PL204797B1

PL204797B1 - Zastosowanie preparatów aktywnej substancji szkliwa

Info

Publication number: PL204797B1
Application number: PL382480A
Authority: PL
Inventors: Stina Gestrelius; Lars Hammarström; Petter Lyngstadaas; Christer Andersson; Ivan Slaby; Tomas Hammargren
Original assignee: Straumann Inst Ag
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2010-02-26
Also published as: US20050271604A1; BRPI9908182C1; BRPI9908182B8; US20020169105A1; US6720009B2; JP2002504520A; BRPI9908182B1; JP4726296B2; US6503539B2; AR020055A1; US20030064927A1; US7294352B2; RU2241489C2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatów aktywnej substancji szkliwa.

Białka macierzy szkliwa obecne w macierzy szkliwa są dobrze znane jako prekursory szkliwa. Białka szkliwa i pochodne macierzy szkliwa zostały wcześniej opisane w literaturze patentowej jako zdolne do indukowania powstawania tkanki twardej (tj. szkliwa, patent USA nr 4,672,032 (Slavkin) oraz powiązań pomiędzy twardymi tkankami (EP-B-0 337 967 oraz EP-B-0 263 086). Według znanego stanu techniki aktywne substancje szkliwa były wykorzystywane do regeneracji tkanek twardych (zmineralizowanych), podczas gdy niniejszy wynalazek dotyczy korzystnego działania przeciwbakteryjnego i przeciwzapalnego.

Stwierdzono, że macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i białka macierzy szkliwa (termin „aktywna substancja szkliwa” stosowany w dalszej części obejmuje macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa oraz białka macierzy szkliwa) mają własności przeciwbakteryjne i/lub przeciwzapalne, które mogą być wykorzystywane do leczenia zarówno tkanek miękkich (tj. niezmineralizowanych), takich jak tkanki zawierające kolagen lub nabłonki, w tym skóra i błony śluzowe, mięśnie, naczynia krwionośne i naczynia limfatyczne, tkanki nerwowe, gruczoły, ścięgna, oczy i chrząstka, jak i twardych (tj. zmineralizowanych).

Wynalazek dotyczy zastosowania preparatu aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń lub stanów zapalnych.

Niniejszy wynalazek oparty jest na zastosowaniu anty-bakteryjnego efektu macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa w terapii i w profilaktyce. Macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa wykazują własności zmniejszania zakażenia.

W niniejszym opisie termin „efekt hamowania zakażenia” odnosi się do działania leczniczego lub zapobiegawczego macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa, i/lub białka macierzy szkliwa na zakażenie w tkankach osobnika.

Pojęcie „zakażenie” odnosi się do inwazji i namnażania się lub nagromadzenia mikroorganizmów w tkankach ciała, co może przebiegać klinicznie bezobjawowo lub wywoływać miejscowe uszkodzenia komórek wskutek współzawodnictwa metabolicznego, działania enzymów, toksyn, wewnątrzkomórkowego namnażania lub odpowiedzi antygen-przeciwciało.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zakażenie, do zapobiegania lub leczenia, którego ma być stosowany wytwarzany lek, może być wywołane mikroorganizmami, takimi jak bakterie, wirusy, drożdże, grzyby, pierwotniaki oraz riketsje.

W niniejszym kontekś cie termin „dział anie przeciwbakteryjne” oznacza zahamowanie wzrostu bakterii lub ich zniszczenie. Pojęcie to nie jest ograniczone do szczególnego rodzaju bakterii lecz obejmuje wszelkie bakterie. Jednak wynalazek ukierunkowany jest na i) bakterie patogenne, wywołujące schorzenia u ssaków, w tym ludzi, i/lub ii) bakterie normalnie obecne w organizmie ssaków, a które pod wpływem pewnych warunków mogą wywoływać niepożądane stany w organizmie.

Wynalazek dotyczy zastosowania czynnej substancji szkliwa do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania lub leczenia rozwoju bakterii na powierzchniach ciała, takich jak skóra, powierzchnia błon śluzowych lub paznokcie, albo powierzchnia zębów.

Pojęcie „skóra” używane jest w szerokim znaczeniu, obejmującym warstwę naskórka skóry oraz - w tych przypadkach gdzie powierzchnia skóry jest mniej lub bardziej uszkodzona - także warstwę właściwą skóry. Oprócz warstwy rogowej warstwa naskórkowa skóry składa się z warstwy nabłonkowej (epitelium), a głębiej położona warstwa tkanki łącznej skóry nazywa się skórą właściwą (dermis).

Oprócz skóry uszkodzone mogą być różne inne tkanki (np. tkanki miękkie i tkanki twarde). Uszkodzeniami tkanek miękkich, w tym błon śluzowych i/lub skóry są na przykład uszkodzenia bakteryjne, wirusowe infekcyjne i liszajowate; owrzodzenia opryszczkowe, zapalenia aftowe (pleśniawkowe), ostre zapalenia nekrotyczne dziąseł i zespół palących ust. Patologie, które podlegają leczeniu kompozycjami wytworzonymi zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmują wąglik, tężec, gangrenę gazową, płonicę, zapalenie mieszków włosowych brody, różę, zapalenie grudek chłonnych mieszków włosowych, liszajec, lub liszajec pęcherzowy, wrzód weneryczny, np. wywołany rzeżączką (obejmujący zapalenie cewki moczowej, zapalenie szyjki macicy i zapalenie odbytnicy), wrzód tropikalny itp. Często znaczenia terminów „rana” i „wrzód”, „rana” i „owrzodzenie” pokrywają się i niekiedy pojęcia te używane są wymiennie. Dlatego, jak wspomniano powyżej, w niniejszym tekście pojęcie rana obejmuje wrzód, zranienie, owrzodzenie i terminy te są stosowane równorzędnie, chyba że wyraźnie wskazano różnice.

PL 204 797 B1

Gojenie się uszkodzeń skóry lub błon śluzowych zachodzi w kilku etapach, które doprowadzają do reparacji lub regeneracji skóry lub błony śluzowej. W ostatnich latach rozróżniono reparację i regenerację jako dwa odrębne rodzaje gojenia. Regeneracje można zdefiniować jako proces biologiczny, za pomocą którego struktura oraz funkcja zniszczonej tkanki zostaje całkowicie odnowiona. Reparacja natomiast jest procesem, podczas którego przywracana jest ciągłość uszkodzonej tkanki przy pomocy innej tkanki, która nie odpowiada strukturze i funkcji tkanki uszkodzonej. W normalnych warunkach organizm ma mechanizmy gojenia uszkodzonej skóry lub błon śluzowych w celu przywrócenia integralności skóry lub śluzówki. Proces reparacji nawet małych rozerwań lub ran może trwać od kilku godzin do dni, a nawet tygodni. Jednak w owrzodzeniach proces gojenia się jest bardzo wydłużony i może trwać miesiące, a nawet lata. Na etapy gojenia się zranień składają się procesy zapalenia (zwykle 1-3 dni), migracji (zwykle 1-6 dni), proliferacji (zwykle 3-24 dni) oraz dojrzewania (zwykle 1-12 miesięcy).

Wszystkie wyżej wymienione procesy gojenia wymagają znacznego czasu. Na szybkość gojenia wpływa sterylność rany, ogólny stan zdrowia osobnika, obecność ciał obcych etc. Niektóre stany patologiczne, jak zakażenie, maceracja, odwodnienie, ogólny zły stan zdrowia oraz niedożywienie mogą doprowadzić do przewlekłych owrzodzeń, jak np. wrzód niedokrwienny.

Aż do chociażby powierzchniowego wygojenia, rana narażona jest na ryzyko przeciągającego się lub nowego zakażenia. Dlatego im szybciej można wygoić ranę, tym prędzej oddala się ryzyko zakażenia.

Tak wiec każda procedura mająca wpływ na przyspieszenie gojenia lub korzystnie wpływająca na przebieg gojenia się zranienia jest bardzo wartościowa.

W niniejszym kontekście termin gojenie kliniczne jest używany dla oznaczenia sytuacji, w której nie udaje się zaobserwować rozerwania tkanki, a jedynie obecne są dyskretne objawy zapalenia, takie jak lekkie zaczerwienienie lub niewielki obrzęk tkanki. Ponadto nie ma skarg na ból samoistny gdy narząd jest w spoczynku lub nie jest dotykany.

Tradycyjnie opatrunki: suchy lub mokry-do-suchego są najczęściej stosowanymi w opatrywaniu ran. Są one stopniowo zastępowane przez środowiska wilgotne z zastosowaniem opatrunku okluzyjnego. Aby skutecznie zreperować lub zastąpić uszkodzoną część ciała, należy utrzymać w stanie wzajemnej równowagi procesy gojenia się rany, włóknienia oraz inwazji mikrobów. Dostępnych jest wiele metod pozwalających odwrócić infekcję utrudniającą gojenie. Opóźnione gojenie lub proces zapalny mogą nasilić zwłóknienie. Ponadto, uprzednio sugerowano, że czynniki wzrostu jak czynnik wzrostu naskórka (EGF), transformujący czynnik wzrostu alfa (TGF-a), transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-b), płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), czynniki wzrostu fibroblastów (FGF) w tym kwaśny czynnik wzrostu fibroblastów (a-FGF) oraz zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (b-FGF), transformujący czynnik wzrost beta (TGF-B), a także insulinopodobne czynniki wzrostu (IGF-1 i IGF-2) są dyrygentami procesu gojenia ran i często są wymieniane jako ułatwiające gojenie ran; jednak ułatwiają one zwłóknienie, które może przeszkadzać skutecznemu gojeniu. Choć przyspieszone gojenie zmniejsza ryzyko zakażenia oraz będące jego następstwem zapalenie, mogące prowadzić do wytworzenia blizny, próby terapeutycznego przyspieszania normalnych procesów gojenia ran były stosunkowo mało skuteczne. Prawdopodobnie jest to wywołane tym, że proces reparacyjny wymaga zgranego współdziałania wielu czynników, wymienionych powyżej.

Niniejsi wynalazcy stwierdzili, że w różnych hodowlach fibroblastów (zarodkowych, skórnych, pochodzących z więzadła okołozębowego, ryb lub ptaków) produkowanych jest dwukrotnie więcej

TGFei w hodowlach pobudzanych preparatem ENDOGAIN® (z BIORa AB, S-205 12 Malmó, Szwecja zawierającym 30 mg liofilizowanej macierzy białkowej Enamel Matrix ( tu skrócone do EMD) i 1 ml roztworu nośnika (alginian glikolu propylenowego), które zmieszano przed zastosowaniem, chyba że białko i nośnik testowane są oddzielnie) w porównaniu z hodowlami niestymulowanymi (pomiar testem ELISA próbki z pożywki hodowlanej (patrz Przykład 1 poniżej). Wzrost obserwuje się po 24 godzinach hodowli, lecz jest bardziej widoczny w następnych dniach (dzień 2 i 3). Po drugim dniu w hodowlach stymulowanych EMDOGAIN® obserwuje się także zwiększenie proliferacji komórek. Podobny, lecz mniej nasilony wzrost produkcji TGFe1 obserwowano w komórkach nabłonkowych. Ponieważ TGFe1 wydaje się odgrywać istotną rolę w epitelializacji powierzchni ran, te obserwacje podbudowują koncepcje niniejszego wynalazku.

Obecni wynalazcy stwierdzili, że po zastosowaniu białek macierzy szkliwa i/albo pochodnych macierzy szkliwa skraca się etap reakcji zapalnej, a typowe jego objawy, jak ciepłota, zaczerwienienie, obrzęk oraz ból, są mniej nasilone.

PL 204 797 B1

Aktywność terapeutyczną i/lub zapobiegawczą macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa można oczywiście udowodnić w testach in vivo na ludziach lub na zwierzętach doświadczalnych (patrz sekcja doświadczalna niniejszego opisu). Jednak wskazówek na skuteczność i/lub aktywność macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa mogą dostarczyć stosunkowo proste testy in vitro, takie jak np. testy z zastosowaniem hodowli komórkowych.

Korzystnie kompozycję z zastosowania według wynalazku stosuje się, gdy zakażenie występuje w obrę bie jamy ustnej, a korzystniej jest ona przeznaczona do zapobiegania i/lub leczenia stanów bakteryjnych w obrębie jamy ustnej.

Korzystnie kompozycję z zastosowania według wynalazku stosuje się, gdy zakażenie jest wywołane bakteriami powodującymi próchnicę, np. Streptococcus mutans; bakteriami powodującymi choroby przyzębia, np. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella Intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter (Fusobacteria, Staphylococci), B. forsythus; bakteriami wywołującymi zapalenie zębodołów etc, np. Staphylococcus, Actinomyces i Bacillus; oraz bakteriami powodującymi ubytki okołowierzchołkowe, np. Spirochetes.

Korzystnie kompozycję z zastosowania według wynalazku stosuje się, gdy bakteria jest obecna na skórze.

Korzystnie kompozycja przeznaczona jest do profilaktyki i/lub leczenia stanów bakteryjnych w obrę bie jamy ustnej.

W zakres wynalazku wchodzi zastosowanie preparatu aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia stanów zapalnych.

Korzystnie kompozycję z zastosowania według wynalazku stosuje się, gdy stan zapalny występuje w obrębie jamy ustnej. Korzystnie kompozycję z zastosowania według wynalazku stosuje się, gdy stan zapalny występuje w miejscu pobrania tkanki do przeszczepienia.

Korzystnie aktywną substancją szkliwa jest macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa.

Korzystnie aktywna substancja szkliwa jest wybrana z grupy składającej się z enamelin, amelogenin, białek innych niż amelogeniny, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, amelin (ameloblastyna, szeatlina), tuftelin oraz ich pochodnych i ich mieszanin.

Korzystniej aktywna substancja szkliwa ma ciężar cząsteczkowy najwyżej około 120000u, jak np.100000u, 90000u, 80000u, 70000u lub 60000u, określony metodą elektroforetyczną SDS Page.

Korzystniej preparat aktywnej substancji szkliwa zawiera mieszaninę aktywnych substancji szkliwa o różnych ciężarach cząsteczkowych.

Korzystniej preparat aktywnej substancji szkliwa składa się co najmniej z dwóch substancji wybranych z grupy składającej się z amelogenin, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, tufteliny, białek tuft, białek surowicy, białek śliny, ameliny, ameloblastyny, sheatliny oraz ich pochodnych.

Korzystnie aktywna substancja szkliwa ma ciężar cząsteczkowy do około 40000u, albo pomiędzy 5000 a 25000u.

Korzystnie główna część aktywnej substancji szkliwa ma ciężar cząsteczkowy 20000u.

Korzystnie co najmniej część aktywnej substancji szkliwa jest w postaci agregatów lub po zastosowaniu in vivo jest zdolna do tworzenia agregatów, korzystnie o wielkości cząstek od 20 nm do 1 mikrometra.

Korzystnie zawartość białka w aktywnej substancji szkliwa w preparacie jest w zakresie od 0,05% wagowych do 100% wagowych, jak np. 5-99% wagowych, 10-95% wagowych, 15-90% wagowych, 20-90% wagowych, 30-90% wagowych, 40-85% wagowych, 50-80% wagowych, 60-70% wagowych, 70-90% wagowych, lub 80-90% wagowych.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą, którą jest alginian glikolu propylenowego albo kwas hialuronowy lub jego sole lub pochodne.

Macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mogą być stosowane do leczenia zakażeń wywołanych przez bakterie razem z lub bez udziału środków antybakteryjnych. Bakteriami Gram-ujemnymi, których zakażenia można leczyć aktywną substancją szkliwa, mogą być paciorkowce, takie jak Neisseria (np. N. meningitis, N. gonorrhoeae) i Acinetobacter lub pałeczki, takie jak Bacterioides (np. B. fragilis), Bordetella (np. B. pertussis, B. parapertussis), Brucella (np. B. melitentis, B. abortus Bang, B. suis), Campylobacter (np. C. jejuni, C. coli, C. fetus), Citrobacter, Enterobacter,

PL 204 797 B1

Escherichia) np. E. coli), Haemophilus (np. H. influenzae, H. parainfluenzae) , Klebsiella (np. K. pneumoniae), Legionella (np. L. pneumophila), Pasteurella (np. P. yersinia, P. multocida), Proteus (np. P.mirabilis, P. vulgaris), Pseudomonas (np. P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei), Salmonella (np. S. enteritidis, S. infantitis, S. Dublin, S. typhi, S. paratyphi, S. schottmulleri, S. choleraesius, S. typhimurium, lub każdy z 2500 innych serotypów), Serratia (np. S. marscences, S. liquifaciens), Shigella (np. S. sonnei, S. flexneri, S. desynteriae, S. boydii), Vibrio (np. V. cholerae, V. el tor) oraz Yersinia (np. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis).

Bakterie Gram-dodatnie, których zakażenia można leczyć aktywną substancją szkliwa, to gronkowce, takie jak Streptococcus (np. S. pneumoniae, S. viridans, S. faecalis, S. pyogenes), Staphylococcus (np. S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. albus), oraz pałeczki, takie jak Actinomyces (np. A. israeli), Bacillus (np. B. cereus, B. subtilis, B. anthracis), Clostridium (np. C. botulinum, C. teteani, C. perfringens, C. diddicile), Corynebacterium (np. C. dyphtheriae), Listeria i Providencia. Inne bakterie, wywołujące zakażenia, to Propionobacterium acne i Pityosporon ovale.

Macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mogą również być stosowane w leczeniu zakażeń wywołanych krętkami, takimi jak Borrelia, Leptospira, Treponema lub Pseudomonas.

Czynnikiem przeciwbakteryjnym, który może być stosowany w kombinacji z macierzą szkliwa, pochodnymi macierzy szkliwa i/lub białkami macierzy szkliwa, może być lek przeciwbakteryjny, który działa przeciwbakteryjnie przez hamowanie syntezy ściany bakteryjnej, taki jak:

beta laktamy i wankomycyna, szczególnie penicyliny, takie jak: amidocylina, ampicylina, amoksycylina, azlocylina, bakampicylina, benzatina penicyliny G., karbenicylina, kloksacylina, cyklacylina, dikloksacylina, metacylina, mezliocylina, nafcylina, oksacylina, penicylina G., penicylina V., piperacylina oraz tikarcylina;cefalosporyny, takie jak leki pierwszej generacji cefadroksyl, cefazolin, cefaleksyna, cefalotyna, cefapiryna i cefradyna, leki drugiej generacji jak cefaclor, cefamandol, cefonicid, ceforanid, cefoksytyna oraz cefuroksym, lub cefalosporyny trzeciej generacji cefoprezon, cefotaksym, cefotetan, ceftazidim, ceftizoksim, ceftriakson i moksalaktam; karbapenemy jak imipenem; lub monobaktamy jak aztreonam;

inne leki przeciwbakteryjne, które działają hamująco na syntezę białek, jak chloramfenikol; inne tetracykliny, szczególnie demeklocyklina, doksycyklina, metacyklina, minocyklina i oksytetracyklina; amino glikozydy, takie jak amikacyna, gentamycyna kanamycyna, neomycyna netylmycyna, paromomycyna, spektynomycyna, streptomycyna i tobramycyna;

polimyksyny takie jak kolistyna, kolistimatat i polimyksyna B, oraz erytromycyny i linkomycyny; leki przeciwbakteryjne, których mechanizm działania opiera się na hamowaniu syntezy kwasów nukleinowych, a szczególnie sulfonamidy, takie jak sulfacytyna, sulfadiazyna, sulfizoksazol, sulfametoksazol, sulfametizol, i sulfapirydyna; trimetoprim, chinolony, nowobiocyna, pirymetamina i rifampina.

W szczególnym wykonaniu wynalazku, zakażenie występuje w jamie ustnej i jest wywołane bakteriami.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna z zastosowania według wynalazku jest stosowana, gdy zakażenie jest wywołane bakteriami, powodującymi próchnicę, np. Streptococcus mutans; bakteriami powodującymi choroby przyzębia, np. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter (Fusobacteria, Staphylococci), B. forsythus; bakteriami wywołującymi zapalenie zębodołów etc, np. Staphylococcus, Actinomyces i Bacillus; oraz bakteriami powodującymi ubytki okołowierzchołkowe, np. Spirochetes.

Bakterie jamy ustnej są hamowane kontaktowo lub zwalczane w inny sposób. Przykłady bakterii wywołujących stany chorobowe w jamie ustnej obejmują:

- bakterie wywoł ują ce próchnicę , np. Streptococcus mutans, Lactobacillus spp.

- bakterie wywoł ują ce choroby przyzę bia np: Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus microns, Camphylobacter (Fusobacteria, Staphylococci), B. forsytus - bakterie powodujące zapalenie zębodołu itp., np. Staphylococcus, Actinomyces i Bacillus

- bakterie powodujące uszkodzenia okołowierzchołkowe, np. Spirochetes i wszystkie wyż ej wymienione.

W celu zahamowania objawów zapalnych stosuje się wiele leków, w tym adrenokortykosterydy, liczną grupę leków obejmującą tzw. niesterydowe leki przeciwzapalne lub NSAID, oraz leki, takie jak czynniki immunosupresyjne. Adrenokortykosterydy, a w szczególności glikokortykoidy, stosowane w dawkach farmakologicznych wywierają silne działanie przeciwzapalne. W szczególności hamują

PL 204 797 B1 wczesną fazę naczyniową procesu zapalnego zmniejszając przepuszczalność naczyń, a tym samym migrację granulocytów. Glikokortykoidy również oddziałują na późną fazę zapalenia oraz na procesy reparacyjne w ten sposób, że hamują proliferację komórek mezenchymatycznych oraz produkcję makromolekuł zewnątrzkomórkowej macierzy, w tym proteoglikanów i kolagenu. Wykazano doświadczalnie, że glikokortykoidy hamują np. funkcje makrofagów, produkcję przeciwciał humoralnych, odpowiedź komórkową oraz prawdopodobnie uwalnianie enzymów lizosomalnych.

Stopień uszkodzenia tkanek może zależeć od reakcji antygen/przeciwciało w organizmie, jak też od stopnia wchłaniania produktów reakcji zapalnej w okolicy zranienia. Nagromadzenie się mediatorów miejscowej reakcji zapalnej przyspiesza proces. W większości przypadków proces ten przebiega powoli, z naciekaniem tkanki komórkami immunologicznie czynnymi oraz z wytwarzaniem tkanki ziarninowej, zawierającej komórki zapalne.

W niniejszym opisie termin „efekt przeciwzapalny” oznacza przeciwdziałanie lub zahamowanie procesu zapalnego.

Stan zapalny może być oczywiście dowolnym stanem zapalnym w/na każdej części ciała lub dowolnym stanem zapalnym występującym w obrębie tkanek miękkich lub twardych. W jednym z wykonań wynalazku stan zapalny jest obecny w obrębie jamy ustnej. Przykładami stanów zapalnych w obrębie jamy ustnej są: zapalenie zębodołu, zapalenie warg, martwica kości (po urazie), złamania.

W jednym z wykonań wynalazek dotyczy zastosowania preparatu aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania lub leczenia stanu zapalnego w miejscu pobrania tkanki do przeszczepu. Stany zapalne mogą przebiegać w obrębie jam stawowych. Przykładem takich stanów zapalnych jest reumatoidalne zapalenie stawów oraz stany z nim związane.

W przeciwieństwie do wielu obecnie stosowanych środków antybiotycznych, białka macierzy szkliwa nie będą upośledzać procesu gojenia ran, a z kolei szybkie gojenie się rany nie pozwala na rozwinięcie się przewlekłego procesu zapalnego. Także reorganizacja właściwych tkanek, jak opisana po zastosowaniu pochodnych macierzy szkliwa do ubytków okołozębowych, jest wyraźnie korzystna, dzięki szybkiemu wygojeniu rany bez bakterii lub reakcji zapalnych.

Zastosowanie macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa powoduje szybkie wygajanie ran po nacięciach chirurgicznych przypuszczalnie przez tworzenie powierzchni, która w kontakcie z bakteriami hamuje ich wzrost, jednocześnie wzmagając migrację fibroblastów i syntezę kolagenu. Gdy skróceniu ulega etap zapalenia, wtedy mniej nasilone są typowe objawy, jak wzrost ciepłoty, zaczerwienienie, obrzęk oraz ból.

Macierz szkliwa jest prekursorem szkliwa i może być otrzymana z każdego, odpowiedniego źródła, t.j. od ssaków, u których rozwijają się zęby. Wygodnym źródłem są rozwijające się zęby zwierząt rzeźnych, takich jak np. cielęta, świnie, owce. Innym źródłem jest np. skóra ryb.

Macierz szkliwa może być sporządzona z rozwijających się zębów, jak opisano uprzednio (EPB-0 337 967 i EP-B-0 263 086). Macierz szkliwa zeskrobuje się i sporządza pochodne macierzy szkliwa, np. przez ekstrakcję wodnymi roztworami, takimi jak bufor, rozcieńczony kwas lub zasada, lub mieszaniną woda/rozpuszczalnik, następnie filtruje się, pozbywając większych elementów, odsala lub stosuje inne etapy oczyszczania, kończąc liofilizacją. Enzymy można unieczynniać przez ogrzewanie lub stosując rozpuszczalniki, w tym przypadku pochodne można przechowywać w stanie ciekłym, bez liofilizacji.

W niniejszym opisie pochodne macierzy szkliwa są pochodnymi macierzy szkliwa, obejmującymi jedno lub kilka białek macierzy szkliwa lub część tych białek, produkowanych naturalnie drogą alternatywnego składania lub obróbki, lub na drodze enzymatycznego lub chemicznego cięcia naturalnej długości białka, lub uzyskanych na drodze syntezy polipeptydów in vitro lub in vivo (metody rekombinacji DNA lub hodowla komórek diploidalnych). Pochodne białek macierzy szkliwa obejmują również polipeptydy lub białka związane z macierzą szkliwa. Polipeptydy lub białka mogą być związane z odpowiednimi cząsteczkami biodegradowalnego nośnika. Ponadto termin „pochodne macierzy szkliwa” obejmuje także analogiczne substancje syntetyczne.

Białka są biologicznymi makrocząsteczkami zbudowanymi z reszt aminokwasów, połączonych za pomocą wiązań peptydowych. Białka, jako łańcuchowe polimery aminokwasów, zwane są także polipeptydami. Zwykle białka składają się z 50-800 reszt aminokwasowych i w związku z tym ich ciężar cząsteczkowy waha się od około 6000 do kilkuset tysięcy, lub więcej, Daltonów (1 dalton (Da) = 1 u). Małe białka nazywane są peptydami lub oligopeptydami.

PL 204 797 B1

Białka macierzy szkliwa są białkami normalnie obecnymi w macierzy szkliwa, tj. prekursorze szkliwa (Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1:282-291), lub białkami, które można otrzymać przez trawienie tych białek. Ogólnie biorąc ciężar cząsteczkowy tych białek wynosi poniżej 120000 Daltonów i w ich skład wchodzą amelogeniny, białka inne niż amelogeniny, bogate w porolinę białka inne niż amelogeniny, ameliny (ameloblastyna, szeatlina) oraz tufteliny.

Preparaty, zawierające aktywną substancję szkliwa wykorzystane w wynalazku, mogą także zawierać co najmniej dwie z wymienionych substancji białkowych. Handlowy produkt, zawierający amelogeniny oraz prawdopodobnie inne białka macierzy szkliwa występuje na rynku pod nazwą EMDOGAIN© (Biora AB).

Na ogół główne białka macierzy szkliwa znane są jako amelogeniny. Stanowią one około 90% wagowych białek macierzy. Pozostałe 10% wagowych stanowią bogate w prolinę białka inne niż amelogeniny, tuftelina, białka tuft, białka surowicy oraz co najmniej jedno białko śliny; mogą jednak występować inne białka, związane z macierzą szkliwa, takie jak np. amelina (ameloblastyna, szeatlina). Ponadto mogą być syntetyzowane i/lub obrabiane białka różnej wielkości (tj. różniące się ciężarem cząsteczkowym). I tak dominujące białka macierzy szkliwa - amelogeniny - występują jako cząsteczki o różnym ciężarze, tworząc razem wielkoczą steczkowe agregaty. Są to wyraźnie hydrofobowe substancje, tworzące w warunkach fizjologicznych agregaty. Mogą być przenoszone, lub być nośnikami dla innych białek lub peptydów.

Brane pod uwagę jest także stosowanie innych substancji białkowych w kompozycjach wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem według wynalazku. Przykładem mogą być takie białka jak białka bogate w prolinę oraz poliprolina. Innymi przykładami substancji, rozpatrywanych jako odpowiednie do stosowania w kompozycjach wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem według wynalazku są agregaty takich białek, agregaty pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa, jak również metabolity macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa oraz białek macierzy szkliwa. Metabolity mogą być różnej wielkości - od wielkości białek do krótkich peptydów.

Jak wyżej wspomniano, białka, polipeptydy lub peptydy do stosowania w kompozycji wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zwykle mają ciężar cząsteczkowy najwyżej około 120 kDa, najczęściej 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa lub 60 kDa, oznaczony metodą elektroforetyczną SDS.

Białka do stosowania w kompozycji wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku normalnie są w postaci preparatów, przy czym zawartość aktywnej substancji szkliwa w preparatach jest w szerokim zakresie od około 0,05% wag./wag. do 100% wagowych, jak np. około 5-99% wagowych, około 10-95% wagowych, około 15-90% wagowych, około 20-90% wagowych, około 30-90% wagowych, około 40-85% wagowych, około 50-80% wagowych, około 60-70% wagowych, około 70-90% wagowych, lub około 80-90% wagowych.

Preparat aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zastosowania zgodnie z wynalazkiem może również zawierać mieszaninę aktywnych substancji szkliwa o róż nym ciężarze czą steczkowym.

Korzystnie preparat aktywnej substancji szkliwa składa się co najmniej z dwóch substancji wybranych z grupy składającej się z amelogenin, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, tufteliny, białek tuft, białek surowicy, białek śliny, ameliny, ameloblastyny, szeatliny oraz ich pochodnych.

Białka macierzy szkliwa można podzielić na mające wysoki ciężar cząsteczkowy oraz niski ciężar cząsteczkowy, i stwierdzono, że dokładnie scharakteryzowana frakcja białek macierzy szkliwa ma korzystne właściwości w leczeniu ubytków okołozębowych (np. rany okołozębowe). Frakcja ta zawiera białka, ogólnie określane jako amelogeniny, dające się ekstrahować kwasem octowym i stanowi część macierzy szkliwa o niskim ciężarze cząsteczkowym (według EP-B-0 337 967 i EP-B-0- 263 086).

Jak omówiono powyżej, część macierzy szkliwa o niskim ciężarze cząsteczkowym wykazuje żądaną aktywność wywoływania w ubytkach okołozębowych połączeń pomiędzy twardymi tkankami. Jednak w niniejszym opisie, aktywne białka nie są ograniczone do frakcji macierzy szkliwa o niskim ciężarze cząsteczkowym. Obecnie priorytetowe białka zawierają białka macierzy szkliwa takie jak amelogenina, amelina, tuftelina itp. o ciężarach cząsteczkowych (określanych in vitro metodą SDSPAGE) poniżej 60000 u, lecz białka mające ciężar cząsteczkowy powyżej 60000u mają także obiecujące własności jako kandydaci do gojenia ran, czynniki antybakteryjne i/lub czynniki przeciwzapalne.

PL 204 797 B1

Wobec powyższego uważa się, że aktywna substancja szkliwa do wytwarzania kompozycji do zastosowania zgodnie z wynalazkiem ma ciężar cząsteczkowy do około 40000u, taki jak np. ciężar cząsteczkowy w zakresie od około 5000 do około 25000u.

W zakresie niniejszego wynalazku jest również zastosowanie peptydów jak opisane w WO 97/02730, tj. peptydów mających co najmniej jeden element sekwencji wybrany z grupy złożonej z tetrapeptydów DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), VTKG (Val-Thr-Lys-Gly), EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) oraz DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu) i które dalej obejmują sekwencje aminokwasowe, które tworząc łańcuch 20 aminokwasów wykazują przynajmniej 80% homologii z łańcuchem grup stanowiących sekwencję wykazaną w SEK ID Nr: 1 oraz z sekwencją aminokwasów 1 do 103 według SEK ID Nr: 1 oraz aminokwasów 6 do 324 wg SEK ID Nr:2.

Przez pojęcie „identyczność sekwencji” rozumie się identyczność kolejności aminokwasów pasujących pod względem tożsamości i pozycji aminokwasów w peptydach. Przerwa jest uważana jako brak identyczności dla odpowiednio jednego lub więcej aminokwasów.

Takie peptydy mogą składać się z 6 do 300 aminokwasów, np. przynajmniej 20 aminokwasów, przynajmniej 30 aminokwasów, przynajmniej 90 aminokwasów, przynajmniej 120 aminokwasów, przynajmniej 150 aminokwasów i przynajmniej 200 aminokwasów.

Sposób izolacji białek macierzy szkliwa wymaga ekstrakcji białek oraz usunięcia jonów wapnia i fosforu z rozpuszczonych hydroksyapatytów przy zastosowaniu odpowiednich metod, np. filtracji w żelu, dializy albo ultra-filtracji (patrz np. Janson, J-C & Ryden, L. (Eds.) Protein purification, VCH Publishers 1989 i Harris, ELV & Angal, S., Protein purification methods - A practical approach, IRL Press, Oxford 1990).

Typowy preparat liofilizowanego białka może zawierać głównie lub wyłącznie do 70-90% amelogenin o ciężarze cząsteczkowym pomiędzy 40000 a 5000 Daltonów, pozostałe 10-30% stanowią mniejsze peptydy, sole oraz resztki wody. Główne prążki białka są na poziomie 20000 u, 12-14 OOOu oraz około 5000.

Rozdzielając białka, np. metodą precypitacji, chromatografii jonowowymiennej, chromatografii z odwróconymi fazami lub chromatografii powinowactwa można oczyś cić amelogeniny o różnych ciężarach cząsteczkowych.

Kombinacja amelogenin o różnych ciężarach cząsteczkowych może ulegać zmianom, od dominującego składnika o ciężarze 20 kDa aż po agregaty amelogenin o różnych ciężarach cząsteczkowych pomiędzy 40000 a 5000 u i do dominującego składnika o ciężarze 5000. Inne białka macierzy szkliwa, takie jak amelina, tuftelina lub enzymy proteolityczne, normalnie występujące w macierzy szkliwa mogą być dołączone do agregatów amelogeniny.

Alternatywnym źródłem pochodnych macierzy szkliwa lub białek może być ich synteza przez komórki hodowane in vitro lub przez bakterie w oparciu o metody rekombinacji DNA (patrz np. Sambrook, J. et al.: Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Na ogół macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa oraz białka macierzy szkliwa są substancjami hydrofobowymi, t.j. gorzej rozpuszczalnymi w wodzie, szczególnie w podwyższonej temperaturze. W zasadzie białka te rozpuszczają się przy niefizjologicznych wartościach pH i w niższej temperaturze, takiej jak 4-20° C, natomiast ulegają agregacji i precypitacji w temperaturze ciała (35-37°C) i w obojętnym pH.

Macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa stosowanie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmują również czynne substancje szkliwa, przy czym co najmniej część aktywnej substancji występuje w postaci agregatów lub jest zdolna do tworzenia agregatów po zastosowaniu in vivo. Korzystnie wielkość cząsteczek agregatów jest w zakresie od około 20 nm do około 1 μm.

Uważa się, że rozpuszczalność macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa ma ważne znaczenie dla aktywności terapeutycznej i profilaktycznej substancji. Gdy kompozycja zawierająca macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa (dalej określane jako „aktywna substancja szkliwa” jako pojęcie ogólne) zostanie podana np. człowiekowi, białkowe substancje ulegną precypitacji w warunkach normalnego, fizjologicznego pH. Zatem w miejscu nałożenia wytwarza się warstwa macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa i warstwa ta (która może być również warstwą cząsteczek w przypadkach powstawania agregatów) nie ulega wypłukaniu w warunkach fizjologicznych. Ponadto dzięki własnościom bioadhezyjnym substancji (patrz niżej) warstwa precypitująca jest mocno związana z tkanką, także na

PL 204 797 B1 brzegu pomiędzy precypitującą warstwą a tkanką. Zatem białkopodobna warstwa, pokrywa tkankę, na którą nałożono macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa, a aktywne substancje szkliwa utrzymywane są in situ przez dłuższy czas, tj. nie ma potrzeby podawania aktywnej substancji szkliwa zbyt często. Ponadto warstwę utworzoną in situ można porównać z opatrunkiem okluzyjnym, tj. wytworzona warstwa chroni tkankę, na której została wytworzona, przed otoczeniem. W przypadku zranionej tkanki, tkanki zakażonej lub tkanki zapalnej taka warstwa chroni tkankę przed dalszym zakażeniem przez mikroorganizmy obecne w otoczeniu. Ponadto warstwa białkowa może wywierać działanie przez bezpośredni kontakt z tkanką lub z mikroorganizmami obecnymi w/na/w pobliżu tkanek.

W celu umoż liwienia wytworzenia in situ warstwy biał kopodobnej, po podaniu korzystne moż e być włączenie odpowiedniej substancji buforowej do farmaceutycznej kompozycji macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa; celem takiej substancji buforowej może być zapobieganie rozpuszczeniu aktywnej substancji szkliwa w miejscu stosowania.

Stwierdzono, że macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mają własności bioadhezyjne, tj. mają zdolność przylegania do powierzchni skóry lub powierzchni błon śluzowych. Te właściwości są najcenniejsze dla postępowania terapeutycznego i/lub zapobiegawczego co najmniej z następujących powodów: - substancje aktywne mogą być zapobiegawczo i/lub terapeutycznie utrzymywane przez dłuższy czas w miejscu przyłożenia (tj. i) można ograniczyć częstotliwość podawania, ii) można uzyskać kontrolę nad uwalnianiem substancji aktywnej i/lub iii) usprawnione jest miejscowe leczenie w miejscu przyłożenia);

- substancje mogą same służyć jako nośniki dla innych profilaktycznie lub terapeutycznie aktywnych substancji, ponieważ nośnik zawierający macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa można uformować jako bioadhezyjne nośniki (t.j. nowy system dostarczania leków bioadhezyjnych, opierający się na bioadhezyjnych własnościach macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa).

Macierz szkliwa stanowi przykład zewnątrzkomórkowej macierzy białkowej, która przylega do powierzchni minerałów jak też do powierzchni białkowych. W fizjologicznej temperaturze i w fizjologicznym pH białka tworzą nierozpuszczalne wielkocząsteczkowe agregaty (Fincham et al. w J. Struct. Biol. 1994 March-April; 112 (2): 103-109 oraz w J. Struct. Biol. 1995 July-August; 115 (1): 50-59), które są stopniowo degradowane przez enzymy proteolityczne (występujące zarówno in vivo, jak i in vitro, pod warunkiem że proteazy nie były poddane procesowi inaktywacji).

Ostatnia obserwacja, że macierz szkliwa jest wytwarzana i przejściowo obecna w przebiegu wytwarzania korzenia i cementu korzeniowego pomaga wyjaśnić jak stosowanie macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa ułatwia regenerację tkanki okołozębowej. Jednak obserwacja, leżąca u podstaw niniejszego wynalazku, że macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa wykazują również korzystny wpływ przeciwzakaźny i przeciwzapalny jest bardzo zaskakująca.

U wielu gatunków resztki macierzy szkliwa znajdują się w świeżo zmineralizowanej koronie, w czasie wyrzynania się zębów w jamie ustnej. Można uznać, że nowe zęby byłyby bardzo podatne na atak bakterii powszechnie występujących w jamie ustnej, gdyby nie miały naturalnej ochrony podczas początkowej fazy.

Stosowanie nierozpuszczalnej macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa wykazujących odpowiednie własności antybakteryjne oraz przeciwzapalne na zranioną powierzchnię wzmocni oraz poprawi gojenie.

Jak przedstawiono w części doświadczalnej macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa lub agregaty białek powstrzymują wzrost bakterii przez hamowanie kontaktowe, podczas gdy poddane ich działaniu komórki reagują na macierz szkliwa jak na normalne środowisko, które hamuje odpowiedzi zapalne.

Macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mogą być stosowane w kompozycji farmaceutycznej wytwarzanych w celach leczniczych, jak i zapobiegawczych.

Ponadto, macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa, i/lub białka macierzy szkliwa mogą być stosowane razem z innymi aktywnymi substancjami leczniczymi, takimi jak np. substancje przeciwbakteryjne, przeciwzapalne, przeciwwirusowe, przeciwgrzybicze, lub też w kombinacji z czynnikami wzrostu, takimi jak np. TGFB, PDGF, IGF, FGF, czynnik wzrostu keratynocytów lub ich peptydowe analogi (przyjmuje się, że EGF ułatwia gojenie poprzez zwiększanie migracji i proliferacji komórek nabłonkowych; ponadto EGF zwiększa w ranie liczbę fibroblastów, powodując zwiększoną syntezę kolagenu).

PL 204 797 B1

Enzymy, a szczególnie proteazy - zarówno normalnie występujące w macierzy szkliwa lub w jej preparatach, jak też dodane, mogą również być użyte w kombinacji z macierzą szkliwa, pochodnymi macierzy szkliwa, i/lub białka macierzy szkliwa.

Preparat aktywnej substancji szkliwa jest zwykle formułowany jako kompozycja farmaceutyczna. Taka kompozycja zawiera preparat białkowy i ponadto farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą. Szczególnie korzystnymi substancjami pomocniczymi do farmaceutycznych kompozycji wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem według wynalazku są alginian glikolu propylenowego, albo kwas hialuronowy albo jego sole lub pochodne.

Poniżej podano przykłady odpowiednich kompozycji, zawierających aktywną(e) substancję(e) szkliwa. W zależności od użycia aktywnej(ch) substancji szkliwa, kompozycja może być kompozycją farmaceutyczną.

W celu podawania osobnikom (ludziom lub zwierzę tom) macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa, i/lub białek macierzy szkliwa (dalej również oznaczanej jako „aktywna substancja szkliwa”) i/lub ich preparatów korzystnie przeprowadza się je w postać kompozycji farmaceutycznej zawierającej aktywną substancję szkliwa i, ewentualnie jedną lub kilka farmaceutycznie dopuszczalnych substancji pomocniczych.

Kompozycje mogą występować w postaci np. stałej, półstałej lub ciekłej, takiej jak np., bioabsorbowalne plasterki, przymoczki, opatrunki, opatrunki żelowe, opatrunki hydrokoloidalne, błony, gąbki, płatki, bandaże, plastry, kompozycje w postaci urządzeń dostarczających, wszczepy; pudry, granulki, kapsułki, perełki z chitozanu, tabletki, pigułki, peletki, mikrokapsułki, mikrokuleczki, nanocząstki; spray'e, aerozole, przyrządy inhalacyjne; żele, hydrożele, pasty, maści, kremy, mydła, czopki, gałki dopochwowe, pasty do zębów; roztwory, dyspersje, zawiesiny, emulsje, mieszaniny, lotiony, płyny do płukania ust, szampony, lewatywy; zestawy składające się z dwóch pojemników, gdzie pierwszy zbiornik zawiera aktywną substancję szkliwa ewentualnie zmieszaną z inną substancją aktywną leczniczo /lub dopuszczalną farmaceutycznie substancją pomocniczą, a drugi pojemnik zawiera odpowiednie podłoże, które ma być dodane do pierwszego pojemnika przed zastosowaniem, celem otrzymania gotowej do użycia kompozycji; oraz w innych stosownych postaciach, jak np. wszczepy lub pokrycia wszczepów, lub w stosownej postaci do użycia w implantacji lub transplantacji.

Za najważniejsze dla niniejszego wynalazku uznaje się zastosowanie preparatu aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania kompozycji do stosowania na skórę lub na błony śluzowe. Zatem kompozycje zawierające aktywną substancję szkliwa do podawania można zaadaptować do podawania dowolną, właściwą drogą, np. na wierzch (skórna), na usta, policzki, donosowo, na małżowinę uszną, doodbytniczo lub dopochwowo, albo podając do jam ciała, takich jak np. korzeń zęba lub kanał korzenia zęba. Ponadto, kompozycja może być zaadaptowana do podawania w połączeniu z zabiegiem chirurgicznym, np. w połączeniu z nacięciem ciała w celu usprawnienia gojenia się ran wewnętrznych oraz uszkodzeń tkanek miękkich.

Jak wspomniano powyżej, kompozycja aktywnej(ych) substancji szkliwa może być przydatna podczas zabiegu chirurgicznego, np. w stosowaniu domiejscowym (np. w obrębie jamy ustnej) w postaci żelu, błony lub suchej tabletki wszczepianej podskórnie, lub jako roztwór do płukania lub leczenia pastą lub kremem powierzchni celem zapobieżenia inwazji bakteryjnej. W związku z chirurgią lub wszczepianiem w okolicy kanału korzenia zęba można zastosować pastę do zaklejenia jamy.

Kompozycje można sporządzić zgodnie z ogólnie przyjętymi zasadami farmaceutycznymi, patrz np. „Remington Pharmaceutical Sciences” i „Encyclopedia of Pharmaceutical Technology” wydana przez Swarbrick, J.& J. C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988.

Jak wyżej wspomniano, zastosowanie kompozycji zawierających aktywną substancję szkliwa jest przeznaczone dla skóry i błon śluzowych. Oczywiście odpowiednie mogą być też inne zastosowania, takie jak np. protezy zębowe, mostki, wszczepy, i stosowanie w obrębie jam ciała, takich jak jama ustna, jama nosowa, jama pochwy. Błona śluzowa jest korzystnie wybrana z błony jamy ustnej, policzków, nosa, uszu oraz pochwy.

Ponadto bardzo duże znaczenie ma stosowanie w okolice zębowe i około zębowe. Ważnymi przykładami są zastosowania do kieszonek okołozębowych (zębowych), na dziąsła, lub na rany dziąseł lub na inne rany w obrębie jamy ustnej, albo w związku z chirurgią w obrębie jamy ustnej.

Dalej przyjmuje się, że dzięki własnościom antybakteryjnym opisanej tu substancji aktywnej szkliwa korzystne może być stosowanie jej na zęby lub na korzenie zębów w celu zapobieżenia próchnicy i/lub płytkom nazębnym. W celu poparcia takiego zastosowania wykazano w (Weinmann, J.P. et al.: Hereditary disturbances of enamel formation and calcif ication, J. Mer. Dent. Assoc. 32:

PL 204 797 B1

397-418, 1945; Sundell S, Hereditary amelogenesis imperfecta. An eoidemiological, genetic and clinical study in a Swedish child population, Swed Dent J Suppl 1986; 31: 1-38), że zęby, które są nieprawidłowo rozwinięte (amelogenesis imperfecta) i w następstwie tego zawierają zwiększoną ilość amelogenin są znacznie mniej podatne na próchnicę.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające aktywną substancję szkliwa służą jako system dostarczania leków. W niniejszym tekście pojęcie „system dostarczania leku” oznacza kompozycję farmaceutyczną (formulację farmaceutyczną lub postać dawkowania), która w następstwie podania prezentuje organizmowi ludzkiemu lub zwierzęcemu aktywną substancję. Tak więc termin „system dostarczania leku” obejmuje czyste kompozycje farmakologiczne, takie jak np. kremy, maści, płyny, pudry, tabletki itp. jak również bardziej złożone formulację, jak spray'e, plastry, bandaże, opatrunki, urządzenia, etc.

Oprócz aktywnej substancji szkliwa, kompozycje farmaceutyczne wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku zawierają dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze.

Dopuszczalna farmaceutycznie substancja pomocnicza jest substancją nieszkodliwą dla osobnika, któremu się ją podaje. Taka substancja pomocnicza spełnia zwykle wymagania narodowych władz zdrowia. Urzędowe farmakopeje, takie jak np. the British Pharmacopoeia, the United States of America Pharmacopoeia oraz The European Pharmacopoeia zawierają standardy farmaceutycznie dopuszczalnych substancji pomocniczych.

Dobór dopuszczalnej farmaceutycznie substancji pomocniczej jest odpowiednia do stosowania w kompozycjach farmaceutycznych, zależ y w istocie od rodzaju postaci dawkowania. Poniżej podane zostaną przykłady właściwie dobranych substancji pomocniczych, zgodnie z wymogami farmaceutycznymi, zastosowanych w różnych rodzajach kompozycji.

Poniżej podano przegląd odpowiednich kompozycji farmaceutycznych wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem wedł ug wynalazku. Przeglą d opiera się na konkretnych drogach podawania. Korzystnie jednak w przypadkach, gdy farmaceutycznie dopuszczalna substancja pomocnicza może być użyta w różnych postaciach dawkowania lub w różnych kompozycjach, zastosowanie określonej dopuszczalnej farmaceutycznie substancji pomocniczej nie jest ograniczone do określonej postaci dawkowania lub do określonej funkcji.

Wyboru dopuszczalnej(ch) farmakologicznie substancji pomocniczej(ch) w kompozycji wytworzonej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku oraz jej(ich) optymalnego stężenia nie można na ogół przewidzieć i musi on być określony na podstawie eksperymentalnej oceny końcowego składu. Jednak specjalista w dziedzinie może znaleźć wskazówki m.in. w „Remington's Pharmaceutical Sciences”, 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, 1990.

Do stosowania na błony śluzowe lub na skórę, kompozycja wytwarzana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może zawierać uznane, farmakologicznie dopuszczalne, nietoksyczne nośniki i substancje pomocnicze, w tym mikrosfery oraz liposomy.

Kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmują wszelkie rodzaje stałych, półstałych oraz płynnych składników. Kompozycjami szczególnie istotnymi są np. pasty, maści, maści hydrofilowe, kremy, żele, hydrożele, roztwory, emulsje, zawiesiny, lotiony mazidła, szampony, galaretki, mydła, pałeczki, spray'e, pudry, błony, pianki, tampony, gąbki np. gąbki kolagenowe), opatrunki (takie jak np. opatrunek absorpcyjny), dreny, bandaże, plastry oraz systemy dostarczania przezskórnego.

Farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze mogą obejmować rozpuszczalniki, czynniki buforujące, konserwanty, środki nawilżające, środki chelatujące, antyoksydanty, stabilizatory, czynniki emulgujące, środki zawieszające, czynniki tworzące żel, podłoża do maści, środki zwiększające penetrację, perfumy oraz środki ochraniające skórę.

Przykładami rozpuszczalników są np. woda, alkohole, oleje roślinne lub od zwierząt morskich (np. oleje jadalne jak olej migdałowy, olej rycynowy, masło kakaowe, olej kokosowy, olej kukurydziany, olej z nasion bawełny, olej lniany, olej oliwkowy, olej palmowy, olej z orzeszków ziemnych, olej makowy, olej sezamowy, olej sojowy, olej słonecznikowy oraz olej z nasion herbaty), oleje mineralne, płynna parafina, glikole polietylenowe, glikole propylenowe, glicerol, płynne polialkilosiloksany, oraz ich mieszaniny.

Przykładami czynników buforujących są np. kwas cytrynowy, kwas octowy, kwas winowy, kwas mlekowy, kwas wodorofosforowy, dietyloamina, etc.

PL 204 797 B1

Właściwymi przykładami środków konserwujących do stosowania w kompozycjach są parabeny, takie jak parahydroksybenzoesan propylu metylu, etylu, paraben butylowy, paraben izobutylowy, paraben isopropylenowy, sorbinian potasu, kwas benzoesowy, kwas sorbowy, benzoesan metylu, fenoksyetanol, bronopol, bronidoks, hydantoina MDM, butylkarbaminian jodopropynylu, EDTA, chlorek benzalkonium i alkohol benzylowy, lub mieszaniny środków konserwujących.

Przykładami środków nawilżających są gliceryna, glikol propylenowy, sorbitol, kwas mlekowy, mocznik, oraz ich mieszaniny

Przykładami substancji chelatujących są sól sodowa EDTA oraz kwas cytrynowy.

Przykładami antyoksydantów są butylowany hydroksyanizol (BHA), kwas askorbinowy i jego pochodne, tokoferol i jego pochodne, cysteina, oraz ich mieszaniny.

Przykładami czynników emulgujących są występujące naturalnie żywice, np. guma arabska lub guma tragakantowa; występujące naturalnie fosfatydy, np. lecytyna soi; pochodne monooleinianu sorbitanu; tłuszcze z wełny; lanolina; estry sorbitanu; monoglicerydy; kwasy tłuszczowe; estry kwasów tłuszczowych (np. triglicerydy kwasów tłuszczowych); oraz ich mieszaniny.

Przykładami środków zawieszających są np. celuloza oraz pochodne celulozy takie jak np. karboksymetyloceluloza, hydroksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, karagenina, guma arabska, tragakanta, oraz ich mieszaniny.

Przykładami podłoży do żelu, czynników zwiększających lepkość lub składników zdolnych do usuwania wysięku z ran są: płynna parafina, polietylen, oleje tłuszczowe, koloidalna krzemionka lub glin, mydła cynkowe, glicerol, glikol propylenowy, tragakanta, polimery karboksywinylowe, krzemiany magnezowo-glinowe, Carbopol, polimery hydrofilne takie jak np.skrobia lub pochodne celulozy, takie jak karboksymetyloceluloza, hydroksyetyloceluloza i inne pochodne celulozy, hydrokoloidy pęczniejące w wodzie, karageniny, hialuroniany (np. żel hialuronowy ewentualnie zawierający chlorek sodu) oraz alginiany, w tym aginian glikolu propylenowego.

Przykładami podłoży do sporządzania maści są np. wosk pszczeli, parafina, cetanol, palmitynian cetylu, oleje roślinne, estry sorbitanu kwasów tłuszczowych (Span), glikole polietylenowe oraz produkty kondensacji między sorbitanowymi estrami kwasów tłuszczowych i tlenkiem etylenu, n.p. monooleinian polioksyetylenosorbitanu (Tween).

Przykładami hydrofobowych lub emulgujących w wodzie podłoży do sporządzania maści są parafiny, oleje roślinne, tłuszcze zwierzęce, syntetyczne glicerydy, woski, lanolina oraz płynne polialkilosiloksany.

Przykładami podłoży do sporządzania maści hydrofilowych są stałe makrogole (glikole polietylenowe).

Innymi przykładami podłoży do sporządzania maści są mydła trietanoloaminowe, sulfonowane alkohole tłuszczowe i polisorbaty.

Przykładami mieszanin sproszkowanych są: alginian, kolagen, laktoza, proszek zdolny do utworzenia po nałożeniu na ranę żelu (absorbuje płyn/wysięk z rany). Zwykle proszki, przeznaczone do stosowania na duże, otwarte rany, muszą być sterylne, a cząsteczki muszą być pulweryzowane do wielkości mikronów.

Przykładami innych substancji pomocniczych są polimery, takie jak karmeloza, sól sodowa karmelozy, hydroksypropylometyloceluloza, hydroksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, pektyna, guma ksantanowa, guma arabska, żelatyna, karbomer, emulgatory takie jak witamina E, stearynian glicerolu, glukozyd cetanylu, kolagen, karagenina, hialuroniany i alginiany i chitozany.

Opatrunki i/lub bandaże również są ważnymi systemami dostarczania aktywnej substancji szkliwa. Gdy opatrunek stanowić ma postać dawkowania, aktywna substancja szkliwa może być zmieszana z innym materiałem/składnikami zanim, albo podczas procesu produkowania opatrunku, lub aktywna substancja szkliwa może w jakiś sposób pokrywać opatrunek, np. przez zanurzenie opatrunku w roztworze lub dyspersji aktywnej substancji szkliwa lub przez rozpylenie lub dyspersję aktywnej substancji szkliwa na opatrunek. Ewentualnie aktywna substancja szkliwa może być stosowana w postaci proszku do opatrunku. Opatrunki mogą występować w formie opatrunku absorbcyjnego w ranach wysiękowych. Opatrunki mogą mieć także postać opatrunków hydrożelowych (np. usieciowane polimery takie, jak np. Intrasite®, które zawierają karboksymetylocelulozę, glikol propylenowy albo polisacharydy, disacharydy i białka) lub w formie opatrunków okluzyjnych takich jak np. alginiany, chitozan, hydrofilowe błony poliuretanowe, listki kolagenowe, płytki, proszki, pianki albo gąbki (np. poliuretanowe lub silikonowe), hydrokoloidy (np. karboksymetyloceluloza, CMC), opatrunki oparte na kolagenie i kwasie hialuronowym, w tym kombinację powyższych.

PL 204 797 B1

Alginian, chitozan oraz opatrunki hydrokoloidowe, nałożone na ranę pobierają płyn wysiękowy. Robiąc to wytwarzają wodny żel na powierzchni rany i uznaje się, że żel ten jest korzystny dla procesu gojenia się rany dzięki utrzymywaniu wilgotności rany.

Rozważa się także, że aktywna substancja szkliwa może być wbudowana do kleju tkankowego, zawierającego również np. fibrynogen i trombinę, i ewentualnie Czynnik XIII lub inny czynnik koagulujący osocze w celu zatrzymania krwawienia.

Kleje tkankowe mogą być sporządzane albo jako mieszanina wstępna aktywnej substancji szkliwa, fibrynogenu i Czynnika XIII, a trombina dodawana jest dopiero potem, bezpośrednio przed zastosowaniem kleju tkankowego na ranę. Alternatywnie, wstępną mieszaninę fibrynogenu i aktywnej substancji szkliwa, i ewentualnie Czynnika XIII można stosować na ranę przed dołączeniem trombiny. W warunkach in situ trombina przemienia fibrynogen we włóknik, powodując w ten sposób zjawisko koagulacji, występujące normalnie w procesie gojenia ran. Obecność aktywnej substancji szkliwa w kleju tkankowym może, jak przedyskutowano wyżej, służyć przyspieszeniu procesu gojenia. Dostępny w handlu produkt nadają cy się do włączenia weń aktywnej substancji szkliwa to Tisseel®, dwuskł adnikowy uszczelniacz włóknikowy, produkowany przez Immuno, AG, Wiedeń, Austria.

W paście do zębów lub w składzie płynu do płukania ust, lub w innych preparatach do stosowania na zęby lub na korzenie zębów, aktywna substancja szkliwa może występować albo w postaci rozpuszczonej w podłożu o lekko kwaśnym pH, lub jako dyspersja w podłożu o obojętnym pH. Zakłada się, że w trakcie stosowania aktywna substancja szkliwa może wytworzyć warstewkę ochronną na powierzchni zębów, tym samym zapobiegając osadzaniu się bakterii wywołujących próchnicę (patrz Przykład 4, poniżej). W takich preparatach do opieki dentystycznej aktywna substancja szkliwa może występować w połączeniu z innymi składnikami zapobiegającymi próchnicy, szczególnie z fluorem i z innymi pierwiastkami śladowymi, takimi jak wanad lub molibden. Przyjmuje się, że w obojętnym pH pierwiastki śladowe wiążą się z (np. wiązaniami jonowymi) lub wtapiają się do aktywnej substancji szkliwa, z której uwalniają się i wywierają przeciwpróchnicze działanie, kiedy aktywna substancja szkliwa zostanie rozpuszczona w pH około 5,5, lub niższym, np. na skutek produkcji kwasów przez bakterie wywołujące próchnicę.

Wymienione wyżej kompozycje do stosowania miejscowego najbardziej nadają się do stosowania bezpośrednio na rany lub mogą być stosowne do podawania na lub do odpowiednich otworów ciała, np. odbytu, cewki moczowej pochwy, ucha, nosa i przedsionka jamy ustnej. Kompozycje mogą po prostu być nałożone bezpośrednio na powierzchnię leczoną, lub podane w inny, wygodny sposób.

Kompozycjami, które okazały się odpowiednie do stosowania miejscowego są takie, które wykazują właściwości tiksotropowe, tj. lepkość kompozycji zmienia się pod wpływem wstrząsania lub mieszania, wobec czego lepkość kompozycji można zmniejszyć podczas podawania, a lepkość kompozycji po nałożeniu na ranę wzrasta, tak że kompozycja utrzymuje się w miejscu podania.

Odpowiednie kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku mogą występować w postaci zawiesin, emulsji lub dyspersji. Takie kompozycje zawierają aktywną substancję szkliwa w połączeniu odpowiednio z czynnikiem dyspergującym lub nawilżającym lub zawieszającym i/lub jednym lub kilkoma czynnikami konserwującymi i innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami pomocniczymi. Kompozycje takie mogą również być odpowiednie do stosowania w dostarczaniu aktywnej substancji szkliwa do np. niezmienionej lub uszkodzonej błony śluzowej takich narządów jak usta, policzki, nos, odbytnica, pochwa, lub też do podawania na nieuszkodzoną lub uszkodzoną skórę, lub rany.

Właściwymi czynnikami dyspergującymi lub nawilżającymi są, na przykład, naturalnie występujące fosfatydy, np. lecytyna, lub lecytyna sojowa; produkty kondensacji tlenku etylenu z np. kwasem tłuszczowym, alkoholem alifatycznym o długim łańcuchu, lub częściowym estrem otrzymanym z kwasów tłuszczowych i heksytolu lub bezwodnika heksytolu, np. stearynian polioksyetylenu, monooleinian polioksytylenosorbitolu, monooleinian polioksyetylenosorbitanu, etc.

Właściwym czynnikiem do sporządzania zawiesin są np. występujące naturalnie żywice, takie jak np. guma arabska, guma ksantanowa, lub guma tragakantowa; celulozy takie jak np. sól sodowa karboksymetylocelulozy, celuloza mikrokrystaliczna (np. Avicel® RC 591, metyloceluloza); alginiany i chitozany takie jak np. alginian sodu, itp.

Odpowiednimi przykładami konserwantów do stosowania w kompozycjach wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku są te same konserwanty, które zostały wymienione powyżej.

PL 204 797 B1

Kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku mogą także być podawane doustnie. Kompozycje nadające się do stosowania doustnego mogą być sporządzane w postaci proszku lub mogą występować w postaci stałej, półstałej, lub płynnej.

Kompozycje do stosowania doustnego obejmują stałe postacie dawkowania takie jak np. proszki, granulki, granulaty, saszetki, tabletki, kapsułki, tabletki musujące, tabletki do żucia, pastylki do ssania, tabletki o natychmiastowym uwalnianiu i tabletki o zmodyfikowanym uwalnianiu oraz ciekłe lub płynne formulacje, takie jak roztwory, zawiesiny, emulsje, dyspersje i mikstury. Ponadto kompozycje mogą występować w postaci proszku, proszków do dyspergowania lub w postaci granulek do sporządzania wodnej zawiesiny po dodaniu ciekłego środka, np. środka wodnego. W odniesieniu do stałej postaci dawkowania do stosowania doustnego (albo miejscowego), kompozycja wytwarzana zgodnie z zastosowaniem wedł ug wynalazku zwykle zawiera aktywne substancje szkliwa oraz ewentualnie jedną lub kilka dopuszczalnych farmakologicznie substancji pomocniczych. Takimi substancjami pomocniczymi mogą być na przykład obojętne rozcieńczalniki lub wypełniacze, takie jak sacharoza, sorbitol, cukier, mannitol, celuloza mikrokrystaliczna, skrobie, łącznie ze skrobią ziemniaczaną, węglan wapnia, chlorek sodu, laktoza, fosforan wapnia, siarczan wapnia lub fosforan sodu; czynniki powodujące granulację i czynniki dezintegrujące, np. pochodne celulozy, łącznie z celulozą mikrokrystaliczną, skrobie łącznie ze skrobią ziemniaczaną, siarczan kroskarmelozy, alginiany, lub kwas alginowy i chitozany; czynniki wiążące, na przykład sacharoza, glukoza, sorbitol, guma arabska, kwas alginowy, alginian sodu, żelatyna, skrobia, skrobia preżelatynizowana, celuloza mikrokrystaliczna, krzemian magnezowo-glinowy, sól sodowa karboksymetylocelulozy, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, etyloceluloza, poliwinylopirolidon, polioctan winylu, glikol propylenowy; oraz chitozany; czynniki smarujące, łącznie z substancjami poślizgowymi i przeciwprzylepnymi, n.p. stearynian magnezu, stearynian cynku, kwas stearynowy, krzemiany, uwodornione oleje roślinne, lub talk.

Innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami pomocniczymi mogą być barwniki, czynniki zapachowe, plastyfikatory, czynniki nawilżające, czynniki buforujące, itd.

W tych przypadkach gdzie kompozycja farmaceutyczna występuje w postaci stałej postaci dawkowania w jednostkach dawkowania (np. tabletkach lub kapsułkach), postać jednostki dawkowania może być pokryta jedną lub kilkoma powłoczkami, wymienionymi poniżej.

W przypadkach gdy kompozycja jest w postaci tabletki, kapsułki lub w wielojednostkowych kompozycjach, kompozycja lub pojedyncze jednostki lub tabletka lub kapsułka zawierająca pojedyncze jednostki mogą być pokryte, np. powłoczką cukrową, powłoczką błonową (np. opartą na hydroksypropylometylocelulozie, metylocelulozie, metylohydroksyetylocelulozie, hydroksypropylcelulozie, karboksymetylocelulozie, kopolimerach akrylanowych (Eudragit), glikolach polietylenowych i/lub poliwinylopirolidonie), lub pokryte powłoczkami dojelitowymi (np. opartymi na kopolimerze kwasu metakrylowego (Eudragit), ftalanie octanie celulozy, ftalanie hydroksypropylu-metylocelulozy, octanie-bursztynianie hydroksypropylo-metylocelulozy, poliftalanie octanie winylu, szelaku i/lub etylocelulozie).

Ponadto mogą być stosowane materiały opóźniające, jak np. monostearynian gliceryny lub distearynian gliceryny.

Do stosowania na błony śluzowe odbytnicy lub pochwy, odpowiednie kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmują czopki (typu emulsji lub zawiesiny), lewatywy oraz doodbytnicze kapsułki żelatynowe (roztwory lub zawiesiny). Stosowne, dopuszczalne farmaceutycznie podłoża czopkowe obejmują masło kakaowe, zestryfikowane kwasy tłuszczowe, glicerynizowaną żelatynę, oraz różne rozpuszczalne w wodzie lub dyspergujące się podłoża jak glikole polietylenowe oraz polieksyetylenowane estry kwasów tłuszczowych i sorbitu. Dołączone mogą być różne dodatki, np. wzmacniacze lub surfaktanty.

Do stosowania na błonę śluzową nosa (jak również błonę śluzowa jamy ustnej) odpowiednimi kompozycjami wytwarzanymi zgodnie z zastosowaniem według wynalazku są spray'e i aerozole do inhalacji. Typowa kompozycja donosowa zawiera aktywną substancję szkliwa w postaci cząstkowej, ewentualnie zdyspergowanej w odpowiednim nośniku. Dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze i ewentualnie inne farmaceutycznie dopuszczalne materiały obecne w kompozycji, takie jak rozcieńczalniki, wzmacniacze, czynniki zapachowe, konserwanty, itp. wybrane są zgodnie z przyjętą praktyką farmaceutyczną w sposób zrozumiały dla specjalistów z dziedziny sporządzania farmaceutyków.

W kompozycjach farmaceutycznych wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem według wynalazku na skórę lub na błony śluzowe aktywna substancja szkliwa w zasadzie występuje w stężeniach w zakresie od okoł o 0,01% do okoł o 99,9% wagowego. Ilość stosowanej kompozycji zwykle wynika

PL 204 797 B1 z ilości całkowitego białka przypadającej na cm² rany/skóry/tkanki, odpowiadającej w zakresie od około 0,01 mg/cm² do około 20 mg/cm² tak jak od około 0,1 mg/cm² do około 15 mg/cm².

Ilość stosowanej kompozycji zależy od stężenia aktywnej substancji szkliwa w kompozycji oraz od stopnia uwalniania z kompozycji aktywnej substancji szkliwa, lecz zwykle mieści się w zakresie najwyżej około 15-20 mg/cm².

W tych przypadkach, gdy aktywna substancja szkliwa podawana jest w postaci ciekłej kompozycji, stężenie aktywnej substancji szkliwa w takiej kompozycji jest w zakresie odpowiadającym zwykle od około 0,1 do około 50 mg/ml. W niektórych przypadkach potrzebne są wyższe stężenia, można zatem otrzymywać stężenia co najmniej około 100 mg/ml.

Gdy mieszanina ma być stosowana w jamie ustnej, odpowiednie są następujące dawki.

Doświadczalnie wykonane pole ubytku (u małp) w obrębie jamy ustnej ma zwykle wymiary 4 x 2 x 5-6 mm, co odpowiada około 50 μl lub od około 0,025 do około 0,15 mg całkowitego białka/mm², lub około 2,5-15 mg/cm². Zwykle stosuje się do 0,5, np. 0,4, 0,3, 0,2 lub 0,1 ml kompozycji o stężeniu około 1-40 mg/ml, np. 5-30 mg/ml.

Powierzchnie ubytków w jamie ustnej u ludzi oraz spowodowane chorobami przyzębia mają wymiar około 5-10 x 2-4 x 5-10 mm, co odpowiada około 200 μl kompozycji i zwykle podaje się najwyżej 0,5-1 ml, 0,2-0,3 ml na ząb, kompozycji, mającej stężenie około 1-40 mg białka/ml, tak jak np. 5-30 mg/ml. Stężenie 0,2-0,3 mg/ml odpowiada około 6 mg białka na 25-100 mm² lub około 0,1 mg/mm², jeżeli obliczone jest jedynie dla powierzchni korzenia. Zwykle podaje się nadmierną objętość, aby pokryta została cała powierzchnia. Nawet do wielowarstwowego podawania potrzebna jest tylko niewielka część wyżej wymienionych ilości.

Ogólnie około 0,1-0,5 ml, jak np. 0,15-0,3 ml lub około 0,25-0,35 ml kompozycji, zawierającej aktywną substancję szkliwa stosuje się w niedoborze objętości w zapaleniu zębodołów (dziury po ekstrakcji zęba).

Stężenia aktywnej substancji szkliwa w kompozycji wynosi prawidłowo około 1-40 mg całkowitego białka/ml, tak jak np. 5-30 mg/ml. Gdy podaje się 0,3-0,4 ml takiej kompozycji na ząb mądrości, objętość ta odpowiada około 0,1mg/cm² (zębodół obliczony jako cylinder o promieniu 5 mm i wysokości 20 mm).

Stężenie aktywnej substancji szkliwa w kompozycji farmaceutycznej zależy od rodzaju substancji szkliwa, jej aktywności, zaawansowania schorzenia wymagającego leczenia lub zapobiegania, wieku oraz stanu ogólnego pacjenta. Przydatne sposoby określania odpowiedniego stężenia aktywnej substancji szkliwa są dobrze znane specjalistom i mogą być ustalane zgodnie z wytycznymi Dobrej Praktyki Klinicznej (GCP) lub wytycznymi Badania Nad Nowymi Lekami („IND”), zawartymi np. w International Standard ISO/DIS 14155 Clinical Investigation of medical devices, 1994, oraz ICH (International Cometee fo Harmonisation): Harmonised tripartite guideline for good clonical practice, Brokwood Medical Publications, Ltd, Surrey, UK, 1996). Specjalista wykorzystując techniki opisane w dostępnych podręcznikach, wytycznych i rozporządzeniach opisanych powyżej jak również w oparciu o swoją wiedzę jest w stanie ustalić dokładny reżim dawkowania, który można wdrożyć dla dowolnej aktywnej substancji szkliwa i/lub wybrać inne aktywne substancje i dawkowanie stosując zaledwie rutynową procedurę doświadczalną.

Wynalazek jest dalej ujawniony w oparciu o dołączone rysunki.

Na Fig. 1 przedstawiono syntezę DNA w ludzkich komórkach PDL pobudzanych EMD lub w komórkach niepobudzanych;

Na Fig. 2 przedstawiono produkcję TGF-B1 przez ludzkie komórki PDL pobudzane EMD i przez komórki niepobudzane;

Fig. 3 jest schematycznym rysunkiem komory przepływowej oraz systemu komputerowego, stosowanych w doświadczeniu przepływowym, opisanym poniżej w Przykładach 3 i 4;

Na Fig. 4, 5 i 6 zilustrowano wyniki trzech odrębnych doświadczeń ukazujących przyleganie Actinomyces viscosus do płytek szklanych pokrytych odpowiednio EMD lub kwasem octowym;

Fig. 7, 8 i 9 są wykresami ukazującymi wyniki trzech odrębnych doświadczeń, pokazujących przyleganie Streptococcus mutans do szklanych płytek, pokrytych, odpowiednio, EMD lub kwasem octowym;

Fig. 10A jest zdjęciem rentgenowskim ukazującym uszkodzenia pooperacyjne po usunięciu zęba mądrości; i

Fig. 10B jest zdjęciem rentgenowskim pokazującym regenerację więzadła okołozębowego po leczeniu EMD, jak opisano w Przykładzie 12 poniżej.

PL 204 797 B1

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Materiały i Metody

Pochodną macierzy szkliwa, EMDOGAIN®, z BIORA AB, S-205 12, Malmo, Szwecja, zawierającą 30 mg liofilizowanego białka macierzy szkliwa (dalej w skrócie EMD) oraz 1 ml roztworu nośnika (alginian glikolu propylenowego), zmieszano przed użyciem, o ile białko oraz nośnik nie były badane oddzielnie. Stosunek wagowy białek o szczytach odpowiadających 20, 14 i 5 kDa wynosił odpowiednio 85/5/10.

Termicznie traktowany EMD to taki, który był ogrzewany przez 3 godziny w temperaturze około 80°C w celu inaktywacji resztkowych proteaz.

Białko amelogenina 20 kDa i peptyd amelogenina bogaty w tyrozynę (TRAP) 5 kDa izolowano z EMD przy zastosowaniu chromatografii HPLC (TSK G-2000 SW żelu, zrównoważonego 30% acetonitrylem w 0,9% NaCl), i oczyszczano na drodze chromatografii z odwróconymi fazami (Pro-RPC, HR 5/10, Pharmacia-Upjohn, Szwecja), stosując gradient acetonitrylu. Wyizolowane białko/polipeptydy dodano następnie w różnych ilościach do roztworu nośnika EMDOGAIN®, o ile nie testowano ich oddzielnie.

Kwas hialuronowy był HMT-0028 (c. cz. 990 000) od Seikagaku Corporation, Tokio, Japonia;

Wszystkie bakterie oraz drożdże przede wszystkim izolowano od pacjentów, klasyfikowano testami metabolicznymi i typowano pod względem antygenowym zgodnie ze standardowymi procedurami. Gatunki bakterii i drożdży stosowane do badań wymieniono w tabeli poniżej.

Albuminę surowicy (bydlęca) oraz kolagen typu I (bydlęcy) otrzymano z Sigmy, St. Louis, USA.

Płytki agarowe „Brain Hart Infusion agar” (tj. zawierające wyciąg z mózgu i serca), produkcji Difco, wzbogacono ludzkimi erytrocytami (100 ml na litr agaru).

P r z y k ł a d 1

Proliferacja komórek oraz produkcja TGF-e1 przez komórki PDL, traktowane EMDOGAIN®

Roztwór podstawowy EMD sporządzano rozpuszczając zawartość ampułki (zawierającej 30 mg EMD) w 3 ml jałowego 0,1% roztworu kwasu hialuronowego (HAc). 60 mikrolitrów roztworu podstawowego EMD dodawano do 6000 mikrolitrów płynu Dulbecco Modified Eagle's Medium, zawierającego 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 1% roztworu penicyliny-streptomycyny. 300 μl mieszaniny dodawano do studzienek w płytkach 96-studzienkowych (NUNC A/S, Denmark, nr. katalogowy 167008), 1000 ludzkich komórek PDL z więzadła okołozębowego człowieka (otrzymanych ze zdrowej ludzkiej tkanki okołozębowej od osobników, którym usunięto przedtrzonowce ze wskazań ortodontycznych, i hodowanych jak opisano w Somerman i in., J. Dental Res. 67, 1988, str. 66-70) dodawano do każdej studzienki i inkubowano przez 5 dni w temp. 37°C, w atmosferze 5% ditlenku węgla.

Komórki PDL używane jako kontrola hodowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's jak opisano powyżej, lecz przy braku EMD.

Po inkubacji, przeprowadzono test na proliferację komórek mierząc wbudowywanie się 5-bromo-2-dezoksyurydyny (BrdU) zgodnie z instrukcją wytwórcy testu (Boehringer Mannheim, nr katalogowy 1647 229). W procedurze tej BrdU jest wbudowywany w miejsce tymidyny w DNA rosnących komórek. Wbudowywanie BrdU wykrywa się testem ELISA, a ilość BrdU mierzona tym testem jest miarą syntezy DNA, i w konsekwencji miarą proliferacji komórek PDL.

Wyniki przedstawione na Fig. 1 wskazują, że w obecności EMD komórki PDL wykazują istotnie szybszą proliferację niż komórki PDL hodowane bez EMD.

Do 100 μl supernatantu komórkowego z hodowli w studzienkach dodano 20 μl 1 N HCl na 10 min. w temperaturze pokojowej. Mieszaninę inkubacyjną zobojętniono dodaniem 20 μl 1 N NaOH/0,5 M. HEPES. 100 μl tej mieszaniny dodano do 400 μl buforu rozcieńczającego. 200 μl roztworu poddano testowi ELISA stosując zestaw Quantkines kit (nr katalogowy DB100), dostępny z R&D Systems, UK, według instrukcji producenta.

Wyniki przedstawione na Fig. 2 wykazują zdecydowany wzrost produkcji TGF-e1 w komórkach PDL inkubowanych z EMD w stosunku do komórek PDL nie inkubowanych z EMD.

P r z y k ł a d 2

Badania wzrostu mikroorganizmów w obecności pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa

Celem tych badań było wykazanie hamującego wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na wzrost mikroorganizmów in vitro.

PL 204 797 B1

Białka użyte w tym przykładzie rozpuszczono w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami (PBS) o pH doprowadzonym do 5,5 przy pomocy kwasu octowego. Drobnoustroje zawieszano w PBS pH 6,8 do końcowego stężenia 0,4 odpowiadającego OD600.

μΐ EMDOGAIN® (30 mg EMD w 1 ml PGA) oraz 50 μΐ EMD, EMD traktowanego termicznie, frakcji A, B, C i H EMD (wszystkie 10 mg białka na 1 ml buforu) nakroplono na płytkę agarową i pozwolono wyschnąć na powierzchni płytki (średnica 9 cm, agar zwykły dla określania odporności z dodatkami potrzebnymi dla poszczególnych rodzajów bakterii). Homogenną zawiesinę drobnoustrojów (1 ml, OD280 = 0,5) rozprowadzono następnie na powierzchni płytki, a płytki inkubowano przez 3 dni w temperaturze 35°C (warunki tlenowe) lub przez 14 dni w atmosferze CO2 (warunki beztlenowe), lub w innych warunkach beztlenowych, według wymagań dla poszczególnych typów bakterii. Wszystkie hodowle sprawdzano codziennie. Kolagen typu I i albuminę surowicy (oba bydlęce) testowano w tych samych warunkach hodowli, jako kontrole.

Nierozcieńczony alginian glikolu propylenowego (PGA-EMD nośnik), bufor PBS i kwas hialuronowy (alternatywny nośnik dla EMD) zastosowano również jako kontrolę negatywną.

Wyniki przedstawiono w Tabeli 1. Jedynie pochodne macierzy szkliwa lub białka macierzy szkliwa hamowały wzrost drobnoustrojów. Nie było śladów strefy dyfuzji wokół białka wskazujących, że zastosowane białko EMD agregowało na powierzchni agaru i że jedynie bakterie będące w bezpośrednim kontakcie z białkiem ulegały inhibicji. Gdy pobrano próbki ze strefy zahamowania i hodowano je w płynnej pożywce (bulion LB z dodatkami), odzyskano monokultury pierwotnych bakterii, co sugeruje, że aktywne białka nie są bakteriobójcze. Wszystkie kontrolne testy były ujemne, nie wykazano niespecyficznego mechanizmu wpływającego na wyniki.

T a b e l a 1

Wzrost (+/-) na powierzchni testowanej substancji

Szczepy

Kolagen typu I

Alginian glikolu propylenowego

EMDOGAIN®

EMD

EMD ogrzany

EMD frakcja A

EMD frakcja B

EMD frakcja C

EMD frakcja H

Kwas hialuronowy

Kontrola buforowa

Actinobacillus actinomycetemcomitans

+

-

+/-

+

-

+

Escherichia coli

+

-

+

+/-

+

Staphylococcus aureus

+

-

+

Streptococcus mutans

+

-

+

Bacillus subtilis

+

Candida albicans

+

EMD frakcja A: głównie amelogenina ~26-20kDa,

EMD frakcja B: białka ~17-13kDa,

EMD frakcja C: peptydy ~10-5kDa,

EMD frakcja H: wszystkie białka w EMD o ciężarze cząsteczkowym powyżej 27 kDa, + oznacza normalny wzrost drobnoustroju,

- oznacza całkowite zahamowanie wzrostu mikroorganizmów, +/- oznacza pewne zahamowanie wzrostu w porównaniu z kontrolą negatywną.

Wszystkie wyniki zawarte w tabeli zebrano w drugim dniu (dla hodowli tlenowych) lub po pięciu dniach (hodowle beztlenowe) inkubacji.

Te wyniki pokazują, że EMD zawiera białka lub peptydy, które agregując na powierzchni mogą hamować wzrost pewnych gram-ujemnych pałeczek i pewnych gram-dodatnich ziarniaków. Na podstawie podstawowych charakterystyk zachowania się białek EMD (ref. jpc), skoro efekt nie jest bakteriobójczy, rozsądnym wytłumaczeniem dla obserwowanego zjawiska jest tworzenie się z agregatów białkowych nierozpuszczalnej bariery, która oddziela mikroorganizmy od potrzebnych im substancji wzrostowych.

PL 204 797 B1

P r z y k ł a d 3

Wpływ EMD na stopień przylegania Actinomyces viscosus in vitro

Wstęp

Badano wpływ EMD na początkowe przyleganie Actinomyces viscosus, bakterii występującej w jamie ustnej, obficie w płytce nazębnej, która nie jest powszechnie uważana za związaną z ciężką paradontopatią. Mimo że organizm ten może tworzyć agregaty z Porphyromonas gingivalis i może zatem mieć wpływ na kolonizację powierzchni korzenia potencjalnymi patogenami przyzębia, Actinomyces spp. znajdowane są we względnie dużych ilościach w zdrowych obszarach poddziąsłowych (te obserwacje potwierdzają doniesienia Liljemarka i wsp., Microbiol. Immunol. 8, 1993, 5-15, którzy stwierdzili, że po leczeniu periodontologicznym odsetek Actinomyces spp. znamiennie wzrastał. Haffajee i wsp., J. Clin. Periodont. 24, 1997, 767-776, wywnioskowali ze zliczeń mikroorganizmów zasiedlających płytkę poddziąsłową, że u pacjentów o dobrej odpowiedzi na pierwotne leczenie przyzębia, Actinomyces viscosus i T. denticola występowały relatywnie obficie.

Materiały

Actinomyces viscosus HG85 został dostarczony przez dr A.J. van Winkelhoff (Zakład Patologii Jamy Ustanej, ACTA). Emdogain dostarczyła firma BIORA (Malmo, Szwecja). Detergent RBS zakupiono od firmy Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Szwajcaria).

Wzrost bakterii i pobieranie

Actinomyces viscosus przeniesiono z hodowli na krwawym agarze do pewnej ilości bulionu Schaedler'a na 24 godz. w temperaturze 37°C. Ta hodowla służyła do zakażenia kolejnej hodowli na bulionie Schaedler'a, którą utrzymywano przez 16 godzin. Komórki zbierano poprzez wirowanie (5 min w 6500 x g) i płukano dwukrotnie demineralizowaną wodą. Następnie mikroorganizmy sonikowano przez 20 sek. mocą 30W (Vibra cell model 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) by rozbić łańcuchy bakterii i agregaty. Sonikację przeprowadzono z przerwami podczas chłodzenia w kąpieli w wodzie z lodem. Komórki liczono z użyciem licznika Burkera-Turker'a. W końcu Actinomyces viscosus zawieszano w buforze adhezyjnym (2 mM fosforanu potasu, 50 mM chlorku potasu i 1 mM chlorku wapnia, pH 6,8)

Pokrycie płytek szklanych

Płytki szklane były dokładnie czyszczone przez sonifikację w 5% detergencie RBS, obficie płukane wodą z kranu, płukane w metanolu i na końcu płukane w wodzie destylowanej. Ta procedura prowadzi do kąta kontaktu z wodą zero stopni. EMD rozpuszczono w 0,01 M kwasie octowym w stężeniu 7,5 mg/ml. Płytki szklane podzielono na dwie połowy markerem teflonowym (DAKO A/S, Glostrup, Dania). Na jedną stronę nanoszono kwas octowy (0,01 M) a 250 μg EMD na drugą. Płytki suszono na powietrzu pod wyciągiem przez 4-6 godzin.

Eksperyment przepływowy

Komora przepływowa i system komputerowy użyte w tym eksperymencie pokazane są schematycznie na Fig.3. Przed każdym eksperymentem wszystkie rurki i komorę przepływową wypełniono buforem adhezyjnym, uważając aby system nie zawierał pęcherzyków powietrza. Szybkość przepływu ustawiono na 2,5 ml/min (porównywalne z przeciętnym przepływem śliny u człowieka). Bakteryjna zawiesina cyrkulowała w układzie przez około 3-4 godziny, i liczono komórki przylegające do substratu. Przeprowadzono 3 niezależne eksperymenty. Każdy eksperyment z użyciem 3x10⁸ komórek na 250 ml buforu adhezyjnego. Podczas eksperymentu obrazy rejestrowano co 10-15 min na 6 wybranych wcześniej miejscach na płytkach pokrytych EMD i płytkach kontrolnych. Wysokość kanału komory przepływu równoległego wynosiła 0,6 mm.

Analiza danych

Po zliczeniu na wszystkich zarejestrowanych obrazach ilości komórek adhezyjnych, dane przeliczono na ilość bakterii na cm². W każdym eksperymencie końcową liczbę mikroorganizmów na cm²stosowano do analizy statystycznej (test t-Studenta dla par obserwacji stosując n jako ilość eksperymentów).

Wyniki

Eksperyment 1 (Fig.4) wykazał stopniowy wzrost liczby przyklejonych mikroorganizmów szczególnie podczas pierwszych 150 min przepływu. Po tym czasie liczba mikroorganizmów przyklejonych do EMD osiągnęła plateau na poziomie 2,0x10⁶ bakterii na cm² to jest około 4 razy więcej niż na częściach płytek pokrytych kwasem octowym.

Także w eksperymencie 2 (Fig.5), EMD dość dramatycznie stymulowało przyleganie Actinomyces viscosus do substratu. Jednak na początku eksperymentu ten efekt był mniej wyraźny. Być może

PL 204 797 B1 było to spowodowane mniejszą gęstością organizmów użytych w systemie przepływowym. Po 90 min liczba bakterii przylegających do EMD stopniowo rosła względem kontroli, osiągając maksimum 1,4 x 10⁶ na cm², trzykrotny wzrost.

Trzeci eksperyment (Fig.6) pokazywał stymulację adhezji Actinomyces viscosus do powierzchni EMD już po 5 min przepływu. EMD indukował gwałtowny przyrost liczby przylegających organizmów w ciągu pierwszych 45 min. Później przyklejanie się postępowało progresywnie. Przyklejanie się do powierzchni traktowanej kwasem octowym przebiegało według podobnego wzorca, lecz z mniejszą liczbą przylegających mikroorganizmów. Po 200 min przyleganie do pokrycia EMD było dwukrotnie wyższe niż do powierzchni poddanej działaniu kwasu octowego.

We wszystkich 3 eksperymentach różnice były statystycznie istotne (p<0,05).

Wyniki wskazują, że EMD użyty do pokrycia powierzchni szkła wykazuje znaczący efekt stymulacyjny in vitro na przywieranie Actinomyces viscosus. Pomimo że nadal nie wiadomo jakie czynniki są odpowiedzialne za ten wzmocniony efekt początkowego przylegania, przyjmuje się, że organizmy oddziałują z resztami prolinowymi obecnymi obficie w amelogeninowych komponentach dostępnych w handlu mieszanek białkowych. Adhezja bakterii często determinowana jest specyficznym rozpoznawaniem białkowo-peptydowym lub lektynowo-węglowodanowym. Wiadomo, że Actinomyces viscosus ze swoimi fimbriami typu 1 może wiązać się z białkami bogatymi w prolinę, jak ślinowe Białka Bogate w Prolinę (ang. Protein Rieh Proteins, PRP's) i kolagen I i III.

Specyficzne interakcje pomiędzy EMD a niektórymi mikroorganizmami jamy ustnej, mogą mieć ważne konsekwencje dla składu biofilmu w jamie ustnej gdyż ekologia płytki może ulegać zmianom. Gdyby można było dokonać takiego przesunięcia ekologicznego w kierunku promowania organizmów niezwiązanych z chorobą przyzębia, zastosowanie EMD mogłoby zaowocować poprawą stanu przyzębia, już tylko poprzez to działanie. Jest to oczywiście zupełnie niezależne od innych dobroczynnych skutków EMD.

P r z y k ł a d 4

Wpływ EMD na stopień przylegania Streptococcus mutans in vitro

Wstęp

Istnieje wiele dowodów na przyczynową rolę organizmów płytki nazębnej w patogenezie takich chorób jamy ustnej jak zapalenie przyzębia czy próchnica. Zgodnie z ostatnim modelem tworzenia się płytki naddziąsłowej, Streptococcus spp. uważane są za dominujących kolonizatorów powierzchni zęba. Następnie płytka rozwija się przez wzrost bakterii i przez dalsze przyrastanie innych gatunków bakterii. Przyrastanie następuje przez wiązania bakteryjno-bakteryjne lub może odbywać się za pośrednictwem cząsteczek śliny. Tworzenie się płytki ułatwia produkcja makrocząsteczek zewnątrzkomórkowych. Streptococcus mutans uważany jest obecnie za jeden z gatunków biofilmu na którym może być skupiona uwaga z powodu jego związku z próchnicą zębów. Mimo że kilka gram-dodatnich bakterii (tj. S. mutans) powoduje zanik kości zębodołu u zwierząt pochodzących od „sterylnych zwierząt, to organizmy te nie przyczyniają się zasadniczo do rozwoju kieszonki przyzębnej. Nie mniej, potencjalnie patogenne mikroorganizmy muszą być zdolne do unikania mechanizmów obronnych i immunologicznych gospodarza, jak też do inicjacji uszkodzenia tkanek gospodarza.

Materia ły

Streptococcus mutans NS został udostępniony dzięki uprzejmości Dr H van der Mei (Materia Technica, University of Groningen). EMDOGAIN dostarczyła firma BIORA (Malmo, Szwecja). Detergent RBS zakupiono w firmie Fluka (Fluka Chemicals AG, Buchs, Szwajcaria).

Wzrost bakterii i pobieranie

Streptococcus mutans przeniesiono z hodowli na krwawym agarze do pewnej ilości bulionu Todd Hewitt na 2 4 godz. w temp. 37°C. Ta hodowla służyła do zakażenia kolejnej hodowli na bulionie Todd Hewitt, którą utrzymywano przez 16 godzin. Komórki zbierano przez wirowanie (5 min w 6500 x g) i płukano dwukrotnie demineralizowaną wodą. Następnie mikroorganizmy sonikowano przez 20 sek. mocą 20W (Vibra Cell model 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA), aby rozbić łańcuchy bakteryjne i agregaty. Sonikację przeprowadzono z przerwami podczas chłodzenia w kąpieli w wodzie z lodem. Komórki liczono z użyciem licznika Burkera-Turker'a. W końcu Streptococcus mutans zawieszono w buforze adhezyjnym (2 mM fosforanu potasu, 50 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku wapnia, pH 6.8)

Pokrycie płytek szklanych

Płytki szklane były dokładnie czyszczone przez sonifikację w 5% detergencie RBS, obficie płukane wodą z kranu, płukane w metanolu i w końcu płukane w wodzie destylowanej. Ta procedura

PL 204 797 B1 prowadzi do kąta kontaktu z wodą zero stopni. EMD rozpuszczano w 0,01 M kwasie octowym w stężeniu 7,5 mg/ml. Płytki szklane podzielono na dwie połowy markerem teflonowym (DAKO A/S, Glostrup, Dania). Na jedna stronę naniesiono kwas octowy (0,01 M), a 250 μg EMD na drugą. Płytki suszono na powietrzu pod wyciągiem przez 4-6 godzin.

Eksperyment przepływowy

Komora przepływowa i system komputerowy użyte w tym eksperymencie pokazane są schematycznie na Fig.3. Przed każdym eksperymentem wszystkie rurki i komorę przepływową wypełniono buforem adhezyjnym, zwracając uwagę na to aby system nie zawierał pęcherzyków powietrza. Przepływ ustawiono na 2,5 ml/min (porównywalne z przeciętnym przepływem śliny u człowieka). Bakteryjna zawiesina cyrkulowała w układzie przez około 3-4 godzin, i liczono komórki przylegające do substratu. Przeprowadzono 3 niezależne eksperymenty. Każdy eksperyment z użyciem 3x10⁸ komórek na 250 ml buforu adhezyjnego. Podczas eksperymentu obrazy rejestrowano co 10-15 min w 6-ciu wcześniej wybranych miejscach na płytkach pokrytych EMD i płytkach kontrolnych. Wysokość kanału komory przepływu równoległego wynosiła 0,6 mm.

Analiza danych

Po zliczeniu na wszystkich zarejestrowanych obrazach ilości komórek adhezyjnych, dane przeliczano na ilość bakterii na cm². W każdym eksperymencie ostateczną liczbę mikroorganizmów na cm²użyto do analizy statystycznej (test t-Studenta dla par obserwacji stosując n jako ilość eksperymentów).

Wyniki

W każdym z trzech eksperymentów EMD wykazał efekt hamujący na stopień przylegania S. mutans (Fig 7, 8, 9; p<0,05). Zahamowanie wyniosło 40-70% w porównaniu z kontrolą traktowaną kwasem octowym.

Pierwszy eksperyment (Fig. 7) wykazał już po 10 min przepływu zahamowanie ilości przylegających S. mutans do powleczonej EMD powierzchni szkła. Po 3 godzinach przyleganie ograniczono do poziomu 60% kontroli.

W drugim eksperymencie (Fig. 8) EMP zaczęła hamować przyleganie S. mutans po 1 1/2 godziny przepływu. Liczba S. mutans przylegających do EMD osiągnęła plateau 0,5 mln na cm² po około 40 min przepływu. Po 3 godz. zliczenia wskazywały na około 25% w stosunku do kontroli.

Trzeci eksperyment (Fig. 9) pokazał zahamowanie przylegania S. mutans pod wpływem EMD już na początku przepływu. Tak jak w eksperymencie 1 zahamowanie osiągnęło 60% wartości kontroli po 3 godz. przepływu.

Badania powyższe pokazują że EMD ma istotny hamujący efekt na przyleganie S. mutans do szklanej powierzchni. Możliwym wytłumaczeniem tego zahamowania może być obecność składników hydrofobowych w mieszaninie EMD. Jednym z białek obficie występujących w tej mieszaninie jest amelogenina, białko mające, poza kwaśną, hydrofilową sekwencją C-końcową, hydrofobowy rdzeń zawierający 100-300 reszt bogatych w prolinę, leucynę, metioninę i glutaminę. Saito i wsp., Arch. Oral Biol. 42, 1997, 539-545, stwierdzili, że przyleganie różnych szczepów S. mutans do immobilizowanych białek hydrofobowych (OAIS) było zahamowane. Autorzy przypisują ten efekt negatywnym ładunkom na powierzchni mikroorganizmów (jak w przypadku S. mutans). Inne charakterystyki powierzchni mogą również być związane z wpływem na wiązanie z substratem. S. mutans zawiera antygen powierzchniowy I/II który ma N-końcową część szczególnie bogatą w alaninę i zawiera także powtórzenia tandemowe. Ten region ma domniemaną strukturę alfa-helikalną, przyjmującą dwuskrętną konformację spiralną, i może przyczyniać się do hydrofobowości powierzchni komórki związanej z ekspresją antygenu I/II.

P r z y k ł a d 5

Wpływ EMD na wzrost pewnych patogenów przyzębia

Prevotella intermedia i Porphyromonas gingivalis wstępnie hodowano przez 10-14 godzin w 37°C w bulionie tioglikolowym z dodatkiem 0,5 mg/l witaminy K i 5 mg/l heminy w atmosferze tlenowej wytworzonej przez GasPakPlus w odpowiednich naczyniach. Gdy gęstość hodowli osiągnęła OD600 0,1-0,2 co odpowiadało gęstości komórek 10⁶-10⁷ cfu (jednostek tworzących kolonie) na ml, pobierano próbki po 100 μl i strącano bakterie wirowaniem. Bakterie zawieszano ponownie w 100 μl świeżo przygotowanej mieszaniny ludzkiej śliny i soli fizjologicznej, i zawiesiny zawierające 10⁵-10⁶ komórek przenoszono do sterylnych 1,5 ml probówek Eppendorfa i mieszano z (i)100 μl roztworu EMD (3 mg EMD w 0,1 ml PGA), (ii) 100 ml PGA lub (iii) 100 μl roztworu mieszaniny roztworu surowicy/NaCl jako kontroli wzrostu. Próbki po 10 μl pobierano do kontroli tempa wzrostu po 0, 3, 6 i 24 godz. Próbki rozcieńPL 204 797 B1 czano seryjnie w sterylnym 0,9% NaCl i po 10 μΐ z poszczególnych rozcieńczeń wysiewano na agar Schaedler'a. Warunki hodowli były takie same jak hodowli wstępnej. Płytki agarowe inkubowano przez 3-4 dni i następnie obliczano cfu i gęstość komórek. Wszystkie eksperymenty wykonywano po 6 razy.

Wyniki (podane jako cfu/ml w procencie stężenia w czasie 0)

1) Hodowle kontrolne w różnych punktach czasowych

	0	3 godz.	6 godz.	24 godz.
P. intermedia	100	160	25	10
P. gingivalis	100	100	125	150

2) Hodowle w obecności PGA w różnych punktach czasowych

	0	3 godz.	6 godz.	24 godz.
P. intermedia	100	140	25	10
P. gingivalis	100	75	50	5

3) Hodowle w obecności EMD w różnych punktach czasowych

	0	3 godz.	6 godz.	24 godz.
P. intermedia	100	40	0	0
P. gingivalis	100	30	0	0

Hodowle były znacząco zahamowane przez obecność EMD w porównaniu z kontrolami z samym nośnikiem lub bez żadnego dodatku EMD

P r z y k ł a d 6

Badanie poprawy gojenia się ran tkanek miękkich pod wpływem ENDOGAIN® po zabiegu chirurgicznym na przyzębiu

Celem tego przykładu jest pokazanie wpływu pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa na poprawę gojenia po chirurgicznych zabiegach periodontologicznych.

Eksperymentalne uszkodzenia przyzębia brzeżnego w ponad 50 zębach małp Makaka wykonano wiertłem dentystycznym poprzez usunięcie cementu korzeniowego, błony okołozębowej i brzegu kości zębodołu na około 5 mm odległość szyjkowo-wierzchołkową. Następnie na eksperymentalne uszkodzenie nic nie aplikowano: nic (kontrola) lub aplikowano pochodne macierzy szkliwa (EMDOGAIN zarówno jako niezawieszony liofilizowany proszek, jak też jako zawiesinę). Stężenie białek w zawiesinie wynosiło około 5-30 mg/ml, a aplikowana na uszkodzenie ilość wynosiła około 0,1-0,2 ml.

Gojenie rany oceniano wizualnie przez następne 8 tygodni. W uszkodzeniach, w których zastosowano EMDOGAIN® gojenie przebiegało dobrze (bez zaczerwienienia czy obrzęku) i nieistotnej płytki po 2 tygodniach gdy usunięto szwy, dobre gojenie i niewielkie zapalenie dziąsła obserwowano po 5 tygodniach, a gojenie bez komplikacji po 8 tygodniach, kiedy kończono eksperyment. W przeciwieństwie do ubytków w kontroli, gdzie występowała reakcja zapalna z odsłonięciem dziąsła i obfitą płytką po 2 tygodniach, z poważnymi odsłonięciami i zapaleniem dziąseł zarówno po 5 tygodniach jak i po 8 tygodniach.

P r z y k ł a d 7

Badanie nad wpływem pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na gojenie się ran powstałych podczas zabiegów na przyzębiu

Celem tego przykładu jest wykazanie wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na szybkie gojenie się ran u pacjentów po chirurgii periodontalnej. Pięćdziesięciu pięciu (55) pacjentów, wymagających zabiegów chirurgicznych na przyzębiu, zostało podzielonych na dwie grupy - jedną, leczoną klasyczną metodą nakładania płatków w modyfikacji Widmana (20 pacjentów), oraz drugą, poddaną tej samej procedurze plus zastosowaniu EMDOGAIN® (35 pacjentów) (stężenie wynosiło 30 mg białka/ml a na ząb stosowano około 0,3 ml). Żaden z pacjentów nie otrzymał antybiotyków podczas zabiegu, ale wszyscy zostali poinstruowani o stosowaniu płynu aseptycznego (chlorheksydyny) do codziennego płukania jamy ustnej.

PL 204 797 B1

Wywiad z pacjentami przeprowadzano podczas usuwania szwów (1-3 tygodnie po zabiegu). Podczas gdy 3 (=15%) pacjentów z grupy kontrolnej stanowiło przypadki wymagające zastosowania terapii antybiotykowej, tylko jeden (=3%) pacjent z grupy, której podawano EMDOGAIN®, wymagał takiego leczenia.

P r z y k ł a d 8

Badania nad wpływem macierzy szkliwa oraz białek macierzy szkliwa na gojenie się ran po usunięciu zęba

Celem tego przykładu jest wykazanie wpływu białek szkliwa/pochodnych macierzy szkliwa na gojenie się ran po usunięciu trzeciego trzonowca. Pacjentom w wieku 30 lat, lub starszym, z symetrycznym wklinowaniem lub niepełnym wklinowaniem trzeciego trzonowca, usuwano trzeci trzonowiec według klasycznej metody wymagającej podniesienia pionowego płata celem przeprowadzenia niezbędnej osteotomii i cięcia, natomiast drugi usuwano analogicznie, a jego zębodół przed zaszyciem wypełniano EMDOGAIN®. Wszyscy pacjenci otrzymywali antybiotyki (3 g amoksycyliny lub 1 g erytromycyny) na 1-2 godziny przed zabiegiem, a po zabiegu otrzymywali Ibuprofen (600 mg x 3). Zostali pouczeni żeby jamę ustną płukać chlorheksydyną (0,1%, 10 ml x 2) przez 4 tygodnie.

Szwy zdejmowano po 2 tygodniach. Gojenie miejsc traktowanych EMDOGAIN® i kontrolnych oceniali zarówno pacjenci, jak i dentysta. W jednym ośrodku, 9 pacjentów miało obustronną ekstrakcję z/bez EMDOGAIN®. Jeden pacjent skarżył się na lekkie podrażnienie od szwów po obu stronach, natomiast inny pacjent skarżył się na silny ból po stronie kontrolnej, lecz nie miał kłopotu ze stroną traktowaną EMDOGAIN®. W drugim ośrodku, trzech spośród 6 pacjentów miało bóle jedynie po stronie kontrolnej. Wreszcie, w trzecim ośrodku jeden pacjent miał poważną komplikację - zapalenie zębodołu - zdiagnozowane po stronie kontrolnej. Miejsce traktowane EMDAGAIN® goiło się bez problemu. Inny pacjent miał lekkie podrażnienie od szwów po obu stronach usunięcia, ale tylko strona kontrolna była w stanie zapalnym, bolesna i wymagała wielokrotnego płukania solą i brania środków przeciwbólowych.

Te wyniki kliniczne wskazują, że stosowanie EMDOGAIN® do wyrostków zębodołowych po usuwaniu zębów mądrości może ułatwić gojenie i zmniejszyć częste skądinąd bolesne obrzęki.

P r z y k ł a d 9

Badanie wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na gojenie tzw. suchego zębodołu

Celem tego przykładu jest wykazanie wpływu białek szkliwa/pochodnych macierzy szkliwa na gojenie się zapalenia zębodołu (suchego zębodołu)

Po usunięciu 35 zakażonego pozostawionego korzenia (radix relicta) pacjent (mężczyzna) w wieku 70 lat uskarżał się na silny ból oraz obrzęk w miejscu zębodołu poekstrakcyjnego. W czasie badania przez dentystę okazało się, że rozwinął się suchy zębodół, w którym początkowo powstały skrzep został rozpuszczony i ściana kostna wyrostka zębodołowego uległa martwicy, a kość przylegająca oraz tkanki miękkie były w stanie zapalnym.

Pacjent miał w swej historii choroby niewydolność serca i leczony był antykoagulantem Meravan. W wyniku tego stanu miał zmniejszony obwodowy przepływ krwi. Także regularnie palił kilka papierosów dziennie.

Zapalenie zębodołu leczono tradycyjnie usuwając martwą kość i prowokując nowe krwawienie. Uruchomiono także dziąsła i nałożono szew dla zamknięcia zębodołu. Pacjent otrzymywał penicylinę (apocylinę 660 mg, 2 tabletki rano i wieczorem, przez 7 dni) celem zwalczenia zakażenia i został również pouczony o płukaniu jamy ustnej dwa razy dziennie roztworem chlorheksydyny. Po pięciu dniach, po zakończeniu leczenia antybiotykiem, pacjent badany w klinice dentystycznej nadal uskarżał się na silny ból. Przeprowadzone badanie pola operacyjnego - wzrokowe, palpacyjne i zgłębnikowe wykazało, że stan zapalny zębodołu trwa nadal oraz że jest więcej martwiczej tkanki kostnej. Badanie rentgenowskie wykazało uszkodzenie kości i martwicę na całej głębokości, aż po część szczytową korzenia. Pole operacyjne raz jeszcze oczyszczono i uszkodzoną w trakcie tego zabiegu kość wypełniono EMDOGAIN® (30 mg/ml, najwyżej 0,5 ml podano) i nałożono nowy szew na dziąsło, by zakryć zębodół. Nie zastosowano dodatkowego leczenia, lecz pacjenta poproszono o dalsze przemywanie jamy ustnej roztworem chlorheksydyny. Po dwóch dniach pacjent poinformował klinikę, że ból oraz obrzęk ustąpiły. Badanie kliniczne oraz usunięcie szwu w tydzień po podaniu EMDOGAIN® wykazało dobre gojenie się bez martwiczych tkanek lub zapalenia oraz normalne dziąsła bez zaczerwienienia lub obrzęku, pokrywające pole rany. Nie było krwawienia ani bolesności w badaniu palpacyjnym lub

PL 204 797 B1 zgłębnikowym. Nie było brzydkiego zapachu ani wysięku. Pacjent nie zgłaszał żadnego bólu ani innych objawów.

P r z y k ł a d 10

Badania nad efektem profilaktycznym pochodnych macierzy szkliwa i białka macierzy szkliwa na powstanie suchego zębodołu

Celem tego przykładu jest wykazanie zapobiegawczego działania pochodnych macierzy szkliwa oraz białek macierzy szkliwa na przeciwdziałanie suchego zębodołu (alveolitis sicca).

82-letnia pacjentka doznała podłużnego złamania korzenia zęba 44. Ząb ten stanowił filar mostu pomiędzy zębem 35 do 46 i leczony był endodontycznie wiele lat wcześniej. Klinicznie dziąsła otaczające ząb były w stanie zapalnym i stwierdzono kieszonkę dziąsłową na całej długości korzenia zęba, aż po szczyt, po stronie językowej. Badanie rentgenowskie wykazało silny miejscowy stan zapalny przyzębia 44.

Stan higieniczny jamy ustnej był zadawalający, lecz z uwagi na stan serca, leczonego preparatem przeciwkrzepliwym Marevan, krwawienie z dziąseł łatwo występowało podczas zgłębnikowania. Sześć miesięcy wcześniej pacjentce usunięto chirurgicznie ząb 35 ze względu na ciężkie zapalenie przyzębia. Po tej operacji cierpiała na długotrwałe zapalenie suchego zębodołu. Bardzo uważała, żeby usunięcie zęba 44 nie spowodowało podobnej komplikacji, jakiej doświadczyła uprzednio. Poinformowano ją, że połączenie jej wieku, leczenia Marevanem, oraz zakażony korzeń i kieszonka dziąsłową dramatycznie zwiększają ryzyko wystąpienia powikłań pooperacyjnych, jak zapalenie zębodołu, ale też, że nie ma alternatywy dla chirurgicznego usunięcia fragmentów korzenia. Pacjentka wyraziła zgodę na usuniecie zęba 44 oraz, w drodze eksperymentu, poddana została profilaktycznemu leczeniu EMDOGAION® w celu zapobieżenia rozwinięciu się suchego zębodołu. Pacjentkę znieczulono, nacięto i usunięto kość policzkową by umożliwić usunięcie fragmentu korzenia bez rozluźnienia mostu. Po usunięciu, pusty zębodół oczyszczono mechanicznie i wypełniono EMDOGAIN© (30 mg/ml, podano najwyżej 0,5 ml), pokryto płatkiem i zeszyto. Tego samego wieczora pacjentka poinformowała telefonicznie o utrzymującym się krwawieniu z miejsca zabiegu (nie zaprzestano leczenia Meravanem przed zabiegiem), lecz innych objawów nie było. Gdy usuwano po pięciu dniach szew, tkanki miękkie rany operacyjnej były całkowicie wygojone. Pacjentka nie zgłaszała innych objawów jak ból czy obrzęk i ogólnie była bardzo zadowolona z leczenia.

P r z y k ł a d 11

Badania wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na gojenie się powikłań pourazowych

Celem tego przykładu jest wykazanie wpływu białek szkliwa/ pochodnych macierzy szkliwa na gojenie się powikłań pourazowych u pacjentów.

Po wypadku pacjentowi na pogotowiu podwiązano górne przednie zęby. Dentysta stwierdził martwicę zębów 11 i 21, zęby 12 i 22 miały boczno-siekaczowe złamania klasy I lub II. Brzeżne dziąsła były w stanie ciężkiego zapalenia i słabo przylegały do powierzchni zębów. Pacjent skarżył się na drętwienie, obrzęk, brzydki zapach i smak. Były także dowody na uszkodzenie więzadła okołozębowego w okolicy szczytowej zębów 11 i 21. Oba środkowe siekacze oczyszczono i wypełniono kanały świeżo zmieszanym wodorotlenkiem wapnia Ca(OH)2.

Po 4 tygodniach gojenie się rany uznano za niezadawalające. Powstał przewlekły stan zapalny i zęby uznano za stracone. Standardowym postępowaniem w takich przypadkach byłoby usuniecie wszystkich czterech siekaczy i zastąpienie ich mostem lub implantami. Pacjent jednak stanowczo się nie zgadzał na takie postępowanie i jako ostateczną próbę uratowania zębów przeprowadzono chirurgię płatków dziąsłowych na wszystkich czterech zębach (11, 12, 21, 22). Zużyto dwie ampułki EMDOGAIN® (60 mg w 3 ml). Najwyżej 0,2 ml EMDAGAIN® (30 mg/ml) podano strzykawką na każdy ząb przed nałożeniem płatów, które przyszyto siedmioma szwami. Cztery szwy zdjęto po 5 dniach. Stwierdzono wtedy znaczną poprawę, subiektywną i kliniczną. Pacjent nie uskarżał się już na ból, zniknęło uczucie drętwienia, a z dotkniętej okolicy nie wydzielał się przykry zapach, ani nie było odczuwania nieprzyjemnego smaku. Po upływie 2 tygodni usunięto pozostałe szwy. Dziąsła nie wykazywały żadnych objawów zapalenia i pacjent nie zgłaszał żadnych skarg. Dziąsło było zdrowe i bez śladu zapalenia; było mocno przytwierdzone do zębów i/lub do kości zębodołu, miało zabarwienie różowe (a nie wyraźnie czerwone jak to w miejscach zapalenia), z normalnymi (nieobrzękniętymi) brodawkami międzyzębowymi. Ponadto stwierdzono znaczną poprawę, jak odtworzenie więzadła zębowego w uszkodzonych częściach zębów oraz odkładanie się nowej tkanki kostnej, jak wykazało badanie rentgenowskie.

PL 204 797 B1

P r z y k ł a d 12

Gojenie ran urazowych w sąsiedztwie zębów i nerwów

Przypadek kliniczny

39-letnia pacjentka doznała poważnego zapalenia okołokoronowego wokół dolnego lewego zęba mądrości (38). W państwowej klinice dentystycznej ząb został częściowo usunięty, pozostawiono część wierzchołkową korzenia w żuchwie, będącą następstwem jatrogennego złamania korzenia. W bólu pacjentkę przyjęto następnego dnia na specjalistyczny oddział chirurgii szczękowej w celu usunięcia fragmentu korzenia. W dwa dni po zabiegu pacjentka zgłosiła się do swego dentysty na kontrolę. Miała spuchniętą lewą stronę całkowity blok nerwu żuchwowego. Badaniem klinicznym i radiologicznym stwierdzono, że w trakcie borowania podczas zabiegu chirurgicznego została poważnie uszkodzona kość żuchwy, dolna trzecia część przywierzchołkowa tylnego korzenia zęba 37 oraz kanał nerwu żuchwowego (patrz zdjęcie rentgenowskie, Ryc. 1A). Mierzona zgłębnikiem głębokość kieszonki tylnej zęba 37 wynosiła 25 mm, sięgała poniżej szczytu wierzchołka tylnego korzenia. W celu pobudzenia gojenia kości i nerwu oraz regeneracji utraconego więzadła zęba 37, ranę operacyjną otworzono i starannie oczyszczono. Po usunięciu resztek solą ujawnioną kość, powierzchnię tylnego korzenia oraz nerw żuchwowy okryto EMDOGAIN© (30 mg/ml, nakładano w nadmiarze; około 1 ml) i ranę ponownie zeszyto trzema szwami. Pacjentkę pouczono by płukała jamę ustną roztworem chlorheksydyny (Corsodyl) dwa razy dziennie przez kolejne pięć dni, a ze względów profilaktycznych podawano przez 5 dni penicylinę (Ampicylinę, 66 mg x 4).

Po dziesięciu dniach pacjentka zgłosiła się do kontroli i na zdjęcie szwów. W tym czasie obrzęk cofnął się i gojenie tkanek miękkich było bardzo dobre. Utrzymywało się jednak całkowite znieczulenie nerwu żuchwowego i pacjentkę poinformowano, że prognoza dla przerwanego nerwu jest, w najlepszym przypadku, niepewna. W tym stanie, z powodu znieczulenia nie można było ocenić żywotności zęba 37. Normalnie uszkodzenie korzenia, jak w opisanym przypadku, prowadzi do martwicy miazgi i kościozrostu zęba. Celem zapobieżenia takim powikłaniom zaleca się leczenie endodontyczne. Jednak aby sprawdzić czy eksperymentalne leczenie może ułatwić gojenie więzadła zębowego, pacjentka zgodziła się na pozostawienie zęba bez leczenia przez dłuższy czas. Została zapisana na comiesięczne badania.

Po dwóch miesiącach po powyższej kontroli pacjentka zgłosiła miejscowe przeczulenie w lewej dolnej wardze, oznakę gojenia się nerwu. Tkanki miękkie w okolicy 37-38 były całkowicie wygojone, bez blizny. Także badanie rentgenowskie ujawniło powstawanie nowej kości w zębodole poekstrakcyjnym. Ząb 37 oraz tkanki go otaczające pozostawały nadal znieczulone.

Po czterech miesiącach od leczenia znieczulenie cofnęło się i testowany ząb 37 okazał się żywy, lecz nadwrażliwy w teście termicznym i elektrycznym. Badanie rentgenowskie wykazało znaczne wypełnienie zębodołu tkanką kostną oraz oznaki regeneracji przyzębia na tylnym korzeniu zęba 37.

Pięć miesięcy od rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN© żywotność zęba 37 była normalna. Badanie rentgenowskie wykazało całkowitą regenerację więzadła zębowego (Ryc. 1B) i nowoutworzona kość wyrostka zębowego, o prawidłowym rysunku, wypełniała ubytki kostne oraz zębodół. Nie było oznak kościozrostu.

Głębokość kieszonki tylnej zęba 37, mierzona zgłębnikiem, wynosiła teraz 10 mm, czyli około 1 mm poniżej linii cementowo-szkliwnej. Po tej kontroli pacjentkę uznano za wyleczoną i została wypisana.

Komentarze:

Całkowite i szybkie wygojenie ran traumatycznych w sąsiedztwie zębów i nerwów po chirurgicznym usunięciu zęba mądrości jest rzadkością. Zwykle powikłania tak poważne jak opisane powyżej kończą się usunięciem uszkodzonego zęba, lub przynajmniej endodontycznym usunięciem miazgi zęba i wypełnieniem korzenia, kończącym się kościozrostem. Przerwany nerw potrzebuje 8-12 miesięcy do wygojenia, o ile w ogóle ono nastąpi, a często spaczone czucie (parestezja) w pewnych regionach trwa przez wiele lat. Szybkie i dobrej jakości wygojenie wyżej przedstawionego przypadku jest bardzo niezwykłe i należy je uznać jako objaw zdolności gojących EMDOGAIN®.

Promienie rentgenowskie (promienie X):

A: Pacjent dwa dni po usunięciu zęba 38. Zwraca uwagę duży ubytek tylny na zębie 37 i zajęcie kanału żuchwowego. Także kość zębodołu od strony tylno-policzkowej zęba 37 usunięto podczas zabiegu.

B: Pacjent w pięć miesięcy po zabiegu. Zwraca uwagę objaw całkowicie funkcjonalnego więzadła zębowego (blaszka twarda, lamina dura) w ubytku na tylnej części korzenia zęba 37. Nie ma oznak kościozrostu. Zarys kanału żuchwowego jest teraz widoczny, a jama zębodołu jest całkowicie

PL 204 797 B1 wypełniona kością. Zwraca także uwagę tworzenie się nowej kości zębodołu w części tylnopoliczkowej wokół zęba 37.

P r z y k ł a d 13

Badania wpływu pochodnych macierzy szkliwa na gojenie się owrzodzeń podudzi (wrzody żylne)

Pacjent 1

Pacjentem był mężczyzna, urodzony w 1926 r i z historią powtarzających się zakrzepów o bardzo złych pozakrzepowych zespołach oraz nawracających owrzodzeń żylaków. Był systemowo leczony antykoagulantami pochodnymi kumaryny, a owrzodzenia były leczone miejscowo Crupodexem (monomer dekstranu) BIOGAL oraz 3% roztworem kwasu bornego. W momencie rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® miał owrzodzenie żylne kształtu owalnego o wymiarach 5 x 4 cm i głębokości 0,5 mm w stanie ziarninowania z bardzo nikłą epitelializacją. Ranę odkażono 3% wodą utlenioną i nakroplono 500 mikrolitrów EMDOGAIN®, a następnie rozprowadzono równomiernie sterylnym patyczkiem po całej powierzchni rany. EMDOGAIN® pozostawiono przez 10 minut na powietrzu a następnie ranę pokryto opatrunkiem Inadine (Johnson & Johnson) Rayon nasyconym maścią 10% jodku povidonu.

Po pięciu dniach stwierdzono epitelializację dalszej części owrzodzenia, a owrzodzenie zmniejszyło się do rozmiaru 1,8 x 2,2 cm, nie było reakcji ubocznych (zapalenia). Nie podano EMDOGAIN®. Po 12 dniach dalsza epitelializacja w bliższej części oraz nowa epitelializacja w bocznych częściach owrzodzenia obejmowała obszar około 2 x 2 cm. Blisko połowa owrzodzenia była wygojona. Nałożono 400 mikrolitrów EMDOGAIN®.

Po 19 dniach miała miejsce dalsza epitelializacja bliższej i bocznych części owrzodzenia, lecz nie występowała w części dalszej, gdzie owrzodzenie było raczej głębokie (około 1 mm). Zastosowano 300 mikrolitrów EMDOGAIN®. Od momentu rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® pacjent nie odczuwał żadnej bolesności owrzodzenia, w przeciwieństwie do okresu przed zastosowaniem leczenia EMDOGAIN®. EMDOGAIN® następnie podawano raz na tydzień aż do dnia 40 (po 200 mikrolitrów), a wrzód uznano za w pełni zagojony po 47 dniach.

Pacjent 2

Pacjentką była kobieta, urodzona w 1949 r i miała żylaki, przewlekłą niewydolność żył oraz nawracające owrzodzenia żylne. Wykazywała wieloważne uczulenie na leki i środki farmaceutyczne, miała również krwawienia żylaków. Wcześniej leczono ją miejscowo kroplami Otosporin (siarczan polimyksyny B + siarczan neomycyny + hydrokortyzon) i kompresami z hydrokortyzonem.

W chwili rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN-em® jej owrzodzenie żylakowe miało średnicę 1 cm i głębokość 2 mm. Podano 300 mikrolitrów EMDOGAIN-u®.

Po 5 dniach stwierdzono epitelializację szerokości 2 mm, na całym obwodzie zranienia i nie stwierdzano objawów ubocznych, reakcji zapalnej. Nie podano EMDOGAIN-u®. Po 12 dniach rana zmniejszyła się do średnicy 2 mm, podano 100 mikrolitrów EMDOGAIN-u®.

Po 19 dniach owrzodzenie miało nadal średnicę 2 mm, ale dno ładnie ziarninowało i owrzodzenie nie było głębokie (0,2 mm). Podano 100 mikrolitrów EMDOGAIN®.

Ta sama pacjentka miała inne owrzodzenie na drugim podudziu, około 0,3 x 1 cm. Podano 200 mikrolitrów EMDOGAIN®.

Po 7 dniach pojawiła się nowa epitelializacja oraz ładne ziarninowanie dna rany, a rana zmniejszyła się do 0,2 x 0,5 cm. Wtedy znowu podano 100 mikrolitrów EMDOGAIN® na każde owrzodzenie raz w tygodniu, aż do dnia 40, a owrzodzenia uznano za w pełni wygojone po 47 dniach. Nie zaobserwowano reakcji alergicznych na EMDOGAIN®.

Inne owrzodzenie, o wymiarach około 0,5 x 0,3 cm, powstało na tej samej nodze, nałożono nań 100 mikrolitrów EMDOGAIN®.

Pacjent 3.

Pacjentką była kobieta, urodzona w 1929 roku i miała głębokie zakrzepy żylne po przebyciu różyczki, i w momencie rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® miała bardzo duże owrzodzenie o wymiarach około 15 x 19 cm w stadium progresji w kierunku bliższym, które uznano po wielu próbach leczenia jako stan beznadziejny. Podano 700 mikrolitrów EMDOGAIN® na obszar około 3 cm od górnego brzegu rany.

Po upływie 7 dni nie stwierdzono epitelializacji, lecz leczone pole było bardziej przezierne (więcej elementów było widocznych) i zawierało małe pólka ziarniny oraz miejsce to było niebolesne, nie było też oznak postępu patologii. Na to samo miejsce nałożono 700 mikrogramów EMDOGAIN-u®.

PL 204 797 B1

Po upływie 4 tygodni, w dalszej części owrzodzenia, nie leczonej EMDOGAIN-em, rozwinęło się zakażenie, prawdopodobnie wywołane Pseudomonas. Podano 700 mikrolitrów EMDOGAINY. Zakażenie cofnęło się po 7 dniach.

Pacjent 4

Pacjentką była kobieta, urodzona w 1947 r., mająca żylaki z powierzchniowym zakrzepowym zapaleniem żył po przebytej różyczce, i w momencie rozpoczęcia terapii EMDOGAIN® miała wrzód podudzia wielkości około 2 x 0,8 cm z czystym, lecz nie ziarninującym dnem. Podano 300 mikrogramów EMDOGAIN®.

Po upływie 7 dni owrzodzenie zmniejszyło się do około 0,7 x 0,3 cm, pojawiła się epitelializacja oraz ziarnina na dnie owrzodzenia. Podano 200 mikrolitrów EMDOGAIN®, a następnie po 100 mikrolitrów EMDOGAIN® raz na tydzień, przez pięć tygodni. Owrzodzenie uznano za w pełni zagojone po pięciu tygodniach.

P r z y k ł a d 14

EMDOGAIN® jako środek wspomagający przy nie chirurgicznym leczeniu przyzębia w miejscach o płaskich powierzchniach.

Przedmiot

Przedmiotem tych badań była ocena, czy stosowanie EMDOGAIN-u® może poprawić gojenie spowodowane nie chirurgicznym leczeniem przyzębia. Szczególnie oceniano wpływ na miejsca o płaskich powierzchniach.

Wzór badań

Badania przeprowadzono jako długoterminowy test wewnątrz osobniczy trwający 6 miesięcy, w badaniach uwzględniono podwójną ślepą próbę, rozziew ust, podawanie środka obojętnego (placebo) i rozkład przypadkowy.

Obiekty badań pacjentów zgłoszonych do Kliniki Chorób Przyzębia, Zakładu Periodontologii, Uniwersytetu w Goteborgu celem leczenia średnio zaawansowanych chorób przyzębia.

Kryteria włączenia • Przynajmniej trzy miejsca płaskiej powierzchni zębów w każdym z dwóch przeciwległych kwadrantów z kieszonkami wysondowanymi na głębokość > 5 mm, oraz przynajmniej jedna para miejsc z kieszonkami o głębokości > 6 mm • Wybrany ząb musi mieć żywą miazgę, określaną bodźcem termicznym lub elektrycznym lub, jeżeli przewidziano go do leczenia kanałowego, był bezobjawowy i bez technicznych uwag.

Postępowanie (leczenie)

Po przeprowadzeniu badania podstawowego, wszyscy pacjenci zostali poinstruowani o prawidłowym pomiarze naddziąsłowych płytek kontrolnych. Przeprowadzono usunięcie kamienia nazębnego i oczyszczono korzenie.

Gdy ustało krwawienie z kieszonek, 24% żel EDTA (otrzymany z Biora AB, Szwecja) nałożono do kieszonek na przeciąg 2 minut. Następnie kieszonki delikatnie przepłukano solą i nałożono albo substancję testowaną (EMDOGAIN®) lub kontrolną (żel PGA)

Oceny

Badania podstawowe przeprowadzane w 1-, 2-, 3-, 8- i 24 tygodniu obejmowały następujące zmienne:

1. Stan higieny jamy ustnej - obecność/brak płytek nazębnych,

2. Stan dziąseł (indeks dziąsłowy, Loe 1967),

3. Głębokość kieszonki oceniana zgłębnikiem,

4. Poziom przywierania oceniany zgłębnikiem,

5. Krwawienie po badaniu sondą - obecność lub brak (15 sekund),

6. Nadwrażliwość zębów - po dmuchnięciu powietrzem (tak/nie),

7. Stopień dyskomfortu - oceniany w 1-, 2- i 3-cim tygodniu stosując 10 cm wzrokową skalę analogową (VAS).

PL 204 797 B1

PŁYTKI NAZĘBNE; wartości średnie (odchylenia standardowe)

	KONTROLA	EMDOGAIN®
Punkt wyjścia	0,10 (0,30)	0,19 (0,40)
1 tydzień	0,08 (0,27)	0,05 (0,22)
2 tygodnie	0,05 (0,22)	0,02 (0,15)
3 tygodnie	0,05 (0,22)	0,10 (0,30)
6 tygodni	0,14 (0,35)	0,19 (0,40)
26 tygodni	0,12 (0,33)	0,07 (0,34)

INDEKS DZIĄSŁOWY; wartości średnie (sd)

	KONTROLA	EMDOGAIN®
Punkt wyjścia	1,40 (0,50)	1,40 (0,50)
1 tydzień	1,00 (0,32)	0,87 (0,52)
2 tygodnie	0,83 (0,44)	0,74 (0,45)
3 tygodnie	0,69 (0,60)	0,60 (0,50)
6 tygodni	0,67 (0,53)	0,64 (0,58)
26 tygodni	0,62 (0,54)	0,62 (0,49)

KRWAWIENIE PO ZGŁĘBNIKOWANIU; %

	KONTROLA	EMDOGAIN®
Punkt wyjścia	100	100
1 tydzień	67	44
2 tygodnie	43	33
3 tygodnie	29	26
6 tygodni	33	31
26 tygodni	19	24

SUBIEKTYWNA OCENA PACJENTA; skala VAS Pierwszy tydzień

	KONTROLA	EMDOGAIN®
skala VAS
0-20	8%	0%
21-40	15%	8%
41-60	31%	30%
61-80	8%	0%
81-100	38%	62%

Trzeci tydzień

	KONTROLA	EMDOGAIN®
1	2	3
skala VAS
0-20	14%	7%

PL 204 797 B1 cd. tabeli

1	2	3
21-40	0%	7%
41-60	3%	0%
61-80	21%	22%
81-100	57%	64%

Wniosek

Pacjenci mają mniej kłopotów pooperacyjnych, mniej krwawią, mniej płytek nazębnych i poprawa indeksu dziąsłowego. Wyniki te potwierdzają korzystny wpływ EMDOGAIN® na gojenie ran.

P r z y k ł a d 15.

Badania pilotowe nad leczeniem zranień u świń

Wprowadzenie

Przedmiot

Przedmiotem tych pilotowych badań jest ocena procesu gojenia ran rozwarstwionych u świń, oraz ocena wpływu EMD na te rany.

Powód wyboru gatunku zwierzęcia

Świnia została wybrana jako modelowe zwierzę do badań, ponieważ udowodniono, że jest to wygodny model do oceny gojenia się ran u ludzi.

Materiał i metody

Zwierzęta

Doświadczenie będzie przeprowadzone na 4 świniach SPF (krzyżowane w Danii, Yorkshire i Duroc). Na początku okresu aklimatyzacji waga zwierząt wynosiła około 35 kg. Okres adaptacji trwający jeden tydzień, w którym zwierzęta są codziennie obserwowane, pozwoli wyeliminować zwierzęta będące w złym stanie. Wszelkie obserwacje będą notowane.

Przetrzymywanie zwierząt

Badania będą prowadzone w zwierzętarni zaopatrzonej w filtrowane powietrze o temperaturze około 21°C (z wahaniem do 3 stopni), względnej wilgotności 55% +/- 15% i powietrzu wymienianym 10 razy/godzinę. Pomieszczenie będzie oświetlone w cyklu 12 godzin jasności i 12 godzin ciemności. Światło będzie od godziny 6 do 18.

Zwierzęta będą trzymane osobno w boksach

Ściółka

Ściółką będą trociny „LIGNOCEL H 3/4” z Hahn & Co, D 24796, Bredenbek-Kronsburg. Przeprowadza się regularnie ocenę zanieczyszczeń tej ściółki.

Dieta

Dostępną w handlu dietę dla świń, „Altromin 9033” z Chr Petersen A/S, DK-4100 Ringsted zastosuje się (około 800 g dwa razy dziennie). Regularnie dokonywana jest analiza głównych składników odżywczych i odpowiednich, możliwych zanieczyszczeń.

Woda pitna

Dwa razy dziennie zwierzęta otrzymają domową wodę pitną. Analizy jej zanieczyszczeń są regularnie dokonywane

Okaleczenia

Zranienia dokona się 1 dnia. Zwierzęta znieczuli się Strensil® Vet. Janssen, Belgia (40 mg azoperonu/ml, 1 ml/10 kg) oraz Atropiną DAK, Dania (1 mg atropiny/ml, 0,5 ml/10 kg), podanymi w pojedynczej dawce domięśniowo, a następnie podany będzie dożylnie Hypnodil® Janssen, Belgia (50 mg metomidatanu/ml, około 2 ml).

Pole grzbietowo-boczne obu stron grzbietu zwierząt zostanie ogolone, umyte wodą z mydłem, zdezynfekowane 70% etanolem, który zostanie zmyty sterylną solą, i wreszcie wysuszony jałową gazą.

Na tak przygotowanym polu zostanie wykonanych osiem ran warstwowych (25 x 25 x 0,4 mm), po cztery po każdej stronie kręgosłupa, używając dermatomu ACCU (GA 630, Aesculap®). Rany zostaną ponumerowane 1 (najbardziej dogłowowa) do 4 (najbardziej doogonowa) po stronie lewej, i 5 (najbardziej dogłowowa) do 8 (najbardziej doogonowa) po prawej stronie zwierzęcia.

PL 204 797 B1

Skrzepnięta krew będzie usunięta jałową gazą. Tuż przed wykonaniem zabiegu, około 8 godzin po zabiegu, i później ilekroć zajdzie tego potrzeba, zwierzęta otrzymają domięśniowo iniekcję Anorfiny, A/S GEA, Dania (0,3 mg buprenorfiny/ml, 0,04 ml/kg).

Dawkowanie po dokonaniu zranienia rany będą traktowane następująco:

	Zwierzę numer
	1	2	3	4
Lokalizacja	lewa	prawa	lewa	prawa	lewa	prawa	lewa	prawa
dogłowowa	A			B	A			B
	B	A			B	A
		B	A			B	A
doogonowa			B	A			B	A

A - kontrola B - EMD

Około 15 minut przed podaniem będzie sporządzony preparat EMD według instrukcji producenta. Preparat EMD zostanie zużyty w ciągu 2 godzin od sporządzenia. Do leczenia ran B, EMD zostanie nałożone jako cienka warstwa na powierzchnię rany. Jedną fiolkę EMD wykorzysta się do 4 ran.

Opatrunek ran

Rany przykryje się opatrunkiem Tegaderm®. Opatrunek będzie pokryty bandażem z gazy, przymocowany Fixomul®. Opatrunki, gaza oraz Fixomul będą utrzymane przy pomocy siatki Bend-arete® (Tesval, Włochy). Opatrunek będzie sprawdzany codziennie.

Opatrunek zostanie zmieniony na drugi dzień (wszystkie zwierzęta) i na trzeci dzień (zwierzęta nr 3 i 4).

Przed każdą zmianą opatrunku zwierzęta będą znieczulane domięśniową iniekcją podaną w grzbiet (1,0 ml/10 kg wagi ciała) mieszaniną Zoleitu 50® Vet, Virbac, Francja (125 mg tiletaminy i 125 mg zolazepamu w 5 ml rozpuszczalnika) Rampun® Vet., Bayer, Niemcy (20 mg ksylazine/ml, 6,5 ml) i Methadon® DAK, Nycomed DAK, Dania (10 mg metadonu, 2,5 ml).

Obserwacja ran

Każda rana będzie poddana obserwacji i fotografowaniu w drugim dniu (wszystkie zwierzęta), w 3 dniu (wszystkie zwierzęta) oraz w 4 dniu (zwierzęta Nr 3 i 4). Oceniany będzie stopień wysięku i zapalenia. Pojawienie się przeszczepionego naskórka będzie szczegółowo opisane.

Oznaki kliniczne

Codziennie będą zapisywane wszelkie widoczne oznaki choroby oraz każde zmiany w zachowaniu się. Każde odchylenie od normy będzie opisane w odniesieniu do czasu, długości trwania i stopnia nasilenia.

Waga ciała

Zwierzęta zostaną zważone po przyjeździe, w dniu dokonania zranienia i po zakończeniu badań.

Obserwacje końcowe

W dniu 3 (po około 56 godzinach od zranienia) zwierzęta Nr 1 i 2 zabije się przecięciem żyły i tętnicy podobojczykowej po ogłuszeniu pociskiem z pistoletu.

W dniu 4 (około 72 godzin po zranieniu), zwierzęta Nr 3 i 4 zabije się przecięciem żyły i tętnicy podobojczykowej po ogłuszeniu pistoletem kulowym.

Pobranie tkanek

Każda rana zostanie wycięta jako całość oddzielona od tkanki mięśni szkieletowych. Jeżeli stwierdzi się jakąś przyległość do mięśni szkieletowych, część mięśni także będzie objęta materiałem do utrwalania. Każde pobranie utrwali się w zbuforowanym obojętnym formaldehydzie 4%.

Procedura histologiczna

Po utrwaleniu czterech reprezentatywnych próbek ze wszystkich ran zatopi się je w parafinie, skroi na grubość 5 milimikronów i wybarwi hematoksyliną i eozyną. Po wybarwieniu skrawki będą oglądane pod mikroskopem świetlnym z zastosowaniem siatki. To pozwoli na pomiar całkowitej długości

PL 204 797 B1 rany oraz długości powierzchni epitelializującej. Ten stosunek będzie wyrażony w procentach rany pokrytej nabłonkiem na skrawek. Pobrane będą średnie wartości dla każdej rany, z tego obliczy się średnie wartości dla grupy.

Statystyka

Dane będą opracowane tak, by otrzymać średnie wartości dla grupy oraz odchylenie standardowe. Ewentualne wartości odbiegające od przeciętnej będą również identyfikowane. Następnie każda zmienna ciągła będzie zbadana na homogenność wariancji testem Bartletta. Jeżeli wariancja jest homogenna, przeprowadzi się analizę wariancji zmiennych. Jeżeli stwierdzi się istotne różnice, ewentualne różnice wewnątrz grupowe zostaną ocenione testem Dunetta. Jeżeli wariancja jest heterogenna, każda zmienna będzie zbadana na normalność metodą Shapiro-Wilk. W przypadku rozkładu normalnego, możliwe różnice wewnątrz grup będą identyfikowane testem t-Student'a. W przeciwnym razie możliwe różnice wewnątrz grup będą oceniane testem Kruskala-Wallisa.

Jeżeli nie wystąpią istotne różnice w obrębie grup, późniejszą identyfikację grup przeprowadzi się testem Wilcoxon Rank-Surn.

Analiza statystyczna będzie wykonana przy pomocy programu SAS® (wersja 6.12), opisanego w „SAS/STAT® User Guide, Version 6, 4-te wydanie tom 1+2”, 1989, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina 27513, USA.

Claims

1. Zastosowanie preparatu aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że zakażenie jest spowodowane mikroorganizmami.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że kompozycja przeznaczona jest do zapobiegania lub leczenia rozwoju bakterii na powierzchni błon śluzowych.

4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że kompozycja przeznaczona jest do zapobiegania lub leczenia rozwoju bakterii na paznokciach lub na powierzchni zębów.

5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że zakażenie występuje w obrębie jamy ustnej.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że kompozycja przeznaczona jest do zapobiegania i/lub leczenia stanów bakteryjnych w obrębie jamy ustnej.

7. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2 albo 6, znamienne tym, że zakażenie jest wywołane bakteriami, powodującymi próchnicę, np. Streptococcus mutans; bakteriami powodującymi choroby przyzębia, np. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter (Fusobacteria, Staphylococci), B. forsythus; bakteriami wywołującymi zapalenie zębodołów etc, np. Staphylococcus, Actinomyces i Bacillus; oraz bakteriami powodującymi ubytki okołowierzchołkowe, np. Spirochetes.

8. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2 znamienne tym, że bakteria jest obecna na skórze.

9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że kompozycja przeznaczona jest do profilaktyki i/lub leczenia stanów bakteryjnych w obrębie jamy ustnej.

10. Zastosowanie preparatu aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia stanów zapalnych.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że stan zapalny występuje w obrębie jamy ustnej.

12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że stan zapalny występuje w miejscu pobrania tkanki do przeszczepienia.

13. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 10, znamienne tym, że aktywną substancją szkliwa jest macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że aktywna substancja szkliwa jest wybrana z grupy składającej się z enamelin, amelogenin, białek innych niż amelogeniny, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, amelin (ameloblastyna, szeatlina), tuftelin oraz ich pochodnych i ich mieszanin.

PL 204 797 B1

15. Zastosowanie według zastrz.13, znamienne tym, że aktywna substancja szkliwa ma ciężar cząsteczkowy najwyżej około 120 kDa, jak np.100000u, 90000u, 80000u, 70000u lub 60000u, określony metodą elektroforetyczną SDS Page.

16. Zastosowanie według zastrz.13, znamienne tym, że preparat aktywnej substancji szkliwa zawiera mieszaninę aktywnych substancji szkliwa o różnych ciężarach cząsteczkowych.

17. Zastosowanie według zastrz.13, znamienne tym, że preparat aktywnej substancji szkliwa składa się co najmniej z dwóch substancji wybranych z grupy składającej się z amelogenin, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, tufteliny, białek tuft, białek surowicy, białek śliny, ameliny, ameloblastyny, szeatliny oraz ich pochodnych.

18. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że aktywna substancja szkliwa ma ciężar cząsteczkowy do około 40000u.

19. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że aktywna substancja szkliwa ma ciężar cząsteczkowy pomiędzy 5000 u a 25000u.

20. Zastosowanie według zatrz. 13, znamienne tym, że główna część aktywnej substancji szkliwa ma ciężar cząsteczkowy 20000u.

21. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że co najmniej część aktywnej substancji szkliwa jest w postaci agregatów lub po zastosowaniu in vivo jest zdolna do tworzenia agregatów.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że agregaty mają wielkość cząstek od 20 nm do 1 mikrometra.

23. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że zawartość białka w aktywnej substancji szkliwa w preparacie jest w zakresie od 0,05% wagowych do 100% wagowych, jak np. 5-99% wagowych, 10-95% wagowych, 15-90% wagowych, 20-90% wagowych 30-90% wagowych, 40-85% wagowych, 50-80% wagowych, 60-70% wagowych, 70-90% wagowych, lub 80-90% wagowych.

24. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 10, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą.

25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że farmaceutycznie dopuszczalną substancją pomocniczą jest alginian glikolu propylenowego.

26. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że farmaceutycznie dopuszczalną substancją pomocniczą jest kwas hialuronowy lub jego sole lub pochodne.