SK277796B6

SK277796B6 - Agent containing nisine for using as bactericide with extended range

Info

Publication number: SK277796B6
Application number: SK689789A
Authority: SK
Inventors: Peter Blackburn; June Polak; Sara-Ann Gusik; Stephen Rubino
Original assignee: Peter Blackburn; June Polak; Sara-Ann Gusik; Stephen Rubino
Priority date: 1989-12-06
Filing date: 1989-12-06
Publication date: 1995-03-08

Abstract

Invention describes bacteriocine compositions of nisine or another lantionine containing bacteriocines in combination with other nonbactericide matters. When bacteriocine preparations are connected with suitable carrier and every component is present in mass sufficient for the efficiency of preparate against gramnegative bacteries except grampositive bacteries, then will be gained the quickly effective bactericide with extended range suitable for different applications.

Description

Vynález sa týka prípravku obsahujúceho nisín na použitie ako baktericídu. Nisín je polypeptid majúci antibakteriálne vlastnosti a je priamo produkovaný rôznymi kmeňmi baktérií Streptococcus lactis. Je známy ako konzervačné činidlo potravín inhibujúce vonkajší rast spór určitých grampozitívnych Bacilli.The invention relates to a composition comprising nisin for use as a bactericide. Nisin is a polypeptide having antibacterial properties and is directly produced by various strains of Streptococcus lactis. It is known as a food preservative inhibiting the external spore growth of certain Gram-positive Bacilli.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Hoci sa niekedy chybne a celkom nepresne pokladá za antibiotikum, je nisín presnejšie klasifikovaný ako bakteriocín, to znamená, látka bielkovinovej povaliy produkovaná baktériami, majúci antibakteriálnu účinnosť len nedruhy blízko príbuzné baktériám, ktoré ho produkujú. Nisín je prirodzene sa vyskytujúca konzervačná látka, ktorá bola v nízkych koncentráciách nájdená v mlieku a syroch a predpokladá sa, že je celkom netoxická a nealergizujúca pre človeka.Although sometimes mistaken and quite inaccurate is considered to be an antibiotic, nisin is more accurately classified as bacteriocin, that is, a proteinaceous substance produced by bacteria, having antibacterial activity only of species closely related to the bacteria that produce it. Nisin is a naturally occurring preservative found in milk and cheese at low concentrations and is believed to be totally non-toxic and non-allergenic to humans.

Novo bol nisín uznaný FDA ako neškodný pre použitie vo forme priamej potravinovej prísady v pasterizovaných syrových nátierkách a pasterizovaných nátierkách z topených syrov a pasterizovaných nátierkách z topených syrov s ovocím, zeleninou alebo mäsom. Navyše s ohľadom na to, že ide o polypeptid, sú každé rezíduá nisínu v potravinách rýchlo strávené.Novel has been recognized by the FDA as harmless for use as a direct food additive in pasteurized cheese spreads and pasteurized spreads of melted cheese and pasteurized spreads of melted cheese with fruit, vegetables or meat. In addition, since it is a polypeptide, any nisin residues in foods are rapidly digested.

Súhrn vlastnosti nisínu je uvedený v práci Hursta A., Advances in Applied Microbiology 27: 85-123 /1981/. Táto publikácia uvádza všeobecné poznatky o nisíne. Nisín produkovaný baktériami Streptococcus lactis je obchodne dostupný ako nie čistý prípravok Nisapin , vyrábaný firmou Aplin & Barrett Ltd., Dorset, GB, a je možné ho získať izoláciou prirodzene sa vyskytujúceho nisínu z kultiir Streptococcus lactis a koncentrovaním nisínu známymi postupmi. Uvádzané sú aj spôsoby výroby nisínu s použitím iných druhov Streptococcus. Pozri Gonzales a spol., US patent č. 4716115, vydaný 29. 12. 1987. Tiež by bolo možné vyrábať nisín technológiou rekombinácie DNA.A summary of nisin properties is given in Hurst A., Advances in Applied Microbiology 27: 85-123 (1981). This publication provides general knowledge of nisin. Nisin produced by Streptococcus lactis is commercially available as a non-pure Nisapin preparation manufactured by Aplin & Barrett Ltd., Dorset, GB, and can be obtained by isolating naturally occurring nisin from Streptococcus lactis cultures and concentrating nisin by known methods. Methods of making nisin using other Streptococcus species are also disclosed. See Gonzales et al., U.S. Pat. No. 4716115, issued Dec. 29, 1987. It would also be possible to produce nisin by recombinant DNA technology.

Nisín bol úspešne použitý ako konzervačný prostriedok pri mliečnych výrobkoch, ako sú topené syry, smotana a mlieka. Použitie nisínu pri topených syroch bolo predmetom patentov v poslednej dobe. Pozri US patent č. 4584199 a 4597972. Použitie nisínu na inhibíciu rastu určitých grampozitívnych baktérií je veľmi dobre dokumentované. Jednako len celkom úspešnému a prijateľnému použitiu nisínu ako konzervačného prostriedku potravín dosiaľ bránil názor, že nisín nie je účinný voči gramnegatívnym a mnohým grampozitívnym baktériám. Gramnegatívne baktérie sú takmer vždy prítomné v spojení s grampozitívnyini baktériami a sú hlavným zdrojom kontaminácie a znehodnotení potravín. Pozri Taylor, US patent č. 5584199, vydaný 22. apríla 1986, a TaylorUS patent č. 4597972, vydaný 1. júla 1986, Tesi a Sandine, Conjugal Transfer of Nisín Plasmid Genes from Streptococcus Lactis 7962 to Leuconostoc Dextranicum 181, Applied and Environmental Microbiology, február 1987, str. 352: A Naturel Preservative, Food Engineering Inť 1, máj 1987, str. 37-38: Focus on Nisin'', Food Manufacture, marec 1987, str. 63.Nisin has been successfully used as a preservative in dairy products such as cheese, cream and milk. The use of nisin in melted cheeses has recently been the subject of patents. See U.S. Pat. 4584199 and 4597972. The use of nisin to inhibit the growth of certain Gram-positive bacteria is well documented. However, the entirely successful and acceptable use of nisin as a food preservative has hindered the idea that nisin is not effective against gram-negative and many gram-positive bacteria. Gram-negative bacteria are almost always present in conjunction with gram-positive bacteria and are a major source of food contamination and degradation. See Taylor, U.S. Pat. No. 5,584,499, issued April 22, 1986; 4597972, issued July 1, 1986, Tesi and Sandine, Conjugal Transfer of Nisin Plasmid Genes from Streptococcus Lactis 7962 to Leuconostoc Dextranicum 181, Applied and Environmental Microbiology, February 1987, p. 352: A Naturel Preservative, Food Engineering Int'l, May 1987, p. 37-38: Focus on Nisin '', Food Manufacture, March 1987, p. 63rd

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Na rozdiel od predchádzajúcich poznatkov bolo teraz zistené, že prípravky obsahujúce nisín v kombinácii s rôznymi nebaktericídnymi prostriedkami majú zvýšenú baktericídnu účinnosť voči gramnegatívnym baktériám rovnako ako zvýšenú účinnosť voči širšiemu spektru grampozitívnych baktérií, ako nisín samotný. Zvýšená baktericídna účinnosť voči grampozitívnym baktériám sa prejavuje v širšom rozmedzí pH, ako sa prv uvádzalo. Vynález poskytuje bakteriocínové kompozície nisínu alebo iných lantionín obsahujúcich bakteriocínov v kombinácii s rôznymi nebaktericídnymi látkami, napríklad komplexotvomými činidlami alebo povrchovoaktívnymi látkami. Vynález ďalej poskytuje tieto kompozície /prípravky/, rozpustené alebo suspenzované vo vhodnom nosiči so zvýšeným širokým spektrom baktericídnej účinnosti.Contrary to the foregoing, it has now been found that formulations containing nisin in combination with various non-bactericidal agents have enhanced bactericidal activity against gram-negative bacteria as well as increased activity against a broader spectrum of Gram positive bacteria than nisin alone. The increased bactericidal activity against Gram-positive bacteria manifests over a wider pH range than previously reported. The invention provides bacteriocin compositions of nisin or other lanthionine-containing bacteriocins in combination with various non-bactericidal agents, such as complexing agents or surfactants. The invention further provides such compositions (formulations) dissolved or suspended in a suitable carrier with increased broad spectrum bactericidal activity.

Konkrétne bolo zistené, že roztok, obsahujúci asi 0,1 Ug/ml až 300 pg/ml v prítomnosti asi 0,1 mM až 20 mM kompexotvomého činidla, napríklad EDTA, prakticky eliminuje rast gramnegatívnych baktérii, ako sú Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Baktrioides gingivalis, Actinobacillus actinoinycetescomitans a Klebsiella pneuinoniae a je účinnejší voči grampozitívnym baktériám, ako je Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Streptococuus agalactiae a Coryneform bacteria, ako nisín samotný. Hoci bolo zvýšenie účinnosti nisínu prítomnosťou komplexotvorného činidla závislé od koncentrácie činidla, koncentrácie EDTA prevyšujúce 20 mM inhibovali napriek očakávaniu baktericídnu účinnosť nisínu. Predsa len v prítomnosti bielkovinového nosiča a polyvalentných polymérov, ako je sérový albumín, kolagén, kasein a keratín, bola inhibícia nisínu vyššími koncentráciami významne znížená, a tým sa rozširuje užitočný rozsah zvýšenia účinnosti nisínu pomocou EDTA.In particular, a solution containing about 0.1 µg / ml to 300 µg / ml in the presence of about 0.1 mM to 20 mM of a complexing agent such as EDTA has been found to virtually eliminate the growth of gram-negative bacteria such as Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Baktrioides gingivalis, Actinobacillus actinoinycetescomitans and Klebsiella pneuinoniae and is more effective against Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes alone, Streptococeus c. Although the increase in the activity of nisin by the presence of the complexing agent was dependent on the concentration of the agent, concentrations of EDTA in excess of 20 mM inhibited the bactericidal activity of nisin despite the expectation. However, in the presence of a protein carrier and polyvalent polymers such as serum albumin, collagen, casein, and keratin, inhibition of nisin by higher concentrations was significantly reduced, thereby extending the useful range of increasing the efficacy of nisin by EDTA.

Bolo tiež zistené, že roztok obsahujúci 0,1 pg/ml až 300 pg/ml nisínu a asi 0,01 mM až 20 mM komplexotvomého činidla vykazuje ďalšie zvýšenie účinnosti nisínu voči gramnegatívnym a grampozitívnym baktériám v prítomnosti asi 0,0) % až 1,0 % povrchovoaktívnej látky. Navyše bolo zistené, že v prítomnosti samotnej povrchovoaktívnej látky má nisín zvýšenú účimtosť voči grampozitívnym baktériám.It was also found that a solution containing 0.1 pg / ml to 300 pg / ml nisin and about 0.01 mM to 20 mM complexing agent showed a further increase in nisin activity against gram-negative and gram-positive bacteria in the presence of about 0.0% to 1%. 0% surfactant. In addition, it has been found that nisin has an increased susceptibility to Gram-positive bacteria in the presence of the surfactant itself.

V predloženom vynáleze vhodné komplexotvomé činidlá obsahujú, ale nie sú obmedzené len na ne, EDTA, CAEDTA, CaNaiEDTA a ďalšie alkyldiaminotetraacetáty, EGTA a citrát. Povrchovoaktivne látky, používané ako čistiace prostriedky, vhodné na kombináciu s nisinom s alebo bez EDTA obsahujú, ale nie sú obmedzené len na ne, neinogénne tenzidy Tweeny, Tritóty a glyceridy, ionogénne tenzidy, ako sú mastné kyseliny, kvartéme zlúčeniny, aniónové tenzidy, ako je dodecylsulfát sodný a amfotéme tenzidy, ako je kokamidopropylbetain a emulgátory.In the present invention, suitable complexing agents include, but are not limited to, EDTA, CAEDTA, CaNaiEDTA and other alkyldiaminotetraacetates, EGTA and citrate. Surfactants used as cleaning agents suitable for combination with nisin with or without EDTA include, but are not limited to, non-inogenic surfactants Tweens, Tritotes and glycerides, ionic surfactants such as fatty acids, quaternary compounds, anionic surfactants such as is sodium dodecyl sulfate and amphoteric surfactants such as cocamidopropyl betaine and emulsifiers.

Pretože grampozitívne a gramnegatívne baktérie sa nachádzajú takmer vždy v potravinách spoločne, účinnosť nisínových prípravkov na gramnegatívne baktérie, ako sú Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella pnetunoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gingivalis, Actinobacillus actinoinycetescomitans a ďalšie gramnegatívne patogény a grampozitívne baktérie, bude mať veľké uplatnenie. Tieto bakteriocidy sú predovšetkým vhodné na obmedzenie a prevenciu kontaminácie surovín pripravovaných potravín a nápojov bakteriálnymi patogémni a ostatnými znehodnocujúcimi mikrobálnymi organizmami. Možné použitie sa týka ošetrení mäsa, najmä hydiny, vajec, syrov a rýb a ošetrenia obalov potravín a manipulačného zariadenia. Ďalšie použitie majú ako konzervačný prostriedok potravín, a to topených syrov, smotany, mlieka, mliečnych výrobkov, pri spracovaní hydiny, rýb, mäsa, zeleniny a v mliekárenskom a potravinárskom zariadení. Použitie nisínových prípravkov nie je obmedzované len na použitie pri potravinách a môže byť vhodné v každej situácii, pri ktorej je nutné alebo žiaduce eliminovať gramnegatívne a grampozitívne baktérie.Since Gram-positive and Gram-negative bacteria are found almost always in food together, the efficacy of nisin preparations on Gram-negative bacteria, such as Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella pnetunoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gingivalis and other active substances, application. These bacteriocides are particularly suitable for reducing and preventing the contamination of the raw materials of prepared foods and beverages by bacterial pathogens and other degrading microbial organisms. Possible uses relate to the treatment of meat, in particular poultry, eggs, cheese and fish, and the treatment of food packaging and handling equipment. They are also used as a food preservative, namely melted cheese, cream, milk, dairy products, in the processing of poultry, fish, meat, vegetables and in dairy and food processing equipment. The use of nisin formulations is not limited to food use and may be appropriate in any situation where it is necessary or desirable to eliminate gram-negative and gram-positive bacteria.

Prípravky môžu byť rozpustené vo vhodnom nosiči, napríklad vo vodnom rozpúšťadle, alebo tlmivom roztoku, alebo môžu byť suspendované v akomkoľvek vhodnom kvapalnom, koloidnom alebo polymérnom základe za vzniku baktericídov. Prípravky alebo baktericídy môžu byť spracované do mastí alebo obkladov na lekárske použitie, ako je liečenie infekcií, ošetrenie rán alebo chirurgických implantácií, ako širokospektrálny dezinfekčný prostriedok vo forme orálnych alebo kožných výplachov, na dezinfekčné kefy, uteráky alebo roztoky. Baktericídy môžu byť použité na čistenie lekárskych nástrojov, predoperačných chirurgických kief a pod.. Baktericídy sú zvlášť vhodné v tých prípadoch, keď je požadovaná dezinfekcia prostredia, ale keď je potrebné chemické germicídy vylúčiť z dôvodov rizika korózie alebo toxických rezíduí.The formulations may be dissolved in a suitable carrier, for example an aqueous solvent or buffer, or may be suspended in any suitable liquid, colloidal or polymeric base to form bactericides. The compositions or bactericides may be formulated in ointments or compresses for medical use, such as treating infections, wound treatments or surgical implants, as a broad-spectrum disinfectant in the form of oral or skin rinses, into disinfectant brushes, towels or solutions. Bactericides can be used to clean medical instruments, preoperative surgical brushes, etc. Bactericides are particularly useful when environmental disinfection is desired but when chemical germicides need to be avoided because of the risk of corrosion or toxic residues.

Na rozdiel od účinnosti širokospektrálnych germicídných prípravkov, ktorá je pri väčšine z nich ovplyvňovaná prítomnosťou komplexných organických látok, sú prípravky podľa vynálezu účinné ako baktericídy aj v prítomnosti organických látok, ako je mlieko alebo sérum.In contrast to the efficacy of broad spectrum germicidal formulations, which in most of them are influenced by the presence of complex organic substances, the formulations of the invention are effective both as bactericides and in the presence of organic substances such as milk or serum.

O nisíne bolo známe, že optimálne inhibuje rast niekoľkých blízko príbuzných grampozitívnych druhov baktérii, predovšetkým grampozitívnych baktérií, tvoriacich spóry pri pH 5,0. Baktericídna účinnosť nisínu v roztoku s koinplexotvomým činidlom bola nezvyčajne rýchla a značne zvýšená smerom k širokému spektru grampozitívnych baktérií pri hodnotách pH vyšších ako 5,0 a navyše sa objavila účinnosť na gramnegatívne baktérie tak v kyslom, ako aj v alkalickom prostredí, výhodne pri rozmedzí pH 5,0 až 8,0. Táto neočakávane rýchla a širokospektrálna baktericídna účinnosť nisínu, aktivovaného komplexotvomým činidlom, ho robí použiteľným medzi inými aplikáciami ako dezinfekčného prostriedku.Nisin was known to optimally inhibit the growth of several closely related Gram-positive bacteria species, in particular Gram-positive spore-forming bacteria at pH 5.0. The bactericidal activity of nisin in a solution with a co-plexing agent was unusually fast and considerably increased towards a broad spectrum of gram positive bacteria at pH values above 5.0, and moreover, efficacy appeared on gram negative bacteria in both acid and alkaline environments, preferably at pH range. 5.0 to 8.0. This unexpectedly rapid and broad spectrum bactericidal activity of nisin, activated by the complexing agent, makes it useful among other applications as a disinfectant.

Nisín prináleží do triedy peptidových bakteriocínov, obsahujúcich lantionín. Do tejto triedy sú tiež zahrnuté subtilín, epidermín, cinnamycín, durainycin, ancovenin a Pep. 5. Každý z týchto peptidových bakteriocínov je produkovaný iným mikroorganizmom. Jednako len bolo zistené, že subtilín, získaný z určitých kultúr Bacillus subtilis, a epidermín, získaný z určitých kultúr Staphylococcus epidennidis, majú molekulové štruktúry veľmi podobné nisínu /pozri Hurst, str. 85-86 a Schnell a spol., Náture, 333, 276-278/. Preto je možné predpokladať, že vďaka podobnosti molekúl budú aj ďalšie peptidové bakteriocíny, obsahujúce lantionín v kombinácii s koinplexotvomými a neinogénnymi tenzidmi eliminovať kontaminácie gramnegatívnymi a grampozitívnymi mikróbmi.Nisin belongs to the class of peptide bacteriocins containing lanthionine. Also included in this class are subtilin, epidermin, cinnamycin, durainycin, ancovenin and Pep. 5. Each of these peptide bacteriocins is produced by a different microorganism. However, it has been found that subtilin derived from certain cultures of Bacillus subtilis and epidermine derived from certain cultures of Staphylococcus epidennidis have molecular structures very similar to nisin (see Hurst, p. 85-86 and Schnell et al., Nature, 333, 276-278]. Therefore, due to the similarity of the molecules, it is anticipated that other lantionine-containing peptide bacteriocins in combination with co-oplexing and noninogenic surfactants will eliminate contamination by gram-negative and gram-positive microbes.

Využitie účinnosti nisínu a ďalších lantionín obsahujúcich peptidových bakteriocínov ako bakteriocídnych prostriedkov voči gramnegativnym baktériám je prekvapujúci, lebo dosial* * známe prostriedky túto účinnosť nepripúšťali. Rovnako zvýšená účinnosť nisínu v prítomnosti EDTA voči grampozitívnym baktériám pri hodnotách pH vyšších ako 5,0, je neočakávaná, lebo sa pred pokladalo, že optimálna účinnosť nisínu je pri pH 5,0. Mimo to objav týchto účinkov nisínu, lantionín obsahujúcich peptidových bakteriocínov, a ich využitie ako baktericídov vypĺňa dlhotrvajúcu potrebu prijateľného, prírodného, netoxického prostriedku voči širokému spektru baktérií v odbore konzervácie potravín.The use of the efficacy of nisin and other lanthionine-containing peptide bacteriocins as bacteriocidal agents against gram-negative bacteria is surprising, as the known agents have not admitted such efficacy. Likewise, the increased efficacy of nisin in the presence of EDTA against Gram positive bacteria at pH values above 5.0 is unexpected as the optimal efficacy of nisin was assumed to be at pH 5.0. In addition, the discovery of these effects of nisin, lanthionine-containing peptide bacteriocins, and their use as bactericides fulfills the long-standing need for an acceptable, natural, non-toxic agent against a broad spectrum of bacteria in the field of food preservation.

Pre znázornenie výhodného a nečakane rýchlehoúčinku zmesi obsahujúcej nisín, EDTA a/alebo rôzne povrchovoaktívne látky, bol s uvedenými baktericídmi vyhotovený rad pokusov. Tieto pokusy sú ilustratívne a predložený vynález nie je nimi nijako obmedzovaný. Je možné predpokladať, že ďalšie bakteriocídy obsahujúce lantionín /peptidové bakteriocíny/ môžu účinne nahradiť nisín a takisto iné komplexotvomé činidlá môžu nahradiť EDTA.In order to illustrate the advantageous and unexpectedly rapid effect of a mixture comprising nisin, EDTA and / or various surfactants, a number of experiments have been carried out with said bactericides. These experiments are illustrative and the present invention is not limited thereto. It is contemplated that other lanthionine-containing bacteriocides (peptide bacteriocins) can effectively replace nisin and also other complexing agents can replace EDTA.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Všetky testy v nasledujúcich príkladoch boli urobené pri teplote 37°C. Zvýšená širokospektrálna baktericidna účinnosť bola určovaná stanovením percentuálneho počtu prežívajúcich baktérií po ošetrení baktericídnym prostriedkom. Všeobecne bolo inkubovaných 10⁷ buniek sledovaného druhu v ml suspenzie s novým baktericidnym prostriedkom počas určitej doby a potom boli baktérie izolované odstredením počas 2 minút. Zo zhluku baktérií bol potom baktericid vymytý pomocou tlmivého roztoku, označovaného tu ako Phagov tlmivý roztok. /50 ml Tris-HCl tlmivý roztok pH 7,8; 1 mM MgSO<, 4 mM CaCl₂, 0,1 M NaCl a 0,1 % želatíny/, baktérie boli potom znova suspendované a postupne riedené do Phagovho tlmivého roztoku a 100 ml baktérií bolo potom vnesených na živnú agarovú platňu. Počet prežívajúcich baktérií bol stanovený na základe počtu vzniknutých mikrobiálnych kolónií /CFU/ po inkubácii počas 24 až 48 hodín pri teplote 37°C. Účinný baktericid podľa predloženého vynálezu je taký, keď prežíva menej ako 0,1 % baktérií z pôvodného počtu životaschopných baktérií.All tests in the following examples were performed at 37 ° C. The increased broad spectrum bactericidal efficacy was determined by determining the percentage of surviving bacteria after treatment with the bactericidal composition. Generally, 10 ⁷ cells of the species of interest were incubated in ml suspension with the new bactericidal agent for a period of time, and then the bacteria were isolated by centrifugation for 2 minutes. The bactericide was then eluted from the bacterial cluster using a buffer, referred to herein as Phag buffer. / 50 ml Tris-HCl buffer pH 7.8; 1 mM MgSO 4, 4 mM CaCl ₂ , 0.1 M NaCl and 0.1% gelatin, the bacteria were then resuspended and serially diluted in Phag buffer and 100 ml of bacteria were then plated on nutrient agar plate. The number of surviving bacteria was determined based on the number of microbial colonies (CFU) formed after incubation for 24 to 48 hours at 37 ° C. The effective bactericide of the present invention is one that survives less than 0.1% of the original viable bacteria.

Príklad 1Example 1

Účinnosť nisínu a komplexotvomého činidla voči gramnegativnym baktériám /S. typhimurium/.Efficacy of nisin and complexing agent against Gram-negative bacteria / S. typhimurium /.

Ako vidno z tabuľky 1, na potvrdenie účinku baklericídu obsahujúceho samotný nisín a nisín s komplexotvomýin činidlom EDTA, boli urobené dva testy vo 20 mM Tris pri pH 8,0 a pri teplote 37°C. Kontrolný test bol urobený bez EDTA a aiázorňuje účinok samotného nisínu na gramnegatívne baktérie S. typhimurium. Zvýšené koncentrácie nisínu vykazujú určité zvýšenie účinnosti, no aj účinnosť vyšších koncentrácií v neprítomnosti EDTA pri dávke 100 pig/ml nisínu prežitie 1,6 % je celkom nedostatočné pri použití ako konzervačného prostriedku potravín. Hodnoty baktericídnej účinnosti získanej pre nisín s EDTA sú významné.As shown in Table 1, to test the effect of baclericide containing nisin alone and nisin with complexing agent EDTA, two assays were performed in 20 mM Tris at pH 8.0 and 37 ° C. The control assay was performed without EDTA and demonstrated the effect of nisin alone on gram-negative S. typhimurium bacteria. Increased concentrations of nisin show some efficacy, but the efficacy of higher concentrations in the absence of EDTA at a dose of 100 pig / ml nisin survival of 1.6% is quite insufficient when used as a food preservative. The bactericidal activity values obtained for nisin with EDTA are significant.

Tabuľka 1 p&jodný Ei»T> m x í n /*w4/al/ počet «· živých 0 10 30 90 1OO 300 txkUOri i * prežitia 5.Uvptolaurlua po 3 hodínách j 3.0 k 10* 0 100 51.3 - 7.0 i.fcTABLE 1 Native Ei »T> m xin / * w4 / al / number of · live 0 10 30 90 1 300 300 txkUOri i * Survival 5.Uvptolaurlua after 3 hours j 3.0 to 10 * 0 100 51.3 - 7.0 i.fc

3.7 x 10* ZO 2.5 10 ^a - ·<1Ο^-*«ClO’*3.7 x 10 * ZO 2.5 10 ^a - <<1Ο ^- * «ClO '*

Test ** /tabuľka 1/, urobený s použitím nisínu s 20 mM EDTA, znázorňuje prekvapujúcu účinnosť anesi nisínu pri eliminácii sledovaných gramnegatív3 nych baktérii.Test ** (Table 1), performed using nisin with 20 mM EDTA, shows the surprising efficacy of anisin nisin in eliminating the Gram-negative bacteria of interest.

Z tabuľky 1 je zrejmé, že v teste ** pri koncentrácii 20 mM EDTA a 30 gg/ml nisinu má tento baktericíd významnú baktericidnu účinnosť na S. typhimurium, zatiaľ čo pri koncentráciách nisinu 100 pg/ml a vyššej, bektericídna zmes nisinu a EDTA baktérieprakticky eliminuje /% prežitia nižšie ako 10~* značí, že pri stanovení neboli zistené žiadne prežívajúce baktérie/. Komhinfcie EDTA a nisinu teda vykazuje synergickú účinnosť viac ako tisícnásobnú s ohľadom na samotný nisín. Príklad 2It can be seen from Table 1 that in a test ** at 20 mM EDTA and 30 gg / ml nisin, this bactericide has significant bactericidal activity on S. typhimurium, while at nisin concentrations of 100 pg / ml and above, the nectin and EDTA bactericidal mixture bacteria virtually eliminates /% survival rates below 10 ~ * indicates that no surviving bacteria were detected in the assay. Thus, EDTA and nisin infections show a synergistic efficacy of more than a thousand times that of nisin alone. Example 2

Účinnosť nisinu, komplexotvomého činidla a povrchovoaktívnej látky voči gramnegatívnym baktériám ZS. typhimurium/.Efficacy of nisin, a complexing agent and a surfactant against Gram-negative ZS bacteria. typhimurium /.

Na stanovenie účinku baktericídu obsahujúceho nisin a tak EDTA, ako aj povrchovoaktivnu látku Tritón X-100 na S. typhimurium boli urobené štyri pokusy /tabuľka 21 vo 20 mM Tris, pH 8,0 pri teplote 37’C. Kontrolný pokus /*#/ bol rovnaký ako kontrolný pokus v príklade 1 /tabuľka 1 /.Four experiments / Table 21 were performed in 20 mM Tris, pH 8.0 at 37 ° C to determine the effect of the nisin-containing bactericide and both EDTA and Triton X-100 surfactant on S. typhimurium. The control experiment (* #) was the same as the control experiment in Example 1 (Table 1).

Tabuľka 2Table 2

Prítomnosť neinogénnej povrchovoaktívnej látky, Tritónu X-100 v kombinácii s EDTA zvyšuje účinnosť nisinu na gramnegativne baktérie, a to ešte viacej, ako vykazuje baktericíd obsahujúci len nisín a samotnú 5 EDTA/príklad 1/.The presence of a noninogenic surfactant, Triton X-100 in combination with EDTA, increases the efficacy of nisin on gram-negative bacteria, even more than that of a bactericide containing only nisin and 5 EDTA alone (Example 1).

Príklad 3Example 3

Účinnosť nisinu, komplexotvomého činidla a povrchovoaktívnej látky voči gramnegatívnym baktériám /S. typhimurium/.Efficacy of nisin, complexing agent and surfactant against Gram-negative bacteria / S. typhimurium /.

Tabuľka 2 dokladá zvýšenú aktivitu baktericídu obsahujúceho nisín, 20 mM komplexotvomého činidla EDTA a neionogénnej povrchovoaktívnej látky Tweenu 20 voči S. typhimurium v 20 mM Tris, pH 8,0 pri teplote 37°C. Kombinácia nisinu a EDTA s /1 %/Table 2 demonstrates the increased activity of the nisin-containing bactericide, 20 mM EDTA complex and Tween 20 nonionic surfactant against S. typhimurium in 20 mM Tris, pH 8.0 at 37 ° C. Combination of nisin and EDTA with / 1% /

Tweenu 20 je účinnejšia, ako kombinácia s Tritónom X-100 /príklad 21.Tween 20 is more effective than the combination with Triton X-100 / Example 21.

Tabuľka 3Table 3

Twt TWT póvodmŕ podot póvodmà podot EDTA AM/ EDTA AM / Tvec· 20 TVec · 20 leín Lein Zpf/·!/ ALR / ·! / živých live Λ/ O Λ / O 10 30 10 30 50 100 300 50 100 300 tMkUín í tMkUín í

oabout

O r- O r O rO r- O r O r

UU

l l 3.0 M 3.0 M 10* * 10 0 0 t O 10O T O 10O S. typhtnurlu· prví íva Jdclcb pu 3 Itodlnéch 51.3 - 7.0 1.6 S. typhtnurlu · first Jdclcb pu 3 Itl 51.3 - 7.0 1.6 2 2 5.7 m 5.7 m 10* * 10 30 30 0 3.5 0 3.5 - -^10> - -<rlO—< Cti)-* - - ^ 10> - - <r10 - <Cti) - * 3 3 4.3 m 4.3 m 10* * 10 20 20 1.0 to-* 1.0 to- * - -cio-* - -cio* <to-< - -cio- * - -cio * <to- <

Príklad 4Example 4

Účinnosť nisinu, komplexotvomého činidla a povrchovoaktívnej látky voči gramnegatívnym baktériám /Escherichia coli/.Activity of nisin, complexing agent and surfactant against Gram-negative bacteria (Escherichia coli).

Aktivita baktericídu obsahujúceho nisín a EDTA voči gramnegativnej baktérii E. coli, ktorá bola stanovená, je uvedená v tabuľke 4.The activity of the bactericide containing nisin and EDTA against the Gram-negative E. coli bacterium which was determined is shown in Table 4.

Tabuľka 4Table 4

35 35 pAutMÍný POČvt Sivých baktérií pAutMINg Number of Gray Bacteria ετ>τΑ AM/ ετ> τΑ AM / Tri X-100 Z8Z three X-100 Z8Z olaín 0 30 Oląina 0 30 /ira/bi/ 1OO / Ira / bi / 1OO 300 300 * E.coli * E.coli pr«žív«14ci pr «alive« 14ci 1 ch 1 ch po after *d hodinách * d hours 1 1 1.0 K 10' 1.0 K 10 ' 0 0 0 0 100 2? 100 2? 25 25 8.5 8.5 40 40 2 2 1.0 M 10' 1.0 M 10 ' 20 20 0 0 14.5 0.86 14.5 0.86 0.01 00:01 0.001 0.001 3 3 1.0 m 10⁷ 1.0 m 10 ⁶ 0 0 1.0 1.0 100 100 30 30 - - 4 4 1.0 M 10⁷ 1.0 M 10 ⁶ 20 20 1.4 1.4 1.2 0.8 1.2 0.8 0.05 00:05 c: ίο-· c: ί ·

Iwly e · t>ea EDTA boli urobené v 30 nK Tri· tlatvého roztoku o pH 8,0 pri teplote '37 ^UĽ. · poflatoCný· poCto·Iwly e · t> e and EDTA are made in 30 nK three · tlatvého solution, pH 8.0 at a temperature of '37 ^ul. · FLAT · POCTO ·

“b"b

OABOUT

o o o- oO ιΛ ΙΛ x- ryo o o-oO ιΛ ΙΛ x- ry

Pokus /tabuľka 21 bol urobený s použitím nisinu a 1 % Tritónu X-100, no bez EDTA. Prítomnosť detergentu samotného inhibuje účinnosť nisinu na gramnegatívne baktérie a nisín je neúčinný. Podľa pokusov **3 a **4, ktoré predstavujú uskutočnenie podľa vynálezu, je prítomnosť 20 mM EDTA v kombinácii s Tritónom X-100 baktericídom, významne zvyšujúcim baktericidnu účinnosť nisinu na S. typhimurium. V skutočnosti kombinácia Tritónu X-100 s EDTA, no bez nisinu, bola účinná, aj keď v menšej miere, ako v prítomnosti nisinu. Kombinácie nisinu, použité pre pokusy **3 a **4 /tabuľka 2/ boli veľmi účinné, najúčinnejšia bola koncentrácia Tritónu X-100 1 % /test **4, tabuľka 21.Experiment / Table 21 was performed using nisin and 1% Triton X-100, but without EDTA. The presence of the detergent alone inhibits the efficacy of nisin on gram-negative bacteria and nisin is ineffective. According to experiments ** 3 and ** 4, which represent an embodiment of the invention, the presence of 20 mM EDTA in combination with Triton X-100 is a bactericide, significantly enhancing the bactericidal activity of nisin on S. typhimurium. In fact, the combination of Triton X-100 with EDTA, but without nisin, was effective, albeit to a lesser extent than in the presence of nisin. The nisin combinations used for the ** 3 and ** 4 experiments (Table 2) were very effective, with Triton X-100 1% / test ** 4 being the most effective, Table 21.

Testy s a bez EDTA boli urobené v 20 mM Tris tlmivého roztoku s pH 8,0 pri teplote 37°C, s počiatočným počtom živých mikroorganizmov 1 x 10⁷ buniek E. coliúnl. Funkcia baktericídu bola meraná ako percentuálny počet baktérii prežívajúcich po 2 hodinách.Assays with no EDTA were performed in 20 mM Tris buffer, pH 8.0 at 37 ° C, with an initial number of living microorganisms of 1 x 10 ⁷ E. coli cells. Bactericide function was measured as the percentage of bacteria surviving after 2 hours.

V teste **1 /kontrolný, tabuľka 4/ bez EDTA, vykazuje nisín málo významnú účinnosť pri eliminácii E. coli. V teste ## /tabuľka 4/, keď je prítomných 20 mM EDTA, vykazuje podstatnú aktivitu voči baktériám E. coli. Aktivita sa zvyšuje so stúpajúcou koncentráciou nisinu. Kombinácia nisinu s EDTA ako baktericíd preukazuje tisícnásobne vyššie synergické zvýšenie voči E. coli, V testoch *#3 a **4 /tabuľka 4/ je možné pozorovať, že Tritón X-100 nemá významnú baktericidnu účinnosť voči E. coli. Tritón X-100 pôsobí tak, že iluiibuje účinnosť voči gramnegatívnym baktériám, ako bolo zistené u S. typhimurium /tabuľka 21. Avšak všeobecné zvýšenie aktivity nisinu pomocou EDTA podstatne mení inhibičné účinky Tritónu X-100, ako je zrejmé z tabuliek 2 a 4.In test ** 1 (control, Table 4) without EDTA, nisin shows little significant efficacy in E. coli elimination. In Test ## (Table 4), when 20 mM EDTA is present, it exhibits substantial activity against E. coli. Activity increases with increasing nisin concentration. The combination of nisin with EDTA as a bactericide shows a 1000-fold higher synergistic increase against E. coli. Triton X-100 works by illusing efficacy against Gram-negative bacteria as found in S. typhimurium / Table 21. However, a general increase in nisin activity by EDTA substantially alters the inhibitory effects of Triton X-100, as shown in Tables 2 and 4.

Tak bolo zistené, že baktericíd obsahujúci nisín a komplexotvomé činidlo, ako je EDTA, je účinným konzervačným činidlom potravín voči rôznym typomThus, it has been found that a bactericide containing nisin and a complexing agent such as EDTA is an effective food preservative against various types

SK 277796 Β6 gramnegatívnych baktérií i v prítomnosti povrchovoaktivnych látok.276 Gram-negative bacteria, even in the presence of surfactants.

Príklad 5Example 5

Účinnosť nisínu a komplexotvomého činidla voči gramnegatívnym baktériám /Klebsiella pneumoniae/. 5Efficacy of nisin and a complexing agent against Gram-negative bacteria (Klebsiella pneumoniae). 5

Účinok baktericidu obsahujúceho nisín a EDTA a samotný nisín voči gramnegatívnym baktériám K. pneumoniae je uvedený v tabuľke 5.The effect of the bactericide containing nisin and EDTA and nisin alone on Gram-negative K. pneumoniae is shown in Table 5.

Tabuľka 5 Table 5 TriUfa ir-ioo Λ/ TriUfa ir-iooΛ / 0 0 nisín 30 100 nisin 30 100 300 300 10 10 Twl TWL pOvodný pcfvt. živých bAkWrlí Original PCfvt. live bAkWrlí EDTh Λ*/ EDTh Λ * / * prežívajúcich po 2 * surviving after 2 hadinJch hadinJch 1 1 10’ 10 ' 0 0 0 0 100 100 - 90 - 90 30 30 2 2 10^y 10 ^y 20 20 0 0 22 22 0.5 1. 0.5 1. i s.oas i s.oas 15 15

Dva testy, jeden s a jeden bez EDTA /kontrolný/ boli urobené vo 20 mM Tris tlmivého roztoku, pH 8,0 pri teplote 37°C s počiatočným počtom živých baktérií K. pneumoniae 10' buniekánl. Účinok bol hodnotený 20 ako percentá baktérií, prežívajúcich po dvoch hodinách.Two assays, one with and one without EDTA (control), were performed in 20 mM Tris buffer, pH 8.0 at 37 ° C with an initial number of living K. pneumoniae 10 'cells. The effect was evaluated as 20 percent of bacteria surviving after two hours.

V teste *xl /kontrola, tabuľka 5/ bez EDTA, vykazuje nisín málo významnú baktericidnu účinnosť voči K. pneumoniae. V teste **2 /tabuľka 5/ v prítomnosti 20 mM EDTA, vykazuje baktericíd podstatnú účinnosť 25 voči K. pneumoniae. Účinnosť zvyšuje so stúpajúcou koncentráciu nisínu.In test * xl (control, Table 5) without EDTA, nisin shows little significant bactericidal activity against K. pneumoniae. In test ** 2 (Table 5) in the presence of 20 mM EDTA, the bactericide shows a substantial activity of 25 against K. pneumoniae. The potency increases with increasing nisin concentration.

Príklad 6Example 6

Účinnosť nisínu voči gramnegatívnym baktériám /Salmonella typhimurium/ je závislá od koncentrácie ^0 komplexotvomého činidla.The effectiveness of nisin against Gram-negative bacteria (Salmonella typhimurium) is dependent on the concentration of the complexing agent.

Údaje z tabuľky 6 ukazujú, že zvýšenie aktivity nisínu voči gramnegatívnym baktériám /S. typhimurium/ je závislá od koncentrácie EDTA v 50 mM acetátu sodného pH 5,0 alebo vo 20 mM Tris, pH 8,0 pri teplote ⁵⁵37°C.The data from Table 6 show that an increase in nisin activity against Gram-negative bacteria / S. typhimurium / is dependent on EDTA concentration in 50 mM sodium acetate pH 5.0 or 20 mM Tris, pH 8.0 at ⁵⁵ 37 ° C.

Tabuľka 6 koncentrácii EDTA až do 100 mM bez nisínu vykazuje málo významnú aktivitu voči S. typhiinurium alebo pri pH 5,0 M*1 /, alebo pH /*#3/ 8,0. V testoch a **4 /tabuľka 6/,keď bolo prítomných 100 pg/ml nisínu v kombinácii s EDTA, vykazuje baktericíd významnú aktivitu voči S. typhimurium. Účinnosť baktericídov bola podobná v kyslej oblasti pH /0,8/, aj keď je známe, že aktivita samotného nisínu voči grampozitívnym baktériám je optimálna pri pH 5,0.Table 6 EDTA concentrations up to 100 mM nisin-free showed little significant activity against S. typhiinurium or at pH 5.0 M * 1 /, or pH / * # 3 / 8.0. In tests and ** 4 (Table 6), when 100 µg / ml nisin was present in combination with EDTA, the bactericide showed significant activity against S. typhimurium. The efficacy of bactericides was similar in the acidic pH range (0.8), although it is known that the activity of nisin alone against Gram positive bacteria is optimal at pH 5.0.

Zvýšenie účinnosti nisínu prítomnosťou EDTA bolo závislé od koncentrácie EDTA a bolo optimálne v rozmedzí 0,2 mM až 10 mM pri pH hodnotách 5,0 až 8,0. S prekvapením bolo zistené, že pri koncentrácii vyššej, ako 10 mM EDTA, sa zvyšovanie účinnosti EDTA znižuje, zníženie účinnosti je výrazne vyššie pri pH 8,0; ako pri pH 5,0.The increase in nisin activity by the presence of EDTA was dependent on the EDTA concentration and was optimally in the range of 0.2 mM to 10 mM at pH values of 5.0 to 8.0. Surprisingly, it was found that at a concentration higher than 10 mM EDTA, the increase in EDTA potency decreased, the decrease in potency was significantly higher at pH 8.0; as at pH 5.0.

Príklad 7Example 7

Nisín a komplexotvomé činidlo voči gramnegatívnym baktériám /S. typhimurium/.Nisin and a complexing agent against Gram-negative bacteria / S. typhimurium /.

Zvýšenie účinnosti nisínu v prítomnosti EDTA voči gramnegatívnym baktériám v prítomnosti biologického tkaniva je demonštrované s S. typhimurium na kuracom svale, výsledky sú uvedené v tabuľke 7. Tabuľka 7An increase in the efficacy of nisin in the presence of EDTA against Gram-negative bacteria in the presence of biological tissue is demonstrated with S. typhimurium in chicken muscle, the results are shown in Table 7. Table 7

CJCJ

II

UX Q mUX Q m

o oo o

oabout

o r“o r "

K κχK κχ

QQ

IÍXIIX

*0 r** 0 r *

X «XX «X

O i/XO i / X

“o x"O x

ux oux o

U)U)

X uXX uX

OABOUT

O) ťyO)

HX st rHX st r

O ry S ôT OO ry S ôT O

oabout

OABOUT

QQ

CO r- UX OjCO r- UX Oj

O Q OO Q O

O Ú O O Q in m hxQ O m Q in m hx

O O O O Φ ď\ yx ui <0 <D r OJ 4 triO O \ \ \ \ \ 0 0 0 0 tri tri tri tri tri OJ OJ

Inkubácia bola urobená alebo v 50 mM octanu sodného pH 5,0 alebo 20 mM Tris, pH 8,0 pri teplote 37'C.Incubation was performed or in 50 mM sodium acetate pH 5.0 or 20 mM Tris, pH 8.0 at 37 ° C.

Kocky kuracieho svalu boli pred použitím čistené chlomanom sodným a povidonjodidom. Na inokuláciu tkaniva boli kocky kuracieho svalu ponorené do suspenzie 10⁶ buniek/ml S. typhimurium vo 20 mM Tris HC1, pH 8,0. Prebytok vllikosti bol odstránený z ponorených kociek strepaním. Vzorky kuracieho tkaniva boli ponorené do tlmivého roztoku obsahujúceho prí5Chicken muscle cubes were cleaned with sodium hypochlorite and povidone iodide before use. For tissue inoculation, chicken muscle cubes were immersed in a suspension of 10 ⁶ cells / ml S. typhimurium in 20 mM Tris HCl, pH 8.0. The excess moisture content was removed from the submerged cubes by shaking. Chicken tissue samples were immersed in buffer containing 5%

SK 27779í B6 pravek s nisinom, dostatočného na prekrytie tkaniva a inkubované pri teplote 37°C počas dvoch hodín, potom bolo tkanivo premiestnené do Phagovho tlmivého roztoku použitého, v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva. Baktérie ostávajúce v testovanom roztoku boli oddelené odstredením, premytím Phagovým tlmivým roztokom a spojené s baktériami získanými vymytím z tkaniva Phagovým tlmivým roztokom. Spojené vzorky /označené nezadržané bunky/ boli sériovo zriedené a 100 μΐ podiely boli použité na stanovenie prežívajúcich baktérií.The nisin is sufficiently sufficient to cover the tissue and incubated at 37 ° C for two hours, then the tissue was transferred to the Phag buffer used, in an amount sufficient to cover the tissue. The bacteria remaining in the test solution were separated by centrifugation, washing with Phag buffer and associated with the bacteria obtained by washing out the tissue with Phag buffer. Pooled samples (labeled non-retained cells) were serially diluted and 100 μΐ aliquots were used to determine surviving bacteria.

V testoch **1 a *#3 /tabuľka 7/, v neprítomnosti nisínu alebo pri pH 5 alebo pH 8, EDTA samotná nemá významný vplyv na prežívajúce S. typhiinurium. V testoch a /tabuľka 7/, v prítomnosti 300 pg/ml nisínu vykazovateli baktericidy významnú aktivitu voči S. typhimurium na kuracích svaloch pri obidvoch hodnotách pH 5,0 a pH 8,0.In tests ** 1 and * # 3 (Table 7), in the absence of nisin or at pH 5 or pH 8, EDTA alone does not have a significant effect on surviving S. typhiinurium. In tests a (Table 7), in the presence of 300 µg / ml nisin, bactericides exhibited significant activity against S. typhimurium in chicken muscles at both pH 5.0 and pH 8.0.

Zvýšenie aktivity nisínu prítomnosťou EDTA bolo závislé od jej koncentrácie, optimálna koncentrácia bola v rozmedzí 0,3 mM až 10 mM EDTA pri obidvoch hodnotách pH 5,0 a 8,0. Pri koncentrácii vyššej ako 10 mM pri pH 8,0 bola aktivácia nisínu EDTA znížená. Avšak ako je vidieť z testu #*5 /tabuľka 7/, v prítomnosti 1,0 % hovädzieho sérového albumínu pri hodnote pH 8,0, účinok nisínu voči S. typhimurium na kuracom svale je vyjadrený v závislosti na koncentráciách EDTA až do 100 mM.The increase in nisin activity by the presence of EDTA was concentration dependent, with optimal concentrations ranging from 0.3 mM to 10 mM EDTA at both pH 5.0 and 8.0. At a concentration greater than 10 mM at pH 8.0, activation of nisin EDTA was reduced. However, as seen from Test # * 5 (Table 7), in the presence of 1.0% bovine serum albumin at pH 8.0, the effect of nisin on S. typhimurium in chicken muscle is expressed in dependence on EDTA concentrations up to 100 mM .

Baktericidy obsahujúce nisín a nízke koncentrácie komplexotvomého činidla, ako je EDTA, v rozmedzí 0,1 mM až 20 mM, môžu byť zvlášť účinné na elimináciu alebo prevenciu kontaminácie potravín gramnegatívnymi baktériami.Bactericides containing nisin and low concentrations of a complexing agent, such as EDTA, in the range of 0.1 mM to 20 mM may be particularly effective in eliminating or preventing food contamination by gram-negative bacteria.

Príklad 8Example 8

Titrácia nisínovej aktivity voči gramnegativnym baktériám /S. typhimurium/.Titration of nisin activity against Gram-negative bacteria / S. typhimurium /.

Pri optimálnej koncentrácii komplexotvomého činidla bola účinnosť baktericídov v Tris tlmivom roztokuAt the optimal concentration of the complexing agent, the efficacy of the bactericides in Tris buffer was

V teste **2 /tabuľka 8/ je zrejmé, že malé množstvá nisínu, ako je 0,3 pg/ml, s 1,0 mM EDTA vo 20 mM Tris pri pH 8,0 v prítomnosti 1,0 % hovädzieho sérového albumínu /BSA/, významne znižuje počet 5 prežívajúcich S. typhimurium. Baktericíd je aktívny voči gramnegativnym baktériám, ako je nisín samotný voči grampozitívnym Streptococci.In test ** 2 (Table 8), it is apparent that small amounts of nisin, such as 0.3 µg / ml, with 1.0 mM EDTA in 20 mM Tris at pH 8.0 in the presence of 1.0% bovine serum albumin (BSA) significantly reduces the number of 5 surviving S. typhimurium. The bactericide is active against gram-negative bacteria, such as nisin alone against Gram-positive Streptococci.

Príklad 9Example 9

Titrácia nisínovej aktivity voči gramnegativnym 10 baktériám /S. typhimurium/.Titration of nisin activity against gram-negative 10 bacteria / S. typhimurium /.

Pri optimálnej koncentrácii komplexotvomého činidla bola účinnosť baktericídu voči gramnegativnym baktériám v prítomnosti biologického tkaniva demonštrovaná s S. typhimurium na kuracom svale. Výsledky 15 sú uvedené v tabuľke 9.At the optimal concentration of the complexing agent, the efficacy of the bactericide against gram-negative bacteria in the presence of biological tissue has been demonstrated with S. typhimurium on chicken muscle. Results 15 are shown in Table 9.

Tabuľka 9Table 9

20 20 Tas Tas t pM t pM pôvodný počet Sivých baktérií the original number of Gray Bacteria EDTA XWMZ EDTA XWMZ ESA /*/ ESA / * / 0 0 BiafB /jtq/Ml/ 10 J00 200 300 BiafB / jtq / Ml / 10 J00 200 300 * I * I prežíva14cicA po 2 hodinách survives 14cicA after 2 hours 1 1 8.0 8.0 3 x 10’ 3 x 10 ’ 0 0 0 0 100 100 2 2 8.0 8.0 3 x I0⁷ 3 x I0 ⁷ 1.0 1.0 t.o t.o 27 27 0 26 0.008 0.007 0.006 0 26 0.008 0.007 0.006

voči gramnegativnym baktériám doložená ako podstatná, ako je uvedené v tabuľke 8.against gram-negative bacteria as substantiated as shown in Table 8.

Tabuľka 8Table 8

OABOUT

Kocky kuracieho svalu boli čistené chlomanom sodným a povidonjodidom. Pre inokuláciu tkaniva boli kocky kuracieho svalu ponorené do suspenzie obsahujúcej 10⁸ buniekánl S. typhimurium vo 20 mM Tris HC1, pH 8,0. Prebytočná vlhkosť bola z ponorených kociek strepaná. Tkanivo bolo umiestnené do tlmivého roztoku obsahujúceho nisínový prípravok. Tlmivý roztok bol použitý v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva a bola urobená inkubácia počas dvoch hodín pri teplote 37°C, potom bolo tkanivo prevedené do Phagovho tlmivého roztoku použitého v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva. Baktérie zostávajúce v testovanom roztoku boli oddelené odstredením, premyté Phagovým tlmivým roztokom a spojené s baktériami získanými vymytím z tkaniva Phagovým tlmivým roztokom. Spojené vzorky /označené ako nezadržané bunky/ boli sériovo zriedené a 100 μΐ podiely boli použité na stanovenie prežívajúcich baktérií.Chicken muscle cubes were cleaned with sodium hypochlorite and povidone iodide. For tissue inoculation, chicken muscle cubes were immersed in a suspension containing 10 ⁸ S. typhimurium cells in 20 mM Tris HCl, pH 8.0. Excess moisture was shaken from the submerged cubes. The tissue was placed in a buffer containing a nisin formulation. The buffer was used in an amount sufficient to cover the tissue and incubated for two hours at 37 ° C, then the tissue was transferred to the Phag buffer used in an amount sufficient to cover the tissue. The bacteria remaining in the test solution were collected by centrifugation, washed with Phag buffer and associated with the bacteria obtained by washing out the tissue with Phag buffer. Pooled samples (labeled as non-retained cells) were serially diluted and 100 μΐ aliquots were used to determine surviving bacteria.

Príklad 10Example 10

Účinnosť nisínu, EDTA a metylparabénu voči gramnegativnym baktériám /S. typhimurium/.Efficacy of nisin, EDTA and methylparaben against Gram-negative bacteria / S. typhimurium /.

Baktericíd obsahujúci nisín a EDTA v spojení so známym prostriedkom na ochranu potravín, metylparabénom, bol doložený ako výnimočne účinný voči gramnegativnym baktériám, ako je uvedené v tabuľke 10.A bactericide containing nisin and EDTA in conjunction with the known food protection agent, methylparaben, has been shown to be exceptionally effective against gram-negative bacteria as shown in Table 10.

Tabuľka 10Table 10

Test H Test H pôvodný počet živých Uaktérlk original number of live Uaktérlk nisín nisin EDTA* /M Z EDTA * / M Z * aetyiparabénu O O.l * aetyiparaben O O.l 1.0 1.0 55 55 A prežívajúcich po 2 And surviving after 2 hodinách hours 1 1 3 k 10* 3 to 10 * O ABOUT 10 10 11.0 1.0 11.0 1.0 10 ·« 10 · « 2 2 3 M 10* 3 M 10 * 300 300 1O 1O 0.03 ^JO'³ 0.03 ^ JO ' ³ xílO^-*xílO ^- *

O <*\ O «£O <* \ O «£

b 50 mM octanového sodného tlmivého roztoku c nezadržané bunkyb 50 mM sodium acetate buffer c non-retained cells

Kocky kuracieho svalu boli pred použitím čistené chlomanom sodným a povidonjodidom. Pre inokuláciu tkaniva boli kocky kuracieho svalu ponorené do suspenzie obsahujúcej 10⁸ buniek/ml S. typhimurium v 50 mM tlmivého roztoku octanu sodného, pH 5,0. Prebytok vlhkosti bol odstránený z ponorených kociek strepaním. Tkanivo bolo umiestnené do tlmivého roz6 toku obsahujúceho nisínové prípravky v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva a inkubované dve hodiny pri teplote 37°C. Potom bolo tkanivo prevedené do Phagovho tlmivého roztoku použitého v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva. Baktérie zostávajúce v roztoku boli oddelené odstredením, premyté Phagovým tlmivým roztokom a spojené s baktériami získanými vymytím z tkaniva Phagovým tlmivým roztokom. Spojené vzorky /označené ako nezadržané bunky/ boli sériovo riedené a 100 μΐ podiely boli použité na stanovanie prežívajúcich baktérií.Chicken muscle cubes were cleaned with sodium hypochlorite and povidone iodide before use. For tissue inoculation, chicken muscle cubes were immersed in a suspension containing 10 ⁸ cells / ml S. typhimurium in 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.0. Excess moisture was removed from the submerged cubes by shaking. The tissue was placed in a buffer containing nisin preparations in an amount sufficient to overlap the tissue and incubated for two hours at 37 ° C. The tissue was then transferred to a Phag buffer used in an amount sufficient to overlap the tissue. The bacteria remaining in the solution were collected by centrifugation, washed with Phag buffer and associated with the bacteria obtained by washing out the tissue with Phag buffer. Pooled samples (labeled as non-retained cells) were serially diluted and 100 μΐ aliquots were used to determine surviving bacteria.

V teste **1 /tabuľka 10/ vykazoval metylparabén v prítomnosti 10 mM EDTA účinnosť voči S. typhimurium len pri koncentrácii 1,0 %. V teste /tabuľka 10/, v prítomnosti 300 pg/ml nisínu, bola účinnosť metylparabénu a nisínu voči S. typhimurium podstatne zlepšená.In test ** 1 (Table 10), methylparaben showed efficacy against S. typhimurium in the presence of 10 mM EDTA only at a concentration of 1.0%. In the test (Table 10), in the presence of 300 µg / ml nisin, the efficacy of methylparaben and nisin against S. typhimurium was significantly improved.

Prípravky obsahujúce nisin a EDTA významne zlepšujú využitie metylparabénu pri ochrane potravín. Ďalej baktericídy môžu podstatne znížiť koncentráciu alebo odstrániť potrebu bežne používaných, ale menej žiaducich prostriedkov na ochranu potravín, ako je metylparabén.Formulations containing nisin and EDTA significantly improve the use of methylparaben in food protection. Furthermore, bactericides can substantially reduce the concentration or eliminate the need for commonly used but less desirable food protection agents such as methylparaben.

Príklad 11Example 11

Účinnosť nisínu a komplexotvomého činidla voči grampozitivnym baktériám /Staphylococcus aureus/.Efficacy of nisin and complexing agent against Gram positive bacteria (Staphylococcus aureus).

Aktivácia nisínu komplexotvomým činidlom je závislá od pH. údaje v tabuľke 11 ukazujú, že pri pH 5,0 je nisin o niečo baktericidne účinnejší voči S. aureus, ako nisin pri pH 8,0. Pri pH 5,0 EDTA nezvyšuje účinnosť nisínu voči S. aureus a pri koncentrácii EDTA vyššej ako 10 mM, EDTA inhibuje baktericídnu aktivitu nisínu. Jednako však je baktericídna účinnosť nisínu aktivovaného EDTA pri pH 8,0 výrazne vyššia, ako baktericídna účinnosť samotného nisínu alebo pri kombinácii s EDTA pri pH 5,0.Activation of nisin by the complexing agent is pH dependent. the data in Table 11 show that at pH 5.0 nisin is somewhat bactericidally more effective against S. aureus than nisin at pH 8.0. At pH 5.0 EDTA does not increase the efficacy of nisin against S. aureus, and at a concentration of EDTA greater than 10 mM, EDTA inhibits the bactericidal activity of nisin. However, the bactericidal activity of nisin activated by EDTA at pH 8.0 is significantly higher than the bactericidal activity of nisin alone or when combined with EDTA at pH 5.0.

Tabuľka 11Table 11

Účinnosť pH na vplyv EDTA na baktericídnu účinnosť nisínu voči Staphylococcus aureusEffectiveness of pH on the effect of EDTA on the bactericidal activity of nisin against Staphylococcus aureus

Ml.ín EDTA pH_______ΡΡ/·1 O O.l O.3 í.O 3.0 iO 30 1OOMl.in EDTA pH _______ ΡΡ / · 1 O.l O.3 i.O 3.0 iO 30 1OO

0.0 0.0 0 0 8.0 8.0 3.0 3.0 7.4 7.4 0.03 00:03 9.0 9.0 0 0 100 100 9.0 9.0 3.0 3.0 0.6 0.6 1.0 1.0

* prečíva 1 tlc >cB po 2 h* * sieves 1 tlc> cB after 2 h * 100 81 100 81 100 100 100 100 100 100 0.01 0.2 0.01 0.2 0.4 3 0.4 3 56 56 - - 100 100 - - 1.3 1.4 1.3 1.4 1.0 1.0 34 BO 34 BO

a počiatočný obsah živých baktérií: 8,0 x 10⁶ cfu/ml. Inkubácia bola urobená v 50 mM tlinivom roztoku octanu sodného, pH 5,0 alebo vo 20 mM Tris-HCl tlmivého 5θ roztoku, pH 8,0 pri teplote 37°C.and initial living bacteria content: 8.0 x 10 ⁶ cfu / ml. Incubation was performed in 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.0 or 20 mM Tris-HCl buffer 5θ, pH 8.0 at 37 ° C.

Baktericídna účinnosť nisínu samotného je uvádzaná /pozri Hurst/ ako najvyššia pri pH 5,0 alebo nižšom a údaje v tabuľke to potvrdzujú. Na základe týchto znalosti sa predpokladalo, že baktericídna účinnosť nisínu s 55 EDTA voči S. aureus bude tiež vyššia pri nižšom pH. Ako je však vidieť z tabuľky 11 a proti očakávaniu /pozri tabuľka 6/, EDTA nezvyšovala účinnosť nisínu voči grampozitivnym baktériám pri pH 5,0. Inhibícia účinnosti nisínu pri vyšších koncentráciách EDTA bola ¢0 ešte pozorovateľná pri pH 5,0. Aktivácia nisínu komplexotvomým činidlom tak nie je závislá len od rozmedzia koncentrácií komplexotvomého činidla, ale, s ohľadom na grampozitívne baktérie, je závislá od pH s tým, že je pH v rozmedzí vyššom ako 5,0. ^5The bactericidal activity of nisin alone is reported (see Hurst) as highest at pH 5.0 or less, and the data in the table confirm this. Based on this knowledge, the bactericidal activity of nisin with 55 EDTA against S. aureus was also expected to be higher at lower pH. However, as can be seen from Table 11 and against expectation (see Table 6), EDTA did not increase the efficacy of nisin against Gram positive bacteria at pH 5.0. Inhibition of nisin activity at higher EDTA concentrations was TA0 still observable at pH 5.0. Thus, activation of nisin by the complexing agent is not only dependent on the concentration range of the complexing agent, but, with respect to gram-positive bacteria, is pH-dependent with a pH in the range of greater than 5.0. ^ 5

Príklad 12Example 12

Účinnosť nisínu a komplexotvomého činidla voči grampozitivnym baktériám.Efficacy of nisin and a complexing agent against gram positive bacteria.

Účinky EDTA na baktericídnu účinnosť nisínu pri pH 8,0 nie sú obmedzené len na S. aureus, dôležitý ľudský patogén, no sú tiež pozorované so Streptococcus mutans, pôsobiacim zubný kaz /tabuľka 12A/, Listeria monocytogenes, patogén potravín /tabuľka 12B/ a so zmesnou populáciou pazušných Corynefonnných baktérií, ktoré spôsobujú telesný pach /tabuľka 12C/.The effects of EDTA on the bactericidal activity of nisin at pH 8.0 are not limited to S. aureus, an important human pathogen, but are also observed with Streptococcus mutans, causing tooth decay (Table 12A), Listeria monocytogenes, food pathogen (Table 12B), and with a mixed population of armory Corynefonni bacteria that cause body odor (Table 12C).

Tabuľka 12ATable 12A

Účinok EDTA na baktericídnu účinnosť nisínu voči Streptococcus mutansEffect of EDTA on the bactericidal activity of nisin against Streptococcus mutans

Klcín EDTA aN pM_______pg/nl 0 0.01 0,1 0.3 t,P 3,0 10 30 1OO * pr*C(vajtlcieh po 2 MCleat EDTA aN pM _______ pg / nl 0 0.01 0.1 0.3 t, P 3.0 10 30 1OO * pr * C (2 m increments)

0.0 0 1OO - - - ·0.0 0 1OO - - - ·

B.O O.l 4.3 1.8 0.04 0.02 0.06 1 23 100 100 počiatočný obsah živých baktérií: 6,0 x 10⁶ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 pri teplote 37°C.BO Ol 4.3 1.8 0.04 0.02 0.06 1 23 100 100 Initial bacteria content: 6.0 x 10 ⁶ cfu / ml. Incubations were performed in 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 at 37 ° C.

Tabuľka I2BTable I2B

Účinok EDTA na baktericídnu účinnosť voči Listeria monocytogenesEffect of EDTA on bactericidal activity against Listeria monocytogenes

Μ1·ίη pH Μ1 · pH pH EDTA mM 0 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30 EDTA mM 0 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30 100 100 A pr»£ív4l4c 1 ľIí pu 2 h* And for 4l4c 1 life pu 2 h * 8,0 8.0 0 0 100 - - 84 - - - 100 - - 85 - - - - - 8.0 8.0 3.0 3.0 0.71 0.04 0.04 0,02 O.l 0.64 10 0.71 0.04 0.04 0.02 O.l 0.64 10 14 14

počiatočný obsah živých baktérií: 6,0 x 10⁶ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 pri teplote 37°C.initial live bacteria content: 6.0 x 10 ⁶ cfu / ml. Incubations were performed in 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 at 37 ° C.

Tabuľka 12CTable 12C

Účinok EDTA na baktericídnu účinnosť nisínu voči Coryneformným baktériámEffect of EDTA on the bactericidal activity of nisin against Coryneform bacteria

Hl.Ír, EDTA nh pH MB/·! o______0.1______0,8 1.0 3.010 * prežívaliiclch po 2 h* 8.0 0 100 - 4.6 3.6 R36Hlr, EDTA nh pH MB / ·! o ______ 0.1 ______ 0.8 1.0 3.010 * survived after 2 h * 8.0 0 100 - 4.6 3.6 R36

8.0 3 0,22 0.03 0.0009 0.1 -0.16 “počiatočný obsah živých baktérií: 1,0 x 10⁶ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 pri teplote 37°C.8.0 3 0.22 0.03 0.0009 0.1 -0.16 “initial live bacteria content: 1.0 x 10 ⁶ cfu / ml. Incubations were performed in 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 at 37 ° C.

Príklad 13Example 13

Rýchla baktericídna účitmosť nisínu aktivovaného komplexotvomým činidlom.Rapid bactericidal activity of complexing agent activated nisin.

Baktericíd obsahujúci nisin s EDTA je rýchlo baktericidne účinný, ako je doložené údajmi uvedenými v tabuľke 13A. Suspenzie 10⁷ buniek/ml grampozitívnych baktérií S. mutans boli inkubované vo 20 mM Tris tlmivého roztoku, pH 7,3 pri teplote 37°C, pri rôznych koncentráciách nisínu aktivovaného 1 mM EDTA. Suspenzie boli inkubované rôzne dlhú dobu v rozmedzí od 0,5 do 60 minút s baktericídmi. Baktericídna účiiuiosť baktericídov bola hodnotená stanovením percent prežívajúcich baktérií. Pri pôsobení EDTA je malé množstvo nisínu, ako 10 pg/rnl, v týchto prípravkoch schopné znížiť obsah baktérii rádovo 6-násobne v priebehu 1 minúty.The nisin-containing bactericide with EDTA is rapidly bactericidally active, as evidenced by the data presented in Table 13A. Suspensions of 10 ⁷ cells / ml Gram-positive S. mutans were incubated in 20 mM Tris buffer, pH 7.3 at 37 ° C, at different concentrations of nisin activated with 1 mM EDTA. The suspensions were incubated for varying periods of time ranging from 0.5 to 60 minutes with bactericides. The bactericidal activity of the bactericides was evaluated by determining the percentage of surviving bacteria. When treated with EDTA, a small amount of nisin, such as 10 µg / ml, in these formulations is able to reduce the bacterial content by the order of 6-fold within 1 minute.

Rýchla baktericídna účinnosť je tiež predpokladom pre účinnú dezinfekciu. Prípravky majú predpoklady byť účinnými baktericídmi najmä ako tu boli doložené ako zložky ústnej vody, výplachov, zubnej pasty alebo iných prostriedkov na ošetrenie zubov voči škvrnám tvoreným S. mutans.Rapid bactericidal efficacy is also a prerequisite for effective disinfection. The compositions are believed to be effective bactericides, particularly as exemplified herein as components of mouthwash, rinse, toothpaste, or other means of treating teeth against S. mutans stains.

Účinnosť nisínu zvýšená prítomnosťou EDTA voči gramnegatívnym baktériám po 2 až 3 hodinách bola doložená v príkladoch 1 až 7. Rýchla baktericídna účinnosť nisínu zvýšená prítomnosťou EDTA bola tiež pozorovaná voči gramnegatívnym baktériám a je doložená údajmi v tabuľke 13B.The efficacy of nisin enhanced by the presence of EDTA against gram-negative bacteria after 2-3 hours was demonstrated in Examples 1-7. The rapid bactericidal activity of nisin increased by the presence of EDTA was also observed against gram-negative bacteria and is illustrated by the data in Table 13B.

Tabuľka 13A 5Table 13A 5

Kinetika baktericidnej účinnosti nisínu zvýšená prítomnosťou EDTA voči Streptococcus mutansKinetics of bactericidal activity of nisin enhanced by the presence of EDTA against Streptococcus mutans

InkubaCM 4o6n nóty/ InkubaCM 4o6n sheet music/ 0 0 ntaín μ«/*1 ntaine μ «/ * 1 1.0 EDTA 1.0 EDTA 1 1 3 3 10 30 10 30 100 100 10 10 0.5 0.5 Š prežívajúcich· Š surviving · -αο-4 -αο-4 1 1 - - - - - - ^10’* <10* ^ 10 ’* <10 * <1O~* <1O ~ * 3 3 100 100 0.5 0.5 0.002 0.002 ^10“* <10** ^ 10 “* <10 ** - - 15 15 - - 0,03 0.03 -s 10-4 -s 10-4 -.10-* -.10- * - - 15 15 30 30 - - - - -í. 10-4 DATE. 10-4 - - - - 60 60 100 100 0.003 0.003 - - - - - -

“kontrolný obsah živých baktérií: 1,0 x 10⁷ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 7,3 pri teplote 37°C. 20'Control content of live bacteria: 1.0 x 10 ⁷ cfu / ml. Incubations were performed in 20 mM Tris-HCl, pH 7.3 at 37 ° C. 20

Tabuľka 13BTable 13B

Rýchla baktericídna účinnosť nisínu zvýšená EDTA voči Escherichia coliRapid bactericidal activity of nisin increased by EDTA against Escherichia coli

N EDTA N EDTA 0 0 0.3 0.3 nlBÍo 1.0 NLBI 1.0 ΜΟΛ* 1 3 10 30 100 1 * 1 3 10 30 100 25 25 1.0 1.0 100 100 í 00 í 00 56 56 * prežívaíúcluh· 0.37 0.013 0.015 0.008 * surviving · 0.37 0.013 0.015 0.007

Pri koncentrácii až do 0,1 % má potravinárska povrchovoaktívna látka monolaurín málo významnú baktericídnu aktivitu voči Streptococcus agalactiae v komplexnom prostredí mlieka. Nisín pri koncentráciách až do 0,2 pg/ml podobne nevykazuje v mlieku významnú baktericídnu aktivitu. Avšak kombinácia týchto dvoch činidiel, 0,1 % monolaurinu a nisínu 0,2 g/ml je extrémne účinná voči S. agalactiae. Tento baktericíd je viac ako 100-násobne účinnejší, ak by bol očakávaný aditívny účinok, a 10 000-násobne účinnejší ako pri zlúčeninách samotných. Ak je aplikácia nisínu obmedzená jeho dostupnou účinnosťou, je baktericíd obsahujúci nisín a povrchovoaktívnu látku možné výhodne použiť.At a concentration of up to 0.1%, the food surfactant monolaurine has little significant bactericidal activity against Streptococcus agalactiae in a complex milk environment. Similarly, Nisin at concentrations up to 0.2 pg / ml does not show significant bactericidal activity in milk. However, the combination of these two agents, 0.1% monolaurine and nisin 0.2 g / ml, is extremely effective against S. agalactiae. This bactericide is more than 100-fold more potent if an additive effect would be expected and 10,000-fold more potent than the compounds alone. If the application of nisin is limited by its available efficacy, the nisin-containing bactericide and the surfactant can be advantageously used.

Príklad, keď je aplikácia nisínu obmedzená jeho využiteľnou účinnosťou, je ilustrovaný údajmi v tabuľke 15B. I keď nisín a najmä baktericíd obsahujúci nisín a EDTA je baktericídne účinný voči L. monocytogenes, údaje v tabuľke 15B dokladajú, že v komplexnom médiu podobnom mlieku je využiteľná účinnosť nisínu voči tomuto organizmu obmedzená. Jednako však baktericíd obsahujúci nisín s glyceridom, tnonooleátom je v mlieku účinný voči potravinárskym patogénoin, aj keď monooleát samotný nie je voči tomuto organizmu baktericídne účinný.An example where the application of nisin is limited by its useful efficiency is illustrated by the data in Table 15B. Although nisin, and in particular the nisin-containing bactericide and EDTA, are bactericidally active against L. monocytogenes, the data in Table 15B show that the useful activity of nisin against this organism is limited in a complex milk-like medium. However, a nisin-containing bactericide with glyceride, monooleate, is active in milk against food pathogenine, although the monooleate itself is not bactericidal against the organism.

Tabuľka 15ATable 15A

Baktericídna účinnosť nisínu voči Streptococcus agalactiae v mlieku pri teplote 37°C /aktivácia nisínu monolaurínom/.Bactericidal activity of nisin against Streptococcus agalactiae in milk at 37 ° C (activation of nisin by monolaurin).

počiatočný obsah živých baktérií: 1,0 x 10⁷ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 pri teplote 37°C.initial live bacteria content: 1.0 x 10 ⁷ cfu / ml. Incubations were performed in 20 mM Tris-HCl, pH 7.0 at 37 ° C.

Príklad 14Example 14

Vplyv bivalentných katiónov na zvýšenie aktivity nisínu vplyvom EDTA.Effect of bivalent cations on the increase in nisin activity by EDTA.

Bivalentné katióny sa viažu s EDTA a druhými komplexotvomými činidlami a bolo by možné predpokladať, že budú neutralizovať aktiváciu nisínu EDTA. Avšak ako je vidieť z tabuľky 14, baktericídna účinnosť nisínu voči S. mutans je zvýšená pri 1 mM EDTA i v prítomnosti 1 mM Ca²⁺ iónu. Len koncentrácia Ca²⁺iónu vyššia ako 3 mM inhibuje aktiváciu nisínu EDTA. Toto je zvlášť dôležité v ústnych vodách, kde sú koncentrácie vápnikových iónov dôležité.Divalent cations bind with EDTA and second complexing agents and would be expected to neutralize the activation of nisin EDTA. However, as can be seen from Table 14, the bactericidal activity of nisin against S. mutans is increased at 1 mM EDTA even in the presence of 1 mM Ca ²⁺ ion. Only a Ca ²⁺ ion concentration greater than 3 mM inhibits the activation of nisin EDTA. This is particularly important in mouthwashes where calcium ion concentrations are important.

Tabuľka 14Table 14

Rýchla baktericídna účinnosť nisínu aktivovaná EDTA v prítomnosti bivalentného katiónu voči Streptococcus mutans nie /n onolaurín /*/Rapid bactericidal activity of nisin activated by EDTA in the presence of a bivalent cation to Streptococcus mutans ne / n onolaurin / * /

0.0100:01

0.1 nisín CaCla aK0.1 nisin CaCla aK

C O.l 0,3 1.0 3 10 oC O.l 0.3 1.0 3 10 o

0.0200:02

0.20.2

100100

2.2 * prefívaiúctch po 2 h*2.2 * after 2 hours *

100 4.5100 4.5

100 0.2100 0.2

0.05 0.0008 “ počiatočný obsah živých baktérií: 6,0 x 10⁷ cfu/ml. Inkubácie boli urobené v mlieku pri teplote 37°C. Tabuľka 15B0.05 0.0008 "initial living bacteria content: 6.0 x 10 ⁷ cfu / ml. Incubations were performed in milk at 37 ° C. Table 15B

Baktericídna účinnosť nisínu voči Listeria monocytogenes v mlieku pri teplote 37“C /aktivácia monooleátom/.Bactericidal activity of nisin against Listeria monocytogenes in milk at 37 ° C (activation with monooleate).

nla ín » aoaooleátualaine oaooleate

0.10.1

1.0 * prežívajúcich po 2 I?1.0 * surviving after 2 I?

O 100 G?About 100 G?

100 0.56 10-’100 0.56 10-

10-4 ^a počiatočný obsah živých baktérií: 5,0 x 10⁷ cfu/ml. Inkubácie boli urobené v mlieku pri teplote 37°C.10-4 ^and initial live bacteria content: 5.0 x 10 ⁷ cfu / ml. Incubations were performed in milk at 37 ° C.

Z prežívalúcich yo 1 ain* 0 100Of survivors yo 1 ain * 0 100

3.93.9

3“ 3 ' 0.0042 0.0042 0.0042 0.053 0.0042 0.053 18 18 30* * 30 0.0019 0.0019 0.0003 0.0003 0.0004 0.06 0.0004 0.06 6.8 6.8 100* 100 * <10-* <10- * <10-* <10- * -CJ.0-* 0,0001 -CJ.0- * 0.0001 1.5 1.5

^E 1 mMNaiEDTA “počiatočný obsah živých baktérií: 1,0 x 10² cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 10 % fetálnom teľacom séru pri teplote 37°C. ^E 1 mM NaEDTA " Initial living bacteria content: 1.0 x 10 ² cfu / ml. Incubations were performed in 10% fetal calf serum at 37 ° C.

Príklad 15Example 15

Účinnosť nisínu a povrchovoaktívnej látky voči grampozitným baktériám.Efficacy of nisin and surfactant against Gram-positive bacteria.

Baktericídna účinnosť nisínu môže byť významne zvýšená, ak sa spojí so samotnou povrchovoaktívnou látkou. To je najlepšie ilustrované pri limitnej koncentrácii nisínu /0,2 pgAnl/, ako je uvedené v tabuľke 15A.The bactericidal activity of nisin can be significantly enhanced when combined with the surfactant itself. This is best illustrated at the limiting nisin concentration (0.2 pgAnl) as shown in Table 15A.

Claims

PATENT CLAIMS

A composition comprising a lanthionine-containing bacteriocin selected from the group consisting of nisin, subtilin, epidermin, cinnamycin, duramycin, ancovenin and Pep 5 and a complexing agent selected from the group consisting of alkylamidine tetraacetates, EGTA and citrate and / or a surfactant.

The composition of claim 1, wherein the complexing agent is selected from the group consisting of alkyl amidine tetraacetates, CaEDTA, Na 2 CaF.DTA, EGTA, and citrate.

The composition of claim 2. characterized in that the alkylamidine tetraacetate is EDTA and the bacteriocin is nisin

4. The composition of claim 1, wherein the surfactant is selected from the group consisting of Tritons, Tweens, glycerides, fatty acids, emulsifiers, quaternary compounds, amphotema, and anionic surfactants.

5. The composition of claim 1, further comprising a food preservative.

An extended range bactericide comprising a carrier, a lanthionine-containing bacteriocin and a complexing agent and / or a surfactant.

The extended range bactericide of claim 6, wherein the lanthionine-containing bacteriocin is selected from the group consisting of nisin, subtilin, epidermin, cinnamycin, duramycin, ancovenin and Pep 5 and the complexing agent is selected from the group consisting of alkylamidine tetraacetates, EGTA and citrate. and the substances are present in an amount such that the bactericide has enhanced activity against at least one of the bacteria selected from the group consisting of Staphylococcus aureus, Strptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Streptococcus agalactiae, Corynefonn bacteria, Salmonella typhimurium, Escherichlaudia coli, Bacterioides gingivalis and Actinobacillus actinomycetescomitans.

8. The bactericide of claim 6, wherein the alkylamidine tetraacetate is EDTA.

9. The bactericide of claim 6, wherein the surfactant is selected from the group consisting of Tritons, Tweens, glycerides, fatty acids, quaternary compounds, emulsifiers, amphoteric, and anionic surfactants, and is present in an amount sufficient to: the bactericide has enhanced activity against at least one bacterium from the group consisting of gram-negative and gram-positive bacteria.

The bactericide of claim 7, wherein the nisin concentration is between about 0.1 pg / ml and 300.0 pg / ml and the concentration of the complexing agent is between about 0.1 mM and 20 mM.

The bactericide of claim 9, wherein the surfactant concentration is between about 0.01% and 1.0%.