SK277796B6 - Agent containing nisine for using as bactericide with extended range - Google Patents

Description

Vynález sa týka prípravku obsahujúceho nisín na použitie ako baktericídu. Nisín je polypeptid majúci antibakteriálne vlastnosti a je priamo produkovaný rôznymi kmeňmi baktérií Streptococcus lactis. Je známy ako konzervačné činidlo potravín inhibujúce vonkajší rast spór určitých grampozitívnych Bacilli.

Doterajší stav techniky

Hoci sa niekedy chybne a celkom nepresne pokladá za antibiotikum, je nisín presnejšie klasifikovaný ako bakteriocín, to znamená, látka bielkovinovej povaliy produkovaná baktériami, majúci antibakteriálnu účinnosť len nedruhy blízko príbuzné baktériám, ktoré ho produkujú. Nisín je prirodzene sa vyskytujúca konzervačná látka, ktorá bola v nízkych koncentráciách nájdená v mlieku a syroch a predpokladá sa, že je celkom netoxická a nealergizujúca pre človeka.

Novo bol nisín uznaný FDA ako neškodný pre použitie vo forme priamej potravinovej prísady v pasterizovaných syrových nátierkách a pasterizovaných nátierkách z topených syrov a pasterizovaných nátierkách z topených syrov s ovocím, zeleninou alebo mäsom. Navyše s ohľadom na to, že ide o polypeptid, sú každé rezíduá nisínu v potravinách rýchlo strávené.

Súhrn vlastnosti nisínu je uvedený v práci Hursta A., Advances in Applied Microbiology 27: 85-123 /1981/. Táto publikácia uvádza všeobecné poznatky o nisíne. Nisín produkovaný baktériami Streptococcus lactis je obchodne dostupný ako nie čistý prípravok Nisapin , vyrábaný firmou Aplin & Barrett Ltd., Dorset, GB, a je možné ho získať izoláciou prirodzene sa vyskytujúceho nisínu z kultiir Streptococcus lactis a koncentrovaním nisínu známymi postupmi. Uvádzané sú aj spôsoby výroby nisínu s použitím iných druhov Streptococcus. Pozri Gonzales a spol., US patent č. 4716115, vydaný 29. 12. 1987. Tiež by bolo možné vyrábať nisín technológiou rekombinácie DNA.

Nisín bol úspešne použitý ako konzervačný prostriedok pri mliečnych výrobkoch, ako sú topené syry, smotana a mlieka. Použitie nisínu pri topených syroch bolo predmetom patentov v poslednej dobe. Pozri US patent č. 4584199 a 4597972. Použitie nisínu na inhibíciu rastu určitých grampozitívnych baktérií je veľmi dobre dokumentované. Jednako len celkom úspešnému a prijateľnému použitiu nisínu ako konzervačného prostriedku potravín dosiaľ bránil názor, že nisín nie je účinný voči gramnegatívnym a mnohým grampozitívnym baktériám. Gramnegatívne baktérie sú takmer vždy prítomné v spojení s grampozitívnyini baktériami a sú hlavným zdrojom kontaminácie a znehodnotení potravín. Pozri Taylor, US patent č. 5584199, vydaný 22. apríla 1986, a TaylorUS patent č. 4597972, vydaný 1. júla 1986, Tesi a Sandine, Conjugal Transfer of Nisín Plasmid Genes from Streptococcus Lactis 7962 to Leuconostoc Dextranicum 181, Applied and Environmental Microbiology, február 1987, str. 352: A Naturel Preservative, Food Engineering Inť 1, máj 1987, str. 37-38: Focus on Nisin'', Food Manufacture, marec 1987, str. 63.

Podstata vynálezu

Na rozdiel od predchádzajúcich poznatkov bolo teraz zistené, že prípravky obsahujúce nisín v kombinácii s rôznymi nebaktericídnymi prostriedkami majú zvýšenú baktericídnu účinnosť voči gramnegatívnym baktériám rovnako ako zvýšenú účinnosť voči širšiemu spektru grampozitívnych baktérií, ako nisín samotný. Zvýšená baktericídna účinnosť voči grampozitívnym baktériám sa prejavuje v širšom rozmedzí pH, ako sa prv uvádzalo. Vynález poskytuje bakteriocínové kompozície nisínu alebo iných lantionín obsahujúcich bakteriocínov v kombinácii s rôznymi nebaktericídnymi látkami, napríklad komplexotvomými činidlami alebo povrchovoaktívnymi látkami. Vynález ďalej poskytuje tieto kompozície /prípravky/, rozpustené alebo suspenzované vo vhodnom nosiči so zvýšeným širokým spektrom baktericídnej účinnosti.

Konkrétne bolo zistené, že roztok, obsahujúci asi 0,1 Ug/ml až 300 pg/ml v prítomnosti asi 0,1 mM až 20 mM kompexotvomého činidla, napríklad EDTA, prakticky eliminuje rast gramnegatívnych baktérii, ako sú Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Baktrioides gingivalis, Actinobacillus actinoinycetescomitans a Klebsiella pneuinoniae a je účinnejší voči grampozitívnym baktériám, ako je Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Streptococuus agalactiae a Coryneform bacteria, ako nisín samotný. Hoci bolo zvýšenie účinnosti nisínu prítomnosťou komplexotvorného činidla závislé od koncentrácie činidla, koncentrácie EDTA prevyšujúce 20 mM inhibovali napriek očakávaniu baktericídnu účinnosť nisínu. Predsa len v prítomnosti bielkovinového nosiča a polyvalentných polymérov, ako je sérový albumín, kolagén, kasein a keratín, bola inhibícia nisínu vyššími koncentráciami významne znížená, a tým sa rozširuje užitočný rozsah zvýšenia účinnosti nisínu pomocou EDTA.

Bolo tiež zistené, že roztok obsahujúci 0,1 pg/ml až 300 pg/ml nisínu a asi 0,01 mM až 20 mM komplexotvomého činidla vykazuje ďalšie zvýšenie účinnosti nisínu voči gramnegatívnym a grampozitívnym baktériám v prítomnosti asi 0,0) % až 1,0 % povrchovoaktívnej látky. Navyše bolo zistené, že v prítomnosti samotnej povrchovoaktívnej látky má nisín zvýšenú účimtosť voči grampozitívnym baktériám.

V predloženom vynáleze vhodné komplexotvomé činidlá obsahujú, ale nie sú obmedzené len na ne, EDTA, CAEDTA, CaNaiEDTA a ďalšie alkyldiaminotetraacetáty, EGTA a citrát. Povrchovoaktivne látky, používané ako čistiace prostriedky, vhodné na kombináciu s nisinom s alebo bez EDTA obsahujú, ale nie sú obmedzené len na ne, neinogénne tenzidy Tweeny, Tritóty a glyceridy, ionogénne tenzidy, ako sú mastné kyseliny, kvartéme zlúčeniny, aniónové tenzidy, ako je dodecylsulfát sodný a amfotéme tenzidy, ako je kokamidopropylbetain a emulgátory.

Pretože grampozitívne a gramnegatívne baktérie sa nachádzajú takmer vždy v potravinách spoločne, účinnosť nisínových prípravkov na gramnegatívne baktérie, ako sú Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella pnetunoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gingivalis, Actinobacillus actinoinycetescomitans a ďalšie gramnegatívne patogény a grampozitívne baktérie, bude mať veľké uplatnenie. Tieto bakteriocidy sú predovšetkým vhodné na obmedzenie a prevenciu kontaminácie surovín pripravovaných potravín a nápojov bakteriálnymi patogémni a ostatnými znehodnocujúcimi mikrobálnymi organizmami. Možné použitie sa týka ošetrení mäsa, najmä hydiny, vajec, syrov a rýb a ošetrenia obalov potravín a manipulačného zariadenia. Ďalšie použitie majú ako konzervačný prostriedok potravín, a to topených syrov, smotany, mlieka, mliečnych výrobkov, pri spracovaní hydiny, rýb, mäsa, zeleniny a v mliekárenskom a potravinárskom zariadení. Použitie nisínových prípravkov nie je obmedzované len na použitie pri potravinách a môže byť vhodné v každej situácii, pri ktorej je nutné alebo žiaduce eliminovať gramnegatívne a grampozitívne baktérie.

Prípravky môžu byť rozpustené vo vhodnom nosiči, napríklad vo vodnom rozpúšťadle, alebo tlmivom roztoku, alebo môžu byť suspendované v akomkoľvek vhodnom kvapalnom, koloidnom alebo polymérnom základe za vzniku baktericídov. Prípravky alebo baktericídy môžu byť spracované do mastí alebo obkladov na lekárske použitie, ako je liečenie infekcií, ošetrenie rán alebo chirurgických implantácií, ako širokospektrálny dezinfekčný prostriedok vo forme orálnych alebo kožných výplachov, na dezinfekčné kefy, uteráky alebo roztoky. Baktericídy môžu byť použité na čistenie lekárskych nástrojov, predoperačných chirurgických kief a pod.. Baktericídy sú zvlášť vhodné v tých prípadoch, keď je požadovaná dezinfekcia prostredia, ale keď je potrebné chemické germicídy vylúčiť z dôvodov rizika korózie alebo toxických rezíduí.

Na rozdiel od účinnosti širokospektrálnych germicídných prípravkov, ktorá je pri väčšine z nich ovplyvňovaná prítomnosťou komplexných organických látok, sú prípravky podľa vynálezu účinné ako baktericídy aj v prítomnosti organických látok, ako je mlieko alebo sérum.

O nisíne bolo známe, že optimálne inhibuje rast niekoľkých blízko príbuzných grampozitívnych druhov baktérii, predovšetkým grampozitívnych baktérií, tvoriacich spóry pri pH 5,0. Baktericídna účinnosť nisínu v roztoku s koinplexotvomým činidlom bola nezvyčajne rýchla a značne zvýšená smerom k širokému spektru grampozitívnych baktérií pri hodnotách pH vyšších ako 5,0 a navyše sa objavila účinnosť na gramnegatívne baktérie tak v kyslom, ako aj v alkalickom prostredí, výhodne pri rozmedzí pH 5,0 až 8,0. Táto neočakávane rýchla a širokospektrálna baktericídna účinnosť nisínu, aktivovaného komplexotvomým činidlom, ho robí použiteľným medzi inými aplikáciami ako dezinfekčného prostriedku.

Nisín prináleží do triedy peptidových bakteriocínov, obsahujúcich lantionín. Do tejto triedy sú tiež zahrnuté subtilín, epidermín, cinnamycín, durainycin, ancovenin a Pep. 5. Každý z týchto peptidových bakteriocínov je produkovaný iným mikroorganizmom. Jednako len bolo zistené, že subtilín, získaný z určitých kultúr Bacillus subtilis, a epidermín, získaný z určitých kultúr Staphylococcus epidennidis, majú molekulové štruktúry veľmi podobné nisínu /pozri Hurst, str. 85-86 a Schnell a spol., Náture, 333, 276-278/. Preto je možné predpokladať, že vďaka podobnosti molekúl budú aj ďalšie peptidové bakteriocíny, obsahujúce lantionín v kombinácii s koinplexotvomými a neinogénnymi tenzidmi eliminovať kontaminácie gramnegatívnymi a grampozitívnymi mikróbmi.

Využitie účinnosti nisínu a ďalších lantionín obsahujúcich peptidových bakteriocínov ako bakteriocídnych prostriedkov voči gramnegativnym baktériám je prekvapujúci, lebo dosial* * známe prostriedky túto účinnosť nepripúšťali. Rovnako zvýšená účinnosť nisínu v prítomnosti EDTA voči grampozitívnym baktériám pri hodnotách pH vyšších ako 5,0, je neočakávaná, lebo sa pred pokladalo, že optimálna účinnosť nisínu je pri pH 5,0. Mimo to objav týchto účinkov nisínu, lantionín obsahujúcich peptidových bakteriocínov, a ich využitie ako baktericídov vypĺňa dlhotrvajúcu potrebu prijateľného, prírodného, netoxického prostriedku voči širokému spektru baktérií v odbore konzervácie potravín.

Pre znázornenie výhodného a nečakane rýchlehoúčinku zmesi obsahujúcej nisín, EDTA a/alebo rôzne povrchovoaktívne látky, bol s uvedenými baktericídmi vyhotovený rad pokusov. Tieto pokusy sú ilustratívne a predložený vynález nie je nimi nijako obmedzovaný. Je možné predpokladať, že ďalšie bakteriocídy obsahujúce lantionín /peptidové bakteriocíny/ môžu účinne nahradiť nisín a takisto iné komplexotvomé činidlá môžu nahradiť EDTA.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Všetky testy v nasledujúcich príkladoch boli urobené pri teplote 37°C. Zvýšená širokospektrálna baktericidna účinnosť bola určovaná stanovením percentuálneho počtu prežívajúcich baktérií po ošetrení baktericídnym prostriedkom. Všeobecne bolo inkubovaných 10⁷ buniek sledovaného druhu v ml suspenzie s novým baktericidnym prostriedkom počas určitej doby a potom boli baktérie izolované odstredením počas 2 minút. Zo zhluku baktérií bol potom baktericid vymytý pomocou tlmivého roztoku, označovaného tu ako Phagov tlmivý roztok. /50 ml Tris-HCl tlmivý roztok pH 7,8; 1 mM MgSO<, 4 mM CaCl₂, 0,1 M NaCl a 0,1 % želatíny/, baktérie boli potom znova suspendované a postupne riedené do Phagovho tlmivého roztoku a 100 ml baktérií bolo potom vnesených na živnú agarovú platňu. Počet prežívajúcich baktérií bol stanovený na základe počtu vzniknutých mikrobiálnych kolónií /CFU/ po inkubácii počas 24 až 48 hodín pri teplote 37°C. Účinný baktericid podľa predloženého vynálezu je taký, keď prežíva menej ako 0,1 % baktérií z pôvodného počtu životaschopných baktérií.

Príklad 1

Účinnosť nisínu a komplexotvomého činidla voči gramnegativnym baktériám /S. typhimurium/.

Ako vidno z tabuľky 1, na potvrdenie účinku baklericídu obsahujúceho samotný nisín a nisín s komplexotvomýin činidlom EDTA, boli urobené dva testy vo 20 mM Tris pri pH 8,0 a pri teplote 37°C. Kontrolný test bol urobený bez EDTA a aiázorňuje účinok samotného nisínu na gramnegatívne baktérie S. typhimurium. Zvýšené koncentrácie nisínu vykazujú určité zvýšenie účinnosti, no aj účinnosť vyšších koncentrácií v neprítomnosti EDTA pri dávke 100 pig/ml nisínu prežitie 1,6 % je celkom nedostatočné pri použití ako konzervačného prostriedku potravín. Hodnoty baktericídnej účinnosti získanej pre nisín s EDTA sú významné.

Tabuľka 1 p&jodný Ei»T> m x í n /*w4/al/ počet «· živých 0 10 30 90 1OO 300 txkUOri i * prežitia 5.Uvptolaurlua po 3 hodínách j 3.0 k 10* 0 100 51.3 - 7.0 i.fc

3.7 x 10* ZO 2.5 10 ^a - ·<1Ο^-*«ClO’*

Test ** /tabuľka 1/, urobený s použitím nisínu s 20 mM EDTA, znázorňuje prekvapujúcu účinnosť anesi nisínu pri eliminácii sledovaných gramnegatív3 nych baktérii.

Z tabuľky 1 je zrejmé, že v teste ** pri koncentrácii 20 mM EDTA a 30 gg/ml nisinu má tento baktericíd významnú baktericidnu účinnosť na S. typhimurium, zatiaľ čo pri koncentráciách nisinu 100 pg/ml a vyššej, bektericídna zmes nisinu a EDTA baktérieprakticky eliminuje /% prežitia nižšie ako 10~* značí, že pri stanovení neboli zistené žiadne prežívajúce baktérie/. Komhinfcie EDTA a nisinu teda vykazuje synergickú účinnosť viac ako tisícnásobnú s ohľadom na samotný nisín. Príklad 2

Účinnosť nisinu, komplexotvomého činidla a povrchovoaktívnej látky voči gramnegatívnym baktériám ZS. typhimurium/.

Na stanovenie účinku baktericídu obsahujúceho nisin a tak EDTA, ako aj povrchovoaktivnu látku Tritón X-100 na S. typhimurium boli urobené štyri pokusy /tabuľka 21 vo 20 mM Tris, pH 8,0 pri teplote 37’C. Kontrolný pokus /*#/ bol rovnaký ako kontrolný pokus v príklade 1 /tabuľka 1 /.

Tabuľka 2

Prítomnosť neinogénnej povrchovoaktívnej látky, Tritónu X-100 v kombinácii s EDTA zvyšuje účinnosť nisinu na gramnegativne baktérie, a to ešte viacej, ako vykazuje baktericíd obsahujúci len nisín a samotnú 5 EDTA/príklad 1/.

Príklad 3

Účinnosť nisinu, komplexotvomého činidla a povrchovoaktívnej látky voči gramnegatívnym baktériám /S. typhimurium/.

Tabuľka 2 dokladá zvýšenú aktivitu baktericídu obsahujúceho nisín, 20 mM komplexotvomého činidla EDTA a neionogénnej povrchovoaktívnej látky Tweenu 20 voči S. typhimurium v 20 mM Tris, pH 8,0 pri teplote 37°C. Kombinácia nisinu a EDTA s /1 %/

Tweenu 20 je účinnejšia, ako kombinácia s Tritónom X-100 /príklad 21.

Tabuľka 3

Twt	póvodmŕ podot	EDTA AM/	Tvec· 20	leín	Zpf/·!/
	živých		Λ/ O	10 30	50 100 300
	tMkUín í

o

O r- O r O r

U

l	3.0 M	10*	0	t O 10O	S. typhtnurlu· prví íva Jdclcb pu 3 Itodlnéch 51.3 - 7.0 1.6
2	5.7 m	10*	30	0 3.5	- -^10> - -<rlO—< Cti)-*
3	4.3 m	10*	20	1.0 to-*	- -cio-* - -cio* <to-<

Príklad 4

Účinnosť nisinu, komplexotvomého činidla a povrchovoaktívnej látky voči gramnegatívnym baktériám /Escherichia coli/.

Aktivita baktericídu obsahujúceho nisín a EDTA voči gramnegativnej baktérii E. coli, ktorá bola stanovená, je uvedená v tabuľke 4.

Tabuľka 4

35		pAutMÍný POČvt Sivých baktérií	ετ>τΑ AM/	Tri X-100 Z8Z	olaín 0 30	/ira/bi/ 1OO	300
					* E.coli	pr«žív«14ci	1 ch
					po	*d hodinách
	1	1.0 K 10'	0	0	100 2?	25	8.5
40	2	1.0 M 10'	20	0	14.5 0.86	0.01	0.001
3	1.0 m 107	0	1.0	100	30	-
	4	1.0 M 107	20	1.4	1.2 0.8	0.05	c: ίο-·

Iwly e · t>ea EDTA boli urobené v 30 nK Tri· tlatvého roztoku o pH 8,0 pri teplote '37 ^UĽ. · poflatoCný· poCto·

“b

O

o o o- oO ιΛ ΙΛ x- ry

Pokus /tabuľka 21 bol urobený s použitím nisinu a 1 % Tritónu X-100, no bez EDTA. Prítomnosť detergentu samotného inhibuje účinnosť nisinu na gramnegatívne baktérie a nisín je neúčinný. Podľa pokusov **3 a **4, ktoré predstavujú uskutočnenie podľa vynálezu, je prítomnosť 20 mM EDTA v kombinácii s Tritónom X-100 baktericídom, významne zvyšujúcim baktericidnu účinnosť nisinu na S. typhimurium. V skutočnosti kombinácia Tritónu X-100 s EDTA, no bez nisinu, bola účinná, aj keď v menšej miere, ako v prítomnosti nisinu. Kombinácie nisinu, použité pre pokusy **3 a **4 /tabuľka 2/ boli veľmi účinné, najúčinnejšia bola koncentrácia Tritónu X-100 1 % /test **4, tabuľka 21.

Testy s a bez EDTA boli urobené v 20 mM Tris tlmivého roztoku s pH 8,0 pri teplote 37°C, s počiatočným počtom živých mikroorganizmov 1 x 10⁷ buniek E. coliúnl. Funkcia baktericídu bola meraná ako percentuálny počet baktérii prežívajúcich po 2 hodinách.

V teste **1 /kontrolný, tabuľka 4/ bez EDTA, vykazuje nisín málo významnú účinnosť pri eliminácii E. coli. V teste ## /tabuľka 4/, keď je prítomných 20 mM EDTA, vykazuje podstatnú aktivitu voči baktériám E. coli. Aktivita sa zvyšuje so stúpajúcou koncentráciou nisinu. Kombinácia nisinu s EDTA ako baktericíd preukazuje tisícnásobne vyššie synergické zvýšenie voči E. coli, V testoch *#3 a **4 /tabuľka 4/ je možné pozorovať, že Tritón X-100 nemá významnú baktericidnu účinnosť voči E. coli. Tritón X-100 pôsobí tak, že iluiibuje účinnosť voči gramnegatívnym baktériám, ako bolo zistené u S. typhimurium /tabuľka 21. Avšak všeobecné zvýšenie aktivity nisinu pomocou EDTA podstatne mení inhibičné účinky Tritónu X-100, ako je zrejmé z tabuliek 2 a 4.

Tak bolo zistené, že baktericíd obsahujúci nisín a komplexotvomé činidlo, ako je EDTA, je účinným konzervačným činidlom potravín voči rôznym typom

SK 277796 Β6 gramnegatívnych baktérií i v prítomnosti povrchovoaktivnych látok.

Príklad 5

Účinnosť nisínu a komplexotvomého činidla voči gramnegatívnym baktériám /Klebsiella pneumoniae/. 5

Účinok baktericidu obsahujúceho nisín a EDTA a samotný nisín voči gramnegatívnym baktériám K. pneumoniae je uvedený v tabuľke 5.

Tabuľka 5	TriUfa ir-ioo Λ/	0	nisín 30 100	300	10
Twl	pOvodný pcfvt. živých bAkWrlí	EDTh Λ*/
				* prežívajúcich po 2	hadinJch
1	10’	0	0	100	- 90	30
2	10y	20	0	22	0.5 1.	i s.oas	15

Dva testy, jeden s a jeden bez EDTA /kontrolný/ boli urobené vo 20 mM Tris tlmivého roztoku, pH 8,0 pri teplote 37°C s počiatočným počtom živých baktérií K. pneumoniae 10' buniekánl. Účinok bol hodnotený 20 ako percentá baktérií, prežívajúcich po dvoch hodinách.

V teste *xl /kontrola, tabuľka 5/ bez EDTA, vykazuje nisín málo významnú baktericidnu účinnosť voči K. pneumoniae. V teste **2 /tabuľka 5/ v prítomnosti 20 mM EDTA, vykazuje baktericíd podstatnú účinnosť 25 voči K. pneumoniae. Účinnosť zvyšuje so stúpajúcou koncentráciu nisínu.

Príklad 6

Účinnosť nisínu voči gramnegatívnym baktériám /Salmonella typhimurium/ je závislá od koncentrácie ^0 komplexotvomého činidla.

Údaje z tabuľky 6 ukazujú, že zvýšenie aktivity nisínu voči gramnegatívnym baktériám /S. typhimurium/ je závislá od koncentrácie EDTA v 50 mM acetátu sodného pH 5,0 alebo vo 20 mM Tris, pH 8,0 pri teplote ⁵⁵ 37°C.

Tabuľka 6 koncentrácii EDTA až do 100 mM bez nisínu vykazuje málo významnú aktivitu voči S. typhiinurium alebo pri pH 5,0 M*1 /, alebo pH /*#3/ 8,0. V testoch a **4 /tabuľka 6/,keď bolo prítomných 100 pg/ml nisínu v kombinácii s EDTA, vykazuje baktericíd významnú aktivitu voči S. typhimurium. Účinnosť baktericídov bola podobná v kyslej oblasti pH /0,8/, aj keď je známe, že aktivita samotného nisínu voči grampozitívnym baktériám je optimálna pri pH 5,0.

Zvýšenie účinnosti nisínu prítomnosťou EDTA bolo závislé od koncentrácie EDTA a bolo optimálne v rozmedzí 0,2 mM až 10 mM pri pH hodnotách 5,0 až 8,0. S prekvapením bolo zistené, že pri koncentrácii vyššej, ako 10 mM EDTA, sa zvyšovanie účinnosti EDTA znižuje, zníženie účinnosti je výrazne vyššie pri pH 8,0; ako pri pH 5,0.

Príklad 7

Nisín a komplexotvomé činidlo voči gramnegatívnym baktériám /S. typhimurium/.

Zvýšenie účinnosti nisínu v prítomnosti EDTA voči gramnegatívnym baktériám v prítomnosti biologického tkaniva je demonštrované s S. typhimurium na kuracom svale, výsledky sú uvedené v tabuľke 7. Tabuľka 7

CJ

I

UX Q m

o o

o

o r“

K κχ

Q

IÍX

*0 r*

X «X

O i/X

“o x

ux o

U)

X uX

O

O) ťy

HX st r

O ry S ôT O

o

O

Q

CO r- UX Oj

O Q O

O Ú O O Q in m hx

O O O O Φ ď\ yx ui <0 <D r OJ 4 tri

Inkubácia bola urobená alebo v 50 mM octanu sodného pH 5,0 alebo 20 mM Tris, pH 8,0 pri teplote 37'C.

Kocky kuracieho svalu boli pred použitím čistené chlomanom sodným a povidonjodidom. Na inokuláciu tkaniva boli kocky kuracieho svalu ponorené do suspenzie 10⁶ buniek/ml S. typhimurium vo 20 mM Tris HC1, pH 8,0. Prebytok vllikosti bol odstránený z ponorených kociek strepaním. Vzorky kuracieho tkaniva boli ponorené do tlmivého roztoku obsahujúceho prí5

SK 27779í B6 pravek s nisinom, dostatočného na prekrytie tkaniva a inkubované pri teplote 37°C počas dvoch hodín, potom bolo tkanivo premiestnené do Phagovho tlmivého roztoku použitého, v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva. Baktérie ostávajúce v testovanom roztoku boli oddelené odstredením, premytím Phagovým tlmivým roztokom a spojené s baktériami získanými vymytím z tkaniva Phagovým tlmivým roztokom. Spojené vzorky /označené nezadržané bunky/ boli sériovo zriedené a 100 μΐ podiely boli použité na stanovenie prežívajúcich baktérií.

V testoch **1 a *#3 /tabuľka 7/, v neprítomnosti nisínu alebo pri pH 5 alebo pH 8, EDTA samotná nemá významný vplyv na prežívajúce S. typhiinurium. V testoch a /tabuľka 7/, v prítomnosti 300 pg/ml nisínu vykazovateli baktericidy významnú aktivitu voči S. typhimurium na kuracích svaloch pri obidvoch hodnotách pH 5,0 a pH 8,0.

Zvýšenie aktivity nisínu prítomnosťou EDTA bolo závislé od jej koncentrácie, optimálna koncentrácia bola v rozmedzí 0,3 mM až 10 mM EDTA pri obidvoch hodnotách pH 5,0 a 8,0. Pri koncentrácii vyššej ako 10 mM pri pH 8,0 bola aktivácia nisínu EDTA znížená. Avšak ako je vidieť z testu #*5 /tabuľka 7/, v prítomnosti 1,0 % hovädzieho sérového albumínu pri hodnote pH 8,0, účinok nisínu voči S. typhimurium na kuracom svale je vyjadrený v závislosti na koncentráciách EDTA až do 100 mM.

Baktericidy obsahujúce nisín a nízke koncentrácie komplexotvomého činidla, ako je EDTA, v rozmedzí 0,1 mM až 20 mM, môžu byť zvlášť účinné na elimináciu alebo prevenciu kontaminácie potravín gramnegatívnymi baktériami.

Príklad 8

Titrácia nisínovej aktivity voči gramnegativnym baktériám /S. typhimurium/.

Pri optimálnej koncentrácii komplexotvomého činidla bola účinnosť baktericídov v Tris tlmivom roztoku

V teste **2 /tabuľka 8/ je zrejmé, že malé množstvá nisínu, ako je 0,3 pg/ml, s 1,0 mM EDTA vo 20 mM Tris pri pH 8,0 v prítomnosti 1,0 % hovädzieho sérového albumínu /BSA/, významne znižuje počet 5 prežívajúcich S. typhimurium. Baktericíd je aktívny voči gramnegativnym baktériám, ako je nisín samotný voči grampozitívnym Streptococci.

Príklad 9

Titrácia nisínovej aktivity voči gramnegativnym 10 baktériám /S. typhimurium/.

Pri optimálnej koncentrácii komplexotvomého činidla bola účinnosť baktericídu voči gramnegativnym baktériám v prítomnosti biologického tkaniva demonštrovaná s S. typhimurium na kuracom svale. Výsledky 15 sú uvedené v tabuľke 9.

Tabuľka 9

20	Tas	t pM	pôvodný počet Sivých baktérií	EDTA XWMZ	ESA /*/	0	BiafB /jtq/Ml/ 10 J00 200 300
					* I	prežíva14cicA po 2 hodinách
	1	8.0	3 x 10’	0	0	100
	2	8.0	3 x I07	1.0	t.o	27	0 26 0.008 0.007 0.006

voči gramnegativnym baktériám doložená ako podstatná, ako je uvedené v tabuľke 8.

Tabuľka 8

O

Kocky kuracieho svalu boli čistené chlomanom sodným a povidonjodidom. Pre inokuláciu tkaniva boli kocky kuracieho svalu ponorené do suspenzie obsahujúcej 10⁸ buniekánl S. typhimurium vo 20 mM Tris HC1, pH 8,0. Prebytočná vlhkosť bola z ponorených kociek strepaná. Tkanivo bolo umiestnené do tlmivého roztoku obsahujúceho nisínový prípravok. Tlmivý roztok bol použitý v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva a bola urobená inkubácia počas dvoch hodín pri teplote 37°C, potom bolo tkanivo prevedené do Phagovho tlmivého roztoku použitého v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva. Baktérie zostávajúce v testovanom roztoku boli oddelené odstredením, premyté Phagovým tlmivým roztokom a spojené s baktériami získanými vymytím z tkaniva Phagovým tlmivým roztokom. Spojené vzorky /označené ako nezadržané bunky/ boli sériovo zriedené a 100 μΐ podiely boli použité na stanovenie prežívajúcich baktérií.

Príklad 10

Účinnosť nisínu, EDTA a metylparabénu voči gramnegativnym baktériám /S. typhimurium/.

Baktericíd obsahujúci nisín a EDTA v spojení so známym prostriedkom na ochranu potravín, metylparabénom, bol doložený ako výnimočne účinný voči gramnegativnym baktériám, ako je uvedené v tabuľke 10.

Tabuľka 10

	Test H	pôvodný počet živých Uaktérlk	nisín	EDTA* /M Z	* aetyiparabénu O O.l	1.0
55					A prežívajúcich po 2	hodinách
	1	3 k 10*	O	10	11.0 1.0	10 ·«
	2	3 M 10*	300	1O	0.03 ^JO'3	xílO-*

O <*\ O «£

b 50 mM octanového sodného tlmivého roztoku c nezadržané bunky

Kocky kuracieho svalu boli pred použitím čistené chlomanom sodným a povidonjodidom. Pre inokuláciu tkaniva boli kocky kuracieho svalu ponorené do suspenzie obsahujúcej 10⁸ buniek/ml S. typhimurium v 50 mM tlmivého roztoku octanu sodného, pH 5,0. Prebytok vlhkosti bol odstránený z ponorených kociek strepaním. Tkanivo bolo umiestnené do tlmivého roz6 toku obsahujúceho nisínové prípravky v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva a inkubované dve hodiny pri teplote 37°C. Potom bolo tkanivo prevedené do Phagovho tlmivého roztoku použitého v množstve dostatočnom na prekrytie tkaniva. Baktérie zostávajúce v roztoku boli oddelené odstredením, premyté Phagovým tlmivým roztokom a spojené s baktériami získanými vymytím z tkaniva Phagovým tlmivým roztokom. Spojené vzorky /označené ako nezadržané bunky/ boli sériovo riedené a 100 μΐ podiely boli použité na stanovanie prežívajúcich baktérií.

V teste **1 /tabuľka 10/ vykazoval metylparabén v prítomnosti 10 mM EDTA účinnosť voči S. typhimurium len pri koncentrácii 1,0 %. V teste /tabuľka 10/, v prítomnosti 300 pg/ml nisínu, bola účinnosť metylparabénu a nisínu voči S. typhimurium podstatne zlepšená.

Prípravky obsahujúce nisin a EDTA významne zlepšujú využitie metylparabénu pri ochrane potravín. Ďalej baktericídy môžu podstatne znížiť koncentráciu alebo odstrániť potrebu bežne používaných, ale menej žiaducich prostriedkov na ochranu potravín, ako je metylparabén.

Príklad 11

Účinnosť nisínu a komplexotvomého činidla voči grampozitivnym baktériám /Staphylococcus aureus/.

Aktivácia nisínu komplexotvomým činidlom je závislá od pH. údaje v tabuľke 11 ukazujú, že pri pH 5,0 je nisin o niečo baktericidne účinnejší voči S. aureus, ako nisin pri pH 8,0. Pri pH 5,0 EDTA nezvyšuje účinnosť nisínu voči S. aureus a pri koncentrácii EDTA vyššej ako 10 mM, EDTA inhibuje baktericídnu aktivitu nisínu. Jednako však je baktericídna účinnosť nisínu aktivovaného EDTA pri pH 8,0 výrazne vyššia, ako baktericídna účinnosť samotného nisínu alebo pri kombinácii s EDTA pri pH 5,0.

Tabuľka 11

Účinnosť pH na vplyv EDTA na baktericídnu účinnosť nisínu voči Staphylococcus aureus

Ml.ín EDTA pH_______ΡΡ/·1 O O.l O.3 í.O 3.0 iO 30 1OO

0.0	0
8.0	3.0	7.4	0.03
9.0	0	100
9.0	3.0	0.6	1.0

* prečíva 1 tlc >cB po 2 h*
100 81	100 100	100
0.01 0.2	0.4 3	56
-	100	-
1.3 1.4	1.0	34 BO

a počiatočný obsah živých baktérií: 8,0 x 10⁶ cfu/ml. Inkubácia bola urobená v 50 mM tlinivom roztoku octanu sodného, pH 5,0 alebo vo 20 mM Tris-HCl tlmivého 5θ roztoku, pH 8,0 pri teplote 37°C.

Baktericídna účinnosť nisínu samotného je uvádzaná /pozri Hurst/ ako najvyššia pri pH 5,0 alebo nižšom a údaje v tabuľke to potvrdzujú. Na základe týchto znalosti sa predpokladalo, že baktericídna účinnosť nisínu s 55 EDTA voči S. aureus bude tiež vyššia pri nižšom pH. Ako je však vidieť z tabuľky 11 a proti očakávaniu /pozri tabuľka 6/, EDTA nezvyšovala účinnosť nisínu voči grampozitivnym baktériám pri pH 5,0. Inhibícia účinnosti nisínu pri vyšších koncentráciách EDTA bola ¢0 ešte pozorovateľná pri pH 5,0. Aktivácia nisínu komplexotvomým činidlom tak nie je závislá len od rozmedzia koncentrácií komplexotvomého činidla, ale, s ohľadom na grampozitívne baktérie, je závislá od pH s tým, že je pH v rozmedzí vyššom ako 5,0. ^5

Príklad 12

Účinnosť nisínu a komplexotvomého činidla voči grampozitivnym baktériám.

Účinky EDTA na baktericídnu účinnosť nisínu pri pH 8,0 nie sú obmedzené len na S. aureus, dôležitý ľudský patogén, no sú tiež pozorované so Streptococcus mutans, pôsobiacim zubný kaz /tabuľka 12A/, Listeria monocytogenes, patogén potravín /tabuľka 12B/ a so zmesnou populáciou pazušných Corynefonnných baktérií, ktoré spôsobujú telesný pach /tabuľka 12C/.

Tabuľka 12A

Účinok EDTA na baktericídnu účinnosť nisínu voči Streptococcus mutans

Klcín EDTA aN pM_______pg/nl 0 0.01 0,1 0.3 t,P 3,0 10 30 1OO * pr*C(vajtlcieh po 2 M

0.0 0 1OO - - - ·

B.O O.l 4.3 1.8 0.04 0.02 0.06 1 23 100 100 počiatočný obsah živých baktérií: 6,0 x 10⁶ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 pri teplote 37°C.

Tabuľka I2B

Účinok EDTA na baktericídnu účinnosť voči Listeria monocytogenes

Μ1·ίη pH		EDTA mM 0 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30	100
		A pr»£ív4l4c 1 ľIí pu 2 h*
8,0	0	100 - - 84 - - -	-
8.0	3.0	0.71 0.04 0.04 0,02 O.l 0.64 10	14

počiatočný obsah živých baktérií: 6,0 x 10⁶ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 pri teplote 37°C.

Tabuľka 12C

Účinok EDTA na baktericídnu účinnosť nisínu voči Coryneformným baktériám

Hl.Ír, EDTA nh pH MB/·! o______0.1______0,8 1.0 3.010 * prežívaliiclch po 2 h* 8.0 0 100 - 4.6 3.6 R36

8.0 3 0,22 0.03 0.0009 0.1 -0.16 “počiatočný obsah živých baktérií: 1,0 x 10⁶ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 pri teplote 37°C.

Príklad 13

Rýchla baktericídna účitmosť nisínu aktivovaného komplexotvomým činidlom.

Baktericíd obsahujúci nisin s EDTA je rýchlo baktericidne účinný, ako je doložené údajmi uvedenými v tabuľke 13A. Suspenzie 10⁷ buniek/ml grampozitívnych baktérií S. mutans boli inkubované vo 20 mM Tris tlmivého roztoku, pH 7,3 pri teplote 37°C, pri rôznych koncentráciách nisínu aktivovaného 1 mM EDTA. Suspenzie boli inkubované rôzne dlhú dobu v rozmedzí od 0,5 do 60 minút s baktericídmi. Baktericídna účiiuiosť baktericídov bola hodnotená stanovením percent prežívajúcich baktérií. Pri pôsobení EDTA je malé množstvo nisínu, ako 10 pg/rnl, v týchto prípravkoch schopné znížiť obsah baktérii rádovo 6-násobne v priebehu 1 minúty.

Rýchla baktericídna účinnosť je tiež predpokladom pre účinnú dezinfekciu. Prípravky majú predpoklady byť účinnými baktericídmi najmä ako tu boli doložené ako zložky ústnej vody, výplachov, zubnej pasty alebo iných prostriedkov na ošetrenie zubov voči škvrnám tvoreným S. mutans.

Účinnosť nisínu zvýšená prítomnosťou EDTA voči gramnegatívnym baktériám po 2 až 3 hodinách bola doložená v príkladoch 1 až 7. Rýchla baktericídna účinnosť nisínu zvýšená prítomnosťou EDTA bola tiež pozorovaná voči gramnegatívnym baktériám a je doložená údajmi v tabuľke 13B.

Tabuľka 13A 5

Kinetika baktericidnej účinnosti nisínu zvýšená prítomnosťou EDTA voči Streptococcus mutans

InkubaCM 4o6n nóty/	0	ntaín μ«/*1	1.0 EDTA
1	3	10 30	100	10
0.5			Š prežívajúcich·	-αο-4
1	-	-	-	^10’* <10*	<1O~*
3	100	0.5	0.002	^10“* <10**	-
15	-	0,03	-s 10-4	-.10-*	-	15
30	-	-	-í. 10-4	-	-
60	100	0.003	-	-	-

“kontrolný obsah živých baktérií: 1,0 x 10⁷ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 7,3 pri teplote 37°C. 20

Tabuľka 13B

Rýchla baktericídna účinnosť nisínu zvýšená EDTA voči Escherichia coli

N EDTA	0	0.3	nlBÍo 1.0	ΜΟΛ* 1 3 10 30 100	25
1.0	100	í 00	56	* prežívaíúcluh· 0.37 0.013 0.015 0.008

Pri koncentrácii až do 0,1 % má potravinárska povrchovoaktívna látka monolaurín málo významnú baktericídnu aktivitu voči Streptococcus agalactiae v komplexnom prostredí mlieka. Nisín pri koncentráciách až do 0,2 pg/ml podobne nevykazuje v mlieku významnú baktericídnu aktivitu. Avšak kombinácia týchto dvoch činidiel, 0,1 % monolaurinu a nisínu 0,2 g/ml je extrémne účinná voči S. agalactiae. Tento baktericíd je viac ako 100-násobne účinnejší, ak by bol očakávaný aditívny účinok, a 10 000-násobne účinnejší ako pri zlúčeninách samotných. Ak je aplikácia nisínu obmedzená jeho dostupnou účinnosťou, je baktericíd obsahujúci nisín a povrchovoaktívnu látku možné výhodne použiť.

Príklad, keď je aplikácia nisínu obmedzená jeho využiteľnou účinnosťou, je ilustrovaný údajmi v tabuľke 15B. I keď nisín a najmä baktericíd obsahujúci nisín a EDTA je baktericídne účinný voči L. monocytogenes, údaje v tabuľke 15B dokladajú, že v komplexnom médiu podobnom mlieku je využiteľná účinnosť nisínu voči tomuto organizmu obmedzená. Jednako však baktericíd obsahujúci nisín s glyceridom, tnonooleátom je v mlieku účinný voči potravinárskym patogénoin, aj keď monooleát samotný nie je voči tomuto organizmu baktericídne účinný.

Tabuľka 15A

Baktericídna účinnosť nisínu voči Streptococcus agalactiae v mlieku pri teplote 37°C /aktivácia nisínu monolaurínom/.

počiatočný obsah živých baktérií: 1,0 x 10⁷ cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 pri teplote 37°C.

Príklad 14

Vplyv bivalentných katiónov na zvýšenie aktivity nisínu vplyvom EDTA.

Bivalentné katióny sa viažu s EDTA a druhými komplexotvomými činidlami a bolo by možné predpokladať, že budú neutralizovať aktiváciu nisínu EDTA. Avšak ako je vidieť z tabuľky 14, baktericídna účinnosť nisínu voči S. mutans je zvýšená pri 1 mM EDTA i v prítomnosti 1 mM Ca²⁺ iónu. Len koncentrácia Ca²⁺ iónu vyššia ako 3 mM inhibuje aktiváciu nisínu EDTA. Toto je zvlášť dôležité v ústnych vodách, kde sú koncentrácie vápnikových iónov dôležité.

Tabuľka 14

Rýchla baktericídna účinnosť nisínu aktivovaná EDTA v prítomnosti bivalentného katiónu voči Streptococcus mutans nie /n onolaurín /*/

0.01

0.1 nisín CaCla aK

C O.l 0,3 1.0 3 10 o

0.02

0.2

100

100

2.2 * prefívaiúctch po 2 h*

100 4.5

100 0.2

0.05 0.0008 “ počiatočný obsah živých baktérií: 6,0 x 10⁷ cfu/ml. Inkubácie boli urobené v mlieku pri teplote 37°C. Tabuľka 15B

Baktericídna účinnosť nisínu voči Listeria monocytogenes v mlieku pri teplote 37“C /aktivácia monooleátom/.

nla ín » aoaooleátu

0.1

1.0 * prežívajúcich po 2 I?

O 100 G?

100 0.56 10-’

10-4 ^a počiatočný obsah živých baktérií: 5,0 x 10⁷ cfu/ml. Inkubácie boli urobené v mlieku pri teplote 37°C.

Z prežívalúcich yo 1 ain* 0 100

3.9

3“	0.0042	0.0042 0.053	18
30*	0.0019	0.0003	0.0004 0.06	6.8
100*	<10-*	<10-*	-CJ.0-* 0,0001	1.5

^E 1 mMNaiEDTA “počiatočný obsah živých baktérií: 1,0 x 10² cfu/ml. Inkubácie boli urobené vo 10 % fetálnom teľacom séru pri teplote 37°C.

Príklad 15

Účinnosť nisínu a povrchovoaktívnej látky voči grampozitným baktériám.

Baktericídna účinnosť nisínu môže byť významne zvýšená, ak sa spojí so samotnou povrchovoaktívnou látkou. To je najlepšie ilustrované pri limitnej koncentrácii nisínu /0,2 pgAnl/, ako je uvedené v tabuľke 15A.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje bakteriocin obsahujúci lantionín vybraný zo skupiny zahrňujúcej nisín, subtilín, epidermin, cinnamycin, duramycín, ancovenín a Pep 5 a komplexotvomé činidlo vybrané zo skupiny zahrňujúcej alkylamidintetraacetáty, EGTA a citrát a/alebo povrchovoaktivnu látku.
2. 2. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že komplexotvomé činidlo je vybrané zo skupiny zahrňujúcej alkylamidíntetraacetáty, CaEDTA, Na^CaF.DTA, EGTA a citrát.
3. 3. Prípravok podľa nároku 2,. vyznačujú8 c i sa t ý m , že alkylamidíntetraacetátom je EDTA a bakteriocínom je nisín
4. 4. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že povrchovoaktívna látka je vybraná zo skupiny zahrňujúcej Tritóny, Tweeny, glyceridy, mastné kyseliny, emulgátory, kvartéme zlúčeniny, amfotéme a aniónogénne povrchovoaktívne látky.
5. 5. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že ďalej obsahuje prostriedok na ochranu potravín.
6. 6. Baktericíd s rozšíreným rozsahom, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nosič, bakteriocín obsahujúci lantionín a komplexotvomé činidlo a/alebo povrchovoaktívnu látku.
7. 7. Baktericíd s rozšíreným rozsahom podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že bakteriocín obsahujúci lantionín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej nisín, subtilín, epidermín, cinnamycín, duramycín, ancovenín a Pep 5 a komplexotvomé činidlo je vybrané zo skupiny zahrňujúcej alkylamidintetraacetáty, EGTA a citrát a tieto látky sú prítomné v takom množstve, že baktericíd má zvýšenú účinnosť voči najmenej jednej z baktérií vybraných zo skupiny zahrňujúcej Staphylococcus aureus, Strptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Streptococcus agalactiae, Corynefonn bacteria, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bakterioides gingivalis a Actinobacillus actinomycetescomitans.
8. 8. Baktericíd podľa nároku 6,vyznačujúci sa t ý m , že alkylamidíntetraacetátom je EDTA.
9. 9. Baktericíd podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že povrchovoaktívna látka je vybraná zo skupiny zahrňujúcej Tritóny, Tweeny, glyceridy, mastné kyseliny, kvartéme zlúčeniny, emulgátory, amfotéme a aniónogénne povrchovoaktívne látky a je prítomná v množstve dostatočnom na to, že baktericíd má zvýšenú účinnosť voči najmenej jednej baktérii zo skupiny zahrňujúcej gramnegatívne a grampozitívne baktérie.
10. 10. Baktericíd podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia nisínu je medzi približne 0,1 pg/ml a 300,0 pg/ml a koncentrácia komplexotvomého činidla je medzi približne 0,1 mM a 20 mM.
11. 11. Baktericíd podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia povrchovoaktívnej látky je medzi približne 0,01 % a 1,0 %.