KR101352795B1

KR101352795B1 - 치아의 접합능을 향상시키기 위한 치과용 클린저 조성물

Info

Publication number: KR101352795B1
Application number: KR1020110017749A
Authority: KR
Inventors: 정종평; 박윤정; 이주연
Original assignee: 주식회사 나이벡
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2014-02-17
Also published as: US8974805B2; WO2011105869A3; KR20110098685A; US20130224128A1; WO2011105869A2

Abstract

본 발명은 치아의 접합능을 향상시키기 위한 치과용 클린저에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 노출된 치근의 상아질 표면에 존재하는 도말층(smear layer)과 구강내 세균들을 제거하여 치주수술에서 치아의 접합능을 향상시키는데 효과적인 치과용 클린저에 관한 것이다.
본 발명의 치과용 클린저는 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate)로 치근 표면에 존재하는 도말층을 제거하고, 치주원인균에 대한 항균작용을 하며, 계면활성제인 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)에 의해 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide)를 제거하는 작용을 하여 치주수술에서 치아의 접합능을 향상시킨다.

Description

치아의 접합능을 향상시키기 위한 치과용 클린저 조성물{Dental Cleanser Composition for Improving Conjugating Ability of Teeth}

본 발명은 치아의 접합능을 향상시키기 위한 치과용 클린저 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 노출된 치근의 상아질 표면에 존재하는 도말층(smear layer)과 구강내 세균들을 제거하여 치주수술에서 치아의 접합능을 향상시키는데 효과적인 치과용 클린저 조성물에 관한 것이다.

치주질환은 치주원인균에 의해 치아 주위의 연조직 및 치조골이 만성염증으로 파괴되어 잇몸에서 출혈이 일어나고, 이가 흔들리며, 최후에는 치아를 상실하는 질환으로서 일반적으로 풍치라고 알려져 있다. 치주원인균으로 Prevotella intermedia, Actinomyces israelii , Fusobacterium nucleatum 등이 있다.

이러한 치주병을 예방하기 위하여, 페니실린 등의 항생제를 이용하여 치면세균막을 형성하는 원인균을 퇴치하려는 노력이 계속되고 있으나, 장기간의 사용시 발생되는 항생제 내성균으로 인하여 실질적인 임상에서는 사용되지 못하고 있는 실정이다. 이를 극복하기 위하여 불소 화합물을 이용하거나, 자동 치아세척기구를 이용하는 등 여러 가지 방법이 개발되고 있으나, 그 효과면에서 큰 성과를 얻지 못하고 있는 실정이다.

정상적인 치주조직의 결합조직성 부착은 치은 및 치주인대의 섬유모세포, 치은상피, 혈관내피세포, 신경세포돌기, 치조골과 교원질, 당단백, 단백당과 같은 세포외기질복합체로 이루어진다. 치주질환에 이환된 치근면은 결합조직 부착의 소실, 지지 치조골의 상실, 세균과 내독소에 의한 치근의 오염, 무기질의 밀도와 성분의 변화, 세포부착과 섬유의 발달을 위해 적절한 기질로 작용하는데 필요한 전구세포에 대한 주화성의 상실과 같은 병리적 변화가 초래될 수 있다.

따라서, 치주질환으로 인해 파괴된 조직의 재생을 위해서는 결합조직 세포가 치근면으로 이동하여 부착할 수 있도록 치근면의 환경을 변화시켜 주어야 하며, 이를 위한 치근면 처치과정에 기계적인 방법으로 치석제거술 및 치근면활택술이 있다.

그러나, 기계적 청소 후 치근표면에는 도말층이 형성되어 섬유모세포 부착 및 결합조직부착을 저해하고, 세균이 증식할 수 있는 기질로 제공되어 치주조직의 치유를 방해할 수 있으므로 부가적으로 치근 세척제를 이용한 치근처리 방법에 대한 연구가 이루어져 왔다. 치과용 클린저(치근 세척제)의 사용은 치근 표면의 미네랄을 제거하고, 박테리아 산물에서 유도된 독성물질을 제거하는 것이다.

치근면 세척을 위한 약제로 구연산(citric acid), 피브로넥틴(fibronectin), 염산 테트라싸이클린(tetracycline hydrochloride, Tc-HCl), 인산(phosphoric acid), 불화석(stannous fluoride), ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 포말린(formalin), 세틸피리디늄클로라이드(cetylpyridinium chloride), 소듐-엔-라우로일사코신(sodium-N-lauroyl sarcosine), 징크 이온토프레시스(zinc iontophoresis) 등이 연구되고 있다.

한국등록특허 제621,191호(폴리리신을 함유한 치아세정지용 조성물) 및 한국공개특허 제2007-0103761호(부식방지 세제조성물과 치과 및 의료기기 세정에의 용도)에는 구연산, 염산 테트라싸이클린과 같은 산성의 화학요법제가 주로 이용되어 많은 동물실험에서 도말층의 제거, 상아세관의 개방, 관간상아질의 탈회에 의한 교원질 기질의 노출, 내독소의 제거 및 항균작용과 같은 치주조직의 재생에 긍정적인 효과가 보고되었다.

그러나, 일련의 임상적 연구에서는 두드러진 개선이 인정되지 않았으며 치유과정 동안 치근의 흡수 및 골성강직, 조직의 괴사, 치은퇴축을 초래하고 치조골의 회복을 방해할 수 있다고 보고되어 결합조직의 치유를 증진시킬 수 있는 다른 형태의 치근면 처리방법의 필요성이 제기되었다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 비이온성 계면활성제인 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)와 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate)를 포함하는 조성물이 치근의 도말층과 구강내 세균들 및 리포다당류를 제거시켜 치주수술에서 치아의 접합능을 향상시킨다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 치근의 상아질 표면의 도말층을 탈미네랄화 시키고, 치주원인균에 대하여 항균작용을 하며, 리포다당류를 제거하여 치아의 접합능을 향상시키는 치과용 클린저 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate)와 비이온성 계면활성제인 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)를 유효성분으로 함유하는 치과용 클린저 조성물을 제공한다.

본 발명의 치과용 클린저 조성물은 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate)로 치근 표면에 존재하는 도말층을 제거하고, 치주원인균에 대한 항균작용을 하며, 비이온성 계면활성제인 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)에 의해 리포다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 제거하는 작용을 하여 치주수술에서 치아의 접합능을 향상시킨다.

도 1은 덴틴 블록의 표면을 관찰한 시차주사 현미경 사진으로, (a)는 아무 처리하지 않은 덴틴 블록 사진이고, (b)는 치과용 클린저 조성물로 처리된 덴틴 블록 사진이며, (c)는 PrefGel로 처리된 덴틴 블록 사진이다.
도 2는 각각의 샘플(sample)에 의한 균의 성장 저해 직경을 측정한 그래프이다.
도 3은 덴틴 블록에 부착된 세포를 관찰한 시차주사 현미경 사진으로, (a)는 아무 처리하지 않은 덴틴 블록에 부착된 세포를 관찰한 사진이고, (b)는 치과용 클린저 조성물로 처리한 덴틴 블록에 부착된 세포를 관찰한 사진이며, (c)는 PrefGel을 처리한 덴틴 블록에 부착된 세포를 관찰한 사진이다.
도 4는 노출된 type I collagen의 분포정도를 관찰한 사진으로, (a)는 아무 처리하지 않은 덴틴 블록에서 type I collagen의 분포 정도를 나타낸 것이고, (b)는 치과용 클린저 조성물을 처리한 덴틴 블록에서 type I collagen의 분포 정도를 나타낸 것이며, (c)는 PrefGel을 처리한 덴틴 블록에서 type I collagen의 분포 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 치과용 클린저 조성물의 사용에 따른 잔존하는 LPS(lipopolysaccharide)의 상대적인 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 비이온성 계면활성제에 따른 잔존하는 LPS의 상대적인 비율을 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate) 및 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)를 유효성분으로 함유하는 치과용 클린저 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 치과용 클린저 조성물은 노출된 상아질 표면의 도말층(smear layer)을 탈미네랄화하여 제거하고, 치주원인균에 대한 항균작용을 하며, 리포다당류를 제거하기 위해 사용될 수 있다.

소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate)는 중성 pH에서 Ca² ⁺, Mg² ⁺, Fe² ⁺, 및 Pb² ⁺와 같은 2가 양이온과 킬레이션을 형성하는 물질로 상아질 내 칼슘이온과 반응하여 칼슘착염을 형성하여 치근면 활택시 생성된 도말층을 제거하고 신선한 교원질 기질을 노출시켜 화학주성에 의한 섬유모세포의 이동을 촉진시키고, 생물학적 활성이 있는 성장인자를 유지하는 장소를 제공할 수 있음이 보고된 바 있다(Aktener BO, et al ., Smear layer removal with different concentrations of EDTA-ethylenediamine mixtures. J Endod 1993;19(5):228-31, Breschi L. et al ., Immunocytochemical identification of type I collagen in acid-etched dentin. J Biomed Mater Res A 2003; 66(4):764-9.).

본 발명에서 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate)는 치근 표면에 존재하는 미네랄 성분을 제거하는 효과와 항균효과를 가진다.

본 발명에 있어서, 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)(C14H22O(C2H4O)n)는 비이온성 계면활성제로, 친수성 polyethylene oxide기와 소수성인 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl기를 가지고 있고, 생화학분야에서 세정제(detergent)로 많이 사용되고 있다. 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)는 0.1~0.5%농도에서는 면역염색법(immunostaining)에서 세포막(cell membrane)에 투과(permeabilization)시키고 1%농도에서는 박테리아의 세포벽(cell wall)을 투과(permeabilize)시킨다.

본 발명에서 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)는 리포다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 제거하는 효과를 가진다. 이 기술분야에서 많이 쓰이고 있는 다른 비이온성 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌 (polyoxyethylene), Tween류, span류 등이 있으나, 리포다당류의 제거효과를 시험한 결과 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)의 리포다당류 제거효과가 가장 큰 것으로 나타났다.

본 발명에 있어서, 상기 치과용 클린저 조성물 100중량부에 대하여, 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate) 18 ~ 30중량부 및 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate) 1 ~ 2중량부를 함유한다, 이는 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate)의 함량이 18중량부 미만인 경우, 탈미네랄 효과가 크지 않고, 30중량부를 초과한 경우에는 탈미네랄 효과가 증가하지 않으므로, 함량의 증가에 따른 실익이 없다. 또한, 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)의 함량이 1중량부 미만인 경우에는 리포다당류를 제거하는 효과가 발생하지 않고, 2중량부를 초과한 경우에는 리포다당류 제거효과가 증가하지 않으므로, 함량의 증가에 따른 실익이 없기 때문이다.

본 발명에 있어서, 치과용 클린저 조성물은 항균 펩타이드를 추가로 함유할 수 있다.

항균 펩타이드는 인간의 선천적인 면역 시스템에 존재하고 있으며, 세포막에 결합하고 구멍을 냄으로써, 박테리아(bacteria), 곰팡이, 바이러스에 대해 넓은 범위의 항균력을 보인다(Brogden KA. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?, Nat Rev Microbiol , 2005;3:238.50., Sørensen OE. et al ., Antimicrobial peptides in innate immune responses, Contrib Microbiol, 2008;15:61.77.). 또한, 그 중 어떤 항균 펩타이드는 또한 LPS의 활성을 중화시키는 역할도 한다(Rosenfeld Y, Papo N, Shai Y. Endotoxin(lipopolysaccharide) neutralization by innate immunity host-defense peptides, Peptide properties and plausible modes of action, J Biol Chem , 2006;281:163643).

항균 펩타이드는 상피세포, 호중구, 침샘 등 감염에 관계하는 다양한 세포에서 생산된다. 그 중 인간 디펜신(human defensin)류, 카세리시딘(cathelicidin)LL-37, 히스타틴(Histatin)류 등이 있으며, 양이온을 띠고 소수성인 항균 펩타이드이다. 양이온성 펩타이드는 그람음성, 그람양성균에 유발되는 패혈증과 염증을 방지한다고 알려져 있다(Scott MG. et al ., Interaction of cationic peptides with lipoteichoic acid and Gram-positive bacteria., Infect Immun , 1999;67:6445.53., Giacometti A. et al ., Potential therapeutic role of cationic peptides in three experimental models of septic shock., Antimicrob Agents Chemother, 2002;46:2132.6.).

본 발명에 있어서, 치과용 클린저 조성물에 사용할 수 있는 항균 펩타이드는 인간 알파 디펜신(human α-defensin), 인간 알파 디펜신(human β-defensin), 카세리시딘(cathelicidin)LL-37 및 히스타틴(Histatin)류로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 항균 펩타이드의 서열번호 1~4 아미노산 서열은 하기와 같다.

서열번호 1 (BD2-2): C-P-R-R-Y-K-Q-I-G-T-C-G-L-P-G-T-K-C-C-K-K-P

서열번호 2 (BD3-3): G-K-C-S-T-R-G-R-K-C-C-R-R-K-K

서열번호 3 (PDGF): R-K-I-E-I-V-R-K-K-P-I-F-K-K-A-T-V-T

서열번호 4 (HB-EGF): C-K-R-K-K-K-G-K-G-L-G-K-K-R-D-P-C-L-R-K-Y-K

본 발명에 있어서, 향균 펩타이드는 치과용 클린저 전체 100중량부에 대하여 3×10^-5~ 10-3중량부 함유될 수 있다. 이는 항균 펩타이드가 3×10^-5 중량부 미만으로 함유되면 항균 효과가 크지 않고, 10^- ³중량부를 초과하여 함유되면 항균 효과가 증가하지 않아 함유 증가에 따른 실익이 없기 때문이다.

본 발명에 있어서, 상기 치과용 클린저 조성물은 프로폴리스, 자일리톨 및 단백질 분해효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 함유할 수 있는데, 프로폴리스 또는 자일리톨을 추가로 포함하여 관능특성을 향상시킬 수도 있고, 단백질 분해효소를 첨가하여 항균효과 및 리포다당류 제거 효과를 높일 수 있다.

본 발명의 치과용 클린저 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체는 부형제(예를 들어, 녹말, 락토오스, 탄산칼슘, 인산칼슘 등), 결합제(예를 들어, 녹말, 아라비아고무, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 결정성 셀룰로오스 등), 윤활제(예를 들어, 마그네슘스테아레이트, 활석 등), 분해제 (예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 활석 합성알루미늄 실리케이트 등), 희석제(예를 들어, 물, 식물유 등) 또는 이들의 둘 이상의 혼합물을 사용할 수 있고, 바람직하게는 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose)를 사용할 수 있다.

본 발명의 치과용 클린저 조성물의 제형은 특별히 제한되지는 않으나, 분말, 미세과립, 액제, 산제, 분무제, 연고제 또는 겔상제제로 제형화될 수 있으며, 이 중 겔상 제제로 제형화됨이 가장 바람직하다.

본 발명의 치과용 클린저 조성물은 노출된 상아질 표면의 도말층(smear layer)을 탈미네랄화 시키고, 치주 원인균에 대한 항균작용을 하며, 그람 음성균의 세포벽에 존재하며 염증을 일으키는 리포다당류(리포폴리사카라이드, lipopolysaccharide, LPS)의 제거를 위해 사용된다. 보다 구체적으로, 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate)로 치근 표면에 존재하는 도말층을 제거하고, 치주 원인균에 대한 항균작용을 하며, 계면활성제인 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)에 의해 리포다당류를 제거하는 작용을 한다.

치주염은 치주원인균에 의해 치주조직이 파괴되는 만성질환으로, 새로운 치주조직이 재생되기 위해서는 치근 표면에 새로운 결합조직의 부착이 선행되어야 한다. 이 과정은 섬유아세포(fibroblast)의 이동과 치근 표면의 콜라겐 섬유(collagen fibril)에 부착에 의해 이루어지는데, 본 발명의 치과용 클린저 조성물을 이용하여 탈미네랄화된 치근 표면은 생리활성 세포외기질 단백질과 성장인자의 저장장소가 되어 상처치유에 긍정적인 환경을 제공할 수 있다. 또한 노출된 기질 단백질은 미네랄화를 유도하여 백악질(cementum)과 골(bone)조직의 재생을 일으킬 수 있으므로, 치아의 접합능을 향상시키게 되는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 치과용 클린저 조성물의 제조

나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) 3g을 70mL의 증류수에 녹여 CMC용액을 제조한 후, 24g EDTA-2Na, 1mL 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)인 Triton X-100(Sigma, USA)을 상기 CMC 용액에 첨가하여 혼합한 다음, 오토클레이브(autoclave)하여 치과용 클린저 조성물을 제조하였다.

실시예 2: 항균 펩타이드가 함유된 치과용 클린저 조성물의 제조

실시예 1에서 제조된 치과용 클린저 조성물 1mL에 서열번호 2로 표시되는 항균펩타이드 1㎍을 혼합하여 제조하였다.

서열번호 2 (BD3-3): G-K-C-S-T-R-G-R-K-C-C-R-R-K-K

실험예 1: 치과용 클린저를 적용한 치아표면의 시차주사현미경 관찰

서울대학교 치과병원, 치주과 내원 환자에서 치과병원의 가이드 라인에 따라 치아를 얻었다. 적출된 치아는 low speed diamond saw를 사용하여 크라운 부분을 제거하고 수직으로 절단하여 세 개의 시료로 (4mm×4mm×1mm in size)로 분할하였다. 덴틴 블록은 표면활택을 한 후, 4℃에서 pH 7.4 PBS에서 사용하기 전까지 보관하였다. 덴틴 블록은 실시예 1에서 제조된 치과용 클린저 조성물에 2분간 처리하고 증류수로 3번 세척하였다. 음성대조군은 치과용 클린저 조성물을 처리하지 않은 덴틴 블록이고, 양성대조군은 PrefGel (Biora, Sweden)으로 처리한 덴틴 블록으로 하였다.

블록을 PBS에서 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 15분간 고정하고, 1% OsO₄ in 0.1 M PBS buffer로 상온에서 30분 동안 후고정하였다. 샘플을 에탄올로 탈수한 후에 동결건조하고, 금으로 코팅하였다. 시차주사현미경(field emission scanning electron microscope, FE-SEM, Jeol, S-4700, Japan)로 덴틴 블록의 표면을 관찰하였다.

그 결과, 도 1은 각 샘플을 처리한 덴틴 블록의 표면을 관찰한 시차주사현미경 사진을 나타낸 것으로, 아무 처리하지 않은 덴틴 블록의 경우 표면의 도말층이 그대로 존재하였고(도 1a), 치과용 클린저 조성물(Clinplant)로 처리한 덴틴 블록의 경우 표면의 도말층이 제거되었으며(도 1b), PrefGel로 처리한 덴틴 블록의 경우 도말층이 제거되었으나 본 발명에 따른 치과용 클린저보다 제거 정도가 크지 않은 것을 확인할 수 있었다(도 1c).

실험예 2: 치과용 클린저 조성물에 의한 항균력 시험

Prevotella intermedia , Actinomyces israeili , Fusobacterium nucleatum을 tryptic soy broth에서 배양시켰다. PBS로 희석하여 ml당 10⁵ ~ 10⁷개의 박테리아를 tryptic soy agar plates에 스프레딩(spreading)하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

직경 6mm의 filter paper disk (whatman)에 각각 PBS, 헥사메딘 (0.5% 클로로헥시딘), 실시예 1에서 제조된 치과용 클린저 조성물(Clinplant), 실시예 2에서 제조된 항균 펩타이드가 첨가된 치과용 클린저 조성물, PrefGel(Biora, Sweden)을 묻히고, 균이 배양된 plate에 직접 놓았다. 혐기성 배양기에서 5일 동안 배양한 후, 균의 성장저해 직경 (inhibition diameter)를 측정하였다.

그 결과, 도 2는 각각의 샘플(sample)에 의한 균의 성장 저해 직경을 측정한 결과를 나타낸 것으로, PBS의 경우, 균의 성장 저해를 하지 못한 것으로 나타났고, 실시예 1에서 제조된 치과용 클린저(Clinplant)의 경우에는 구강소독제인 헥사메딘 보다 직경이 컸으므로 항균력이 더 우수한 것으로 나타났다. 또한, 기존제품인 PrefGel과 실시예 1의 치과용 클린저 조성물(Clinplant)은 비슷한 크기의 성장저해 직경을 보였고, 실시예 2의 항균 펩타이드를 함유한 Clinplant 경우에는 균에 대한 성장저해 정도가 가장 우수한 것으로 나타났다. 이는 항균 펩타이드를 첨가함으로 인해 치과용 클린저 조성물의 항균효과가 첨가하지 않았을 때보다 유의성 있게 증가함을 알 수 있었다. (*p<0.05, clinplant에 비해 유의할 수준으로 항균력이 효과가 있음.)

실험예 3: 치과용 클린저를 적용한 치아표면에서의 세포부착

NIH3T3 세포를 T75 flasks에서 10% FBS (Gibco)와 1% antibiotic-antimycotic solution(Gibco)을 α-MEM에 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다.

덴틴 블록은 실시예 1에서 제조된 치과용 클린저 조성물에 2분간 처리하고 증류수로 3번 세척하였다. 음성대조군은 치과용 클린저를 처리하지 않은 덴틴 블록이고, 양성대조군은 PrefGel(Biora, Sweden)으로 처리한 덴틴 블록으로 하였다. NIH3T3 세포를 5×10⁵/50㎕로 덴틴 블록에 시딩하고 37℃, 5% CO₂에서 1시간 배양한 후 250㎕의 배지를 첨가하였다. 1일 후 블록을 PBS에서 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 15분간 고정하고, 1% OsO₄ in 0.1 M PBS buffer로 상온에서 30분 동안 후고정하였다. 샘플을 에탄올로 탈수한 후에 동결건조하고, 금으로 코팅하였다. 시차주사현미경(field emission scanning electron microscope, FE-SEM, Jeol, S-4700, Japan)로 덴틴 블록의 표면을 관찰하였다.

그 결과, 도 3은 각 덴틴 블록에 부착된 세포를 관찰한 시차주사 현미경 사진을 나타낸 것으로, 아무 처리하지 않은 덴틴 블록의 경우 부착된 세포의 수가 많지 않고, 구 형태를 유지하므로 잘 부착되어 있지 않았다(도 3a). 반면, 실시예 1에서 제조된 치과용 클린저 조성물로 처리한 덴틴 블록의 경우 많은 수의 세포가 부착되어 있으며, 세포모양도 잘 펴져 있어서 안정적인 부착을 보였다(도 3b). PrefGel을 처리한 덴틴 블록의 경우 치과용 클린저와 비슷한 정도로 세포부착 정도를 보인 것을 확인할 수 있었다(도 3c).

실험예 4: 치과용 클린저 조성물을 적용한 치아표면에서의 Type I collagen 관찰

덴틴 블록에 실시예 1에서 제조된 치과용 클린저 조성물을 2분간 적용하고 세척한 후, 치근 덴틴 블록(root dentin block)에 존재하는 콜라겐(collagen)을 측정하기 위해 mouse monoclonal IgG anti-type I collagen (Sigma Chemical Co.)을 사용하였다. 치근 덴틴 블록을 상온에서 1시간 동안 blocking buffer (1% BSA in PBS)에 방치하였다. 1차 항체(antibody)를 1% BSA/PBS (1:500)의 농도로 4℃에서 8시간 동안 결합시키고, PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 2차 antibody (FITC conjugated goat anti-mouse IgG 1:1000 in 1% BSA/PBS)를 상온에서 1시간 동안 결합시키고, PBS로 10분씩 3회 세척하였다. FLUOVIEW software (Olympus, Tokyo, Japan) 기반 Olympus FV-300 laser scanning microscope를 사용하여 콜라겐(collagen)의 분포를 관찰하였다.

그 결과, 도 4는 노출된 type I collagen의 분포 정도를 관찰한 사진을 나타낸 것으로, 아무 처리하지 않은 덴틴 블록의 경우, type I collagen을 관찰할 수 없었고(도 4a), 실시예 1에서 제조된 치과용 클린저 조성물을 처리한 덴틴 블록에서는 FITC의 형광이 많이 분포한 것으로 보아 type I collagen의 노출이 잘 이루어졌다(도 4b). PrefGel을 처리한 덴틴 블록에서는 치과용 클린저와 비슷한 정도의 type I collagen의 노출이 이루어진 것을 확인할 수 있었다(도 4c).

실험예 5: 치과용 클린저 조성물에 의한 리포다당류의 제거 측정

박테리아의 리포다당류의 제거를 측정하기 위해 HEK-Blue LPS detection kit (InvivoGen, San Diego, CA, USA)을 사용하였다. 24 well plate에 100㎍/ml의 LPS 표준물질(E.coli K12 LPS)을 코팅하고 4℃에서 8시간 동안 방치하였다. PBS, 헥사메딘(0.5% 클로로헥시딘), 실시예 1의 치과용 클린저 조성물(Clinplant), PrefGel(Biora, Sweden), 옥틸 페놀 에톡시레이트를 제외한 실시예 1의 치과용 클린저 조성물(CMC+EDTA) 및 EDTA-2Na를 제외한 실시예 1의 치과용 클린저 조성물(CMC+Triton-X100) 200㎕ 각각을 2분 동안 적용하고, PBS로 3번 세척하였다. HEK-Blue cell을 detection media에 분산한 후, well 당 4×10⁴ 개를 시딩하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 620nm 파장에서 microplate reader(BIO-TEK, Winooski, Vermont, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. Lipopolysaccharide free water를 코팅한 well의 흡광도를 Blank로 하여 잔존하는 LPS 비율을 계산하였다.

* 상대적인 흡광도 비율(The relative absorbance ratio) = 각 sample을 처리한 well에서의 흡광도 / Endotoxin free water를 처리한 well에서의 흡광도

그 결과, 도 5는 잔존하는 LPS 표준물질의 상대적인 비율을 나타낸 그래프로, Triotn-X100이 존재했을 때 잔존하는 LPS 표준물질의 상대적인 비율이 가장 낮은 것으로 나타났고, EDTA는 LPS 표준물질의 제거에 효과가 없는 것으로 나타났으며, 헥사메딘 (Hexamedine)과 PrefGel 역시 LPS 표준물질제거에 역시 효과가 없는 것으로 나타났다. 그러나, EDTA-2Na와 Triton-X100이 함유된 실시예 1의 치과용 클린저 조성물(Clinplant)의 경우에는 잔존하는 LPS 표준물질의 비율이 Triotn-X100으로만 처리한 경우보다 상대적인 낮아 실시예 1의 치과용 클린저 조성물(Clinplant)에 함유된 EDTA-2Na와 Triton-X100이 LPS 표준물질 제거에 상승효과가 있는 것을 알 수 있었다.

실험예 6: 비이온성 계면활성제에 의한 리포다당류의 제거 측정

박테리아의 리포다당류의 제거를 측정하기 위해 HEK-Blue LPS detection kit (InvivoGen, San Diego, CA, USA)을 사용하였다. 24 well plate에 100㎍/ml의 LPS 표준물질(E.coli K12 LPS)을 코팅하고 4℃에서 8시간 동안 방치하였다. 각각 1%의 Triton X-100 (Sigma), Span 80 (Sorbitan monooleate, M.W. 428, Sigma), Tween 20 (M.W. 1228, Sigma), Polyoxyethylene (M.W. 1400, Sigma)를 각각 2분 동안 적용하고, PBS로 3번 세척하였다. HEK-Blue cell을 detection media에 분산한 후, well 당 4×10⁴ 개를 시딩(seeding)하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 620nm 파장에서 microplate reader(BIO-TEK, Winooski, Vermont, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. Lipopolysaccharide free water를 코팅한 well의 흡광도를 Blank로 하여 잔존하는 LPS 표준물질 비율을 계산하였다.

* 상대적인 흡광도 비율(The relative absorbance ratio) = 각 sample을 처리한 well에서의 흡광도 / LPS free water를 처리한 well에서의 흡광도

그 결과, 도 6은 잔존하는 LPS 표준물질의 상대적인 비율을 나타낸 그래프로, Triton X-100(HLB 13)으로 처리했을 때, 잔존하는 LPS 표준물질의 비율이 가장 낮았고, 그 다음으로 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene, HLB 10), Tween 20 (HLB 16), Span 80 (HLB 4)의 순으로 증가하였다. Triton X-100이 LPS 표준물질 제거에 가장 효과적으로 나타났다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

인간 베타 디펜신(human β-defensin)류인, 서열번호 2(BD3-3)의 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드와 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate) 및 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate)를 유효성분으로 함유하는 치아 접합 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치아 접합 개선용 조성물 100중량부에 대하여, 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate) 18 ~ 30중량부 및 옥틸 페놀 에톡시레이트(octyl phenol ethoxylate) 1 ~ 2중량부가 함유되는 것을 특징으로 하는 치아 접합 개선용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 치아 접합 개선용 조성물은 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 치아 접합 개선용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 치아 접합 개선용 조성물 100중량부에 대하여, 3×10^-5 ~ 10^-3중량부가 함유되는 것을 특징으로 하는 치아 접합 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치아 접합 개선용 조성물은 프로폴리스, 자일리톨 및 단백질 분해효소로 구성된 군 중 선택되는 하나 이상을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 치아 접합 개선용 조성물.