DK171069B1

DK171069B1 - Præparat indeholdende et lanthionin-holdigt bacteriocin i kombination med et chelaterings- og/eller overfladeaktivt middel

Info

Publication number: DK171069B1
Application number: DK045690A
Authority: DK
Inventors: Peter Blackburn; June Polak; Sara-Ann Gusik; Stephen D Rubino
Original assignee: Applied Microbiology Inc
Priority date: 1988-06-22
Filing date: 1990-02-21
Publication date: 1996-05-28
Also published as: DE68927189T2; ATE142504T1; HU893794D0; IE63998B1; NO179354C; WO1989012399A1; IE892015L; DE68927189D1; IL90700A0; EP0382814A1; JPH089525B2; NO895147L; HU204980B; NO895147D0; JPH03500051A; DE68913189D1; IE940624L; EP0545911B1; IL90700A; DE68913189T2

Description

DK 171069 B1

Opfindelsen angår et præparat indeholdende et lan-thionin-holdigt bacteriocin i kombination med et chelate-rings- og/eller overfladeaktivt middel.

Nisin er et polypeptid med antimikrobielle egenskaber, 5 der i naturen produceres af forskellige stammer af bakterien Streptococcus lactis. Nisin er et kendt næringsmiddel-konserveringsmiddel, der inhiberer væksten af sporer af visse arter af gram-positive bakterier.

Skønt nisin til tider fejlagtigt og upræcist betegnes 10 som et antibiotikum, klassificeres dette stof mere korrekt som et bacteriocin, dvs. et proteinholdigt stof, der produceres af bakterier og kun har antibakteriel aktivitet mod arter, der er nært beslægtede med nisinets oprindelsesarter. Nisin er et naturligt forekommende konserveringsmiddel, der 15 findes i lav koncentration i mælk og ost, og dette stof menes at være fuldstændig ikke-toksisk og ikke-allergent overfor mennesker.

Nisin er fornyligt blevet anerkendt som sikkert af FDA som en direkte næringsmiddelbestanddel i pasteuriseret 20 smøreost, pasteuriseret behandlet smøreost og pasteuriseret eller pasteuriseret behandlet smøreost med frugter, grøntsager eller kød. Eftersom nisin er et polypeptid, vil eventuelle nisinrester, der bliver tilbage i næringsmidler, endvidere blive hurtigt fordøjet.

25 En sammenfatning af nisins egenskaber findes i A.

Hurst, Advances in Applied Microbiology 27., 85-123 (1981).

I denne publikation beskrives det, der generelt vides om nisin. Nisin, der produceres af Streptococcus lactis, er kommercielt tilgængeligt som et urent præparat, Nisaplin®, 30 der fås fra Aplin & Barrett Ltd., Dorset, England, og kan fås ved isolering af naturligt forekommende nisin fra kulturer af Streptococcus lactis, hvorpå nisinet koncentreres ved anvendelse af kendte metoder. Der er også beskrevet metoder til produktion af nisin under anvendelse af ændrede 35 stammer af Streptococcus, jf. US patentskrift nr. 4.716.115. Det skulle også være muligt at producere nisin ved anvendelse 2 DK 171069 B1 af rekombinant DNA-teknologi.

Nisin er blevet anvendt effektivt som et konserveringsmiddel i mejeriprodukter, f.eks. behandlet ost, fløde og mælk. Anvendelsen af nisin i behandlede osteprodukter er 5 genstand for nyligt meddelte patenter, jf. US patentskrifterne nr. 4.584.199 og nr. 4.597.972. Anvendelsen af nisin til inhibering af væksten af visse gram-positive bakterier er godt dokumenteret. Nisinets fuldstændige succes og anerkendelse som et konserveringsmiddel til næringsmidler er 10 hidtil blevet hindret af den antagelse, at nisin er ineffektivt mod gram-negative og mange gram-positive bakterier. Gram-negative bakterier er praktisk taget altid til stede i forbindelse med gram-positive bakterier og er en hovedkilde til ødelæggelse af næringsmidler og forurening, jf. US 15 patentskrift nr. 4.584.199 og US patentskrift nr. 4.597.972, samt Tsai og Sandine, "Conjugal Transfer of Nisin Plasmid Genes from Streptococcus Lactis 7962 to Leuconostoc Dex-tranicum 181, Applied and Environmental Microbiology, februar 1987, side 352, "A Natural Preservative", Food Engineering 20 International, maj 1987, side 37-38 samt "Focus on Nisin", Food Manufacture, marts 1987, side 63.

Det har nu i modsætning til den kendte teknik vist sig, at præparater indeholdende nisin og andre lanthionin--holdige bacteriociner i kombination med forskellige ikke-25 baktericide midler har forøget eller forstærket, bredspektret baktericid aktivitet mod gram-negative bakterier samt en forøget aktivitet mod et bredere spektrum af gram-positive bakterier end nisin eller de andre bacteriociner alene. Den forøgede baktericide aktivitet mod gram-positive bakterier 30 forefindes i et pH-område, der er bredere end tidligere antaget. Opfindelsen angår således et præparat, der er ejendommeligt ved, at det indeholder et lanthionin-holdigt bac-teriocin i kombination med et chelateringsmiddel og/eller overfladeaktivt middel. En række foretrukne udførelsesformer 35 for præparatet ifølge opfindelsen er angivet i krav 2-12.

Det har således nærmere betegnet vist sig, at en 3 DK 171069 B1 opløsning af ca. 0,1 μg nisin pr. ml til ca. 300 μg nisin pr. ml i nærværelse af fra ca. 0,1 mM til ca. 20 mM af et chelateringsmiddel, f.eks. EDTA, i praksis eliminerer væksten af gram-negative bakterier, f.eks. Salmonella typhimurium, 5 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gin-givalis, Actinobacillus actinomycetescomitans og Klebsiella pneumoniae, og er mere aktiv mod gram-positive bakterier, f.eks. Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Streptococcus agalactiae og Coryneform-bak-10 terier, end nisin alene. Omend forøgelsen af nisin-aktivi-teten med chelateringsmidlet er koncentrationsafhængig, er koncentrationer af EDTA ud over 20 mM i modsætning til forventningerne inhiberende for den baktericide aktivitet af nisin. I nærværelse af et proteinholdigt bærestof og poly-15 valente monomere, f.eks. serumalbumin, collagen, gelatine, casein og keratin, formindskes inhiberingen af nisin ved koncentrationer af EDTA på over 20 mM imidlertid signifikant, hvilket betyder en udstrækning af det anvendelige område for EDTA-forstærkning af nisins aktivitet.

20 Det har også vist sig, at en opløsning med fra ca.

0,1 μg nisin pr. ml til ca. 300 μg/ml og fra ca. 0,1 mM til ca. 20 mM af et chelateringsmiddel yderligere vil forøge effektiviteten af nisin mod gram-negative og gram-positive bakterier i nærværelse af fra ca. 0,01 til ca. 1,0% over-25 fladeaktivt middel. Det har yderligere vist sig, at nisin i nærværelse af overfladeaktivt middel alene har forøget aktivitet mod gram-positive bakterier.

Ifølge den foreliggende opfindelse omfatter egnede chelateringsmidler EDTA, CaEDTA, CaNa2EDTA og andre alkyl-30 diamin-tetraacetater, EGTA og citrat. Overfladeaktive midler, der er værdifulde som rensemidler, og som er egnede til kombination med nisin, med eller uden EDTA, omfatter f.eks. de ikke-ioniske overfladeaktive midler Tweens, Tritons og glycerider, ioniske overfladeaktive midler, f.eks. fedtsyrer, 35 kvaternære forbindelser, anioniske overfladeaktive midler, f.eks. natriumdodecylsulfat, og amphotere overfladeaktive 4 DK 171069 B1 midler, f.eks. cocamidopropylbetain, og emulgeringsmidler.

Eftersom gram-positive og gram-negative bakterier praktisk taget altid findes sammen i næringsmidler, vil effektiviteten af nisinpræparaterne mod gram-negative bak-5 terier såsom Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gin-givalis og Actinobacillus actinomycetescomitans og andre gram-negative pathogener og gram-positive bakterier være til stor nytte. Baktericiderne er navnlig egnede til kontrol 10 med og hindring af forurening af rå bestanddele, behandlede næringsmidler og drikkevarer i forbindelse med bakterielle pathogener og andre mikrobielle, ødelæggende organismer. Potentielle næringsmiddel-relaterede anvendelser omfatter behandlingen af kødvarer, navnlig fjerkræ, æg, ost og fisk 15 samt behandling af næringsmiddel-indpakningsmaterialer og håndteringsudstyr hertil. Yderligere anvendelser omfatter konservering af næringsmidler, f.eks. i behandlet ost, fløde, mælk, mejeriprodukter og ved rensning af fjerkræ, fisk, kød, grøntsager samt mejeri- og næringsmiddelbehandlingsap-2 0 paratur. Anvendelsen af nisinpræparaterne skal ikke begrænses til næringsmiddel-relaterede anvendelser, og nisinpræparaterne kan anvendes i enhver situation, hvor der forefindes et behov eller ønske om at eliminere gram-negative og gram--positive bakterier.

25 Præparaterne kan opløses i et egnet bærestof, f.eks.

et vandigt opløsningsmiddel eller pufferstof, eller suspenderes i enhver egnet væskeformig, kolloid eller polymer matrix til dannelse af baktericider. Præparaterne eller baktericiderne kan inkorporeres i salver eller overtræk til 30 medicinsk anvendelse, f.eks. behandling af infektioner, sårforbindinger eller kirurgiske implantater og som bredspektrede desinfektionsmidler til skylning af huden eller oral skylning, desinficerende rensemidler, aftørringsmidler eller lotions. Baktericiderne kan anvendes til rensning af 35 medicinske instrumenter, i præ-operative kirurgiske rensemidler og lignende. Baktericiderne er især anvendelige under 5 DK 171069 B1 omstændigheder, hvor en desinfektion af omgivelserne ønskes, men hvor kemiske germicider er udelukket på grund af risikoen for korroderende eller på anden måde toksiske remanenser.

I modsætning til aktiviteten af de fleste bredspekt-5 rede germicider, der påvirkes i uønsket retning ved nærværelsen af komplekst organisk materiale, er præparaterne ifølge opfindelsen virksomme som baktericider i nærværelse af organisk materiale, f.eks. mælk eller serum.

Det er kendt, at nisin optimalt inhiberer væksten af 10 nogle få nært beslægtede gram-positive bakterier, navnlig visse gram-positive sporeformende bakterier ved en pH-værdi på 5,0. Den baktericide aktivitet af nisin i opløsning sammen med et chelateringsmiddel er overraskende hurtig og i høj grad forstærket mod et bredt område af gram-positive bak-15 terier ved pH-værdier, der er større end pH = 5,0, og aktiveres endvidere mod gram-negative bakterier ved både sure og basiske pH-værdier, fortrinsvis i pH-området fra 5,0 til 8,0. Denne uventet hurtige og bredspektrede baktericide aktivitet af chelateringsmiddel-aktiveret nisin gør dette 20 egnet til brug som blandt andet et desinfektionsmiddel.

Nisin tilhører klassen af peptid-bacteriociner, der indeholder lanthionin. Også omfattet af denne klasse er subtilin, epidermin, cinnamycin, duramycin, ancovenin og Pep 5. Disse bacteriocin-peptider produceres hver for sig 25 af forskellige mikroorganismer. Subtilin opnået fra visse kulturer af Bacillus subtilis og epidermin opnået fra visse kulturer af Staphylococcus epidermidis har vist sig at have molekylstrukturer, der minder meget om molekylstrukturen for nisin, jf. Hurst, side 85-86, samt Schnell et al., 30 Nature 333. 276-278. Det antages derfor og er faktisk blevet påvist, at andre lanthionin-holdige peptid-bacteriociner på grund af de molekylære ligheder er lige så effektive som nisin i kombination med chelateringsmidler og/eller ikke-ioniske overfladeaktive midler til eliminering af gram-nega-35 tive og gram-positive bakterielle forureninger.

Effektiviteten af nisin og andre lanthionin-holdige 6 DK 171069 B1 peptid-bacteriocin-præparater som baktericider mod gram--negative bakterier er overraskende, eftersom den kendte teknik generelt peger bort fra denne aktivitet for nisin. Den forøgede aktivitet af nisin mod gram-positive bakterier 5 i nærværelse af EDTA ved en pH-værdi på mere end 5,0 er uventet, eftersom man hidtil har ment, at nisin-aktiviteten er optimal ved en pH-værdi på 5,0. Endvidere opfylder erkendelsen af en sådan effektivitet af de nisin- og lanthio-nin-holdige peptid-bacteriocin-præparater som baktericider 10 et langvarigt behov indenfor videnskaben med hensyn til konservering af næringsmidler, hvilket område har lidt under manglen på et acceptabelt, naturligt, ikke-toksisk middel, der er virksomt mod et bredt spektrum af bakterier.

Til påvisning af den overlegne og uventet hurtige 15 aktivitet af et præparat indeholdende nisin, EDTA og/eller forskellige overfladeaktive midler mod såvel gram-negative som gram-positive bakterier, er der med baktericideme blevet udført et antal forsøg. Disse forsøg tjener som illustration af opfindelsen. Andre lanthionin-holdige peptid-bacteriociner 20 er virksomme erstatninger for nisin, og andre chelaterings-midler end EDTA er virksomme erstatninger for EDTA, jf. de følgende forsøgsresultater.

Alle forsøg i de følgende eksempler er udført ved 37°C. Effektiviteten af de forstærkede, bredspektrede bak-25 tericider er bestemt ved bestemmelse af den baktericide aktivitet som målt som den procentvise bakterielle overlevelse efter behandling med baktericidet. Generelt indsamles bakterier ved centrifugering i 2 minutter efter inkubering af en cellesuspension med 107 celler pr. ml af den art, der 30 skal undersøges, med det hidtil ukendte baktericid i nærmere bestemte tidsrum. Den fremkomne bakterie-pellet vaskes fri for baktericidet med en hjælpepuffer, der her betegnes en phag-puffer (50 mM tris-HCl-puffer med en pH-værdi på 7,8, 1 mM MgSC>4, 4 mM CaCl2, 0,1 M NaCl og 0,1% gelatine), gen-35 suspenderes og seriefortyndes i phag-puffer, og 100 ml af de suspenderede bakterier udspredes på næringsagarplader.

7 DK 171069 B1

Overlevende bakterier bestemmes som optalte kolonidannende enheder (CFU) efter inkubering i 24-48 timer ved 37°C. Et virksomt baktericid ifølge opfindelsen er et sådant, der tillader mindre end 0,1% af det oprindelige levedygtige 5 antal bakterier at overleve.

Eksempel 1

Aktivitet af nisin og et chelateringsmiddel mod gram-negative bakterier (S. typhimurium) 10 Som det fremgår af den følgende tabel I, udføres der to forsøg i 20 mM tris, pH = 8,0, ved 37°C ved påvisning af virkningen af baktericidet indeholdende nisin og chelate-ringsmidlet EDTA alene. Forsøg nr. 1, der er et kontrolforsøg, udføres uden EDTA og viser virkningen af nisin alene 15 mod den gram-negative bakterie S. thyphimurium. De forøgede koncentrationer af nisin udviser nogen aktivitet, men selv aktiviteten af højere koncentrationer i nærværelse af EDTA, der giver 1,6%' s overlevelse ved 100 μg nisin pr. ml, er ganske utilstrækkelig til et konserveringsmiddel til nærings-20 midler. Niveauet for den baktericide aktivitet, der opnås med nisin og EDTA, er signifikant.

tabel i

Oprindeligt 25 levedygtigt

Forsøg bakterie- EDTA Nisin (μg/ml) nr. antal (mM) 0 10 30 50 100 300

Procentvis S. typhimurium- 30 overlevelse efter 3 timer 1 3,0 x 106 0 100 51,3 - 7,0 1,6 2 5,7 x 106 20 2,5 - 10~3 - <10'4 <10"4

Forsøg nr. 2, jfr. tabel I, udføres under anvendelse 35 af nisin plus 20 mM EDTA og viser den overraskende aktivitet af nisinpræparatet til eliminering af den undersøgte gram--negative bakterie.

Det fremgår af tabel I, at ved forsøg nr. 2 i en 8 DK 171069 B1 koncentration på 20 mM EDTA og 30 μg nisin pr. ml har bak-tericidet en markeret baktericid aktivitet mod S. typhimu-rium, medens ved en nisinkoncentration på 100 μg/ml og højere nisin- og EDTA-baktericidet praktisk taget eliminerer bak-5 terierne (procentvis overlevelse mindre end 10'4, hvilket indikerer, at der ikke findes nogen overlevende bakterier ved forsøget). Kombinationen af EDTA og nisin udviser således en potenseret aktivitet, der er mere end 1000 gange aktiviteten af nisin alene.

10 Den følgende tabel IA viser aktiviteten af subtilin og chelateringsmiddel mod den gram-negative bakterie Salmonella typhimurium.

Tabel IA

Aktivitet af subtilin og chelateringsmiddel mod den gram-ne-15 gative bakterie Salmonella typhimurium

Bærestof Subtilin EDTA rrM

(/xg/ml) 0 0,1 1 3 10 100 20 % overlevelse 2 timer 0 100a

Puffer pH 8,0b 5 5 0,008 0,0004 0,004 0,04 11,3 25

Puffer pH 5,0C 5 0,06 0,04 0,0003 0,00030,08 6 30 a oprindeligt levedygtigt bakterieantal 3 x 10® CFQ/ml b 20 nM Tris-HCl, pH 8,0 c 50 rrM Na-acetat, pH 5,0

Eksempel 2 35 Aktivitet af nisin, et chelateringsmiddel og et overflade-aktivt middel mod gram-negative bakterier (S. typhimurium)

Der udføres fire forsøg, jf. tabel II, til bestemmelse af virkningen på S. typhimurium af baktericidet indeholdende nisin og både EDTA og det overfladeaktive middel 40 Triton X-100 i 20 mM tris, pH = 8,0, ved 37°C. Kontrollen, 9 DK 171069 B1 jf. forsøg nr. 1, er identisk med kontrollen i eksempel 1, jf. tabel I.

10 DK 171069 B1 i

O O

O i i i H

Γ0 V

KQ O i

O - - O

O rH I rH

rH ^ V

i & u 3 0) — -H B o o

i—I Vi -H

gO 3 4J O ^ I I

\ ld £ vn tn -ri m i si — α u S 0) C 4J J-) ro ^

•H 4-t II

cg -tu o o

•H O 0} I I Η H

S Γ0 CD V V

0} CG

Ή i—i

> <D

U > a cu

φ iH

ϋ Vi ro O

O <D

o Vi > H ro i i H di 0 ui σι ro ^

M ° ' ' O

M o o o h J π ro v

W

PQ

< ^ a O o P o

-H rH -—~ O rH O

V-l i o\° O

E-l X “ H O rH

< — Η 2 Q £ o o o o

ω —' CM CM

U JJ

Cn t n -H -H I CO ID CO m

H -|J d) O O O O

d) ζΤ)*Ή rH rH rH rH

X) >H Vh

C Ό 0) η X X X X

ri (D u)

Vi > -u o o t" e'en o) ro c ....

OrHXirt! m m ii) i/i tn

S

CG

Vi · rH (Μ Γ0 ^ O Vi

bu C

11 DK 171069 B1

Forsøg nr. 2, jfr. tabel II, udføres under anvendelse af nisin og 1,0% Triton X-100, men uden EDTA. Tilstedeværelsen af detergentet alene inhiberer aktiviteten af nisin mod den gram-negative bakterie, og nisin er uvirksom. Ved for-5 søgene nr. 3 og nr. 4, jfr. tabel II, der repræsenterer den foreliggende opfindelse, udgør tilstedeværelsen af 20 mM EDTA i kombination med Triton X-100 imidlertid et baktericid, der mærkbart forøger den baktericide aktivitet af nisin mod S. typhimurium. Kombination af Triton X-100 med EDTA, men 10 uden nisin, er faktisk virksom, men i en mindre grad end i nærværelse af nisin. Omend ved begge forsøg nr. 3 og nr. 4, jfr. tabel II, nisinkombinationerne er særdeles virksomme, er koncentrationen af 1,0% Triton X-100, jfr. forsøg nr. 4, tabel II, mest effektiv.

15 Tilstedeværelsen af det ikke-ioniske overfladeaktive middel, Triton X-100, i kombination med EDTA forøger aktiviteten af nisin mod gram-negative bakterier endog mere end baktericidet indeholdende nisin og EDTA alene, jfr. eksempel 1.

20 De følgende tabeller IIA-IID viser aktiviteten af nisin og forskellige chelateringsmidler mod E. coli og S. mutans.

Tabel IIA

25 Aktivitet af nisin og chelateringsmidler mod Escherichia coli

Chelateringsmiddel 1 mM^

Nisin (/zg/ml) 0 EDTA DTPA CDTA EGTA 1 0 % overlevelse 1 minut 100 100a 0,61 4,2 4,3 10,9 3 5 a oprindeligt levedygtigt bakterieantal 1 x 107 CFU/ml b 10 mM Tris-HCl, pH 7,3 40 12 DK 171069 B1

Tabel IIB

Aktivitet af nisin og CaNa2EDTA mod Streptococcus mutans 5

CaNa2EDTA mM

Bærestof Nisin (μg/ml) 0 1 10 % overlevelse 1 minut 10% FCSb 3,0 3,0 0,052 15

Oprindeligt levedygtigt bakterieantal 3 x 106 CFU/ml b 10% kalvefosterserum 20

Tabel IIC 25

Aktivitet af nisin og citrat mod Streptococcus mutans 30

Bærestof Nisin Citrat trM

(μς/τύ.) 0 0,1 1 3 10 100 35 % overlevelse 2 timer

Puffer pH 7,3b 0,3 3,65 1,25 0,1 0,42 0,2 0,35 40

Oprindeligt levedygtigt baterieantal 3 x 106 CFU/ml b 10 mM Tris-HCl, pH 7,3 45 13 DK 171069 B1

Tabel IIP

Aktivitet af nisin og citrat mod Escherichia coli 5 Bærestof Nisin % Citrat (μg/τcl) 0 0,1 0,3 1 3 % overlevelse 1 minut 10

Puffer pH 3,5 0 100 100 56 73 100 100 100 0,0025 0,0006 0,56 14,6 15

Oprindeligt levedygtigt baterieantal 5 x 107 CFU/ml Eksempel 3 20 Aktivitet af nisin, et chelateringsmiddel og et overfladeaktivt middel mod gram-negative bakterier (S. typhimurium)

Tabel III viser den forøgede aktivitet mod S. typhimurium af baktericidet indeholdende nisin, 20 mM af chelate-ringsmidlet EDTA og det ikke-ioniske overfladeaktive middel 25 Tween 20 i 20 mM tris, pH = 8,0, ved 37°C. Som ved Triton X-100, jfr. eksempel 2, er kombinationen af nisin og EDTA med (1%) Tween 20 mest virksom.

14 DK 171069 B1

I I

O O O

O i rH rH

Γ0 V V

KO I l

O v o O

O rH rH rH

rH V V

s P

3 <D

— -H £ O

γ-h Vi -h B o 3 p> i i

\ ld B

tn -η ro a. Pi — tt ^ S Φ C p> p> ro ·<?

-H <+-4 I I

w (U o o

•H O CO I Η H

£ ro <l) v v m m

Ή rH

> <u P> > c a>

(U rH

U P ro o <u

O P > ιΗ I I

H ft O LD

O)

Η I

M O LD O

M O O - rH

H <N V

PI W

m o <q c\ E-i

C

<D

Φ ^ o 3 o\° o o

E”* ' H

C ~ t-> S

Q B o o o

H —' O) CN

-P P) tn tn •Η -Η I IJ) ID li)

H 4J I) O O O

d) t n ή i—i i—i i—i Ό >h p

CO (1)H XXX

-P (D p) (ti P > Pi p o r-~ ro ft Q) (ti C ~ O H J3 it ro ι/l tn s w P · rH CM ro

O P ft C

15 DK 171069 B1

De følgende tabeller IIIA og HIB viser aktiviteten af nisin kombineret med et chelateringsmiddel og forskellige overfladeaktive midler.

5 Tabel IIIA

Aktivitet af nisin og ikke-ioniske overfladeaktive midler mod Escherichia coli 10 Tween-produkter Bærestof Nisin [μg/ml} 0 Tw20 Tw40 Tw80

+ 1 mM EDTA

15 % overlevelse 1 minut 0 100a 100 100 100

Puffer pH 7,0b 3 0,25 0,001 0,007 0,007 2 0 _ a Oprindeligt levedygtigt bakterieantal 1 x 107 CFU/ml b 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 25

Tabel HIB

30 Aktivitet af nisin og amfotert overfladeaktivt middel mod Streptococcus mutans % cocamidopropylbetain Bærestof Nisin {μg/ml) 0 0,1

35 + 1 mM EDTA

% overlevelse 1 minut 40 10% FCSb 0 100 11 3 30 0,07 a oprindeligt levedygtigt bakterieantal 1 x 107 CFU/ml 45 b 10% kalvefosterserum 16 DK 171069 B1

Eksempel 4

Aktivitet af nisin, et chelateringsmiddel og et overfladeaktivt middel mod gram-negative bakterier (Escherichia coli)

Virkningen af baktericidet indeholdende nisin og 5 EDTA mod den gram-negative bakterie E. coli påvises som det fremgår af den følgende tabel IV.

17 DK 171069 B1 1—i ^ —- in o i

H O -O O

g O 00 - I H

''v m o v tn s.

i-l G d) H in

•H g O O

to o ή in ~ o » •h o jj oq o m o

S rH

I CM

*G

i—I G

O d> U 4-> 4-1

• dl ID

pq oo oo o tu r~ - i

ro CO CO (N O O

*H i—1 > <v 4-1 > G dl QJ i—1

U G

K- O dl m r, G > o - o m ocpoo^fO'

η r~\ rH i—1 i—I

ω

CQ

<

* G

O o -U o

•Η H ^ O O

G I o\° O O

[h ^ t—I rH

< ~ E-i 2

Dg o o o o W — cm n) 4-1 4-) tn tn -H -h i Γ" E~~

rH 4-1 d) O O O O

d) tD'H rH rH i—I rH

T5 X G

C Ό OJ Η X X X X

H ¢) U « G > ,V .u oooo a dl Cd G '

O ,—I Ρ3 (tf rH rH rH rH

tn s

CD

G · H CN ro H4

0 G pH C

18 DK 171069 B1

Forsøgene med og uden EDTA udføres i 20 mM tris-puf-feropløsning, pH = 8,0, ved 37°C, med et oprindeligt levedygtigt bakterieantal på 1 x 107 E. coli-celler pr. ml. Virkningerne af baktericidet måles som en funktion af den 5 procentvise bakterie-overlevelse efter 2 timer.

Ved forsøg nr. 1, jfr. kontrol, tabel IV, uden EDTA udviser nisin kun ringe meningsfyldt aktivitet til eliminering af E. coli. Ved forsøg nr. 2, jfr. tabel IV, hvor der er 20 mM EDTA til stede, udviser det baktericide præparat 10 imidlertid en væsentlig aktivitet i forhold til E. coli- -bakterierne. Aktiviteten forøges i effektivitet, når koncentrationen af nisin forøges. Kombinationen af nisin med EDTA som et baktericid viser en 100 ganges potenseret forøgelse af aktiviteten mod E. coli. Ved forsøg nr. 3 og nr.

15 4, jfr. tabel IV, kan det ses, at Triton X-100 ikke har nogen potenseret baktericid aktivitet mod E. coli. I virkeligheden synes Triton X-100 at inhibere nisin-aktivitet mod gram-negative bakterier, således som konstateret med S. typhimurium, jfr. tabel II. Den samlede forøgelse af nisin-20 aktiviteten med EDTA ophæver imidlertid i det væsentlige de inhiberende virkninger af Triton X-100, hvilke fremgår af tabel II og IV.

Det fremgår således, at baktericidet indeholdende nisin og et chelateringsmiddel, f.eks. EDTA, er et virksomt 25 næringsmiddel-konserveringsmiddel mod forskellige typer af gram-negative bakterier, selv i nærværelse af overfladeaktive midler.

Eksempel 5 3 0 Aktivitet af nisin og et chelateringsmiddel mod gram-negative bakterier (Klebsiella pneumoniae)

Virkningen af baktericidet indeholdende nisin og EDTA alene mod den gram-negative bakterie K. pneumoniae påvises som vist i tabel V.

19 DK 171069 B1

LD

oo o co o o roen o

Pi <D 4-J 4-1 <D

i—1 O Φ OH

go tn uo

H iH H

tn tu =i. >

<D

i—I Pi

C U <D

H (Dg C« > -ri

H O -U LO

iz; o I -

ro o\° fN] O

> O CN

O O CM

J H

ω

CQ

< Η

C

O o -U o •H rH --—-

Pi I o\° O O

Η X —'

<C -E-< S

Q g o o W cm

4J 4J

tjl tn -H -H t HD (U <D cji-h TJ >i Pi C TJ (D rH •H 0) 4J (0

Pi > Λί j-> r- t^ &I Q) ro C o o

O 1—i rQ ro HH

tn

S

tn

Pi · H CM

O Ih Ph C

20 DK 171069 B1

De to forsøg, et med og et uden EDTA (kontrol) udføres i 20 mM tris-puffer, pH = 8,0, ved 37°C, med et oprindeligt levedygtigt bakterietal på 107 celler af K. pneumoniae pr. ml. Virkningen måles som en funktion af den procentvise 5 bakterie-overlevelse efter 2 timer.

Ved forsøg nr. 1, jfr. kontrol, tabel V, uden EDTA udviser nisin kun ringe meningsfyldt baktericid aktivitet mod K. pneumoniae. Ved forsøg nr. 2, jfr. tabel V, hvor der er 20 mM EDTA til stede, udviser baktericidet imidlertid en 10 væsentlig aktivitet mod K. pneumoniae. Aktiviteten forøges i effektivitet, når koncentrationen af nisin forøges.

Eksempel 6

Nisin-aktivitet mod gram-negative bakterier (Salmonella 15 typhimurium) er afhængig af koncentrationen af chelaterings-middel

De i tabel VI angivne data viser, at den forøgede aktivering af nisin mod gram-negative bakterier (S. typhimurium) afhænger af koncentrationen af EDTA i enten 50 mM 20 natriumacetat, pH = 5,0, eller i 20 mM tris, pH = 8,0, ved 3 7 0 C . 1 21 DK 171069 B1 o m o o i i ^ ro

I—I

CN ^ m o ^ ko

O ' - H

— un ro o rH o

§ M

E dJ

— B «·

H O

<J 4-> fN O <i<

tr* - - I

Q o pj in o o

Cx3 i—I H rH i—I

Sh

(D

4J

ΜΗ 0) r~ ^ -vj·

o tu - I -I

- ω oo o oo o

CN r-H ro i—I H

ω > d> i—I ^H d) > ^

CN O I I

- I O I O

O C/} rH rH

*H

> 4-1 ΰ tu u M 0

ζ Jh O U) O

^ O CU O - O

J Η ° H

ω

CQ

C

Fh

C i—I

-H g ω \ o o

•H tJl O O O O

S =t H rH

4J 4-J

tn σι Ή Ή i i—I -JJ <1)

<D Cn*H ^ KD KD VD

TJ >, U O O O O

£h G) rH rH rH rH rH

H (D 4J (C

!h > Λί 4J xxxx

Λ d) fO C

O Η Λ cC ro ro in m o o o o td - O* ui in to oj tn s m 5-1 · rH cn ro O V4

Cn C

22 DK 171069 B1

Ved forsøg nr. 1 og nr. 3, jfr. kontrollerne, tabel VI, hvor der anvendes EDTA-koncentrationer på op til 100 mM uden nisin, iagttages der kun ringe meningsfyldt aktivitet mod S. typhimurium ved enten pH = 5,0 (nr. 1) eller pH = 5 8,0 (nr. 3) . I forsøgene nr. 2 og nr. 4, jfr. tabel VI, hvor der er 100 μg nisin pr. ml til stede i kombination med EDTA, udviser baktericiderne imidlertid en væsentlig aktivitet mod S. typhimurium. Aktiviteten af baktericiderne er af samme størrelsesorden både ved en sur pH-værdi (5,0) 10 og ved en basisk pH-værdi (8,0), til trods for den kendsgerning, at aktiviteten af nisin alene mod gram-positive bakterier er optimal ved en pH-værdi på 5,0.

Forøgelsen af nisin-aktiviteten med EDTA er koncentrationsafhængig, idet den er optimal i området fra 0,2 mM 15 til 10 mM ved pH-værdierne 5,0 og 8,0. Ved koncentrationer højere end 10 mM EDTA bliver forøgelsen af nisin-aktiviteten med EDTA overraskende formindsket. Formindskelsen af aktiveringen er signifikant større ved en pH-værdi på 8,0 end ved en pH-værdi på 5,0.

20

Eksempel 7

Nisin og et chelateringsmiddel mod gram-negative bakterier (S. typhimurium)

Forøgelsen af nisin-aktiviteten med EDTA mod gram-25 -negative bakterier i nærværelse af biologisk væv påvises med S. typhimurium på kyllingsmuskler og fremgår af den følgende tabel VII.

23 DK 171069 B1 r* σι

O O (NO

o I - I

h o cn o CN ro o o

O I - I I

ro O O

ro o in O i - i ·. i

CN O O

KO ro H h* o

^ O CN O

o u ko o m o o η a>

E

•H ^

4J rO O

o σι o

CN O O O

I - I -

ro U O O O

0)

4J

4H

0)

ftf H CN I

0) o o o

0} i - I - H

rH r—I O O V

H Q) § > Η E 0)

H — rH

> ^H CN

<0 o

J H > LT) (NO

W Q ro O o o o

m ω * i - I

rtl o co o o o

H -H

>

JJ

c 0) υ O σ»

rH H CN H O

Λ I - I ~ o o o o <c

CO

PQ

c CN Ή αο η o ιη o £ - o 3

η σ h r- o rQ

O rH rH

rd £ 0) 3

rH H

rH φ

C! rH O) CO

•H £ Λ U (1)

CO \ O O O CO

•Htp o σ o o o d) X

S ^ ro ro ro TJ 0 c 0) <*°

tjl H

c W μ

Λ <D

X) χ|

d) rH

> o I Λ

0) (LI

x xi o o o o o λ: c

a - - ~ ~ - HH

a ld in oo oo oo (ΒΛ

Cn s

CO

L-j · Η (M ro -tf in o n fe c 24 DK 171069 B1

Inkuberinger udføres i enten 50 mM natriumacetat, pH = 5,0, eller i 20 mM tris, pH = 8,0, ved 37°C.

Terninger af kyllingsmuskel renses med natriumhypo-chlorit og povidon-iod forud for anvendelsen. Til podning af 5 vævet dyppes terningerne af kyllingsmuskel i en cellesuspension med 10® celler af S. typhimurium pr. ml i 20 mM tris-HC1, pH = 8,0. Overskud af fugtighed fjernes fra de neddyp-pede terninger ved afdræning. Kyllingeprøverne anbringes i tilstrækkelig puffer indeholdende nisinpræparatet til dækning 10 af vævet og inkuberes i 2 timer ved 37°C, hvorefter vævet fjernes til en tilstrækkelig mængde phag-puffer til dækning af vævet. De bakterier, der forbliver i forsøgsopløsningen, opsamles ved centrifugering, vaskes med phag--puffer og kombineres med bakterier, der er afvasket fra 15 vævet med phag-puffer. De kombinerede prøver, der betegnes "ikke-vedhængende" celler, seriefortyndes, og alikvoter på 100 μΐ udplatteres af de overlevende bakterier.

Ved forsøg nr. 1 og nr. 3, jfr. tabel VII, i fraværelse af nisin ved en pH-værdi på enten 5 eller 8 har EDTA 20 alene ingen signifikant virkning på overlevelsen af S. typhimurium. Ved forsøg nr. 2 og nr. 4, jfr. tabel VII, hvor der er 300 μg nisin pr. ml til stede, udviser baktericiderne imidlertid en væsentlig aktivitet mod S. typhimurium på kyllingemuskel ved såvel pH = 5,0 som ved pH = 8,0.

25 Forsøgeisen af nisin-aktiviteten med EDTA er koncen trationsafhængig, idet den optimale koncentration ligger i området fra 0,3 til 10 mM EDTA ved begge pH-værdier, 5,0 og 8,0. Ved koncentrationer højere end 10 mM EDTA ved pH = 8,0 formindskes aktiveringen af nisin med EDTA. Som det 30 imidlertid fremgår af forsøg nr. 5, jfr. tabel VII, udtrykkes effektiviteten af nisin mod S. typhimurium på kyllingemuskel imidlertid i hele området af EDTA-koncentrationer op til 100 mM i nærværelse af 1,0% okseserumalbumin ved en pH-værdi på 8,0.

35 Baktericider indeholdende nisin og lave koncentra tioner af chelateringsmiddel, f.eks. EDTA, i området fra 0,1 25 DK 171069 B1 til 20 mM, kan således være yderst virksomme til eliminering eller hindring af forurening af næringsmidler med gram-negative bakterier.

5 Eksempel 8

Titrering af nisin-aktivitet mod gram-negative bakterier (S. tyhphimurium)

Ved den optimale koncentration af chelateringsmiddel påvises effektiviteten af baktericidet i tris-puffer mod 10 gram-negative bakterier at være væsentlig, således som det fremgår af tabel VIII.

26 DK 171069 B1 O V£> O - i

H rH

O

O i H

ro V

H

ro O

O H O

Η LO

LO

O O

ro U O

0) £ Ή

4-> H

O O

- (N I

H O

0)

4J

M-4 — 0)

rH CO

B ro 0» O

\ tø I

tr O H O

3 QJ

H ^ > LJ 0»

LJ G H

Γ -H ^ ^ tø 0> j -Η £> g S Η 0 ( r- § o “ ' o * >

4J

G

0)

U

0 U O ro o Cu o vo

H

O

< ~

W i· OH

PQ

< ~ H S o Q E o -

W — H

4J -U

tn tn

•Η Ή I

i—I 4-> <D

0) tj) -H <XI "^0 Ό >ί 0 o o

C T) (LI H HH

-H 01 JJ Λ

U > Μ V XX

04 O) to C

O rH Λ (0 Φ U) tn s ω

^4 Η (M

O o P c 27 DK 171069 B1

Det fremgår af forsøg nr. 2 i tabel VIII, at så lidt som 0,3 μg nisin pr. ml med 1,0 mM EDTA i 20 mM tris ved pH =8,0 i nærværelse af 1% okseserumalbumin (BSA) signifikant formindsker overlevelsen af S. typhimurium. Baktericidet er 5 lige så aktivt mod gram-negative bakterier som nisin alene er aktivt mod gram-positive streptococcer.

Eksempel 9

Titrering af nisin-aktivitet mod gram-negative bakterier 10 (S. typhimurium)

Ved den optimale koncentration af chelateringsmidlet påvises effektiviteten af et baktericid mod gram-negative bakterier i nærværelse af biologisk væv med S. typhimurium på kyllingemuskel, og resultaterne fremgår af tabel IX.

DK 171069 B1 S 28 o o

O I

ro o C" i—I o E o \ o tj o i o 3 CM Vi

CD

C E oo

•H -H O

CQ 4J O

-H O

S O CN I O

rH

Vi

CD

4J

4H

<D

VD

(U CN

O CO I

rH i—I O

0) >

CD

rH

v

CD

> O o t"

O O CN

CQ H ♦H >

V

d

(D

u o 2 < — Vi o

M CQ o\° Οι O

dl ω m < Η <C — Η S o Q E o -

W ^ rH

4-) JJ

Cn tn

•Η Ή i rH 4J CD

0) DVrl [" l> T3 >ί Vi o o

d Ό (D H HH

H CD -U fC

Vi > M 4J XX

a (D (0 d O Ή XJ ro ro ro o o ffi ^ a oo oo

Cn

S

CQ

Vi · h cn O V fc d 29 DK 171069 B1

Terninger af kyllingemuskel renses med natriumhypo-chlorit og povidon-iod forud for anvendelsen. Til podning af vævet dyppes terninger af kyllingemuskel i en cellesuspension indeholdende 10® celler af S. typhimurium pr. ml i 5 20 mM tris-HCl, pH = 8,0. Overskud af fugtighed fjernes fra de neddyppede terninger ved afdræning. Vævet anbringes i tilstrækkelig puffer indeholdende nisinpræparaterne til dækning af vævet og inkuberes i 2 timer ved 37°C, hvorefter vævet overføres til en tilstrækkelig mængde phag-puffer til 10 dækning af vævet. De bakterier, der forbliver i forsøgsopløsningen, opsamles ved centrifugering, vaskes med phag--puffer og kombineres med bakterier, der udvaskes fra vævet med phag-puffer. De kombinerede prøver, der betegnes som "ikke-vedhængende" celler, seriefortyndes, og alikvoter på 15 100 μΐ udplatteres til bestemmelse af de overlevende bak terier .

Eksempel 10

Nisin-EDTA- og methylparaben-aktivitet mod gram-negative 20 bakterier (S. typhimurium)

Et baktericid indeholdende nisin og EDTA, der kombineres med et kendt konserveringsmiddel til næringsmidler, methylparaben, påvises at være eksceptionelt virksomt mod gram-negative bakterier, jfr. tabel X.

30 DK 171069 B1 u ^ i o φ i o

- CO OH

Hi—I Η V

Q) > d)

rH

C kj ro

d) d> Sh I

X) H > d) O O

dj 0 6 - H

ko -Η Η V

dj CQ -l-J

O -H

H > CN

> -O

x: β k JJ d) d) ro d) U jJ co o S O H ' '

kj d) H O

o\° O p H

X

w

CQ

<

H O

X! ld < - H 2 o o il

P 6 HH

to — æ a

kJ

' d)

kj I—I

dJ i—I

G Ή d)

-H i—I HU

CD 6 O G

•H S O O a <D

'Z tn ro k fl

dj G

Η d) o tn u c JJ JJ dj %

tn tn i X

-H -H I « fl

H JJ tu 2 II

d) tn-H CD O > 73 kl O O S' d T3 d) i—I HH 6 d>

-H CD JJ dS M

k-ι > λ; jj xx ox:

a d) dj C LD H

OrHXJdJ roro Xtu tn s

CD

kJ · H CM

O kJ

Cu C

31 DK 171069 B1

Terninger af kyllingemuskel renses med natriumhypo-chlorit og povidon-iod forud for anvendelsen. Til podning af vævet dyppes terninger af kyllingemuskel i en cellesuspension med 108 celler af S. typhimurium pr. ml i 50 mM 5 natriumacetatpuffer med en pH-værdi på 5,0. Overskud af fugtighed fjernes fra de neddyppede terninger ved afdræning. Vævet anbringes i tilstrækkelig puffer indeholdende nisin-præparater til dækning af vævet og inkuberes i 2 timer ved 37°C, hvorefter vævet overføres til en tilstrækkelig mængde 10 phag-puffer til dækning af vævet. De bakterier, der forbliver i forsøgsopløsningen, opsamles ved centrifugering, vaskes med phag-puffer og kombineres med bakterier udvasket fra vævet med phag-puffer. De kombinerede prøver, der betegnes som "ikke-vedhængende" celler, seriefortyndes, og alikvoter 15 på 100 μΐ udplatteres til bestemmelse af de overlevende bakterier .

I forsøg nr. 1, jfr. tabel X, viser methylparaben i nærværelse af 10 mM EDTA sig at være virksomt mod S. typhimurium ved kun en koncentration på 1,0%. Ved forsøg nr. 2, 20 jfr. tabel X, hvor der er 300 μg nisin pr. ml til stede, er effektiviteten af methylparaben og nisin mod S. typhimurium imidlertid væsentligt forbedret.

Præparaterne indeholdende nisin og EDTA forbedrer på signifikant måde anvendeligheden af næringsmiddel-konser-25 veringsmidlet methylparaben. Endvidere kan baktericiderne føre til væsentlige formindskelser i koncentrationerne eller eliminere behovet for disse almindeligt anerkendte, omend mindre ønskelige næringsmiddel-konserveringsmidler såsom methylparaben.

30 32 DK 171069 B1

Eksempel 11

Nisin- og chelateringsmiddel-aktivitet mod gram-positive bakterier (Staphylococcus aureus)

Aktiveringen af nisin med et chelateringsmiddel er 5 pH-afhængig. De i tabel XI angivne data bekræfter, at nisin ved en pH-værdi på 5,0 er noget mere baktericidt virksomt mod S. aureus end nisin ved en pH-værdi på 8,0. Ved en pH--værdi på 5,0 forøger EDTA ikke nisin-aktiviteten mod S. aureus, og ved koncentrationer af EDTA højere end 10 mM 10 EDTA er EDTA inhiberende for den baktericide aktivitet af nisin. Den baktericide aktivitet af nisin aktiveret med EDTA ved en pH-værdi på 8,0 er imidlertid signifikant større end den baktericide aktivitet af nisin alene eller i kombination med EDTA ved en pH-værdi på 5,0.

DK 171069 B1 n 33

G

υ u o u 0

i—I

£ a G o

JJ O i i i O

CO rH oo Ό μ O 40 ni O (C O ID i Γ0

S co G H

•H % •Η 'Η

'rrt CN O

10 O O 00 i I

n\ Ή G rH

ϋ 0) rH

Ί3 4J E

44 \ U

y φ 3 o H 4-i r- Η φ o 00 O 03 O O 00 G - η o - o ~ ω τ3

Γ0 (Ur-1 O rH rH O <U

fO > H - >

Λ CD G

r-4 X <D o CO >4 44

S O) O 44 CO

fi E > »G

G ·Η O o CM if 00 ft II

**> CO < - Η - i - JJ

-i *H E-I H CO CO O Η Π1 te rid q -π >4 -υ a S ω > α) qj 9 -G -g -η u - a α d g g g

M CD (D E CD

-η υ r4 JJ G 44 S POOOO 00 Λί -4 44

S - G O - I - G G G

E3 O 04 r4 O Η Λ JJ a

w fC I

CD G rH

^ Cn U

<e -4 S K

JJ E I

<D ro Ti CO

Sr4 O O >i O -4 - I - I - JJ 40 >4

0> O O r4 <D JJ

DO > -4

G CD S

•Η (Η CQ E

G CD

Μ Ή i4 O

G O 4< O UO G § CN

•H O 0^0" JJ 44 > r4 r4 O C Ti 4 g g <d •G ^ a ft & ω 5 rH G -

H <D -4 O

T) 14 4-1 G CD 40 G G rH -4 X)

•4 E 4 G II

V CO O O Qi ^ co -4 cn o > o - o g æ 1—1 13 3. ro 00 G H a

(U

V ’

>i CO H G

44 <D

T3 Ih o o o o G G ffi - HG a C0 00 40 40 34 DK 171069 B1

Den baktericide aktivitet af nisin alene er rapporteret, jfr. litteraturanvisningen til Hurst, at være størst ved en pH-værdi på 5,0 eller mindre, og de i tabel XI angivne data understøtter dette. På basis af denne information an-5 tages det, at den baktericide aktivering af nisin med EDTA mod S. aureus ligeledes vil være størst ved en lavere pH--værdi. Som det imidlertid fremgår af tabel XI og i modsætning til forventningerne, jfr. tabel VI, iagttages EDTA ikke at forøge nisin-aktiviteten mod gram-positive bakterier 10 ved en pH-værdi på 5,0. Inhibering af nisin-aktivitet ved høje koncentrationer af EDTA iagttages imidlertid stadig ved en pH-værdi på 5,0. Aktiveringen af nisin med et chela-teringsmiddel foregår således kun indenfor et område af chelateringsmiddel-koncentrationer, og det er med hensyn 15 til gram-positive bakterier afhængigt af pH-værdien, idet det foretrukne pH-område ligger ved pH-værdier højere end pH = 5,0.

Eksempel 12 20 Nisin- og chelateringsmiddel-aktivitet mod gram-positive bakterier

Virkningerne af EDTA på den baktericide aktivitet af nisin ved en pH-værdi på 8,0 er ikke begrænset til S. aureus, der er et betydningsfuldt humant pathogen, men iagttages 25 også med Streptococcus mutans, der er ansvarlig for dental plaque, jfr. tabel XIIA, Listeria monocytogenes, der er et i næringsmidler forekommende pathogen, jfr. tabel XIIB, og i forbindelse med en blandet population af aksillære Coryne-form-bakterier, der bidrager til kropslugt, jfr. tabel XIIC.

35 DK 171069 B1 o o o ^

O I O O I H

rH H rH

CD O

C! o

β O β I rH CO O β I O

4J ro in ω ro β H

βω βω

SE 0) E

H 01 Ή CD 4-) 0 4-> β 'tf

O cn uo >1 O} CD

U o i cn U o i

0 rH Μ 0 H M O

υ ω βω 0 4-) -0 4->

4-> 4-1 i—1 CJ S Ή HU

& ω E o ω E o ω \ o- β \ t" Μ ω p ro ·η ω pro 4-1 O CO 4-1 ί-Ι Ο CO Η 4Π CO - rH OTi <U - Η - U Ti ροωΐΗ ω 4J οοφιο ω Τ > co > CD > co > 0 ω ο ·η ω ο 6 ι—I i—I Ο μ3 ι—I ΗΟ >4 - ^ ' ^ 4-> S ω X co m Τ Σ ω χοο ρω ε > So e>cm [J 4-> Ο ο OlirjE ΟΟΟΟΙΙ LJ-H < - CD - ri C - "tf ' ' „

?ς> η Η COlO CO £ ^4-) HH CO 00 O CO K

J -H Q -H a Π ω Q ·Η Λ ri 4J w > ο · ri 4-1 ω > S Μ 4.) Η - “ ·Η Η - S β α β η S > β ω η

S ω -uuS-H ω 4JU

^ ω UCN cm μ iJ υ ^ β æ Ό roOo fdi 4<! roOotdi •Η -Μι- (Deo β -Μι-ωω Ο Ο C4 Ο -Η -Η Ο C4 Ο -Η -Η •Η Μ μ ω Η >Η

u ω 4-) ό ω 4J

ω 4J ·η 4-) 4-> μ s υ μ s Μ ω ε ·η m ε β ^ 43 Μ *tf 43 43 Η Ο οω Η οο - ι — 4-ICN 4-) - 1-4-)04 co ο ο σι Λ! ο οίη - -Μ -Η β -Η -Ή β 4J 43 4-> •η σι ω cn co co >1 ω β >ι ω

•Η Η ΤΙ Μ ω rHTiiH

β ο αο ω S Τ3 ο r- ω S

- I- >4Η Ο 0->4Η •β ο τη ω τι ·β η ο ω τ

α η p a HP

< Ο CO 4-> β rtj 4-> β Η ο ο - σι ω Η σι ω q η ^ -η cn Q -η σ> ω η α ω η β tu -η ω -η 4-1 β Ή Τ) β β β ω β βω β Η ·Η 43 β Η -Η 43 ω -η ε ββ ω -η ε shp β co\ η a λ β ο a χ Μ Η σι Ο- Οβ Η η σι Ο-Οβ ω 13¾. ο β ι—ι ω ^¾ Γοβπ σι βι β β •Η ·Η β β 4* -¾ Μ ο ο 4ι ο ο

•Η X ·Η X

> a oo oo > a oo oo 36 DK 171069 B1

U

03

•H

(D

4-1 40 H

o (C ro (0 HG o

Λ <D

i B

ε ή i—t o s -u ε o 0 \ r- 4-1 cn) 3 ro CL) o 4-1 G G υ T3 >i ro (D co i (1) H 4-> Ό >

0 4-1 O

U <D H O

m Ό 2 0) X oo S ο ε ω

Π ε o rH 40 i—I O II

ΰ C ' (L)

^4-) E-ι H > ro o HK

j 03 Q 03 o □ -u ω r-i S ·Η S-l rH -

G3 > <D ΟΪ (T5 rH

S -H > O JJ U

M 4J 0 o C DC

JkJ ro 40 o ni i Π3 - ω - - <u co O Ή ^ O ·Η Ή 03 > g sh T3 4-1 d) 4-1

H IC 4J

U 03 X Z

h u (ΰ ε IH 0 ro Λ

a) HG O O

JJ - Dj i ~ 4-1 (N

X o o Di

ffl -Η -H

Λ 4J

D> ω G >i 0) 03 cn Ό 4

Ό o oj 0) S

O O ~ > 4H

•fC H O <D T3 CX Ή 3

rtj 4-4 iH

E-ι cn qj P -H cn W rH c

0) -H

4-i n g rt c ω ch -h ca

03 -Η ε iH G

εω \ Cl. -V

•H Dl o ro OG

0) !S =i (0 m

Dl G H

5

Ih o o •G DC - > Cu oo oo 37 DK 171069 B1

Eksempel 13

Hurtig baktericid aktivitet for nisin aktiveret med chelate-ringsmiddel

Det baktericid, der indeholder nisin sammen med EDTA, 5 er hurtigtvirkende baktericidt, hvilket illustreres af de data, der fremgår af tabel XIIIA. Suspensioner af den gram--positive bakterie S. mutans med koncentrationer på 107 celler pr. ml inkuberes i 20 mM tris-puffer, pH = 7,3, ved 37°C med et område af koncentrationer af nisin aktiveret med 10 1 mM EDTA. Suspensionerne inkuberes i forskellige tidsrum fra 0,5 til 60 minutter med baktericiderne. Den baktericide effektivitet af baktericiderne bedømmes ved bestemmelse af den procentvise overlevelse af bakterierne. Ved forøgelse af aktiviteten med EDTA er en så ringe mængde som 10 μg 15 nisin pr. ml i dette præparat i stand til at formindske den bakterielle belastning med 6 logaritmiske enheder i løbet af 1 minut.

Hurtig baktericid aktivitet er en forudsætning for en effektiv desinfektion. Præparaterne kan således forudsiges 20 at være effektive baktericider, navnlig som her påvist, som bestanddele af mundskyllemiddel, skylle- og rensemidler, tandpasta eller andre lignende tand- og mundpræparater, der er aktive mod plaque-dannende S. mutans.

Aktiviteten af nisin forøget med EDTA mod gram-nega-25 tive bakterier efter 2-3 timer er påvist i eksempel 1-7. Den hurtige baktericide aktivitet af nisin forøget med EDTA ses også mod gram-negative bakterier, og dette er illustreret ved de data, der fremgår af tabel XIIIB.

38 DK 171069 B1 HH i i nj O o o O rH rH I t I l

Μ Η V V

c fl

JJ rH

2 E

6 ^ \ II 3 CO O O HH u £3 O i—li—I (J o U ro i v v i i i r-· U <C Γ" ro 0 Eh o

U Q h tJ

0 W ns 0J

< JJ <U ^ «tf X > I—i S W iii i—i 0) E I—i ooo o - I—I t-( O (U I rH rH rH I I ~ro X JJ OH > V V V H ~ M ' <U r-

i-O H i—I

w O sh μ ii CQ 0 T) 0) (1) <6 0J > CN "tf Hffi Η E O oii i—i ώ

JJ O O O (D

<D i—I m ~ Η Η I U'

JJ £ Γ0 -rlllOVV rH

H \ > (DU

> tn -U Cn EG

H 3. c -Hl jj <u jj m M Co ro tn η (0 -η O ro o Sh

(0 Sh LD O O V JJ

Ό -H (¾ » « v <D

H Sh i i o o i o >S

U <D E

H i—I

M o

0) rH CN

jj m

W rij O O JJ -H

fl Η o i i o i i ο C

Λ Q η h ro to a cd

iH HH U

0 Ό r0 S

HH 0) HH

E Cn Ti

T) C C

H D -ri 0 0) rH Sh

Λ M r- rH QJ

μ μ in f« cn

0 W I QJ 4J C

HH JJ (0 JJ rH -H

CO CnjJ 0 iH

QJ iH C C Sh QJ

Μ 0 -H C JJ Λ to HH Sj -rl LD fi 3

H 0) E - O M

JJ C X!— OHrouooo X G

QJ*Hp HroHDfOH

CM M V

Η ·Η C -H

WC H JJ

39 DK 171069 B1 co o

i< O O

H o P h m o w ηΰ -η <D E ιλ

6 H

H O

4J O - 1) ro Ci o

M <D

M 4-)

W 4-1 H

U CD E

CO ro \ (-1 (UH d ·

0 CQ O CM U

4-1 O i—I - U O

H <D O ["· C > t> ro

•ri (DO

CO rH H Ti

•Η Cl <D

PQ ti CD X > H t> t~~

M 4-1 rH O ro O O

M (0 E ' ' X \ ro CQ O H Γ"

•ri Cr -H

P H 3 > ·· II

W 0 4J rH

CQ U C C IH H

<C -H <D 4-1 &4

E—1 ffl CQ υ C

Η -Η O 0 O Π5

£J S - Cl LD (D CO

0 i—I CD Ή -H

•H 4 4

M (D 4J

<D 4J

A M S

U (0 E

CO Λ

Cd ro o o

' o D (N

Ό o h Cn

0 -Η -H

É -C

Cn co

4J >4 <D

α) c

4J O <D S

•ri O O > 4H

> Η (DO

•ri i—I P

4J

M 4-> C

nj tn (D

-H tj)

Ό rH C

H (D -H

U D 4

ri d (D

U -Η Λ <D Cd

4J CD -V

M Od

(β (C M

X) < σι η

H Q

jj ω (η o d s a eh 40 DK 171069 B1

Eksempel 14

Virkning af divalente kationer på EDTA-forøgeIse af nisin--aktivitet

Divalente kationer bindes til EDTA og andre chelate-5 ringsmidler og skulle forventes at neutralisere aktiveringen af nisin med EDTA. Som det imidlertid fremgår af de i tabel XIV angivne data, forøges den baktericide aktivitet af nisin mod S. mutans med 1 mM EDTA, selv i nærværelse af 1 mM Ca2 + --ion. Kun ved en koncentration på over 3 mM er Ca2 + -ionen 10 inhiberende for EDTA-aktiveret nisin. Dette er af særlig betydning ved anvendelser til mundvaske- eller -skyllemidler, hvor calciumionkoncentrationerne er relevante.

41 DK 171069 B1 g

W

Ό

<U

ε jj 0) M oo oo cn

<D o H

i—I V£> i—1 •ri fXj

JJ

MG Γ-Η ffl *H rH £ £ O O \

G o o G

Η H O O 4H U

M - - U o •Η ro Ih O O 0- G (1) CM Γ0

JJ O

4-1 4-1 rH 03 (C φ ^ 0) O -tf X >

> Μ (I) o I

H C O CG O O O £

X (0 »rH » Η »G

JJ H CL) O V H Ih J 3 > Φ W £ <D ·· cq CQ i—I '—I Ih rfj CO Ih ro Π3 Φ

E-hG <U oj O ^ 4JjJ

U > in o i Cm

U roO ooo (i O

0 » - » i—i 0) 4H

U o cq oov -ria) 0 -h u >

JJ S > Φ rH

O« £ jj jj fd cu c cm λ; λ; M og φ ^ (ϋ JJ i—I U O o\°

W U H O O O

rd - Jh ' JJ H

T3 G U o Oj o cn 0 0 Ή Ή

£ ·Η JJ

jj οι σ tn cn JJ G ^ rH ^ >Ί Φ Φ o o i T3 Ih jj ooooo φ 5>

H JJ O » » » H >4H

> G O rHCNIOOV ΦΤ3 ri φ rH 3

JJ r-1 <J

G E-ι JJ >h ifl > Q tn φ H pq -π tn Ό Ό OJ rH β

ri Π3 Φ *H

U 4H 2 fl 4 ri Ιβ G Φ

Ih S -h Λ

φ Φ £ Ih G

JJ CO Qa M

H H o G

cc φ ω g h .O Ih en £

Η H G

JJ tø -H WWW

IhG cq ororooo G -ri ro o æ ή s h 42 DK 171069 B1

Eksempel 15

Nisin- og overfladeaktivt middel-aktivitet mod gram-positive bakterier

Den baktericide aktivitet af nisin kan også forøges 5 signifikant ved kombination med et overfladeaktivt middel alene. Dette illustreres bedst ved en begrænsende nisinkon-centration (0,2 μg/ml) som vist i tabel XVA. Ved koncentrationer op til 0,1% har det overfladeaktive middel monolaurin af næringsmiddelkvalitet kun ringe signifikant baktericid 10 aktivitet mod Streptococcus agalactiae i det komplekse medium mælk. Nisin i koncentrationer på op til 0,2 μg/ml udviser ligeledes heller ingen signifikant baktericid aktivitet i mælk. Imidlertid er kombinationen af de to midler, 0,1% monolaurin og nisin i en koncentration på 0,2 μg/ml, yderst 15 potent mod S. agalactiae. Dette baktericid er mere end 100 gange mere aktivt end det, der måtte forventes med hensyn til en additiv effekt, og 10.000 gange mere aktivt end hver af bestanddelene individuelt. Når således anvendelsen af nisin er begrænset gennem dette stofs tilgængelige aktivitet, 20 kan det forventes, at et baktericid indeholdende nisin sammen med et overfladeaktivt middel vil være mere anvendeligt.

Et eksempel på et tilfælde, hvor anvendelsen af nisin er begrænset af dette stofs tilgængelige aktivitet, er illustreret af de data, der er angivet i tabel XVB. Omend 25 nisin, og navnlig baktericidet indeholdende nisin og EDTA, er baktericidt virksomt mod L. monocytogenes, viser de i tabel XVB angivne data, at den tilgængelige nisinaktivitet mod denne organisme er begrænset i et sammensat medium såsom mælk. Baktericidet sammensat af nisin sammen med glyceridet 30 monooleat er imidlertid virksomt i mælk mod dette i næringsmidler forekommende pathogen, omend monooleatet i sig selv ikke har nogen baktericid virkning mod den nævnte organisme.

43 DK 171069 B1

TABEL XVA

Baktericid nisin-aktivitet mod Streptococcus agalactiae i mælk ved 37°C

(Aktivering af nisin med monolaurin) 5--

Nisin Monolaurin (μg/ml) (%) 0 0,01 0,1 10 Procentvis overlevelse efter 2 timera 0 100 100 4,5 0,02 100 100 0,2 0,2 2,2 0,05 0,0008 15 aOprindeligt levedygtigt bakterieantal: 6,0 x 107 cfu/ml Inkuberinger udføres i mælk ved 37°C.

TABEL XVB

Baktericid nisin-aktivitet mod Listeria monocytogenes i 20 mælk ved 37°C

(Aktivering af nisin med monooleat)

Nisin Monooleat {μg/ml) (%) 25 0 0,1 1,0

Procentvis overlevelse efter 2 timera 0 100 67 63 100 0,56 10“3 10“4 3 0 -- aOprindeligt levedygtigt bakterieantal: 5,0 x 107 cfu/ml Inkuberinger udføres i mælk ved 37°C.

Claims

1. Præparat, kendetegnet ved, at det indeholder et lanthionin-holdigt bacteriocin i kombination med et chelaterings- og/eller overfladeaktivt middel.

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det lanthionin-holdige bacteriocin er valgt fra gruppen bestående af nisin, subtilin, epidermin, cinnamycin, duramycin, ancovenin og Pep 5.

3. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at chelateringsmidlet er valgt fra gruppen bestående af alkyldiamin-tetraacetater, CaEDTA, Na2CaEDTA, EGTA og citrat.

4. Præparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at alkyldiamin-tetraacetatet er EDTA, og at bacterio- 15 cinet er nisin.

5. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det overfladeaktive middel er valgt fra gruppen bestående af Triton-præparater, Tweens, glycerider, fedt syrer, emulgeringsmidler, kvaternære forbindelser, amphotere 20 og anioniske overfladeaktive midler.

6. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det tillige indeholder et næringsmiddel-konserveringsmiddel .

7. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at det tillige indeholder et bærestof.

8. Præparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det lanthionin-holdige bacteriocin er valgt fra gruppen bestående af nisin, subtilin, epidermin, cinnamycin, duramycin, ancovenin og Pep 5, og chelateringsmidlet er valgt 30 fra gruppen bestående af alkyldiamin-tetraacetater, EGTA og citrat, og er til stede i sådanne mængder, som forøger den antibakterielle aktivitet af præparatet overfor mindst én af bakterierne valgt fra gruppen bestående af Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Strep-35 tococcus agalactiae, Coryneform-bakterier, Salmonella typhi-murium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas DK 171069 B1 aeruginosa, Bacterioides gingivalis og Actinobacillus acti-nomycetescomitans.

9. Præparat ifølge krav 8, kendetegnet ved, at alkyldiamin-tetraacetatet er EDTA.

10. Præparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det overfladeaktive middel er valgt fra gruppen bestående af Triton-præparater, Tweens, glycerider, fedtsyrer, kvaternære forbindelser, emulgeringsmidler, amphotere og anioniske overfladeaktive midler og til stede i en mængde, 10 der er tilstrækkelig til at forøge den antibakterielle aktivitet af præparatet overfor mindst én af bakterierne fra gruppen bestående af gram-negative og gram-positive bakterier .

11. Præparat ifølge krav 8, kendetegnet 15 ved, at koncentrationen af nisin ligger mellem ca. 0,1 og ca. 300,0 μg/ml, og at koncentrationen af chelateringsmidlet ligger mellem ca. 0,1 og ca. 20 mM.

12. Præparat ifølge krav 10, kendetegnet ved, at koncentrationen af overfladeaktivt middel ligger 20 mellem ca. 0,01 og ca. 1,0%. 25 30 35