FI98880C

FI98880C - Lantioniinia sisältävät bakteriosiinikoostumukset käytettäväksi parannettuina, laaja-alaisina bakterisideina

Info

Publication number: FI98880C
Application number: FI895878A
Authority: FI
Inventors: June Polak; Peter Blackburn; Sara-Ann Gusik; Stephen D Rubino
Original assignee: Applied Microbiology Inc
Priority date: 1988-06-22
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1997-09-10
Also published as: EP0382814B1; DK45690A; DD301912A9; HU893794D0; DE68927189T2; DE68927189D1; IE77643B1; ATE101490T1; JPH03500051A; NO179354B; DE68913189T2; FI895878A0; IL90700A; HU204980B; EP0382814A1; DK45690D0; WO1989012399A1; IE63998B1; ATE142504T1; IE940624L

Description

. 98880

LANTIONIINIA SISÄLTÄVÄT BAKTERIOSIINIKOOSTUMUKSET KÄYTETTÄVÄKSI PARANNETTUINA, LAAJA-ALAISINA BAKTERISIDEINA

Keksinnön tausta

Nisiini on polypeptidi, jolla on antimikrobisia ominaisuuksia ja jota luonnossa tuottavat Streptococcus lactis-bak-teerin eri kannat. Se tunnetaan ruoan säilöntäaineena, joka estää gram-positiivisten basillien tiettyjen lajien itiöiden kasvun.

Vaikka nisiinistä joskus virheellisesti ja epätarkasti puhutaan antibioottina, se oikeammin luokitellaan bakte-riosiiniksi, t.s. bakteerien tuottamaksi proteiiniaineeksi, jolla on antibakteerinen vaikutus vain lajeja kohtaan, jotka ovat läheisesti sukua samaa alkuperää oleville lajeille. Nisiini on luonnossa esiintyvä säilöntäaine, jota on pieniä määriä maidossa ja juustossa, ja jonka uskotaan olevan täysin myrkytöntä ja ei-allergeenista ihmisille.

FDA on äskettäin todennut nisiinin turvalliseksi selvänä ruoan ainesosana pastöroidussa juustolevitteessä, pastöroidussa sulatejuustolevitteessä ja pastöroidussa sulate-juustolevitteessä, jossa on hedelmiä, vihanneksia tai lihaa. Lisäksi, koska se on polypeptidi, kaikki ruoassa jäljellä olevat nisiinijäämät hajoavat nopeasti.

Yhteenveto nisiinin ominaisuuksista on julkaisussa Hurst, A., Advances in Applied Microbiology 27:85-123 (1981). Tämä julkaisu kuvaa sitä, mitä nisiinistä yleensä tiedetään. Streptococcus lactis-bakteerien tuottama nisiini on kaupallisesti saatavana epäpuhtaana valmisteena, Nisaplin®, Aplin & Barrett Ltd.:ltä, Dorset, England, ja sitä voidaan saada eristämällä luonnossa esiintyvä nisiini Streptococcus lac-tis-viljelmistä ja konsentroimalla nisiini tunnettujen menetelmien mukaan. On raportoitu myös nisiinin tuottamisesta käyttäen erilaisia Streptococcus-kantoia. Katso Gonzalez et ai., US-patentti nro 4,716,115, hyväksytty 2 98880 29.12.1987. Pitäisi olla mahdollista tuottaa nisiiniä myös yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

Nisiiniä on käytetty tehokkaasti säilöntäaineena meijeri-tuotteissa, kuten sulatejuustossa, kermassa ja maidossa.

Nisiinin käyttö sulatejuustotuotteissa on ollut viimeaikaisten patenttien kohteena. Katso US-patentit nro 4,584,199 ja 4,597,972. Nisiinin käyttö tiettyjen gram-po-sitiivisten bakteerien kasvun estämiseen on tarkoin dokumentoitu. Sen täydellisen menestyksen ja ruoan säilöntäaineeksi hyväksymisen esteenä on tähän asti ollut usko, että nisiini on tehoton gram-negatiivisia bakteereita ja monia gram-positiivisia bakteereita vastaan. Gram-negatiivisia bakteereita on lähes aina mukana yhdessä gram-positiivisten bakteereiden kanssa ja ne ovat ruoan pilaantumisen ja kon-taminoitumisen pääasiallinen syy. Katso Taylor, US-patentti nro 5,584,199, myönnetty 22.4.1986, ja Taylor, US-patentti nro 4,597,972, myönnetty 1.7.1986; Tsai and Sandine, "Conjugal Transfer of Nisin Plasmid Genes from Streptococcus Lactis 7962 to Leuconostoc Dextranicum 181, Applied and Environmental Microbiology. Feb. 1987, p. 352; "A Natural Preservative," Food Engineering Int'l, May 1987, pp. 37-38; "Focus on Nisin," Food Manufacture, March 1987, p.63.

Keksinnön yhteenveto

Keksinnön kohteena ovat laaja-alaisena bakterisidinä käyttökelpoiset koostumukset joille on tunnusomaista se, että de sisältävät lantioniinipitoista bakteriosiinia ja kela-toivaa ainetta ja vaihtoehtoisesti pinta-aktiivista ainetta.

Keksintö tarjoaa käyttöön bakteriosiinikoostumukset ni-siinistä tai muista lantioniinipitoisista bakteriosiineis-ta, yhdessä erilaisten ei-bakterisidisten aineiden, esimerkiksi kelatoivien aineiden tai pinta-aktiivisten aineiden kanssa. Keksintö tarjoaa edelleen käyttöön koostumukset

II

3 98880 liuotettuna tai suspendoituna sopivaan kantajasua laaja-alaisempien bakterisidien saamiseksi.

On havaittu, että vastoin aikaisempia uskomuksia koostumuksilla, jotka sisältävät nisiiniä yhdessä erilaisten ei-bak-terisidisten aineiden kanssa, on parempi, laaja-alainen bakterisidinen vaikutus gram-negatiivisiin bakteereihin, sekä parempi vaikutus suurempaa joukkoa gram-positiivisia bakteereita vastaan kuin nisiinillä yksinään. Paranitunut bakterisidinen vaikutus gram-positiivisia bakteereita vastaan ilmenee laajemmalla pH-alueella kuin aikaisemmin on luultu.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Spesifisesti on havaittu, että liuos, jossa on noin 0,1 μg/ml - 300 μg/ml nisiiniä sekä noin 0,1 mM - 20 mM kela-toivaa ainetta, esimerkiksi EDTA:a, tehokkaasti eliminoi gram-negatiivisten bakteereiden, kuten Salmonella tvphimu-rjumin. Escherichia colin. Pseudomonas aeruqinosan. Bacte-rioides ginaivaliksen, Actinobacillus actinomvcetemcomitan-sin, ja Klebsiella pneumoniaen. kasvua ja on aktiivisempi gram-positiivisia bakteereita vastaan, kuten Staphylococcus aureus, Steptococcus mutans. Listeria monocytogenes. Streptococcus aqalactiae ja Corvneform-bakteerit. kuin nisiini yksinään. Vaikka nisiinin vaikutuksen lisääntyminen kelaat-torin vaikutuksesta oli konsentraatiosta riippuva, olivat EDTA:n konsentraatiot yli 20 mM vastoin odotuksia inhiboivia nisiinin bakterisidi-aktiivisuudelle. Kuitenkin, jos läsnä oli proteiinikantaja ja polyvalenttisia polymeerejä, kuten seerumin albumiini, kollageeni, gelatiini, kaseiini ja keratiini, nisiinin inhiboituminen yli 20 mM:n EDTA-kon-sentraatioiden vaikutuksesta väheni merkittävästi, jolloin nisiinin EDTA-lisäyksen käyttökelpoinen alue laajentuu.

On myös havaittu, että liuos, jossa on noin 0,1 μg/ml - 300 μg/ml nisiiniä ja noin 0,1 mM - 20 mM kelatoivaa ainetta, edelleen lisää nisiinin tehokkuutta gram-negatiivisia ja . 98880 4 gram-positiivisia bakteereita vastaan, jos läsnä on noin 0,01% - 1,0% pinta-aktiivista ainetta. Lisäksi on havaittu, että kun läsnä on pelkkä pinta-aktiivinen aine, nisiinillä on parempi vaikutus gram-positiivisiin bakteereihin.

Tässä keksinnössä sopivia kelatoivia aineita ovat, mutta ei näihin rajoittuen, EDTA, CaEDTA, CaNa2EDTA, ja muut alkyy-li-diamiinitetra-asetaatit, E6TA ja sitraatti. Pinta-aktii-visia aineita, jotka ovat arvokkaita pesuaineina, sopivia yhdistettäväksi nisiinin kanssa, EDTA:n kanssa tai ilman, ovat, mutta ei näihin rajoittuen, ionittomat pinta-aktiivi-set aineet, Tweenit, Tritonit ja glyseridit, ioniset pin-ta-aktiiviset aineet, kuten rasvahapot, kvaternääriset yhdisteet, anioniset pinta-aktiiviset aineet, kuten kokami-dopropyylibetaiini, ja emulgoijat.

Koska gram-positiiviset ja gram-negatiiviset bakteerit melkein aina löydetään yhdessä ruoista, on nisiinikoostu-musten tehokkuus gram-negatiivisia bakteereita, kuten Salmonella typhimurium, Escherichia coli. Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa. Bacterioides qinaivalis, Actinobacillus actinomvcetescomitans. ja muita gram-negatiivisia patogeenejä ja gram-positiivisia bakteereita vastaan erittäin hyödyllinen. Bakterisidit sopivat erityisesti raaka-aineiden, valmisruokien ja virvoitusjuomien bakteeri-patogeenien ja muiden mikrobiaten pilaajaorganismien aiheuttaman kontaminaation kontrolloimiseen ja ehkäisyyn. Potentiaalisia ruokiin liittyviä käyttöjä ovat lihojen, erityisesti siipikarjan, munien, juuston ja kalan käsittely ja ruoan pakkaus- ja käsittelylaitteiden käsittely. Muita käyttöjä ovat käyttö säilöntäaineena ruoassa, kuten sulatejuustossa, kermassa, maidossa, meijerituotteissa ja puhdistettaessa siipikarjan, kalan, lihojen, vihannesten ja meijerituotteiden ja ruoan käsittelylaitteita. Nisiinikoostu-musten käytön ei pitäisi rajoittua ruokaan liittyviin käyttöihin ja nisiinikoostumusten pitäisi olla käyttökelpoisia missä tahansa tilanteessa, jossa tarvitaan tai halutaan

II

5 98880 eliminoida gram-negatiivisia ja gram-positiivisia bakteereita .

Koostumukset voidaan liuottaa sopivaan kantajaan, esimerkiksi vesiliuokseen tai puskuriin, tai suspendoida mihin tahansa sopivaan nesteeseen, kolloidiseen tai polymeeri-matriisiin, bakterisidien saamiseksi. Koostumukset tai bakterisidit voidaan liittää voiteisiin tai päällysteisiin lääketieteellistä käyttöä varten, kuten infektioiden hoitoon, haavapeitteisiin tai kirurgisiin siirrännäisiin sekä laajakirjoisena desinfiointiaineena ihon tai suun huuhtelunesteissä, desinfiointipesimissä, pyyhkeissä tai nesteissä. Bakterisidejä voidaan käyttää lääketieteellisten instrumenttien puhdistukseen, ennen leikkausta käytettävissä kirurgisissa pesimissä ja vastaavissa. Bakterisidit ovat erityisen sopivia olosuhteissa, jolloin halutaan desinfioida ympäristöä, mutta kemialliset pieneliöitä tuhoavat aineet ovat poissuljettuja, korrodoivien tai muuten myrkyllisten jäämien riskien takia.

Vastoin useimpien laajakirjöisten pieneliöitä tuhoavien aineiden aktiivisuutta, jota monimutkaisten orgaanisten aineiden läsnäolo haittaa, tämän keksinnön koostumukset ovat tehokkaita bakterisideinä orgaanisen aineen, kuten maidon tai seerumin läsnäollessa.

Nisiinin tiedettiin optimaalisesti inhiboivan muutaman gram-positiivisille bakteereille läheistä sukua olevien bakteerien kasvua, erityisesti tiettyjen gram-positiivisten itiöitä muodostavien basillien kasvua pH:ssa 5,0. Nisiinin bakterisidivaikutus liuoksessa kelatoivan aineen kanssa oli yllättävän nopea ja suuresti lisääntynyt gram-positiivisia bakteereita kohtaan pH-arvoilla yli 5,0, ja lisäksi se aktivoitui gram-negatiivisille bakteereille sekä happamassa että emäksisessä pH:ssa, edullisesti alueella 5,0-8,0. Tämä kelaattorilla aktivoidun nisiinin odottamattoman nopea ja ; laaja-alainen bakterisidivaikutus tekee sen sopivaksi käy tettäväksi muun muassa desinfektioaineena.

6 98880

Nisiini kuuluu lantioniinia sisältävien peptidibakteriosii-nien joukkoon. Tähän luokkaan kuuluvat myös subtiilini, epidermiini, sinnamysiini, duramysiini, ancoveniini ja Pep 5. Kutakin näitä bakteriosiinipeptideitä valmistavat eri mikro-organismit. Tietyllä Bacillus subtilis-vilielmistä saadulla subtiliinilla sekä tietyllä Staphylococcus enider-midis-viljelmistä saadulla epidermiinillä on kuitenkin todettu olevan molekyylirakenne, joka on hyvin samanlainen kuin nisiinillä (katso Hurst, pp. 85-S6, ja Schnell et ai., Nature. 333:276-278). Sen vuoksi uskotaan, että molekyyli-rakenteiden samanlaisuuden vuoksi muut lantioniinipitoiset peptidibakteriosiinit ovat yhtä tehokkaita kuin nisiini-koostumukset yhdessä kelatoivien aineiden ja ionittomien pinta-aktiivisten aineiden kanssa eliminoitaessa gram-nega-tiivisia ja gram-positiivisia bakteerikontaminaatioita.

Nisiinin, sekä laajemmin muiden lantioniinia sisältävien pep-tidibakteriosidien, koostumusten tehokkuus bakterisi-deina gram-negatiivisia bakteereita vastaan on yllättävää, koska tekniikan tasossa yleensä todetaan muuta tästä nisiinin vaikutuksesta. Nisiinin lisääntynyt aktiivisuus gram-positiivisia bakteereita vastaan EDTA:n läsnäollessa pH:ssa yli 5,0 on odottamatonta, koska aikaisemmin uskottiin, että nisiinin aktiivisuus on optimaalinen pH:ssa 5,0. Lisäksi nisiinin ja lantioniinipitoisten peptidibakteriosiinien tällaisen tehokkuuden löytäminen toteuttaa pitkäaikaisen tarpeen ruoansäilytysalalla, joka on kärsinyt sopivan, luonnollisen, myrkyttömän aineen puutteesta, joka olisi tehokas suurta joukkoa bakteereita vastaan.

Nisiiniä, EDTA:ta ja/tai erilaisia pinta-aktiivisia aineita ' sisältävän koostumuksen erinomaisen ja odottamattoman nope an vaikutuksen esittelemiseksi suoritettiin useita kokeita bakterisideilla. Nämä kokeet on tarkoitettu valaisemaan asiaa eikä niiden ole tarkoitus rajoittaa tätä keksintöä.

On odotettavissa, että muut lantioniinia sisältävät pepti-dibakteriosidit olisivat tehokkaita korvikkeita nisiinille, li 7 98880 ja että muut kelatoivat aineet kuin EDTA olisivat tehokkaita korvikkeita EDTA:lie.

Kaikki kokeet seuraavissa esimerkeissä suoritettiin 37°C: ssa. Laaja-alaisempien bakterisidien tehokkuus määritettiin tutkimalla bakterisidiaktiivisuus mitattuna prosenttisena bakteerien eloonjäämisenä bakterisidilla käsittelyn jälkeen. Yleensä bakteerit kerättiin sentrifugoimalla 2 minuuttia sen jälkeen, kun oli inkuboitu 107 solua ml:aa kohti kohdeaineen suspensiota uuden bakterisidin kanssa määrätyn pituiset ajat. Bakteeripelletti pestiin puhtaaksi bak-terisidista apupuskurilla, jota tässä nimitetään Phage-pus-kuriksi (50 mM Tris-HCl-puskuri, pH 7,8, 1 mM MgS04, 4 mM CaCl2, 0,1 M NaCl ja 0,1% gelatiinia), suspendoitiin uudelleen ja sarjalaimennettiin Phage-puskuriin, ja 100 ml sus-pendoituja bakteereja levitettiin ravinneagarlevyille. Eloonjääneet bakteerit määritettiin arvioimalla pesäkkeitä muodostavat yksiköt (CFU) sen jälkeen, kun oli inkuboitu 24-48 tuntia 37°C:ssa. Tehokas tämän keksinnön mukainen bakterisidi on sellainen, joka antaa alle 0,l%:n alkuperäisestä elinkykyisten bakteerien lukumäärästä jäädä eloon.

Esimerkki 1

Nisiinin ia kelatoivan aineen vaikutus gram-neoatiivisia bakteereita (S. typhimurium) vastaan

Kuten taulukossa 1 on esitetty, suoritettiin kaksi koetta 20 mM:ssa Tris, pH 8,0 37°C:ssa nisiiniä ja kelatoivaa ainetta EDTA:a yksinään sisältävän bakterisidin tehon osoittamiseksi. Koe 1, kontrollikoe, suoritettiin ilman * EDTA:a ja se osoittaa pelkän nisiinin vaikutuksen gram-ne- gatiivista bakteeria S. tvphimuriumia vastaan. Nisiinin suuremmilla konsentraatioilla on jonkin verran vaikutusta, mutta jopa suurempien konsentraatioiden vaikutus ilman EDTA:a, 1,6% eloonjääminen nisiinin konsentraatiolla 100 . /xg/ml, on täysin riittämätön ruoan säilöntäaineelle. Ni- 8 98880 siinillä ja EDTA:lla saatu bakterisidivaikutuksen määrä on huomattava.

TAULUKKO 1

Alkup. elinkyk.

Koe bakteerien EDTA Nisiini {μg/ml) £_lukumäärä_(mM) 0 10 30 50 100 300 S.typhimuriumin prosenttinen eloonjääminen 3 h kuluttua 1 3,0x10* 0 100 51,3 - 7,0 1,6 2 5,7x10* 20 2,5 - 10-3 - <10'4 <10'4

Koe #2, joka suoritettiin käyttäen nisiiniä sekä 20 mM EDTA:a, osoittaa nisiinikoostumuksen yllättävän vaikutuksen eliminoitaessa kohteena olevia gram-negatiivisia bakteereita .

Taulukko 1 osoittaa, että kokeessa #2 konsentraatiolla 20 mM EDTA:a ja 30 μg/ml nisiiniä bakterisidilla on merkittävä bakterisidiaktiivisuus S.tvohimuriumia vastaan, kun taas nisiinin konsentraatiolla 100 ^g/ml ja sitä enemmän nisii-nin ja EDTA:n muodostama bakterisidi tehokkaasti eliminoi bakteerit (prosenttinen eloonjääminen alle 10'4, joka osoittaa, ettei kokeessa ollut yhtään eloonjäänyttä bakteeria) . Niinpä EDTA:n ja nisiinin yhdistelmällä on yhteisvaikutus, joka on yli 1000 kertaa suurempi kuin nisiinillä , yksinään.

Esimerkki 2

Nisiinin. kelatoivan aineen ia pinta-aktiivisen aineen vaikutus gram-negatiivisiin bakteereihin (S. tvphimurium)

Suoritettiin neljä koetta (taulukko 2) nisiiniä ja sekä EDTA:a että pinta-aktiivista ainetta Triton X-100:a 20 mM:ssa Trisiä, pH 8,0, 37°C, sisältävän bakterisidin vaikutuksen määrittämiseksi S.tvphimurinmiin. Kontrollikoe (koe 1) on identtinen esimerkin 1 kontrollikokeen kanssa (tau-lukko 1) .

Il » 98880 «3· O C o Ο α; ,Η »ne I I I v •Η (Π 4J o 4-1 4-1 C 4-1 ω d ^

CO rH I

o 3 VO o o O U A! · *-< ° o. on n- I \»

^ X! ^ V

c

Ή CO

_ Is c o ρ .·: o o E in 3 Ξ \ E .5 r· ^ I ( -h :55 vo 5 j= -® a

> O

•P ~ CO rr

° I I

H . ^ o o

5 o w « ^ S

, , V V

CO

•H

2 cO o

° * · I I

^ f-4 «-Η CO

o 1/1 * * «Τ

g I

--3 CO O

J Ο Ο · O f-l o r- · », ·< r-4 CO O *

H

C

O o— o .-1 o 4J O OC ...

••H >—I — O .H O —(

U I

E-ι X

< — h Σ O o o o

a E CM CM

CJ W

c <u :ca

•'HU

. ϋ m -2 VO VO VO VO

fiSJ S S S S

2. S t 3 xxxx ·* ·* 36 o o c~ HH 83 ...

<aixir-( co ro in in <D *: o

• ^ 1-1 CM CO

10 98880

Koe #2 (taulukko 2) suoritettiin käyttäen nisiiniä ja 1,0%

Triton X-100:aa, mutta ilman EDTA:a. Pelkän detergentin läsnäolo inhiboi nisiinin vaikutuksen gram-negatiivisiin bakteereihin, ja nisiini oli tehotonta. Kokeissa #3 ja -jf4 (taulukko 2), jotka edustavat keksintöä, 20 mM EDTA:a yhdessä Triton X-100:n kanssa muodostaa kuitenkin bakterisidin, joka merkittävästi nostaa nisiinin bakterisidivaikutusta S♦typhimurjumia kohtaan. Triton X-100:n ja EDTA:n yhdistelmä ilman nisiiniä oli todellakin tehokas, vaikka pienemmässä määrin kuin nisiinin läsnäollessa. Vaikka sekä kokeessa ^"3 että ^4 (taulukko 2) olivat nisiiniyhdistelmät hyvin tehokkaita, oli konsent-raatio 1,0% Triton X-100:aa (koe^4, taulukko 2) kaikkein tehokkain .

Ionittoman pinta-aktiivisen aineen Triton X-100:n läsnäolo yhdessä EDTA:n kanssa lisää nisiinin vaikutusta gram-negatiivisiin bakteereihin jopa enemmän kuin bakterisidi, joka sisältää nisiiniä ja EDTA:a yksinään (esimerkki 1).

Esimerkki 3

Nisiinin, kelatoivan aineen ja pinta-aktiivisen aineen vaikutus gram-negatiivisiin bakteereihin (S. typhimurium)

Taulukko 3 osoittaa lisääntyneen vaikutuksen S. typhimuriumia kohtaan bakterisidissa, joka sisältää nisiiniä, 20 mM kela-toivaa ainetta EDTA:a ja ionitonta pinta-aktiivista ainetta Tween 20:ä 20 mM:ssa Tris, pH 8,0, 37°C:ssa. Samoin kuin Triton X-100:n kanssa (esimerkki 2), on nisiinin ja EDTA:n yhdistelmä, jossa on 1% Tween 20:ä, kaikkein tehokkain.

li 98880 11 TAULUKKO 3

Alkup. elinkyk.

Koe bakteerien EDTA Tween20 Nisiini (yug/ml) ^ lukumäärä (mM) (%) O_10_30_50 100 300 S.typhimuriumin prosenttinen eloonjääminen 3 h kuluttua 1 3.0xl06 0 0 100 51.3 - 7.0 1*6 - 2 5.7xl06 20 0 2.5 - <10~3 - <10 4 <10 4 3 4.3xl06 20 1.0 *10~2 - <1θ“4 - <10”4 <10 4

Esimerkki 4

Nisiinin, kelatoivan aineen ja pinta-aktiivisen aineen vaikutus gram-negatiivisiin bakteereihin (Escherichia coli)

Nisiiniä ja EDTA:a sisältävän bakterisidin teho gram-negatiivisiin E.coli-bakteereihin todettiin, kuten taulukossa 4 on esitetty.

TAULUKKO 4

Alkup. elinkyk.

Koe bakteerien EDTA Tween20 Nisiini (yug/ml) # lukumäärä (mM) (%)_0 30 100 300 E. colin prosenttinen eloonjääminen 2 h kuluttua 1 1.0 x 107 0 0 100 27 25 8.5 2 1.0 x 107 20 0 14.5 0.86 0.01 0.001 3 1.0 x 107 0 1.0 100 30 4 1.0 x 107 20 1.0 1.2 0.8 0.05 <10~4 98880 12

Kokeet ilman EDTA:a ja sen kanssa suoritettiin 20 mM:ssa Tris-puskuriliuosta, pH 8,0, 37°C:ssa, alkuperäisen elinkykyisten E.coli-solujen lukumäärän ollessa 1x10? solua/ml. Bakterisidin vaikutukset mitattiin prosenttisen bakteereiden eloonjäämisen funktiona 2 tunnin kuluttua.

Kokeessani, (kontrollikoe, taulukko 4) ilman EDTA:a, nisii-nillä oli jonkin verran merkityksellistä vaikutusta E.colin eliminointiin. Kokeessa-$2 (taulukko 4), jossa on mukana 20 mM EDTA:a, oli bakterisidikoostumuksella kuitenkin olennainen vaikutus E. coli-bakteereihin. vaikutuksen tehokkuus lisääntyi, kun nisiinin konsentraatiota lisättiin. Nisiinin yhdistelmä EDTA:n kanssa bakterisidina osoittaa 1000-kertaisen yhteisvaikutuksen tehokkuuden lisääntymisen E.coliin. Kokeissa #3 ja ^4 (taulukko 4) voidaan nähdä, että Triton X-100:lla ei ole mitään merkittävää bakterisidivaikutusta E.coliin. Itse asiassa Triton X-100 näyttää inhiboivan nisiinin vaikutusta gram-negatiivisiin bakteereihin kuten todettiin S. typhi-muriumilla (taulukko 2). EDTA:n lisääminen nisiiniin kuitenkin muuttaa Triton X-100:n vaikutukset käänteiseksi, kuten voidaan nähdä taulukoista 2 ja 4.

Niinpä näyttää siltä, että bakterisidi, joka sisältää nisii-niä ja kelatoivaa ainetta, kuten EDTA:a, on tehokas ruoan : säilöntäaine erilaisia gram-negatiivisten bakteereiden lajeja vastaan jopa pinta-aktiivisten aineiden läsnäollessa.

Esimerkki 5

Nisiinin ja kelatoivan aineen vaikutus gram-negatiivisiin bakteereihin (Klebsiella pneumoniae)

Nisiiniä ja EDTA:a yksinään sisältävän bakterisidin vaikutus gram-negatiivisiin bakteereihin K. pneumoniae osoitettiin taulukossa 5 esitetyllä tavalla.

98880 13 TAULUKKO 5

Alkup.

elinkyk. Triton bakteerien EDTA X-100 Nisiini yug/ml

Koe lukumäärä (mM) (%)_0_30_100_300 % eloonjääminen 2 tunnissa 1 107 0 0 100 - 50 38 2 107 20 0 22 0,5 1,1 0,085

Kaksi koetta, toinen EDTA:n kanssa ja toinen ilman sitä (kontrollikoe), suoritettiin 20 mM Tris-puskurissa, pH 8,0 ja 37°C:ssa, alkuperäisen elinkykyisten K. pneumoniae-solujen lukumäärän ollessa 107 solua/ml. Tehokkuus mitattiin prosenttisen bakteereiden eloonjäämisen funktiona 2 tunnin kuluttua.

Kokeessani, (kontrollikoe, taulukko 5) ilman EDTA:a, nisii-nillä oli jonkin verran merkityksellistä bakterisidivaikutus-ta K^_ pneumoniae-bakteereihin. Kokeessa $ 2 (taulukko 5), jolloin mukana oli 20 mM EDTA, oli bakterisidilla kuitenkin oleellinen vaikutus K. pneumoniae-bakteereihin. Vaikutuksen tehokkuus lisääntyi, kun nisiinin konsentraatio kasvoi.

Esimerkki 6

Nisiinin vaikutus gram-negatiivisiin bakteereihin (Salmonella typhimurium) on riippuvainen kelaattorin konsentraatiosta

Taulukossa 6 olevat tiedot osoittavat, että nisiinin lisään-tynyt vaikutus gram-negatiivisiin bakteereihin (S.typhimurium) on riippuvainen EDTA:n konsentraatiosta joko 50 mM natriumasetaatissa, pH 5,0, tai 20 mM Tris:ssä, pH 8,0, 37°C:ssa.

98880 14 ♦ · ¢0 3 o ^ mo 0 *-> I I «τ m r-1 ^ rH 3

CM TT VD

mo·.

01 C · · »—I o 2 m ·· co ο .-t E -c < cm rr rr

E-ι (NO I

DO| ^ · o rr o ö ·—1| I m · r-ι r-i ω <-i o

•H

ε •’(Π :cd •I—) r- 'T r~ N*

O c * I · I

• Q CO O CO O

CM Q CO f—I >—I

rH

« · cm -cr

• II II

Ο Ο o f—I ·—) \£> o ^ O VD Ο ττ T Ol 0.0 © ^ o ^ <c

H

•H

f—I

H E o o o o

Ο O

“ tr <-1 Ή c 0) :cc • *H V.

-X V. :cc vo VD vo VD

• >. ω :tc ο ο ο O

Ο. -X <1> E i-i t-l t-i r-t

3CDI3 XXX X

ϋ ή ϋ λ co co m m * .“I t-H CO 3 C 0) Xl i-i

O O O O

SCI ....

Dj m m oo © dl ι-H CN fO ^ 1S 98880

Kokeissani ja ^3, (kontrollikokeet, taulukko 6), joissa käytettiin EDTA-konsentraatioita aina 100 mM:iin asti ilman ni-siiniä, oli hiukan merkityksellistä vaikutusta S. typhimu-riumiin joko pH:ssa 5,0 (^1) tai pH:ssa 8,0 (#3). Kokeissa$2 ja ^4 (taulukko 6) oli kuitenkin 100 ^ug/ml nisiiniä yhdessä EDTA:n kanssa, jolloin bakterisideilla oli huomattava vaikutus S_^ typhimuriumiin. Bakterisidien vaikutus oli samanlainen sekä happamassa pH:ssa (5,0) että emäksisessä pH:ssa (8,0), huolimatta siitä seikasta, että nisiinin vaikutus yksinään gram-negatiivisiin bakteereihin on optimaalinen pH:ssa 5,0.

Nisiinin parannus EDTAilla oli konsentraatiosta riippuvainen, ollen optimaalinen alueella 0,2 mM - 10 mM pH-arvoissa 5,0-8,0. Yllättäen konsentraatioilla yli 10 mM EDTA:a nisiinin EDTA:n avulla tapahtuva paraneminen vähenee; vaikutuksen vähentyminen on merkittävästi suurempi pH-arvolla 8,0 kuin pH-arvolla 5,0.

Esimerkki 7

Nisiini ja kelatoiva aine gram-negatiivisia bakteereita (S. typhimurium) vastaan

Nisiinin vaikutuksen parantaminen EDTAslla gram-negatiivisia bakteereita vastaan biologisen kudoksen läsnäollessa osoi-tetttiin S. typhimuriumilla kanan lihaksessa, ja on esitetty taulukossa 7.

16 98880 r-~

Ο (Μ W

C < . O

2 « 1 ° 1 " ·

Ή g O

•U

oj n oi = | o i i o Ή g 12 ° ° c ro m

°| I o I

<n| ^ · OI

S o e « W tN?

< I

E-ι m vD r~ ro QOl-H tr <N tr o

Cd .—1| E · O · «O

•to o . in o .

tco O O

•ro c O ΓΟ o o o o

ro| i—l O · O

« I · I o o o o Γ"- I—I <N rr

*—11 I O I O I

o « · o

i*i O O rH

g V

ä <

<C tN

E-π ro in cvj o m • I O I O O ^ o · · o o o ra o -h n

•H

«—< cn ·—i E

• I · I · O 3 O O C ·

O «H

(0 c

•H

CO rH O tn CN e : o| · · o · o p »-H O »H Γ-“ · Ih «H O 0)

CU

•H « * . 4-1 J H -Q 3 c

2 E OOOOO rH CO

« 'a S SS 0X5 UJ OI ro ro ro CO 3 2 Ϊ ^

^ ^ iJ C

CO

E 6* : o do O O O O tj ^ LO LH CO CO CO g *co D 4-)

4-> rH

4-> :co

U CO

CO -H

CU I H 00 ι-4ίΝΓθτριη co I) I? 98880

Inkuboinnit suoritettiin joko 50 mM natriumasetaatissa, pH 5,0, tai 20 mM Trisissä, pH 8,0, lämpötilassa 37°C.

Kuutiot kanan lihaksesta huuhdottiin natriumhypokloriitilla ja povidonijodilla ennen käyttöä. Kudoksen siirrostamiseksi kanan lihaskuutiot kastettiin suspensioon, jossa oli 10^ S. typhimurium-solua 20 mM.-ssa Tris-HCl, pH:ssa 8,0. Ylimääräinen kosteus poistettiin kastetuista kuutioista valuttamalla. Kananäytteet pantiin riittävään määrään nisiinikoostumus-ta sisältävää puskuria peittämään kudos, ja inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa, jonka jälkeen kudos siirrettiin riittävään määrään Phage-puskuria peittämään kudos. Koeliuoksessa jäljellä olevat bakteerit kerättiin sentrifugoimalla, pestiin Phage-puskurilla, ja yhdistettiin bakteereiden kanssa, jotka oli pesty kudoksesta Phage-puskurilla. Yhdistetyt näytteet (nimitetään "tarttumattomiksi" soluiksi) sarjalaimennettiin ja 100 yul:n erät pantiin levyille elossa olevien bakteereiden määrittämiseksi.

Kokeissa /l ja#3 (taulukko 7), ilman nisiiniä joko pH:ssa 5 tai pH:ssa 8, ei EDTA:11a yksinään ollut merkittävää vaikutusta s. typhimurium-bakteereiden eloonjäämiseen. Kokeissa $2 ja -^4 (taulukko 7), jolloin mukana oli 300 ^ug/ml nisiiniä, oli bakterisideilla kuitenkin huomattava vaikutus s. typhi-muriumiin kanan lihaksessa sekä pH:ssa 5,0 että pH:ssa 8,0.

Nisiinin parantaminen EDTA:11a oli konsentraatiosta riippuvainen, optimaalisen konsentraation ollessa alueella 0,3 mM -10 mM EDTA sekä pH-arvossa 5,0 että 8,0. Konsentraation ollessa yli 10 mM EDTA pH:ssa 8,0 EDTA:11a aikaansaatu nisiinin aktivoituminen vähenee. Kuten kokeessa f 5 (taulukko 7) kuitenkin on esitetty, kun läsnä on 1,0 % naudan seerumin albumiinia pH:ssa 8,0, nisiinin tehokkuus S_;_ typhimuriumia vastaan kanan lihaksessa ilmenee koko EDTA-konsentraatioiden alueella ainaa 100 mM:iin saakka.

18 98880

Niinpä bakterisidit, jotka sisältävät nisiiniä ja pienen kon-sentraation kelatoivaa ainetta, kuten EDTA:a, alueella 0,1 mM - 20 mM, voivat olla äärettömän tehokkaita eliminoimaan tai ehkäisemään gram-negatiivisten bakteereiden aiheuttaman ruoan kontaminoitumisen.

Esimerkki 8

Nisiinin gram-negatiivisiin bakteereihin (s. typhimurium) kohdistuvan vaikutuksen titraaminen.

Kelatoivan aineen optimaalisessa konsentraatiossa Tris-pusku-rissa olevan bakterisidin tehokkuus gram-negatiivisiin bakteereihin osoitettiin huomattavaksi, kuten taulukossa 8 on esitetty.

li 98880 19

ο VO

0 · 1 •H c—1 "3· 01 I o

<O| CO «H

p V

jj 4-> 3 m <—( , --1 * ° OI p H ·

«h| in O

c -- £ w E o

\o ^ I

O' · O

3Γ *?

•H CO

•S -g s ••H ®. :i 1 o w . :co •h ·ι-ι z ' c

° CO

fll ° I o

o w O

00 1 o i>ä S ^.1 1 H? o o

Eo ·<

H

O ro

o| O VO

rH

<1 o o W«» · o I ·—i < ~ E-1 Σ o o

Q E

W ^ I—I

c QJ:tO v ι_ι:σ] • 7v<U:3 «> «> O. 0) a 2 Ξ p e j-ι d T) " X ·η·Χ'Α vS to r—I rH CO El

< <U

0) O »=

W <H (N

98880 20

Kokeessa ^2 (taulukko 8) voidaan nähdä, että niinkin vähän kuin 0,3 pg/ml nisiiniä yhdessä 1,0 mM:n kanssa EDTA 20 mM:ssa Trisiä pHrssa 8,0 ja siten, että läsnä oli l % naudan seerumin albumiinia (BSA), merkittävästi vähensi S.typhimu-riumin eloonjäämistä. Bakterisidi on yhtä vaikuttava gram-negatiivisiin bakteereihin kuin nisiinillä yksinään on gram-positiivisiin Streptococci-bakteereihin.

Esimerkki 9

Nisiinin gram-negatiivisiin bakteereihin (S. typhimurium) suuntautuvan vaikutuksen titraaminen

Kelatoivan aineen optimaalisella konsentraatiolla bakterisi-din tehokkuus gram-negatiivisiin bakteereihin biologisen kudoksen läsnäollessa osoitettiin S.typhimurjumi11a kanan lihaksessa, ja on esitetty taulukossa 9.

TAULUKKO 9

Alkup.

elinkyk.

Koe bakteerien EDTA BSA Nisiini yug/ml : & pH lukumäärä (mM) (%) 0 10 100 200 300

Eloonjäämis-% 2 tunnin kuluttua 1 8,0 3xl07 0 0 100 - 2 8,0 3xl07 1,0 1,0 27 0,26 0,008 0,007 0,006

Kananlihaskuutiot huuhdeltiin natriumhypokloriitilla ja povi-donijodilla ennen käyttöä. Kudoksen siirrostamiseksi kananlihaskuutiot kastettiin S.typhimurium-suspensioon. jossa oli 108 solua/ml 20 mM:ssa Tris HCl, pH:ssa 8,0. Ylimääräinen kosteus poistettiin valuttamalla. Kudos pantiin riittävään määrään nisiinikoostumusta sisältävää puskuria kudoksen peittämiseksi, ja inkuboitiin 2 tuntia 370c:Ssa, jonka 2i 98880 jälkeen kudos siirrettiin riittävään määrään Phage-puskuria kudoksen peittämiseksi. Koeliuoksessa jäljellä olevat bakteerit kerättiin sentrifugoimalla, pestiin phage-puskurilla, ja yhdistettiin bakteereihin, jotka oli pesty kudoksesta phage-puskurilla. Yhdistetyt näytteet (nimitettiin "tarttumattomiksi" soluiksi) sarjalaimennettiin ja 100 yul:n erät pantiin levyille elossa olevien bakteereiden määrittämiseksi.

Esimerkki 10

Nisiini-EDTA:n ja metyyliparabeenin vaikutus gram-negatiivi-siin bakteereihin (s. typhimurium)

Nisiiniä ja EDTA:a sisältävän bakterisidin yhdistettynä tunnetun ruoan säilöntäaineen, metyyliparabeenin kanssa, osoitettiin olevan erinomaisen tehokkaan gram-negatiivisiin bakteereihin, kuten taulukossa 10 on esitetty.

TAULUKKO 10

Alkup. elinkyk.

Koe bakteerien Nisiini EDTA*3 % metyyliparabeenia $_lukumäärä_g/ml_(mM)_0_0,1_0,2

Eloonjäämis-%c 2 tunnin kuluttua 1 3x10® 0 10 11,8 1,0 10~4 2 3x10® 300 10 0,03 <10“3 <10“4 b 50 mM Na-asetaattipuskuria, pH 5,0 c tarttumattomat solut

Kananlihaskuutiot puhdistettiin natriumhypokloriitilla ja po-vidonijodilla ennen käyttöä. Kudoksen siirrostamiseksi kananlihaskuutiot kastettiin S.typhimurium-suspensioon, jossa oli 1q8 solua/ml 50 mM:ssa natriumasetaattipuskurissa, pH 5,0.

22 98880

Ylimääräinen kosteus poistettiin kastetuista kuutioista valuttamalla. Kudos pantiin riittävään määrään nisiinikoostu-musta sisältävään puskuria, jotta se peittyi, ja inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa, jonka jälkeen kudos siirrettiin riittävään määrään Phage-puskuria sen peittämiseksi. Koeliuoksessa jäljellä olevat bakteerit pestiin kudoksesta phage-puskurilla. Yhdistetyt näytteet (nimitettiin "tarttumattomiksi" soluiksi) sarjalaimennettiin ja 100 ,Ol:n erät levitettiin levyille e-lossa olevien bakteerien määrittämiseksi.

Kokeessani (taulukko 10) on metyyliparabeenin osoitettu 10 mM:n läsnäollessa EDTA:a olevan vaikuttava S. typhimuriumia kohtaan vain konsentraatiolla 1,0 %. Kokeessa $2 (taulukko 10), kun läsnä oli 300 ^ug/ml nisiiniä, parani metyyliparabeenin ja nisiinin tehokkuus S. typhimuriumia vastaan oleellisesti .

Nisiiniä ja EDTA:a sisältävät koostumukset paransivat merkittävästi ruoan säilöntäaineen metyyliparabeenin hyödyllisyyttä. Lisäksi bakterisidien avulla voidaan oleellisesti vähentää näiden yleisesti tunnettujen, vaikkakin vähemmän haluttujen ruoan säilöntäaineiden, kuten metyyliparabeenin, konsent-raatioita, tai poistaa niiden tarvetta.

Esimerkki 11

Nisiinin ja kelatoivan aineen vaikutus gram-positiivisiin bakteereihin (Staphylococcus aureus)

Nisiinin aktivoiminen kelatoivalla aineella on pH-riippuvai-nen. Taulukossa 11 olevat tiedot vahvistavat, että pH:ssa 5,0 nisiini on jonkin verran bakterisidisempi S_;_ aureusta vastaan kuin pH:ssa 8,0. pHrssa 5,0 EDTA ei lisää nisiinin vaikutusta S.aureusta vastaan ja EDTA:n konsentraatioilla yli 10 mM EDTA inhiboi nisiinin bakterisidivaikutusta. EDTA:N avulla aktivoitu bakterisidivaikutus pH:ssa 8,0 on merkittävästi suurempi kuin yksin nisiinin bakterisidivaikutus, tai yhdessä EDTA:n kanssa pH:ssa 5,0.

Il

Taulukko 11 23 98880 pH;n vaikutus EDTA:n vaikutuksiin nisiinin bakterisidi-aktiivisuuteen Staphylococcus aureukseen

Nisiini EDTA mM

pH j^g/ml 0 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30 100

Eloonjäämis-% 2 h:n kuluttua3 8.0 0 100 - 100 81 100 100 100 8.0 3.0 7.4 0.03 0.01 0.2 0.4 3 56 - 5.0 0 100 - - 100 - 5.0 3.0 0.6 1.0 1.3 1.4 1.8 - 34 80 a alkuperäinen elinkykyisten lukumäärä: 8,0x10^ cfu/ml

Inkuboinnit suoritettiin 50 mM:ssa natriumasetaattipuskuria, pH 5,0, tai 20 mM:ssa Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, 37°C:ssa.

Pelkän nisiinin bakterisidivaikutuksen on raportoitu (katso Hurst) olevan suurimmillaan pH:ssa 5,0 tai sen alapuolella, ja taulukossa 11 olevat tiedot tukevat tätä. Tämän informaation perusteella uskottiin, että EDTA:11a parannetun nisiinin bakterisidivaikutus S. aureusta vastaan olisi samoin suurempi alhaisemmassa pH:ssa. Kuten taulukosta 11 voidaan kuitenkin nähdä ja vastoin odotuksia (katso taulukko 6), EDTA:n ei havaittu lisäävän nisiinin vaikutusta gram-positiivisiin bakteereihin pH:ssa 5,0. Suurten EDTA-konsentraatioiden inhiboiva vaikutus nisiinin aktiivisuuteen havaittiin kuitenkin vielä pH:ssa 5,0. Niinpä nisiinin aktivoituminen kelatoivan aineen avulla tapahtuu vain kelaattorin konsentraatioalueilla, ja gram-positiivisten bakteereiden suhteen on riippuvainen pH:sta edullisen pH-alueen ollessa yli 5,0.

24 98880

Esimerkki 12

Nisiinin ja kelatoivan aineen vaikutus gram-positiivisiin bakteereihin EDTA:n vaikutus nisiinin bakterisidiaktiivisuuteen pH:ssa 8,0 ei ole rajoittunut S♦ aureukseen, tärkeään ihmisen patogeeniin, vaan on havaittavissa myös Streptococcus mutansilla, joka on syyllinen hammasplakkiin (taulukko 12A), Listeria monocytogenesillä, ruokaperäisellä patogeenillä(taulukko 12B), ja sekapopulaatiolla kainalokuopan Coryneform-baktee-reilla, jotka synnyttävät kehon hajun (taulukko 12c).

Taulukko 12A

EDTA:n vaikutukset nisiinin bakterisidiaktiivisuuteen Streptococcus mutansia kohtaan

Nisiini EDTA mM

pH μ g/ml 0 0.01 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30 100

Eloonjäämis-% 2 h:n kuluttua3 8.0 0 100 - - - - 8.0 0.1 4.3 1.8 0.04 0.02 0.06 1 25 100 100 a alkuperäinen elinkykyisten lukumäärä: 6,0x10^ cfu/ml

Inkuboinnit suoritettiin 37°C:ssa 20 mMrssa Tris-HCl:ää, pH:n ollessa 8,0.

Taulukko 12B

25 98880 EDTA;n vaikutukset bakterisidiaktiivisuuten Listeria monocytogenesiä kohtaan

Nisiini EDTA mM

pH μ g/ml 0 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30 100 t

Eloonjäämis-% 2 h:n kuluttua3 8.0 0 100 84 - - - 8.0 3.0 0.71 0.04 0.04 0.02 0.1 0.64 10 14 a alkuperäinen elinkykyisten lukumäärä 6,0x10^ cfu/ml

Inkuboinnit suoritettiin 37°C:ssa 20 mM:ssa Tris-HCl:ää, pH:Ssa 8,0.

Taulukko 12C

EDTA;n vaikutukset nisiinin bakterisidiaktiivisuuteen Coryneform bakteereita kohtaan

Nisiini EDTA mM

pH ^tf-g/ml 0 0.1 0.3 1.0 3.0 10

Eloonjäämis-% 2 h:n kuluttua3 8.0 0 100 - 4.6 3.6 8 36 8.0 3 0.22 0.03 0.0009 0.1 — 0.16 a alkuperäinen elinkykyisten lukumäärä; Ι,ΟχΙΟ6 cfu/ml

Inkuboinnit suoritettiin 37oc.ssa 20 mM:ssa Tris-HCl;ää pH:ssa 8,0.

26 98880

Esimerkki 13

Kelaattorilla aktivoidun nisiinin nopea bakterisidivaikutus

Nisiiniä EDTA:n kanssa sisältävä bakterisidi on on nopeasti bakterisidinen, kuten taulukossa 13A olevista tiedoista käy ilmi. Gram-positiivisen bakteerin S. mutansin suspensioita 107 solua/ml inkuboitiin 20 mM:ssa Tris-puskuria, pH:ssa 7,3 37°C:ssa 1 mM:lla EDTA:a aktivoidun nisiinin konsentraatio-alueella. Suspensioita inkuboitiin eri aikoja 0,5-60 minuuttia bakterisidien kanssa. Bakterisidien bakterisiditehokkuus arvioitiin määrittämällä bakteereiden eloonjäämisen prosentti. EDTA:11a täydennettynä niinkin pieni määrä kuin 10 yug/ml nisiiniä tässä koostumuksessa pystyy vähentämään bakteeri-kuormitusta arvoon <10“4 (6 logs) 1 minuutissa.

Nopea bakterisidiaktiivisuus on edellytys tehokkaalle desinfektiolle. Niinpä koostumusten ennustetaan olevan tehokkaita bakterisideja erityisesti tässä esitellyllä tavalla, suuveden, huuhteluaineen, hammastahnan tai muun samanlaisen ham-paidenpuhdistusaineen komponenttina, joka vaikuttaa plakkia muodostavaan S. mutansiin.

EDTA:11a parannetun nisiinin aktiivisuus gram-negatiivisia bakteereita vastaan 2-3 tunnissa osoitettiin esimerkeissä 1-7. EDTA:11a täydennetyn nisiinin nopea bakterisidivaikutus myös gram-negatiivisiin bakteereihin on nähtävissä ja tämä käy ilmi taulukossa 13B esitetyistä tiedoista..

Il

Taulukko 13A

27 98880 EDTAilla täydennetyn nisiinin bakterisidiaktiivisuuden kinetiikka Streptococcus mutansia kohtaan

Inkubointi- Nisiini nR/ml sekä 1,0 mM ΕΠΤΑ:a aika 0 1 ^ 10 30 1ÖÖ (minuuttia)

Eloonjäämis-% 2 h:n kuluttua3 0.5 - - <:io-4 1 - <10"4 <10‘4 ^10"4 3 100 0.5 0.002 <10“4 ^10~4 15 - 0.03 <10"4 <10"4 30 - <10“4 - - 60 100 0.003 - - a elinkykyisten solujen vertailulukumäärä: 1,0 x 107 cfu/ml

Inkuboinnit suoritettiin 20 mM:ssa Tris-HCl, pHtssa 7,3, . 37°C:ssa.

Taulukko 13B

EDTAilla parannetun nisiinin nopea bakterisidiaktiivisuus Escherichia colia kohtaan

Nisiini Ifq/rol mM EDTA 0 0.3 1.0 3 10 30 100

Eloonjäämis-% 1 minrssaa 1.0 100 100 56 0.37 0.013 0.015 0.008 28 98880 a alkuperäinen elinkykyisten lukumäärä: 1,0x10? cfu/ml Inkuboinnit suoritettiin 20 mM:ssa Tris, pH 7,0, 37°C:ssa. Esimerkki 14

Kaksiarvoisten kationien vaikutus EDTA:n avulla tapahtuvaan nisiinin aktiivisuuden lisäämiseen

Kaksiarvoiset kationit sitoutuvat EDTAtan ja muihin kelatoi-viin aineisiin ja niiden voisi odottaa neutraloivan nisiinin aktivoimista EDTA:lla. Kuten taulukossa 14 olevista tiedoista s voi kuitenkin nähdä, nisiinin bakterisidiaktiivisuuf S. mu-tansia kohtaan lisääntyy 1 mM:lla EDTA:a jopa silloin kun läsnä on 1 mM Ca2+ioneja; vain 3 mM:n yläpuolella oli Ca2+-ioni inhiboiva EDTArlla aktivoidulle nisiinille. Tämä on erityisen tärkeätä suuvesissä käytettäessä, jolloin kalsiumioni-konsentraatiot ovat relevantteja.

TAULUKKO 14 EDTAilla aktivoidun nisiinin nopea bakterisidivaikutus Streptococcus mutansia kohtaan kahdenarvoisen kationin läsnäollessa

CaCl. mM

Nisiini 0 0.1 ^0.3 1.0 3 10 E.loonjäämis-% 1 min:ssaa 0 100 3 2.9 3E 0.0042 0.0042 0.052 18 30E 0.0019 0.0003 0.0004 0.06 6.8 100E <10“4 <10‘4 <il0~4 0.0001 1.5 29 98880 E 1 mM Na2EDTA:a a alkuperäinen elinkykyisten lukumäärä Ι,ΟχΙΟ2 cfu/ml.

Inkuboinnit suoritettiin 10 % sikiövasikan seerumissa 37°C:ssa.

Esimerkki 15

Nisiinin ja pinta-aktiivisen aineen vaikutus gram-positii-visiin bakteereihin

Nisiinin bakterisidiaktiivisuutta voidaan myös merkittävästi lisätä yhdistämällä pelkkään pinta-aktiiviseen aineeseen.

Tätä kuvataan parhaiten rajoitetulla nisiinikonsentraatiolla (0,2 pg/ml), kuten taulukossa 15A on esitetty. Aina konsent-raatioihin 0,1 % saakka oli ruokaan sopivalla pinta-aktiivi-sella aineella monolauriinilla vähän bakterisidivaikutusta Streptococcus agalactiaeta vastaan kompleksikasvualustassa maidossa. Myöskään nisiinillä ei konsentraatioilla aina 0,2 ug/ml:aan saakka myöskään ole merkittävää bakterisidivaikutusta maidossa. Näiden kahden aineen yhdistelmä, 0,1% mono-lauriinia ja nisiiniä 0,2 yug/ml, on kuitenkin äärimmäisen potentiaalinen S^_ agalactiae-bakteeria kohtaan. Tämä bakterisi-di on yli 100 kertaa aktiivisempi kuin voisi odottaa lisävaikutuksesta, ja 10 000 kertaa aktiivisempi kuin kumpikaan komponentti yksinään. Niinpä kun nisiinin käyttöä rajoittaa sen käytettävissä oleva aktiivisuus, voidaan bakterisidin, joka sisältää nisiiniä sekä pinta-aktiivista ainetta, odottaa olevan käyttökelpoisempi.

Esimerkki siitä, kun nisiininkäyttöä rajoittaa sen käytettävissä oleva aktiivisuus, on esitetty taulukossa 15B olevissa tiedoissa. Vaikka nisiini, ja erityisesti bakterisidi, joka sisältää nisiiniä ja EDTA:a, on bakterisidinen L. monocyto-genesiä vastaan, taulukon 15B tiedot osoittavat, että kompleksikasvualustassa kuten maidossa käytettävissä oleva nisiinin aktiivisuus tälle organismille on rajoitettu. Nisiiniä glyseridin, mono-oleaatin kanssa sisältävä bakterisidi on 30 98880 kuitenkin tehokas maidossa tälle ruokaperäiselle patogeenille vaikka mono-oleaatilla ei sellaisenaan ole bakterisidiaktiivisuutta tähän organismiin.

Taulukko 15A

Nisiinin bakterisidiaktiivisuus Streptococcus agalactiaeen maidossa 37°C:ssa (Nisiinin aktivointi monolauriinilla) («g/M) Monologiini 0 0.01 0.1

Eloonjäämis-% 2 h:ssaa 0 100 100 4.5 0.02 100 100 0.2 0.2 2.2 0.05 0.0008 a alkuperäinen elinkykyisten lukumäärä 6,0xl07 cfu/ml.

Inkubointi maidossa 37°C:ssa

Taulukko 15B

Nisiinin bakterisidiaktiivisuus Listeria monocytogenesiin maidossa 37°C:ssa (Nisiinin aktivointi mono-oleaatilla)

Ni5^ Mono-oleaattia g/ml 0 0.1 1.0

Eloonjäämis-% 2 h:ssaa 0 100 67 63 100 0.56 10~3 10-4 a alkup. elinkyk. lukum.: 5,0xl07 cfu/ml. Inkubointi maidossa lämpötilassa 37°c.

Il

Claims

98880
1. Koostumus, joka on käyttökelpoinen laaja-alaisena bakte-risidina, tunnettu siitä, että se käsittää lantio-niinipitoista bakteriosiinia ja kelatoivaa ainetta ja vaihtoehtoisesti pinta-aktiivista ainetta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lantioniinipitoinen bakteriosiini on nisiini, subtiilini, epidermiini, sinnamysiini, duramysiini, ankoveniini tai Pep 5.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kelatoiva aine on alkyylidiamiinitetra-asetaatti, CaEDTA, Na2EDTA, EGTA tai sitraatti.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että alkyylidiamiinitetra-asetaatti on EDTA ja bakteriosiini on nisiini.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että pinta-aktiivinen aine on nonioninen pesuaine, joka on johdettu nonoksinolista, oktoksinolista ja tyloksopolista, nonioninen pesuaine, joka käsittää polyoksietyleeni-(20)sorbi-taanimonorasvahappojohdannaisia, glyseridi, rasvahappo, emul-gaattori, kvarternaarinen yhdiste, amfoteerinen tai anioninen pinta-aktiivinen aine.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää myös ruoan säilöntäaineen. ‘ 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lantioniinipitoinen bakteriosiini on nisiini, subtiilini, epidermiini, sinnamysiini, duramysiini, ankoveniini tai Pep 5, ja kelatoiva aine on alkyylidiamiinitetra-asetatti, EGTA tai sitraatti, jotka ovat läsnä sellaisina määrinä, että bakteriosidin tehokkuus on lisääntynyt ainakin yhdenlaisia bakteereita kohtaan ryhmästä Staphylococcus aureus. Streptococ- 98880 cus mutana. Listeria monocytogenes. Streptococcus aqalactiae. Corvneform-bakteerit. Salmonella tvphimurium. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae. Pseudomonas aeruginosa, Bacteriocides gingivalis ja Actinobacillus actionomvcetescomitans.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että nisiinin pitoisuus on välillä noin 0,1 - 300 μ9/ιη1, ja kelatoivan aineen pitoisuus on välillä noin 0,1 - 20 mM.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että pinta-aktiivisen aineen pitoisuus on välillä noin 0,01 - 1,0%.