacillus actinomycetescomitans. Gram-positive Bakterien, für die Sensitivität gegenüber den erweiterten Bakteriziden nachgewiesen wurde, sind Staphylococcus aureus. Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Streptococcus Agalactiae und Coryneform-Bakterien. Siehe hiermit im Zusammenhang stehende US-Patentanmeldung von Blackburn, „Nisin Compositions For Use as Enhanced, Broad Range Bactericides" (Nisinzusammensetzungen zur Verwendung als erweiterte Breitbereichsbakterizide), die eine teilweise Weiterführung von UD-Patentanmeldung 209 861 vom 22. Juni 1988 ist und hier als Referenz einbezogen wird.

Summarische Darstellung der Erfindung

Es wurde festgestellt, daß die Aktivität von Bakteriozinen, wie Lysostaphin und Nisin, überraschend verstärkt und der Gesamtbereich und die Geschwindigkeit der Aktivität vergrößert werden können, wenn man die beiden Bakteriozine miteinander kombiniert. Die Eigenschaften der neuartigen Bakteriozinzusammensetzungen, die Lysostaphin und Nisin enthalten, dürften durch den Zusatz von chelatbildenden Mitteln und/oder Oberflächenmitteln, welche den Bereich der Nisin- und Lysostaphinaktivität verstärken und ausdehnen, außerdem verstärkt werden.

Alle neuartigen Bakteriozinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten Lysostaphin und Nisin (nachstehend als „Zusammensetzung" bezeichnet). Die Bakteriozinzusammensetzung wird zu einem erweiterten Breitbereichsbakterizid (nachstehend als „Bakterizid" bezeichnet), wenn sie in einem geeigneten Trägermittel, beispielsweise einem Lösungsmittel, oder in einer geeigneten flüssigen, festen oder kolloidalen Matrix aufgelöst oder zur Suspension gebracht wird. Die neuartigen Bakterizide enthalten Lysostaphin in einer ausreichenden Menge, um als Bakterizid gegenüber Staphylococcus wirksam zu sein, und Nisin ist in einer ausreichenden Menge vorhanden, um die bakterizide Wirkung von Lysostaphin gegenüber Staphylococci zu erweitern. Andere Zusammensetzungen enthalten Lysostaphin, Nisin und ein chelatbildendes Mittel, und sie können auch ein Oberflächenmittel enthalten. Diese Zusammensetzung in einem Trägermittel ergibt ein neuartiges Bakterizid, bei dem Lysostaphin und Nisin im gleichen Konzentrationsbereich wie in der Lysostaphin/Nisin-Zusammensetzung vorhanden sind, und das chelatbildende Mittel in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um die bakterizide Wirkung von Nisin gegenüber Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien zu erweitern. Noch eine andere Zusammensetzung besteht aus Lysostaphin, Nisin und einem oberflächenaktiven Mittel. Diese Zusammensetzung in einem Trägermittel ergibt ein neuartiges Bakteriozid, bei dem das oberflächenaktive Mittel in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um die bakterizide Wirkung von Nisin und Lysostaphin gegenüber Gram-positiven Bakterien zu erweitern.

Die Zusammensetzungen können direkt oder in einem Trägermittel zur Behandlung und Verhinderung von bakterieller Kontamination und Infektion durch Auflösung der Zusammensetzung in einem geeigneten Trägermittel oder durch Suspergieren in einer geeigneten Matrix und durch Aufbringung auf den betroffenen Abschnitt oder durch Zusatz zu einer anderen Zusammensetzung zur Bekämpfung und Verhinderung von Infektion eingesetzt werden.

Die meisten chemischen Desinfektionsmittel sind zu korrosiv oder anderweitig zu toxisch, um in Lebensmitteln und vielen medizinischen Anwendungen eingesetzt werden zu können, die Mehrzahl der Antibiotika wirkt zu langsam, um als Desinfektionsmittel eingesetzt werden zu können, und sind in Nahrungsmitteln nicht zugelassen, um die Risiken einer erworbenen Antibiotika-Resistenz zu vermeiden, die mit einer solchen Anwendung verbunden wären. Die neuartigen Bakterizide sind nichtkorrosiv, nichttoxisch, für den Einsatz in Lebensmitteln und auf offenen Wunden geeignet, wirksam gegen antibiotischresistente Bakterien und wirken schnell auch sich teilende und nichtteilende Bakterien, so daß sie als Desinfektionsmittel genutzt werden können.

Die Zusammensetzungen oder Bakterizide können in Salben oder Auflagen für die Behandlung von Infektionen, Wundversorgungsmaterial oder chirurgische Implantate und andere Medikamente, wie Nasentropfen, Mundspülmittel, desinfizierende Reinigungsmittel, Wischmittel oder Lotionen, einbezogen werden. Die Bakterizide können genutzt werden für das Reinigen von medizinischen Instrumenten und ähnlichen und unter Umständen, in denen die Desinfektionen des Umfeldes gewünscht wird, keimtötende chemische Mittel aber auf Grund der Gefahren von korrosiven oder anderweitig toxischen Rückständen ausgeschlossen sind. Die Breitbereichsbakterizide sind besonders geeignet für Anwendungen im Zusammenhang mit Lebensmitteln, so die Behandlung von Fleisch, insbesondere Geflügel, Eiern, Käse und Fisch, oder für Verpackungs- und Handhabungsvorrichtungen für Lebensmittel und für die Kontrolle, Bekämpfung und Verhinderung der Kontamination von Rohstoffen, zubereiteten Lebensmitteln und Getränken durch bakterielle Pathogene und andere Mikrobenverderb-Organismen. Im Gegensatz zur Aktivität der meisten Breitspektrumgermizide, die durch das Vorhandensein komplexer organischer Substanzen beeinträchtigt wird, sind die Bakteriozinzusammensetzungen und Bakterizide nach der vorliegenden Erfindung bei Vorhandensein von organischen Substanzen, beispielsweise Milch oder Serum, wirksam.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bestehen aus Lysostaphin und Nisin, Lysostaphin, Nisin und einem chelatbildenden Mittel oder Lysostaphin, Nisin, einem chelatbildenden Mittel und einem oberflächenaktiven Mittel. Um erweiterte Breitbereichsbakterizide zu schaffen, werden die Zusammensetzungen in einem geeigneten Losungsmittel aufgelöst

oder in einer geeigneten Matrix suspergiert. Es wird angenommen, daß Zusammensetzungen, die aus Lysostaphin, Nisin, einem chelatbildenden Mittel und/oder einem oberflächenaktiven Mittel, die in einem geeigneten Trägermittel aufgelöst sind, beispielsweise einem wäßrigen Lösungsmittel oder einem Puffer, oder in einer geeigneten Matrix suspergiert sind, eine einen breiten Bereich umfassende, schnelle bakterizide Aktivität gegenüber Gram-positiven wie gegenüber Gram-negativen Bakterien haben.

Vorzugsweise wird die Zusammensetzung in einem flüssigen Trägermittel aufgelöst oder in einer flüssigen, kolloidalen oder polymeren Matrix suspergiert, so daß Lysostaphin in dem Bakterizid in einem Bereich von 0,1 bis 100pg/ml vorhanden ist und durch das Vorhandensein des Bakteriozins Nisin auf den Bereich von 0,1 bis 300 pg/ml erweitert wird, was zu einem Bakterizid führt, das signifikant stärker bakterizid gegenüber Staphylococcus als Lysostaphin allein ist. Es wird angenommen, daß die bakterizide Gesamtaktivität eines solchen neuartigen Bakterizids weiter potentiell wird und gegenüber einem bereiten Bereich von Gram-negativen wie Gram-positiven bakteriellen Spezies wirksam ist, wenn das Nisin im Bakterizid durch ein chelatbildendes Mittel erweitert wird, wie das in der hiermit im Zusammenhang stehenden Patentanmeldung von Blackburn u. a. ausgeführt wird, die den Titel „Nisin Compositions For Use as Enhanced, Broad Range Bactericides" (Nisinzusammensetzungen für den Einsatz als erweiterte Breitbereichsbakterizide) trägt. Die Kombination aus Lysostaphin, Nisin und einem chelatbildenden

das ebenfalls in der Patentanmeldung von Blackburn u.a. ausgeführt wird.

Beispielsweise wird Nisin aktiviert und auf einen größeren Bereich von Gram-positiven Bakterien erweitert und ein solches chelatbildendes Mittel, wie EDTA, im Bereich von 0,1 bis 20,OmM. Bei Vorhandensein von EDTA hat Nisin eine bakterizide Aktivität gegenüber Gram-negativen Organismen, und seine Aktivität gegenüber Gram-positiven Bakterien wird erweitert und ist wirksam über einem breiten pH-Wert-Bereich und gegenüber einem breiteren Bereich von Gram-positiven Bakterien. Außerdem verbessert das Vorhandensein eines oberflächenaktiven Mittels im Bereich von 0,01 % bis 1,0% im Bakterizid die Effektivität des Nisins gegenüber Gram-positiven Bakterien. Zu den geeigneten nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyoxyalkylphenole (z.B. Triton X-100), Polyoxyalkylsorbitane (z. B. Tweens) und Glyzeride (z. B. Monolaurin und Dioleate). Zu den geeigneten ionischen oberflächenaktiven Mitteln gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Emulsifikatoren, Fettsäuren, quaternäre Verbindungen und anionische Oberflächenmittel (z.B. Natriumdodekylsulfat) und amphoterische Oberflächenmittel, beispielsweise Kokamidopropylbetain.

Zu den geeigneten Trägermitteln für die Bakterizide nach der vorliegenden Erfindung gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, die allgemein anerkannten wäßrigen Puffer. Zu den geeigneten Matrizen für die Suspension der neuartigen Zusammensetzungen nach der Erfindung gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, organische Lösungsmittel, kolloidale Suspensionen und Polymere, die mit dem Bakterizid kompatibel sind.

Lysostaphin, das in der Erfindung eingesetzt wird, kann durch Fermentierungsmethoden hergestellt werden, bei denen S.simulans in einer flüssigen Kultur gezogen wird. Diese Fermentierungsmethoden werden in US-PS 3 278 378 und in Proceedings of the National Academy of Sciences, 51:414—421 (1964), beschrieben. Es wurden auch verschiedene Verbesserungen bei der Herstellung von Lysostaphin durch Fermentierungsmethoden gemacht, wie in den US-PSn 3 398 056 und 3 594 284 dokumentiert wird. Die beiden letztgenannten Angaben legen Verbesserungen im Kulturmedium und in den Impfungstechniken offen, durch welche die Produktion von Lysostaphin durch Fermentierung beschleunigt und verbessert werden kann.

Außerdem kann Lysostaphin durch rekombinante Mikroorganismen, einschließlich der Stämme von Escherichia coli. Bacillus subtilus und Bacillus sphaericus, hergestellt werden. Eine Methode zur Gewinnung von Lysostaphin aus Mikroorganismen, die durch rekombinante Plasmide transformiert wurden, die das Gen für Lysostaphin kodieren, wird vollständig in US-Patentanmeldung 034 464 offengelegt, die eine teilweise Weiterführung der US-Patentanmeldung 852 407 ist. Beide Patentanmeldungen werden hier als Referenz einbezogen. Vorzugsweise wird Lysostaphin aus dem B.sphaericus-Stamm OO gewonnen, der ein rekombinantes Plasmid enthält, das die Synthese von Lysostaphin steuert. Dadurch wird die Produktion großer Mengen von Lysostaphin erreicht, das im wesentlichen frei von immunogenen Staphylococcus-Kontaminanten ist, und die Reinigung von Lysostaphin erleichtert, da sich das Lysostaphin direkt im Wachstumsmedium ansammelt. Es wurde festgestellt, daß B. sphaericus-Transformanten, die die Plasmide pBC 16-1 L oder pROJ 6649-IL enthalten, für diesen Zweck besonders geeignet sind, obwohl auch andere Stämme als Lysostaphinquelle geeignet sind. Diese Plasmide werden vollständig in den oben genannten, hiermit im Zusammenhang stehenden Patentanmeldungen beschrieben.

Durch S.stimulans während des experimentellen Wachstums produziert, wird Lysostaphin zunächst als inaktiver Vorläufer sekretiert, der extrazellulär verarbeitet wird zu reifem, aktivem Bakteriozin durch eine Protease, die in der stationären Wachstumsphase produziert wird. Im Gegensatz zur natürlichen Lysostaphinproduktion wird Lysostaphin, das durch einen rekombinanten Stamm von B. sphaericus produziert wird, wie das in der US-Patentanmeldung 034 464 beschrieben wird, extrazellulär als reifes, aktives Protein während der exponentielien Wachstumsphase akkumuliert.

Nisin kann kommerziell als unreines Präparat, Nisaplin™, von der ApMn & Barrett, Ltd., Dorset, England, bezogen werden und kann durch Isolierung von natürlich vorkommendem Nisin aus Kulturen von Streptococcus lactis und anschließendes Konzentrieren des Nisins nach bekannten Methoden gewonnen werden. Berichtet wird auch über Methoden zur Produktion von Nisin unter Nutzung von geänderten Stämmen von Streptococcus. Siehe Gonzalez u.a., US-PS4 716 115 vom 29.Dezember 1987. Möglich dürfte es auch sein, Nisin durch Rekombinant-DNA herzustellen. Nisin ist ein Glied der Familie der lanthioninhaltigen Bakteriozine. Es wird angenommen, daß andere lanthioninhaltige Bakteriozine auf Grund der strukturellen Ähnlichkeit in Kombination mit Nisin gleichermaßen wirksam sind.

Die folgenden, nichteinschränkenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter und demonstrieren die Effektivität der neuen, erweiterten Breitbereichsbakterizide. Es wird angenommen, daß die Zusammensetzungen aus Lysostaphin, Nisin und einem chelatbildenden Mittel, da Grad und Bereich der Nisinaktivität ebenfalls durch chelatbildende Mittel erweitert werden, auch neuartige Bakterizide mit einer erweiterten bakteriziden Aktivität im Vergleich zu Zusammensetzungen ergeben, welche nur aus Lysostaphin und Nisin bestehen.

Alle Versuche in den folgenden Beispielen wurden bei 37⁰C ausgeführt. Die Effektivität der erweiterten Breitbereichsbakterizide wurde durch Untersuchung der bakteriziden Aktivität bestimmt, die anhand des prozentualen bakteriellen Überlebens nach der Behandlung mit dem Bakterizid gemessen wurde. Im allgemeinen wurden nach einer Inkubation einer Suspension der

Zielspezies von 10⁷ Zellen/ml mit dem neuartigen Bakterizid über die angegebene Zeitdauer die Bakterien durch zweiminütiges Zentrifugieren aufgenommen. Das Bakterienpellet wurde mit einem Bergungspuffer, der hier als Phag-Puffer bezeichnet wird (5OmM Tris-HCI-Puffer, pH-Wert 7,8,1 mM MgSO₄,4mM CaCI₂,0,1 M NaCI und 0,1 % Gelatine), frei von dem Bakterizid gewaschen, wieder zur Suspension gebracht und nacheinander in Phag-Puffer verdünnt, und ΙΟΟμΙ der suspergierten Bakterien wurden auf Nähr-Agar-Platten ausgestrichen. Die überlebenden Bakterien wurden durch Kennzeichnung von koloniebildenden Einheiten (CFU) nach einer Inkubation von 24 bis 48 Stunden bei 37°C bestimmt. Ein wirksames Bakterizid nach der Erfindung ist ein Bakterizid, das ein Überleben von weniger als 0,1 % der ursprünglichen Zählung lebensfähiger Bakterien erlaubt.

Beispiel 1 Lysostaphin und Nisin

Zellen von Staphylococcus aureus wurden bei 37^CC in Milch suspergiert und 2 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen von Lysostaphin, Nisin oder einer Kombination von Lysostaphin und Nisin in der Milch inkubiert. Die bakterizide Aktivität der

Bakterizide wurde durch Bestimmung des prozentualen Überlebens von Bakterien in der oben beschriebenen Weise ermittelt.

Die Ergebnisse des Experiments werden in der Tabelle 1 gegeben.

Tabelle 1

Bakterielle Aktivität von Lysostaphin, Nisin und deren Kombinationen gegenüber Staphylococcus aureus

Lysostaphin	Nisin,	Mg/ml	0,5	45	33	-	1,0	2,0	4,0
Mg/ml	0	0,2	% Überleben, 2 Stunden⁸
		100	0,7	2,6	9	2,5	0,5
0					0,5
	43	<10"⁴	0,15	0,04	0,004
0,1			<10"³
	<10~³	-	<10"⁴	-
1,0

a = Anfängliche Lebendzählung: 5 χ 10⁷ CFU/ml.

Nisin allein hat in Milch nur geringe praktische bakterizide Aktivität gegenüber Staphylococcus. Lysostaphin allein wirkt in Milch bakterizid gegenüber S. aureus und kann eine Verringerung um mehr als fünf log bei den lebensfähigen Zellen bei einer Konzentration von 1,(^g/ml bewirken. Wird Lysostaphin in Milch mit Nisin kombiniert, ergibt sich eine Zusammensetzung, die ein neuartiges Bakterizid ist, wodurch die bakterizide Aktivität des Bakterizids signifikant und überraschend über der der einzelnen Bakteriozine allein liegt und die höher als die erwartete additive Wirkung ist. Das wird am besten durch eine begrenzende Lysostaphinkonzentration (0,1 μg/ml) veranschaulicht, wie das die Tabelle 1 zeigt. Wenn also die Anwendung von Lysostaphin durch die verfügbare Aktivität begrenzt ist, kann erwartet werden, daß eine Bakteriozinzusammensetzung, die aus Lysostaphin mit Nisin in einem geeigneten Trägermittel, wie in diesem Beispiel Milch, besteht, ein Bakterizid mit erweitertem, breitem Bereich darstellt.

Beispiel 2

Lysostaphin plus Nisin plus EDTA plus Oberflächenmittel

Die Daten in der Tabelle 2 veranschaulichen die neuartige Bakterizidmächtigkeit einer Zusammensetzung, die aus Lysostaphin, Nisin, EDTA und einem Monoglyzerid-Oberflächenmittel besteht, gegenüber S. aureus und S.agalactiae in Milch, einem komplexen Nahrungsmittel. Es wurde bereits gezeigt, daß niedrige Konzentrationen von EDTA die Aktivität von Nisin potentieren, während höhere Konzentrationen von EDTA die Aktivität von Nisin unterbinden, siehe die hiermit im Zusammenhang stehende Patentanmeldung von Blackburn u. a. In Milch wirken sich höhere Konzentrationen von EDTA weniger hemmend auf die bakterizide Aktivität der Bakteriozinzusammensetzung aus.

Tabelle 2

Bakterizide Aktivität von Lysostaphin, Nisin, EDTA und Monoglyzerid in Milch bei 37°C gegenüber Staphylococcus aureus und Streptococcus agalactiae

Spezies	0,23 L	0,1 L	Kontrolle⁰
	1,0N	1,0N
	0,1% ML	1,0% ML
	% Überleben,	2 Stunden
S.agalactiae"	0,0001^E	0,0007^E	100
(McDonald)
S.aureus⁹	0,004^E	0,002^E	100
(Newbould)

N = Nisin, pg/ml; L = Lysostaphin, pg/ml; ML = Monolaurin; E = enthielt 5OmM EDTA; a = S.aureus, anfängliche Lebendzählung: 8,1 χ 10⁷ Zellen/ml; b = S.agalactiae, anfängliche Lebendzählung: 6,6 χ 10⁷Zellen/ml; c = kein Bakteriozin oder Monoglyzerid

Claims

1. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Lysosthaphin und einem lanthioninhaltigen Bakteriozin besteht.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das lanthioninhaltige Bakteriozin aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Nisin, Subtilin, Epidermin, Zinnamycin, Duramycin, Ancovenin und Pep 5 besteht.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein chelatbildendes Mittel enthält.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oberflächenaktives Mittel enthält.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das chelatbildende Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alkyldiamintetraazetaten, CaEDTA, Na₂CaEDTA, EGTA und Zitrat besteht.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkyldiamintetraazetat EDTA ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Tritonen, Tweens, Glyzeriden, Emulsifikatoren, Fettsäuren, quaternären Verbindungen, amphoterischen und anionischen Oberflächenmitteln besteht.

8. Erweitertes Breitbereichsbakterizid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Lysostaphin, einem lanthioninhaltigen Bakteriozin und einem Trägermittel besteht.

9. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das lanthioninhaltige Bakteriozin aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Nisin, Subtilin, Epidermin, Zinnamyzin, Duramycin, Ancovenin und Pep 5 besteht.

10. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein chelatbildendes Mittel enthält.

11. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oberflächenaktives Mittel enthält.

12. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysostaphin und das lanthioninhaltige Bakteriozin in ausreichenden Mengen vorhanden sind, so daß das Bakterizid eine verstärkte Aktivität gegenüber Staphylokokken und Gram-positiven Bakterien hat.

13. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysostaphin, das lanthioninhaltige Bakteriozin und das chelatbildende Mittel in Mengen vorhanden sind, so daß das Bakterizid eine verstärkte Aktivität gegenüber Staphylokokken und gegenüber wenigstens einem der Bakterien aus der Gruppe aufweist, die aus Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien besteht.

14. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, so daß das Bakterizid eine verstärkte Aktivität gegenüber Staphylokokken und gegenüber wenigstens einem Glied der Gruppe aufweist, die aus Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien besteht.

15. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das chelatbildende Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alkyldiamintetraazetaten, EGTA und Zitrat besteht.

16. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkyldiamintetraazetat EDTA ist.

17. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Tritonen, Tweens, Glyzeriden, Fettsäuren, Emulsifikatoren, quaternären Verbindungen, amphoterischen und anionischen oberflächenaktiven Mitteln besteht.

18. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Gramnegative bakterielle Ziel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsieila pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gingivalis und Actinobacillus actinomycetesconitans besteht.

19. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Grampositive bakterielle Ziel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus sporenbildenden Bazillen, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Stroptococcus agalactiae und Cornyeform-Bakterien besteht.

20. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die effektive Konzentration von Lysostaphin zwischen etwa 0,1 und ΙΟΟμρ/ιηΙ und die Konzentration von Nisin zwischen etwa 0,1 und 300μ9/ητιΙ betragen.

21. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Lysostaphin zwischen etwa 0,1 und 100μ9/ΓηΙ, die Konzentration des lanthioninhaltigen Bakteriozin zwischen etwa 0,1 und 300pg/ml und die Konzentration des chelatbildenden Mittels zwischen etwa 0,1 mM und 2OmM betragen.

22. Erweitertes Breitbereichsbakterizid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels zwischen etwa 0,01 % und 1,0% des Endvolumens beträgt.