KR0143423B1 - 향상된, 광범위 살균제로서 사용하기 위한 니신 조성물 - Google Patents

Abstract

내용 없음

Description

[발명의 명칭]

향상된, 광범위 살균제로서 사용하기 위한 니신 조성물

[발명의 배경]

본원은 1988년 6월 22일자 출원된 미합중국 특허출원 제209,861호의 연속 출원이다. 니신은 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococus lactis) 박테리아의 각종 균주에 의해서 자연에서 생산되는 항균 특성을 지닌 폴리펩티드이다. 이것은 일정한 그람 양성균종 포자의 성장을 저해하는 공지된 식품 보존제이다.

때로 니신이 항생제로서 오인되거나 부정확하게 불리우고 있으나, 니신은 박테리오신, 즉 박테리아에 의해 생산되고, 그것의 원종에 밀접하게 관련되는 균종에 대해서만 항균 작용을 하는 단백질 분해 물질로서 분류하는 것이 더 정확하다. 니신은 우유나 치즈 중에서 저농도로 발견되는 자연발생 보존제이며, 또한 인간에 대한 독성이 없고, 알레르기를 일으키지도 않는다.

니신은 근래에 저온 살균 치즈, 저온 살균 치즈 가공품, 그리고 과일, 야채 또는 육류 함유 저온 살균 치즈 또는 저온 살균 치즈 가공품의 직접적인 식품 성분으로서 FDA에 의해 공인되었다. 또한 이것은 폴리펩티드이기 때문에, 식품중에 남아있는 니신 잔류물은 재빨리 소화된다.

니신의 특성에 대해 요약한 것을 문헌에서 찾아볼 수 있다［Hurst, A., Advances in Applied Microbiology 27:85-123(1981)］. 이 문헌에는 니신에 대해 일반적으로 알려져 있는 사항이 기술되어 있다. 스토렙토코쿠스 락티스에 의해 생산된 니신은 니사플린(제조처:Aplin Barrett Ltd., Dorset, England)이라는 불순한 제제로서 시판되고 있으며, 스트렙토코쿠스 락티스의 배양물로부터 자연발생 니신을 분리하고 공지방법에 따라 니신을 농축함으로써 얻을 수 있다. 또한 스트렙토코쿠스의 다른 변종을 이용하여 니신을 제조하는 방법도 개시되어 있다［참조:1987년 12월 29일자 특허된, Gonzalez등의 미합중국 특허 제4,716,115호］.

니신은 가공된 치즈, 크림 및 우유와 같은 유제품의 보존제로서 효율적으로 사용되고 있다. 치즈 가공품에의 니신의 용도는 최근에 허여된 특허들의 주제이다［참조:미합중국 특허 제4,584,199호 및 제4,597,972호］. 특정 그람 양성균의 성장을 저해시키기 위한 니신의 용도는 잘 보고되어 있다. 그러나, 이것의 식품보존제로서의 완전한 성공과 허용성은 아직까지 해결되지 않고 있는데, 이것은 니신이 그람 음성균과 많은 그람양성균에 대해 비효과적인 것으로 여겨지고 있기 때문이다. 그람 음성균은 거의 항상 그람 양성균과 공존하며 식품의 변질과 오염의 주요인이 되고 있다［참조:Taylor, U.S.Pat. No.5,584,199, issued April 22, 1986 and Taylor, U.S.Pat. No.4,597,972, issued July 1, 1986;; Tsai and Sandine, Conjugal Transfer of Nisin Plasmid Genes from Streptococus Lactis 7962 to Leuconostoc Dextranicum 181, Applied and Environmental Microbiology, Feb. 1987, p.352; A Naural preservative, Food Engineering Int'l, May 1987, pp.37-38; Focus on Nisin, Food Manufacture, Mach 1987, p.63］.

[발명의 요약]

본 발명자는 여러 비-살균제와 배합하여 니신을 포함시킨 조성물은 선행기술과는 달리 그람 음성균에 대해 향상되고, 광범위한 살균작용을 지니고 있을 뿐만 아니라, 니신 단독의 경우보다 그람 음성균에 대해 향상된 작용을 하고 있다는 것을 발견하였다. 그람 양성균에 대한 향상된 살균 작용은 상기한 선행기술의 경우보다 더 넓은 pH범위에서 일어난다. 본 발명은 니신 또는 다른, 란티오닌 함유 박테리오신을 여러 비-살균성제, 예를 들면 킬레이트화제 또는 계면활성제와 배합한 박테리오신 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 향상된 광범위 살균제를 생성시키기 위해 적합한 담체에 용해하거나 또는 현탁시킨 조성물을 제공한다.

[발명의 상세한 설명]

상술하면, 약 0.1mM 내지 20mM의 킬레이트화제, 예를 들면 EDTA 존재하의 니신 약 0.1μg/ml 내지 300μg/ml을 함유한 용액은 살모넬라 티피머륨(Salmonella Typhimurium), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 박테리오이드스 긴지발리스(Bacterioides gingivalis), 악티노바실루스 악티노마이세테스코미탄스(Actinobacillus actinomycetescomitans), 및 클레브시엘리 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)와 같은 그람 음성균의 성장을 저해하고, 또한 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 리스테리아 모노시토겐스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae)및 코리네포름(Coryneform) 박테리아와 같은 그람 양성균에 대해 니신 단독의 경우보다 더욱 강한 작용을 한다. 킬레이터에 의한 니신 작용의 향상은 농도에 좌우되나, 예상과 다르게, EDTA농도 20mM과량에서는 니신의 살균 작용이 억제된다. 그러나, 단백분해담체 및 혈청 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 카제인 및 케라틴과 같은 다가폴리머 존재하에서는 EDTA 20mM이상의 농도에 의한 니신의 억제는 상당히 감소되어 니신의 EDTA향상의 유효범위가 넓어지게 된다.

또한 약 0.1μg/ml 내지 300μg/ml의 니신 및 약 0.1mM 내지 20mM의 킬레이트화제의 용액은 계면활성제 약 0.01% 내지 1.0% 존재하에 그람 음성균 및 그람 양성균에 대한 니신의 효율성이 향상될 수 있다는 것을 발견하였다. 이밖에도, 계면활성제 단독으로 존재하는 경우, 니신은 그람 양성균에 대해 향상된 작용을 하게 된다는 것을 발견하였다.

본 발명에서, 적합한 킬레이트화제는 다음에 열거하는 것으로 한정되는 것은 아니나, EDTa, CaEDTA, CaNa₂EDTA 및 다른 알키디아민 테트라아세테이트, EGTA 및 시트레이트가 포함된다. EDTA존재 또는 부재하에 니신과 배합하기에 적합한 청정제로서 가치있는 계면활성제는 비이온 계면활성제 트윈, 트리톤 및 글리세리드, 지방산, 4급 화합물과 같은 이온 계면활성제, 나트륨 도데실 설페이트와 같은 음이온 계면활성제 및 코카미도프로필 베타인과 같은 양쪽성 계면활성제 및 유화제가 포함되나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

그람 양성균 및 그람 음성균은 대부분 식품 중에서 함께 발견되기 때문에, 살모넬라 티피머륨, 에스케리키아 콜리, 클레브시엘라 뉴모니아에, 슈도모나스 아에루기노사, 박테리오드스 긴지발리스, 악티노바실루스 악티노마이세테스코미탄스와 같은 그람 음성균과 다른 그람 음성 병원균 및 그람 양성균에 대한 니신 조성물의 효율성은 크게 이용될 수 있다. 살균제는 세균 병원체 및 다른 미생물 변질물에 의한 원료 성분, 가공 식품, 및 음료의 오염을 저해 및 방지하는데 특히 적합하다. 효능이 미치는 식품과 관련된 용도는 육류, 특히 가금, 계란, 치즈 및 어류의 처리와 식품 포장 및 취급 장치의 처리가 포함된다. 또한, 가공된 치즈, 크림, 우유, 유제품과 같은 식품 보존제로서 그리고 가금, 어류, 육류, 채소 및 유제품과 식품의 가공 장치를 클리닝하는데 사용된다. 니신 조성물의 용도는 식품에 관련 경우에만 국한되지 않으며, 니신 조성물은 그람 음성균 및 그람 양성균을 제거할 필요가 있거나 제거되기를 원하는 모든 경우에 유용하다.

본 조성물은 적합한 담체, 예를들면 수용성 용매 또는 완충액에 용해시키거나 또는 적합한 액체, 콜로이드성 또는 중합체 매트릭스에 현탁시킬 수 있다. 본 조성물 또는 살균제는 감염, 상처의 소독에 또는 외과적 임플란트의 처치에 그리고 피부 또는 구강 린스, 소독 스크러브, 와이프 또는 로션용 광범위 소독약으로서 의과적 용도를 위한 연고 또는 코팅물로 혼입할 수 있다. 본 살균제는 의료기구, 수술전 외과 스크러브 등을 세정하는데 사용할 수 있다. 본 살균제는 특히 환경적 소독을 원하거나, 부식 또는 독성이 잔류되는 위험부담 때문에 화학적 살균제는 피하게 되는 경우에 유용하다.

착 유기물질의 존재로 인하여 작용이 저하되는 가장 광범위한 살균제의 경우와는 달리, 본 발명의 조성물은 우유 또는 혈청과 같은, 유기 물질의 존재하에서 살균제로서 효과가 있다.

니신은 밀접하게 관련된 몇가지 그람 양성균, 특히 pH 5.0에서 바실리를 형성하는 특정 그람 양성 포자의 생장을 적절하게 억제하는 것으로 알려져 있다. 킬레이트화제와 함께 용액중에서의 니신의 살균 작용은 pH 5.0보다 더 높은 pH에서 광범위한 그람 양성균에 대해 놀라울만치 신속하고 크게 향상되고, 그리고 더욱이 산성 및 염기성 양자의 pH, 바람직하기는 pH 5.0 내지 8.0에서 그람 음성균에 대해 작용한다. 킬레이트-활성화에 의한 니신의 이러한 이외의 신속하고도 광범위한 살균 작용에 의해, 그중에서도, 소독약으로 적합하게 사용할 수 있다.

니신은 란티오닌을 함유하는 펩티드 박테리오신 부류에 속한다. 이 부류중 서브틸린, 에피더민, 신나마이신, 듀라마이신, 안코베닌 및 Pet 5가 포함된다. 이들 박테리오신 펩티드는 상이한 미생물에 의해 각기 생산된다. 그러나, 바실루스 서브틸리스의 특정 배양물로부터 얻은 서브틸린과, 스타필로코쿠스 에피더미디스의 특정 배양물로부터 얻은 에피더민은 니신과 매우 유사한 분자구조를 지닌 것으로 밝혀졌다［참조:Hurst, pp.85-86, Schnell et al., Nature, 333:276-278］. 그러므로 분자구조의 유사성에 기인하여 다른 란티오닌을 함유하는 펩티드 박테리오신은 그람 음성균 및 그람 양성균의 오염을 제거하는데 있어서 니신을 킬레이트화제 및 비이온 계면활성제와 배합한 경우와 동등한 효력을 가질 수 있다.

그람 음성균에 대한 살균제로서 니신과, 부가에 의해 다른 란티오닌을 함유하는 펩티드 박테리오신 조성물의 효용성은 놀라울만하다. 그 이유는 선행기술에서는 일반적으로 니신의 이러한 작용에 대해 언급된 것이 없기 때문이다. pH 5.0이상에서 EDTA존재하에 그람 양성균에 대한 니신의 작용이 향상된다는 것은 니신의 작용이 이전에는 pH 5.0에서 최적이 된다고 믿고 있었던 것을 고려해 볼때 획기적인 것이다. 더욱이, 니신과 란티오닌 함유 펩티드 박테리오신 조성물이 살균제로서의 효용성을 지니고 있다는 것을 발견함으로써, 광범위 박테리아에 대해 효과적이면서 허용가능한 천연의 비독성 물질의 부재로 문제가 되어온 식품보존 기술면에서 장기간 요구되어온 필요성을 충족할 수 있게 되었다.

니신, EDTA 및/또는 다른 계면활성제를 함유한 조성물의 그람음성균 및 그람 양성균에 대한 우수하고도 의외의 신속한 작용성을 입증하기 위해, 살균제로 여러 시험을 실시하였다. 이들 실험은 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 여기에 한정시키는 것은 아니다. 다른 란티오닌 함유 펩티드 박테리오신이 니신의 효과적인 대영물이고, EDTA가 아닌 다른 킬레이트화제 역시 EDTA의 효과적인 대용물이 될 수 있다.

다음 실시예에서 모든 시험은 37℃에서 수행한다. 향상된 광범위 살균제의 효용성은 살균제로 처리한 후 박테리아의 생존율로써 측정하여 살균 작용을 검정함으로써 측정할 수 있다. 일반적으로, 신규한 살균제를 사용하여 표적 균종의 현탁액 ml당 10⁷세포를 특정 시간동안 배양한 후 2분간 원심분리하여 박테리아를 수집한다. 박테리아 펠렛을 파지 완충액(50mM 트리스-HCl 완충액 pH 7.8, 1mM MgSO₄, 4mM CaCl₂, 0.1M NaCl 및 0.1% 젤라틴)으로 세정하여 살균제를 제거하고 재현탁시킨 후 파지 완충액으로 일련의 희석을 한후, 현탁된 박테리아 100ml를 영양아가 플레이트상에 펼친다. 37℃에서 24 내지 48시간동안 배양후 콜로니 형성단위(CFU)를 세어서 생존한 박테리아를 측정한다. 본 발명에 따른 효율적인 살균제는 초기의 박테리아 수에 대해 생존한 수가 0.1% 미만이 되게 하는 것이다.

[실시예 1]

그람 음성균(에스. 티피머티움)에 대한 니신과 킬레이트화제의 작용

표 1에서 보는 바와 같이, 니신을 함유하는 살균제의 효과와 킬레이트화제 EDTA만의 효과를 나타내기 위해 20mM 트리스중(pH 8.0), 37℃에서 두가지 시험을 실시한다. 시험 #1, 대조는 EDTA부재하에 수행한 것이며, 그람 음성 박테리아 에스. 티피머리움에 대해 니신 단독의 효과를 나타낸다. 니신의 농도가 증가하면 약간의 작용을 발휘하나, EDTA부재하에서는 고농도에서도 작용은 마찬가지이며, 니신 ml당 100μg에서의 1.6% 생존수는 식품 보존제로서 전적으로 부적합하다.

니신 및 EDTA로부터 얻은 살균 작용의 수준은 유의적이다.

니신에 200mM EDTA를 첨가하여 수행한 시험 #2(표 1)는 표적 그람 음성균을 제거하는데 있어서의 니신 조성물의 놀라울만한 작용을 입증하고 있다.

표 1은 시험 #2에서 20mM EDTA와 니신 30μg/ml의 농도에서 살균제가 에스. 티피머리움에 대해 현저한 살균 작용을 지니는 반면, 니신 100μg/ml 이상의 농도에서 니신과 EDTA살균제는 박테리아가 실제상 제거(생존율 10 미만으로, 이것은 검정분석에서 생존한 박테리아가 없다는 것을 나타내는 것이다)되었다는 것을 보여주고 있다. 따라서, EDTA와 니신을 배합하면 니신 단독의 경우도바 1000배 이상의 상승 작용을 한다는 것이 입증되었다.

[실시예 2]

그람 음성균(에스. 티피머리움)에 대한 니신, 킬레이트화제 및 계면활성제의 작용

200mM 트리스(pH 8.0)중 37℃에서 니신과 EDTA 및 계면활성제 트리톤 X-100을 함유하는 살균제의 에스. 티피머리움에 대한 효과를 측정하기 위해 4가지 시험(표 2)을 실시하였다. 대조(시험 #1)는 실시예 1(표 1)의 대조와 동일하다.

시험 #2(표 2)는 EDTA부재하에 니신과 1.0% 트리톤 X-100을 사용하여 수행한 것이다. 세제 단독으로 존재하는 경우 그람 음성균에 대한 니신의 작용을 억제하여 니신은 효과가 없게 된다. 그러나, 본 발명을 나타내는, 시험 #3 및 #4에서는(표 2), 20mM EDTA가 트리톤 X-100과 공존하는 경우, 살균제는 에스. 티피머리움에 대한 니신의 살균 작용이 현저히 증가하게 된다. 니신 부재하에 트리톤 X-100을 트리톤 X-100과 배합하는 경우에도, 니신이 존재하는 경우보다 그 정도는 덜하지만, 효과는 있다. 시험 #3 및 #4(표 2) 양자의 경우, 니신을 배합하는 것이 매우 효과적이긴 하나, 트리스 X-100의 농도를 1.0%로 하는 경우(시험 #4, 표 2), 가장 효과적이다.

비이온 계면활성제, 트리톤 X-100을 EDTA와 배합하여 함유하는 경우, 니신과 EDTA단독으로 함유하는 살균제(실시예 1)보다 그람 음성균에 대한 니신의 작용은 향상된다.

[실시예 3]

그람 음성균(에스. 티피머리움)에 대한 니신, 킬레이트화제 및 계면활성제의 작용

표 3은 200mM 트리스중(pH 8.0), 37℃에서 니신, 20mM의 킬레이트화제 EDTA 및 비이온 계면활성제 트윈 20을 함유하는 살균제의 에스. 티피머리움에 대한 향상된 작용성을 보여주고 있다. 트리톤 X-100을 첨가하는 실시예 2에서와 같이, 니신과 EDTA를 트윈 20(1%)과 배합하는 경우 가장 효과적이다.

[실시예 4]

그람 음성균(에스케리키아콜리)에 대한 니신, 킬레이트화제 및 계면활성제의 작용

그람 음성균 E. coli에 대한 니신과 EDTA를 함유하는 살균제의 효과는 표 4에서 보는 바와 같이 입증되었다.

EDTA존재 및 부재하의 시험은 20mM트리스 완충액(pH 8.0)중 37℃에서, E. coli세포/ml 초기 생존수 1×10 로 실시하였다. 2시간후 박테리아 생존율의 함수로서 살균제의 효과를 측정하였다.

시험 #1(대조, 표 4)에서, EDTA가 부재하는 경우, 니신은 E. coli의 제거에 대한 약간의 유의적인 작용을 나타내었다. 그러나, 시험 #2(표 4)에서, 20mM EDTA가 존재하는 경우, 살균 조성물은 E. coli박테리아에 대해 실제적인 작용을 나타내었다. 작용성은 니신의 농도가 증가함에 따라 효용성이 증가하였다. 살균제로서 니신을 EDTA와 배합할 경우 E. coli에 대한 효과가 1000배로 상승되는 것이 입증되었다. 시험 #3 및 #4(표 4)에서 트리톤 X-100은 E. coli에 대해 유의적인 살균 작용을 나타내지 않는다. 실제로, 트리톤 X-100은 에스. 티피머리움(표 2)에서 나타난 바와 같이, 그람 음성균에 대해 니신의 작용을 억제하는 것이 나타났다. 그러나, EDTA에 의한 니신의 전체적인 향상은 표 2 및 4에서 보는 바와 같이, 트리톤 X-100의 억제 영향을 실제적으로 반전시키고 있다.

따라서, 니신과 EDTA와 같은, 킬레이트화제를 함유하는 살균제는 계면활성제가 존재하는 경우에도 여러 형태의 그람 음성균에 대한 효과적인 식품보존제가 될 수 있다.

[실시예 5]

그람 음성균(클레브시엘라 뉴모니아에)에 대한 니신 및 킬레이트화제의 작용

그람 음성균 케이. 뉴모니아에 대한 니신과 EDTA단독으로 함유하는 살균제의 효과가 표 5에서 나타난 바와 같이 입증되었다.

20mM트리스 완충액(pH 8.0)중 37℃에서 케이. 뉴모니아에 초기 생존수 10 세포/ml로 EDTA가 존재하는 경우와 부재하는 경우의 2종 시험을 수행하고, 2시간후 박테리아 생존율의 함수로서 효과를 측정한다.

시험 #1(대조, 표 5)에서, EDTA가 부재하는 경우, 니신은 케이. 뉴모니아에 대해 약간의 유의적인 살균작용을 하였다. 그러나, 시험 #2(표 5)에서는 20mM EDTA가 존재하는 경우, 살균제는 케이. 뉴모니아에 대해 실제적인 작용을 하였다. 작용효과는 니신의 농도가 증가함에 따라 증가하였다.

[실시예 6]

킬레이터 농도에 의존하는 그람 음성균(살모넬라 티피머리움)에 대한 니신의 작용

표 6의 데이타는 그람 음성균(에스. 티피머리움)에 대해 니신의 작용이 향상되는 것은 50mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0) 또는 20mM 트리스(pH 8.0)중 37℃에서 EDTA의 농도에 따라 좌우된다는 것을 입증하고 있다.

시험 #1 및 시험 #3(대조, 표 6)에서, 니신의 부재하에 EDTA농도를 100mM이하로 사용할 경우, pH 5.0(#1) 또는 pH 8.0(#3)에서 에스. 티피머리움에 대해 약간의 유의적인 작용을 하였다. 그러나, 시험 #2 및 #4(표 6)에서는 100μg/ml의 니신이 EDTA와 배합하여 함유되는 경우, 살균제는 에스. 티피머리움에 대해 실제적인 작용을 하였다. 살균제의 작용은 그람 양성균에 대해 니신 단독인 경우의 작용이 pH 5.0에서 최적이라는 사실에도 불구하고, 산성 pH(5.) 1 및 염기성 pH(8.0) 양쪽 모두에서 유사하다.

EDTA에 의한 니신의 작용 향상은 농도에 따라 좌우되고, 최적범위는 pH 5.0 내지 8.0에서 0.2mM 내지 10mM이다. 놀라웁게도, 10mM EDTA이상의 농도에서는 EDTA에 의한 니신의 작용은 감소하게 되며, 작용의 감소는 pH 5.0에서 보다 pH 8.0에서 매우 크다.

[실시예 7]

그람 음성균(에스. 티피머리움)에 대한 니신과 킬레이트화제

생물 조직의 존재하에서, EDTA에 의해 그람 음성균에 대한 니신의 작용이 향상되는 것은 닭근육상의 에스. 티피머리움에서 입증되었으며, 그 결과는 표 7과 같다.

a:부착되지 않은 세포

b:1% 소혈청 알부민(BSA) 함유

배양은 50mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0) 또는 20mM 트리스(pH 8.0)중 37℃에서 실시하였다.

입장체의 닭금육을 사용하기 전에 하이포아염소산 나트륨 및 요드화 포비돈으로 세정한다. 조직을 접종하기 위해 입장체 닭 근육을 20mM 트리스 염산(pH 8.0)중 에스. 티피머리움 10 세포/ml의 현탁액에 침지한다. 태핑에 의해 과량의 수분을 침지된 입방체로부터 제거한다. 닭 시료를 조직이 덮힐만큼 니신 조성분을 함유한 충분한 완충액에 넣고 37℃에서 24시간동안 배양하고 그후 조직을 꺼내어 조직이 완전히 덮일 수 있는 충분한 파지 완충액으로 옮긴다. 시험용액중에 잔류한 박테리아를 원심분리하여 모으고, 파지 완충액으로 세정한 다음, 파지 완충액에 의해 조직으로부터 세정된 박테리아와 합한다. 합한시료(부착되지 않은세포라 한다)를 순차로 희석하고 100μl분취액을 생존 박테리아를 측정하기위해 플레이트한다.

시험 #1 및 #3(표 7)에 있어서, pH 5 또는 pH 8에서 니신이 부재할 경우, EDTA단독에서는 에스. 티피머리움의 생존에 미치는 유의적인 효과가 나타나지 않는다. 그러나, 시험 #2 및 #4(표 7)에서 300μg/ml의 니신이 존재하는 경우, 살균제는 pH 5.0 및 pH 8.0에서 닭 근육상의 에스. 티피머리움에 대해 실질적인 작용을 발휘하였다.

EDTA에 의한 니신의 작용 향상은 농도에 의존하며, 최적농도는 pH 5.0 및 8.0양자에서 EDTA 0.3mM 내지 10mM범위이다. pH 8.0에서 10mM EDTA보다 높은 농도에서는 EDTA에 의한 니신의 활성화는 감소된다. 그러나, 시험 #5(표 7)에서 보는 바와 같이, pH 8.0에서 100%의 소혈청 알부민이 존재하는 경우 닭 근육에 있어서의 에스. 티피머리움에 대한 내신의 효과는 100mM까지의 EDTA농도 범위에 걸쳐 나타난다.

따라서, 니신과 저농도의 킬레이트화제, 예를 들면 0.1mM 내지 20mM 범위의 EDTA를 함유하는 살균제는 그람 음성균의 제거나 오염방지에 매우 효과적일 수 있다.

[실시예 8]

그람 음성균(에스. 티피머리움)에 대한 니신의 작용 측정

킬레이트화제의 최적농도에서 그람 음성균에 대해 트리스 완충액중 살균제의 효과가 실제적으로 나타난 것이 입증되었으며, 이것은 표 8에서 보는 바와 같다.

시험 #2(표 8)에서, 니신의 양은 0.3μg/ml정도로 소량이고, 1% 소혈청 알부민(BSA)존재하에 pH 8.0에서 20mM 트리스중 1.0mM EDTA를 사용하는 경우, 생존한 에스. 티피머리움은 크게 감소하였다. 본 살균제는 그람 음성균에 대해 그람 양성 스트렙토코키(Streptococci)에 대한 니신 단독의 경우와 같은 작용을 하고 있다.

[실시예 9]

그람 음성균(에스. 티피머리움)에 대한 니신의 작용 측정

생물조직 존재하에 킬레이트화제 최적농도에서의 그람 음성균에 대한 살균제의 효과가 닭 금육의 에스. 티피머리움에서 입증되었으며, 이것은 표 9에서 보는 바와 같다.

입장체의 닭 근육을 사용하기 전에 하이포아염소산나트륨과 포비돈 요드로 세정한다. 조직을 접종하기 위해, 입장체의 닭근육을 20mM 트리스 염산(pH 8.0)중 에스. 티피머리움의 10 세포/ml 현탁액으로 침지하고, 태핑에 의해 침지된 입장체 물질로부터 과량의 수분을 제거한다. 조직이 충분히 덮힐 정도의 니신 조성물을 함유한 완충액에 조직을 넣고 37℃에서 2시간동안 배양한 후 조직을 덮을 정도의 충분한 파지 완충액으로 조직을 옮긴다. 시험용액에 잔류한 박테리아를 원심분리하여 모으고, 파지 완충액에 의해 조직으로부터 세정한 박테리아와 합한다. 합한 시료(부착되지 않은세포라 한다)를 순차로 희석하고 100μl 분취액을 생존 박테리아를 측정하기 위해 플레이트한다.

[실시예 10]

그람 음성균(에스. 티피머리움)에 대한 니신 EDTA와 메틸파라벤의 작용

니신과 EDTA를 함유하는 살균제는 공지의 식품 보존제와 배합할 경우, 표 10에서 보는 바와 같이, 그람 음성균에 대해 이례적으로 효과가 있는 것으로 입증되었다.

b:아세테이트 완충액, pH 5.0

c:부착되지 않은 세포

입장체의 닭 근육을 사용하기 전에 하아포아염소산 나트륨으로 세정한다. 조직을 접종하기 위해, 입장체의 닭 근육을 50mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.0)중 에스. 티피머리움 10 세포/ml 현탁액으로 침지한다. 태핑에 의해 과량의 수분을 침지된 입장체 물질로부터 제거한다. 조직이 잠길 정도의 충분한 니신 조성물을 함유한 완충액에 조직을 넣고 37℃에서 2시간동안 배양한 후, 조직이 잠길 정도의 충분한 파지 완충액으로 조직을 옮긴다. 시험용액에 잔류한 박테리아를 원심분리하여 모으고 파지 완충액으로 세척한 후 파지완충액에 의해 조직으로부터 세척된 박테리아와 합한다. 합한 시료(비부착된 세포라 한다)를 순차적으로 희석하고 100μl 분취액을 생존 박테리아를 측정하기 위해 플레이트한다.

시험 #1(표 10)에서, 메틸 파라벤은 10mM EDTA존재하에서 1.0%의 농도에서만 에스. 티피머리움에 대해 효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나, 시험 #2(표 10)에서는, 300μg/ml의 니신이 존재하는 경우, 에스. 티피머리움에 대한 메틸 파라벤과 니신의 효용성은 실질적으로 향상되었다.

니신과 EDTA를 함유한 조성물은 식품 보존제인 메틸 파라벤의 실용성을 크게 향상시킨다. 더욱이, 본 살균제는 농도의 실질적인 감소가 가능하며, 또는 덜 바람직하지만, 메틸 파라벤과 같은, 통상적으로 공지된 식품 보존제의 필요성을 배제시킬 수 있다.

[실시예 11]

그람 양성균(스타필로코쿠스 아우레우스)에 대한 니신과 킬레이트화제의 작용

킬레이트화제에 대한 니신의 활성화는 pH-의존적이다. 표 11에서의 데이타는 니신은 pH 5.0에서의 에스. 아우레우스에 대한 살균작용이 pH 8.0에서 보다 다소 높다는 것을 확인시켜 주고 있다. pH 5.0에서, EDTA는 에스. 아우레우스에 대한 니신의 작용을 향상시키지 않으며, EDTA가 10mM보다 높은 경우, EDTA는 니신의 살균작용을 억제한다. 그러나, pH 8.0에서 EDTA에 의해 활성화된 니신의 살균작용은 니신 단독의 경우나, 또는 pH 5.0에서의 EDTA와 배합한 경우에 지니는 살균작용보다 매우 높다.

a:초기 생존수 8.0×10⁶cfu/ml

배양은 50mM 나트륨 아세테이트 완충액, (pH 5.0) 또는 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0) 중 37℃에서 실시하였다.

니신 단독의 살균 작용은 pH 5.0 또는 그 이하에서 가장 높은 것으로 보고되었으며(참조, Hurst), 표 11의 데이타는 이것을 지지하는 것이다. 이 자료에 의거하여 에스. 아우레우스에 대해 EDTA에 의한 니신의 살균작용의 활성화는 마찬가지로 보다 낮은 pH에서 가장 높아지는 것으로 판단된다. 그러나, 표 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 예상과 달리(참조 표 6), EDTA는 pH 5.0에서 그람 양성균에 대한 니신의 작용을 향상시키지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 고농도의 EDTA에 의해 니신의 작용이 억제되는 것은 pH 5.0에서도 마찬가지로 관찰되었다. 따라서, 킬레이트화제에 의한 니신의 활성화는 킬레이터 농도범위 내에서만 일어나며, 그람 양성균에 있어서도 pH에 따라 좌우되는데, 바람직한 pH범위는 pH 5.0이상이다.

[실시예 12]

그람 양성균에 대한 니신과 킬레이트화제의 작용

pH 8.0에서 니신의 살균작용에 미치는 EDTA의 효과는 에스. 아우레우스, 중요한 인간 병원체에 한정되지 않으며, 치구를 일으키는 스트렙토코쿠스 뮤탄스(표 12a), 음식 감염병원체인 리스테리아 모노시토겐스(표 12b), 그리고 체취의 원인이 되는, 조 코리네포름 박테리아 혼합 집단균체(표 12c)에서도 관찰되었다.

a:초기 생존수:6.0×10 cfu/ml

배양은 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)중 37℃에서 실시하였다.

a:초기 생존수:6.0×10 cfu/ml

배양은 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)중 37℃에서 실시하였다.

a:초기 생존수:1.0×10 cfu/ml

배양은 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)중 37℃에서 실시하였다.

[실시예 3]

킬레이터에 의해 활성화된 니신의 신속한 살균 작용

EDTA와 니신으로 이루어진 살균제는 표 13a에 나타난 데이타에 의해 알 수 있는 바와 같이 살균작용이 신속하다. 10 ml에서 에스. 뮤탄스 그람 양성균의 현탁액을 20mM 트리스 완충액(pH 7.3)중 37℃에서 1mM EDTA에 의해 활성화된 니신의 농도 범위에서 배양시킨다. 살균제가 함유된 현탁액을 0.5 내지 60분의 다양한 시간대에서 배양시킨다. 살균제의 살균 효과는 박테리아의 생존율을 측정하여 평가한다. EDTA에 의한 작용의 향상으로 이 제제내에 니신이 10μg/ml정도의 소량이 함유된 경우 1분이내에 6log로 박테리아 양이 감소될 수 있다.

신속한 살균 작용은 효과적인 소독의 선행 요건이 된다. 따라서, 본 조성물은 특히 양치질 약, 린스, 치약 또는 에스. 뮤탄스를 형성하는 플라크에 대해 활성을 가진 다른 유사한 치마제의 성분으로서 여기에서 입증된 바와 같이, 효과적인 살균제가 될 수 있다.

2 내지 3시간 후 EDTA에 의해 작용이 향상된, 그람 음성균에 대한 니신의 작용은 실시예 1 내지 7에 나타나 있다. EDTA에 의해 작용이 향상된 니신의 신속한 살균 작용은 그람 음성균에서도 나타났으며, 이것은 표 13b의 데이타로써 알 수 있다.

a:생존 세포수:1.0×10 cfu/ml

배양은 20mM 트리스-HCl(pH 7.3)중 37℃에서 실시하였다.

a:초기 생존수:1.0×10 cfu/ml

배양은 20mM 트리스(pH 7.0)중, 37℃에서 실시하였다.

[실시예 14]

니신의 작용 향상에 영향을 주는 EDTA에 2가 양이온이 미치는 효과

2가 양이온은 EDTA 및 다른 킬레이트화제와 결합하여 EDTA에 의한 니신의 활성화를 억제할 수 있다. 그러나, 표 14의 데이타에서 알수 있는 바와 같이, 에스. 뮤탄스에 대한 니신의 살균작용은 1mM Ca 이온의 존재하에서도 1mM EDTA에 의해 향상되며, 단지 3mM 이상에서 Ca 이온은 EDTA 활성화된 니신을 저해하였다. 이것은 칼슘이온 농도가 관련되는 양치질 약에 적용시 특히 중요하다.

E 1mM NaEDTA

a 초기 생존수 1.0×10 cfu/ml

배양은 37℃에서 10% 송아지 태아 혈청중에서 실시하였다.

[실시예 5]

그람 양성균에 대한 니신과 계면활성제의 작용

니신의 살균 작용은 계면활성제만을 배합하는 경우 크게 향상될 수도 있다. 이것은 표 15a에서 보는 바와 같이 제한되는 니신 농도(0.2μg/ml)에서 가장 잘 알 수 있다. 0.1% 이하의 농도에서는, 식품용 계면활성제 모노라우린이 착 배지 밀크중에서 스트렙토코쿠스 아갈락티아에에 대해 유의적인 살균작용을 약간 밖에는 하지 않는다. 마찬가지로, 니신은 밀크중 0.2μg/ml 이하의 농도에서 유의적인 살균작용을 발휘하지 않는다. 그러나, 두 물질, 0.1%의 모노라우린과 니신 0.2g/ml을 배합할 경우, 에스. 아갈락티아에에 대한 효능은 높아지게 된다. 이 살균제는 상가 효과에서 기대할 수 있는 것보다 활성이 100배 이상이고 성분들 각각의 경우보다는 활성이 10,000배나 높다. 따라서, 니신의 적용을 그것의 이용가능한 작용으로 한정시킬 경우, 계면활성제와 니신으로 이루어진 살균제는 더욱 효용성이 있게 되리라는 것을 예측할 수 있다.

니신의 적용이 그것의 이용가능한 작용으로 제한되는 경우의 예를 표 15b의 데이타로써 알 수 있다. 니신, 특히 니신과 EDTA로 이루어진 살균제는 엘. 모노시토겐스에 대해 살균작용을 하지만, 착배지와 같은 밀크중에서는 이 미생물에 대한 이용가능한 니신의 작용은 제한이 된다는 것을 표 15b의 데이타가 입증하고 있다. 그러나, 니신과 글리세리드, 모노올레이트로 된 살균제는 모노올레이트 그 자체는 이 미생물에 대한 살균작용을 하지 않으나, 밀크중에서 이 식품감염 병원체에 대해 효과가 있게 된다.

a 초기 생존수 6.0×10 cfu/ml

배양은 밀크중 37℃에서 실시하였다.

a 초기 생존수 5.0×10 cfu/ml

배양은 밀크중 37℃에서 실시하였다.

Claims (13)

1. 란티오닌 함유 박테리오신과 킬레이트화제를 포함하여 이루어지는 조성물로서, 상기 란티오닌 함유 박테리오신은 니신, 서브틸린, 에피더민, 신나마이신, 듀라마이신, 안코제닌 및 Pep 5를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되고, 상기 킬레이트화제는 CaEDTA, Na₂CaEDTA 및 다른 알킬디아민 테트라아세테이트, EGTA 및 시트레이트를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 란티오닌 함유 박테리오신과 계면활성제를 포함하는 조성물로서, 상기 란티오닌 함유 박테리오신은 니신, 서브틸린, 에피더민, 신나마이신, 듀라마이신, 안코베닌 및 Pep 5를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되고, 상기 계면활성제는 트리톤, 트윈, 글리세리드, 지방산, 유화제, 4급 화합물, 양쪽성 및 음이온성 계면활성제를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 란티오닌 함유 박테리오신, 킬레이트화제 및 계면활성제를 포함하여 이루어지는 조성물로서, 상기 란티오닌 함유 박테리오신은 니신, 서브틸린, 에피더민, 신나마이신, 듀라마이신, 안코베닌 및 Pep 5를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되고, 상기 킬레이트화제는 CaEDTA, Na₂CaEDTA 및 다른 알킬디아민 테트라아세테이트, EGTA 및 시트레이트를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되고, 상기 계면활성제는 트리톤, 트윈, 글리세리드, 지방산, 유화제, 4급 화합물, 양쪽성 및 음이온성 계면활성제를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 알킬디아민 테트라아세테이트가 EDTA이고, 상기 박테리오신이 니신인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 식품 보존제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 담체, 란티오닌 함유 박테리오신 및 킬레이트화제를 포함하여 이루어지는 조성물로서, 상기 란티오닌 함유 박테리오신은 니신, 서브틸린, 에피더민, 신나마이신, 듀라마이신, 안코베닌 및 Pep 5를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되고, 상기 킬레이트화제는 CaEDTA, Na₂CaEDTA 및 다른 알킬디아민 테트라아세테이트, EGTA 및 시트레이트를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 향상된 광범위 살균제.
7. 담체, 란티오닌 함유 박테리오신 및 계면활성제를 포함하여 이루어지는 조성물로서, 상기 란티오닌 함유 박테리오신은 니신, 서브틸린, 에피더민, 신나마이신, 듀라마이신, 안코베닌 및 Pep 5를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되고, 상기 계면활성제는 트리톤, 트윈, 글리세리드, 지방산, 유화제, 4급 화합물, 양쪽성 및 음이온성 계면활성제를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 향상된 광범위 살균제.
8. 담체, 란티오닌 함유 박테리오신, 킬레이트화제 및 계면활성제를 포함하여 이루어지는 조성물로서, 상기 란티오닌 함유 박테리오신은 니신, 서브틸린, 에피더민, 신나마이신, 듀라마이신, 안코베닌 및 Pep 5를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되고, 상기 킬레이트화제는 CaEDTA, Na₂CaEDTA 및 다른 알킬디아민 테트라아세테이트, EGTA 및 시트레이트를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되고, 상기 계면활성제는 트리톤, 트윈, 글리세리드, 지방산, 유화제, 4급 화합물, 양쪽성 및 음이온성 계면활성제를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 향상된 광범위 살균제.
9. 제6항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 란티오닌 함유 박테리오신 및 상기 킬레이트화제는, 상기 살균제가 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 뮤탄스, 리스테리아 모노시토겐스, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 코리네포름 박테리아, 살모넬라 티피머리움, 에스케리키아 콜리, 클레브시엘라 뉴모니아에, 슈도모나스 아에루기노사, 박테리오이드스 긴기발리스 및 악티노바실루스 악티오마이세테스코미탄스로 구성된 그룹에서의 선택되는 박테리아 1종 이상에 대하여 향상된 효능을 나타낼 수 있는 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 살균제.
10. 제9항에 있어서, 상기 알킬디아민 테트라아세테이트가 EDTA인 것을 특징으로 하는 살균제.
11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 계면활성제는 상기 살균제가 그람 음성균 및 그람 양성균으로 이루어진 그룹에서 선택되는 박테리아 1종 이상에 대하여 향상된 효능을 나타낼 수 있는 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 살균제.
12. 제9항에 있어서, 상기 니신의 농도가 약 0.1μg/ml 내지 300.0μg/ml이고, 상기 킬레이트화제의 농도는 약 0.1mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 살균제.
13. 제11항에 있어서, 상기 계면활성제의 농도가 약 0.01% 내지 1.0%인 것을 특징으로 하는 살균제.