BRPI9908182B1

BRPI9908182B1 - Compositions of matrix protein for wound healing

Info

Publication number: BRPI9908182B1
Application number: BRPI9908182-2A
Authority: BR
Inventors: Gestrelius Stina; Hammarström Lars; Lyngstadaas Petter; Andersson Christer; Slaby Ivan; Hammargren Tomas
Original assignee: Straumann Holding Ag
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2017-09-26
Also published as: US7294352B2; US20030064927A1; BRPI9908182C1; US20050271604A1; US20020169105A1; US6720009B2; JP4726296B2; AR020055A1; BRPI9908182B8; US6503539B2; PL204797B1; JP2002504520A; RU2241489C2

Abstract

"composições de proteína de matriz para cura de feridas". substâncias ativas de esmalte podem ser usadas para preparação de uma composição farmacêutica ou cosmética para cura de uma ferida, aperfeiçoamento de cura de uma ferida, regeneração ou reparo de tecido liso ou para prevenir ou tratar infecção de inflamação.

Description

"COMPOSIÇÕES DE PROTEÍNA DE MATRIZ PARA CURA DE FERIDAS" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere aos usos de uma matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte como agentes terapêuticos ou profilâticos. As substâncias são ativas como agentes para cura de feridas, antibacterianos e/ou anti-inflamatórios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Proteínas de matriz de esmalte, tais como aquelas presentes na matriz de esmalte, são melhor conhecidas como precursores de esmalte. Proteínas de esmalte e derivados de matriz de esmalte foram descritos anteriormente na literatura de patente para induzir formação de tecido rígido (isto é, formação de esmalte, Patente U.S. Número 4.672.032 (Slavkin)) ou ligação entre tecidos rígidos EP-B-0 337.967 e EP-B-0 263.086). Assim, a técnica anterior é unicamente centrada na regeneração dos tecidos rígidos, enquanto a presente invenção lida com os efeitos benéficos na cura de ferida do tecido macio, e efeitos antibacterianos e anti-inf lamatórios que são inesperadamente encontrados.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na verificação de que a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte {o termo "uma substância de esmalte ativa" encontra-se a seguir também usado como uma matriz de esmalte, um derivado de matriz de esmalte ou uma proteína de matriz de esmalte) são agentes benéficos para o melhoramento ou aperfeiçoamento da cura' de feridas nos tecidos macios (isto é, tecidos não mineralizados), tais como, colágeno ou tecidos contendo epitélio, incluindo pele e mucosa, músculos, vasos sangüineos e linfáticos, tecidos nervosos, glândulas, tendões, olhos e cartilagem. Conforme demonstrado na seção experimentação aqui, a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte exercem efeitos especialmente úteis na cura ou profilaxia das feridas de tecido macio.

Consequentemente, a invenção se refere ao uso de uma preparação de uma substância de esmalte ativa para preparação de uma composição farmacêutica ou cosmética i) para cura de uma ferida, ii) para aperfeiçoamento da cura de uma ferida e/ou iii) para regeneração de tecido macio e/ou reparo.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para aperfeiçoar a cura de uma ferida ou de promoção de regeneração do tecido macio e/ou reparo, o processo compreendendo administração, a um indivíduo que necessite da mesma, de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de uma substância de esmalte ativo.

Adicionalmente, foi verificado que a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteína de matriz de esmalte possuem propriedades antibacterianas e/ou anti-inflamatórias que podem ser usadas para tratamento das condições de tecido rígido e macio (isto é, mineralizado).

Em outros aspectos, a presente invenção refere-se ao uso de uma preparação de uma substância de esmalte ativa para preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de uma infecção ou condições inflamatórias.

CURA DA FERIDA

Feridas e/ou úlceras são encontradas normalmente salientando-se da pele ou sobre uma superfície de mucosa ou como o resultado de um infarto em um órgão ("ataque") . Uma ferida pode ser um resultado de um defeito de tecido ou uma lesão de uma condição subjacente, A regeneração das feridas periodontais experimentalmente provocadas foi descrita anteriormente pelos inventores e não destina-se a estar dentro do escopo da presente invenção. No presente contexto, o termo "pele" se refere à superfície mais externa do corpo de um animal, tal como um ser humano e pode ser oral, bucal, aural, nasal, pulmão, olhos, gastrointestinal, vaginal ou mucosa retal.

No presente contexto o termo "ferida" denota um dano ao corpo com interrupção da integridade normal das estruturas do tecido. O termo também destina-se a englobar os termos "ferida", "lesão", "necrose" e "úlcera". Normalmente, o termo "ferida" é um termo popular para quase qualquer lesão da pele ou membranas da mucosa e o termo "úlcera" é um defeito local, ou escavação, da superfície de um órgão ou tecido, que é produzido pela escara do tecido necrótico. A lesão geralmente se refere a qualquer imperfeição do tecido. Necrose está relacionada a morte do tecido resultando de infecção, danos, inflamação ou infartação. O termo "ferida" usado no presente contexto denota qualquer ferida (vide abaixo ou uma classificação de feridas) e em qualquer estágio específico no processo de cura incluindo o estágio antes de qualquer cura ter iniciado ou mesmo antes de uma ferida específica como uma incisão cirúrgica ser feita (tratamento profilático).

Exemplos de feridas que podem ser prevenidas e/ou tratadas de acordo com a presente invenção são, por exemplo, feridas assépticas, feridas por contusão, feridas por incisão, feridas laceradas, feridas por não penetração (isto é, feridas onde não existe rompimento da pele, porém existe dano às estruturas subjacentes), feridas abertas, feridas por penetração, feridas por perfuração, feridas por punção, feridas sépticas, feridas subcutâneas, etc. Exemplos de feridas são feridas no leito, feridas de cancro, feridas por cromo, feridas por friagem, feridas causadas por pressão, etc. Exemplos de úlceras são, por exemplo, úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera de gota, úlcera diabética, úlcera isquêmica hipertensiva, úlcera estase, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical, úlcera venérea, por exemplo causada por gonorréia (incluindo uretrite, endocervicite e proctite). Condições relacionadas as feridas ou machucados que podem ser sucessivamente tratadas de acordo com a invenção são queimaduras, antrax, tétano, gangrena por asfixia, escarlatina, erisipela, sicose barbae, foliculite, impetigo contagiosa ou "ferida” e "úlcera" e "ferida" e "machucado" e, adicionalmente, os termos são freqüentemente usados aleatoriamente. Portanto, conforme mencionado acima, no presente contexto, o termo "ferida" engloba o termo "úlcera", "lesão", "machucado" e "infartação" e os termos são usados indiscriminadamente a menos que de outra forma indicado.

Os tipos de feridas a serem tratadas de acordo com a invenção incluem também i) feridas em geral, ais como, por exemplo, cirúrgica, traumática, infecciosa, isquêmica, térmica, química e feridas com bolhas; ii) feridas específicas para a cavidade oral, tais como, por exemplo, feridas pós-extração, feridas endodónticas especialmente em conexão com o tratamento de cistos e abcessos, úlceras e lesões de bactérias, de origem virótica ou autoimunológica, mecânica, química, térmica, infecciosa e feridas liquenóides; úlceras de herpes, estomatite com afta, gengivite ulcerativa aguda necrotizante e síndrome de boca queimando são exemplos específicos; e iii) feridas na pele, tais como, por exemplo, neoplasma, queimaduras (por exemplo, química, térmica), lesões (bacteriana, virótica, autoimunológica), mordidas e incisões cirúrgicas. Outro modo de classificar-se as feridas é como i) pequena perda de tecido devido as incisões cirúrgicas, abrasões menores e mordidas menores, ou como ii) perda sígnificante de tecido. 0 último grupo incluindo úlceras isquêmicas, machucados por pressão, fístulas, lacerações, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas por doação (em tecidos macios e rígidos) e infartações. 0 efeito de cura de uma substância de esmalte ativo foi verificado como sendo de interesse em conexão com feridas que estão presentes na cavidade oral. Tais feridas podem ser ferimentos corpóreos ou traumas associados com cirurgia oral incluindo cirurgia periodontal, extração de dente, tratamento endodóntico, inserção de implantes dentários, aplicação e uso de prótese dentária e semelhantes. Na seção experimental aqui, o efeito benéfico de uma substância de esmalte ativo em tais feridas foi demonstrado. Adicionalmente, o efeito de cura em um tecido macio foi observado.

Na cavidade oral, a cura de feridas como feridas por afta, feridas traumáticas ou feridas associadas a herpes é também aperfeiçoada após aplicação de uma substância de esmalte ativo. As feridas traumáticas e feridas associadas a herpes podem naturalmente, também estar situadas em outras partes do corpo além da cavidade oral.

Em outros aspectos da invenção, a ferida a ser prevenida e/ou tratada é selecionada do grupo consistindo de feridas assépticas, infartações, feridas por contusão, feridas por incisão, feridas laceradas, feridas de não penetração, feridas abertas, feridas por penetração, feridas por perfuração, feridas por punção, feridas sépticas e feridas subcutâneas.

Outras feridas que são de importância em conexão com a presente invenção são feridas como úlceras isquêmicas, machucados por pressão, fistulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas em local de doação. Úlceras isquêmicas e machucados por pressão são feridas que normalmente apenas saram muito lentamente, especialmente, em tais casos, uma cura aperfeiçoada e mais rápida é naturalmente, de grande importância para o paciente. Adicionalmente, os custos envolvidos no tratamento dos pacientes que sofrem de tais feridas são marcantemente reduzidos quando a cura é aperfeiçoada e acontece mais rapidamente.

Feridas em local de doação são feridas que, por exemplo, ocorrem em conexão com a remoção do tecido rígido de uma parte do corpo para outra parte do corpo, por exemplo, em conexão com transplante. As feridas resultantes de tais operações são muito doloridas e uma cura aperfeiçoada é portanto muito valiosa. 0 termo "pele" é usado em um sentido mais amplo, englobando a camada epidérmica da pele e - naqueles casos onde a superfície da pele é mais ou menos machucada - também a camada dérmica da pele. Fora do estrato córneo, a camada epidérmica da pele é a camada externa (epitelial) e a camada de tecido conjunto mais profunda da pele é denominada derme.

Uma vez que a pele é a parte mais exposta do corpo, ela é especialmente suscetível a vários tipos de danos, tais como, por exemplo, rupturas, cortes, abrasões, queimaduras e mordidas ou danos que surgem de várias doenças. Adicionalmente, muito da pele é freqüentemente destruído em acidentes. Contudo, devido a barreira importante e função fisiológica da pele, a integridade da pele é importante para o bem estar do indivíduo, e qualquer quebra ou ruptura representa uma ameaça que deve ser combatida ser pelo corpo a fim de proteger sua existência. A parte dos danos à pele, os danos podem também estar presentes em todos os tipos de tecidos (isto é, macio e rígido). Danos aos tecidos macios incluindo membranas das mucosas e/ou pele São especialmente relevantes em conexão com a presente invenção. A cura de uma ferida na pele ou em uma membrana de mucosa sofre uma série de estágios que resultam tanto no reparo ou regeneração a pele ou membrana da mucosa. Nos anos recentes, a regeneração e reparto foram distinguidos como os dois tipos de cura que podem ocorrer. A regeneração pode ser definida como um processo biológico, pelo que a arquitetura e função de perda de tecido são completamente renovadas. Reparo, por outro lado, é um processo biológico, pelo que, a continuidade do tecido rompido é restaurada por novos tecidos que não replicam a estrutura e função dos perdidos. A maior parte das feridas curam através de reparo, significando que um novo tecido formado é estrutural e quimicamente diferente do tecido original (tecido de cicatrização). No primeiro estágio do reparo do tecido, um processo que é quase sempre envolvido é a formação de um tecido conjuntivo transiente na área do tecido danificado. Este processo inicia-se por formação de uma nova matriz de colágeno extracelular por fibroblastos. Esta nova matriz de colágeno extracelular é então o suporte para um tecido conjuntivo durante o processo de cura final. A cura final é, na maior parte dos tecidos, um tecido conjuntivo contendo formação de cicatrização. Em tecidos que possuem propriedades de regeneração, tais como, por exemplo, pele e osso, a cura final inclui regeneração do tecido original. Este tecido regenerado possui frequentemente algumas características de cicatrização, por exemplo, um espessamento de uma fratura de osso que é curada.

Sob circunstâncias normais, o corpo provê mecanismos para cura de pele danificada ou mucosa, a fim de restaurar a integridade da barreira da pele ou mucosa. 0 processo de reparo mesmo para rupturas pequenas ou feridas pode levar um período de tempo estendendo-se de horas e dias a semanas. Contudo, na ulceração, a cura pode ser muito lenta e a ferida pode persistir por um período estendido de tempo, isto é, meses ou mesmo anos.

Os estágios de cura de ferida normalmente incluem inflamação (normalmente 1-3 dias), migração (normalmente 1-6 dias), proliferação (normalmente 3-24 dias) e maturação {normalmente 1-12 meses) . 0 processo de cura é um processo complexo e bem orquestrado que envolve migração, proliferação e diferenciação de uma variedade de tipos de células, bem como a síntese de componentes de matriz. 0 processo de cura pode ser separado nas três fases que se seguem: i) Hemostase e Inflamação Quando as plaquetas estão presentes fora do sistema circulatório e expostas à trombina e colágeno, elas são ativadas e agregam-se. Assim, as plaquetas iniciam o processo de reparo agregando-se e formando um tampão temporário para assegurar hemostase e impedir invasão por bactérias. As plaquetas ativadas iniciam o sistema de coagulação e liberam fatores de crescimento, como o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e fatores de crescimento epidérmico (EGFs) e fatores de crescimento de transformação (TGFs).

As primeiras células que invadem a área da ferida são os neutrófilos seguido por monócitos que são ativados por macrófagos. 0 papel principal dos neutrófilos parece ser limpeza da ferida ou defesa da mesma contra contaminação por bactéria e aperfeiçoamento da cura da ferida por remoção de células e plaquetas mortas. A infiltração de neutrófilos cessa nas primeiras 48 horas contanto que nenhuma contaminação bacteriana esteja presente na ferida.

Neutrófilos em excesso são fagocitosados por macrófagos de tecido recrutados do grupo de circulação de monócitos presentes no sangue. Acredita-se que os macrófagos sejam essenciais para sarar eficazmente uma ferida pelo que, eles são também responsáveis pela fagocitose dos organismos patogênicos e uma limpeza de resíduos de tecido. Adicionalmente, eles liberam vários fatores envolvidos nos eventos subsequentes do processo de cura. Os macrófagos atraem fibroblastos que iniciam a produção de colágeno- ii) Formação de Tecido de Granulação e Re-epitelização Dentro de 48 horas após o ferimento, os fibroblastos começam a proliferar e migrar para dentro do espaço da ferida a partir do tecido conjuntivo na borda da ferida. Os fibroblastos produzem colágenos e glicosaminoglicanos e entre outros, a baixa tensão de oxigênio na ferida estimula a proliferação de células endoteliais. As células endoteliais dão surgimento à formação de uma nova rede capilar.

Ativadores de colagenase e plasminogeno são secretados dos ceratinócitos. Se a ferida é deixada descansar e bem alimentada com oxigênio e nutrientes, os ceratinócitos migrarão para a ferida. Acredita-se que os ceratinócitos migrem apenas sobre tecido viável e, consequentemente, os ceratinócitos migram para dentro da área abaixo do tecido machucado e a crosta da ferida. A área ferida é adicionalmente diminuída por contração. iii) Remodelamento Dérmico Assim que a re-epitelização é completada, o remodelamento do tecido começa. Esta face, que demora vários anos, restaura a resistência ao tecido machucado.

Todos os processos de cura mencionados acima levam tempo considerável. A razão de cura é influenciada pela não infecção da ferida, a saúde geral do indivíduo, presença de corpos estranhos, etc. Algumas condições patológicas como infecção, maceração, desidratação, geralmente saúde fraca e desnutrição podem conduzir a formação de uma úlcera crônica, tal como, por exemplo, úlcera isquêmica.

Até pelo menos a cura superficial ter ocorrido, a ferida corre o risco de infecção contínua ou nova infecção. Portanto, quanto mais rápido a ferida sarar, mais rápido o risco é eliminado.

Assim, qualquer procedimento que possa influenciar na razão de cura da ferida ou influenciar favoravelmente a cura de feridas é de grande valor.

Adicionalmente, uma vez que a maior parte dos processos de reparo de tecido inclui a formação precoce de tecido conjuntivo, um estímulo deste e os processos subsequentes são contemplados para aperfeiçoar a dura do tecido.

No presente contexto o termo "cura clínica” é usado para significar uma situação onde nenhuma interrupção de tecido pode ser visualmente observada e apenas sinais discretos de inflamação estão presentes, tais como uma leve vermelhidão ou um tecido discretamente inchado. Além disto, não existem queixas de dores quando o órgão está relaxado ou não é tocado.

Conforme mencionado acima, a invenção se refere ao uso de uma matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte como um agente de cura de ferida, isto é, um agente que acelera, estimula e promove a cura de feridas dérmicas ou de mucosa. Consequentemente, um uso importante é também o uso como agente de regeneração de tecido e/ou reparo de tecido. Adicionalmente, devido ao efeito de cura de ferida, a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte possuem efeito de alívio de dor.

Tradicionalmente, ataduras secas ou úmidas a secas tem sido usadas comumente para cuidado da ferida. Estas são gradualmente substituídas por ambientes úmidos usando ataduras oclusivas. Para reparar ou substituir com sucesso uma parte do corpo danificada, os processos de cura de ferida, fibrose e invasão microbiana devem ser equilibrados um contra o outro. Muitas ferramentas disponíveis para proteção contra infecção comprometem a cura da ferida. A cura retardada da ferida ou inflamação pode exacerbar a fibrose. Além disto, foi sugerido anteriormente que fatores de crescimento como fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de transformação -a (TFG-α), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs) incluindo fator de crescimento de fibroblasto ácido {α-FGF) e fator de crescimento de fibroblasto básico (β-FGF), fator-β de crescimento de transformação (TGF-β) e fatores de crescimento como insulina (IGF-1 e IFG-2) são condutores do processo de cura da ferida e são freqüentemente citados como promotores de cura de ferida; contudo, eles podem realmente promover a fibrose que, por sua vez, pode fornecer cura com sucesso. Mesmo assim, a cura acelerada oferece a maior promessa para reduzir o risco de infecção e de inflamação resultante que pode conduzir a formação de cicatriz, abordagens terapêuticas para acelerar o processo de cura de ferida normal depararam relativamente com pouco sucesso. Isto deve-se provavelmente ao fato de que o processo de reparo envolve vários fatores, conforme acima.

Para esta finalidade, os presentes inventores observaram que em várias culturas de células de fibroblastos (embrionárias, dérmicas, derivadas de ligamento periodontal, peixe ou ave), duas vezes quando muito de TGFpl é produzido nas culturas de células estimuladas com EMDOGAIN® comparado as culturas não estimuladas quando ensaiadas por exemplo, por ELISA em uma amostra de meio de cultura (vide Exemplo 1 a seguir). 0 aumento está presente após 24 horas de cultura, porém mais pronunciado nos dias que se seguem (dias 2 e 3) . Após o segundo dia, também a proliferação de célula é aumentada nas culturas de célula estimuladas com EMDOGAIN®. Um aumento semelhante, porém menos pronunciado de produção de TGFpi é observado em células epiteliais humanas. Como TGFpl parece ser de importância central na epitelissação das feridas superficiais, estas averiguações suportam o conceito da presente invenção.

Na cavidade oral o uso de ataduras é comum. Tais ataduras são do tipo tradicional, por exemplo, Ataduras cirúrgicas para parar sangramento e atadura periodontal Coe-Pack (Coe Laboratories, the GC Group, Chicago, USA) sobre feridas abertas, Gaze embebida em solução de antibiótico é inserida no alvéolo de extração de dente e requer remoção após alguns dias, quando a cura tiver iniciado. 0 enxágüe com anti-sépticos tais como, clorhexidina é usado normalmente após cirurgia oral. Algumas vezes, antibióticos gerais ou tópicos são também prescritos.

Em geral, precauções específicas devem ser levadas em consideração, em conexão com tratamento de feridas, tais como, por exemplo, considerações de esterilidade, problemas de contaminação, aplicação correta de bandagens/ataduras, etc., que normalmente requer que o tratamento/aplicação seja realizado por enfermeiras bem treinadas ou semelhante. Assim, o tratamento da ferida freqüentemente torna-se uma operação cara quando o agente de cura da ferida deve ser aplicado várias vezes ao dia. Uma redução desejada nos custos envolvidos no tratamento da ferida é portanto obtida quando a freqüência da aplicação pode ser reduzida ou se os processos de cura são aperfeiçoados levando a uma redução no período de tempo necessário para sarar a ferida.

Os presentes inventores verificaram que a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte possuem propriedades de cura de ferida. Adicionalmente, existem indicações de que a aplicação de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de esmalte conduz a cura aperfeiçoada da ferida. Especialmente, os inventores observaram que após aplicação de proteínas de matriz de esmalte e/ou derivados de matriz de esmalte, o estágio de inflamação é encurtado e os sinais típicos tais como, aquecimento, vermelhidão, oedema e dor são menos observados e novos tecidos são formados mais rapidamente. 0 tempo observado para cura da ferida (por exemplo, após cirurgia) é significativamente encurtado quando comparado à cirurgia sem o uso de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte. A atividade terapêutica e/ou profilática de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de esmalte pode, naturalmente, ser evidenciada por testes in vivo usando animais experimentais ou seres humanos (conforme a seção experimental aqui), Contudo, uma indicação da eficácia e/ou atividade da matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de esmalte pode ser obtida por realização de testes relativamente simples in vitro tais como, por exemplo, testes envolvendo culturas de células.

Adicionalmente, existem vários parâmetros que podem ser empregados a fim de avaliar o efeito de cura da ferida. Estes incluem: Planimetria auxiliada por computador (avaliação da razão de cura da ferida aberta) Formação de imagem doppler a laser (avaliação de perfusão da ferida) Tensiometria (avaliação da resistência da ferida) Histopatologia/citologia (avaliação microscópica dos tecidos da ferida e fluidos) Bioquímica (HPLC/RIA) (avaliação de vários medicamentos e componentes bioquímicos de cura de tecido) Eletrodiagnósticos (avaliação da relação de cura da ferida e inervação) Cintigrafia (imagem de ardionuclídeo de tecido da ferida) Em conexão com o tratamento de feridas/úlceras, a limpeza dos resíduos e da ferida é de importância especifica. Acredita-se que a limpeza e/ou retirada de resíduos das feridas/úlceras sejam um pré-requisito para o processo de cura e, adicionalmente, quando os agentes de cura da ferida são aplicados, tais agentes precisam exercer seu feito no tecido vital e fresco e não no tecido morto ou tecido contaminado. A retirada de resíduos de tecido necrótico pode ser realizada por pelo menos quatro processos diferentes: i) retirada de resíduos por lâmina, ii) retirada de resíduos mecânica, iii) retirada de resíduos por enzimas e iv) retirada de resíduos autolítica.

Portanto, a presente invenção se refere também ao uso de um processo de retirada de resíduos em combinação com o uso da matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte para a cura ou prevenção de feridas. Tal terapia de combinação envolve as duas etapas que se seguem, a saber: i) processo de retirada de resíduos e ii) aplicação de uma matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte e as duas etapas podem ser realizadas tantas vezes quanto desejado e em qualquer ordem apropriada.

Quando a ferida tiver sido submetida a retirada de resíduos, a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte podem ser aplicados tanto diretamente sobre quanto dentro da ferida ou ela pode se aplicada na forma de qualquer composição farmacêutica apropriada, tal como, uma atadura seca ou úmida para limpeza dentro da qual a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte foram incorporados. A matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte podem, naturalmente, ser aplicados em conexão com a limpeza da ferida.

Conforme será discutido mais a frente, a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte podem ser usados como tal ou eles podem ser usados em uma preparação apropriada ou composição farmacêutica.

EFEITO DE DIMINUIÇÃO DE INFECÇÃO

Em um aspecto adicional da presente invenção, a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte são usados como agentes terapêuticos ou profiláticos possuindo um efeito anti-microbiano. A matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte exibem propriedades de diminuição de infecção.

No presente contexto, o termo efeito de diminuição de infecção se refere ao tratamento ou efeito de prevenção pela matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte em uma infecção em um tecido de um indivíduo, quando o tecido ou o indivíduo é tratado com a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte. 0 termo infecção se refere a invasão e multiplicação de microorganismos nos tecidos do corpo ou acúmulo sobre os tecidos, que pode não ser aparente clinicamente ou resultar em dano celular local devido ao metabolismo competitivo, enzimas, toxinas, replicação intracelular ou resposta de antigeno-anticorpo.

De acordo com a presente invenção, a infecção a ser prevenida e/ou tratada pode ser causada por um microorganismo. Os microorganismos de interesse, de acordo com a presente invenção incluem bactérias, vírus, leveduras, fungos, protozoários e rickétsias.

No presente contexto, o termo "efeito anti-bacteriano" significa que o crescimento da bactéria é suprimido ou a bactéria é destruída. 0 termo não é limitado a determinadas bactérias, porém engloba em geral qualquer bactéria. Contudo, a invenção focaliza i) bactéria patogênica que causa doenças em mamíferos incluindo seres humanos e/ou ii) bactéria que normalmente está presente em um corpo de mamífero e que sob determinadas condições pode causar condições indesejadas no corpo..

Consequentemente, a presente invenção refere-se ao uso de uma substância de esmalte ativa para a prevenção ou tratamento de um crescimento bacteriano em uma superfície do corpo tal como pele, uma superfície de mucosa ou nas unhas ou superfície dos dentes.

DESCRIÇÃO GERAl· E ESPECÍFICA DAS CONDIÇÕES BACTERIANAS A SEREM NEUTRALIZADAS. A matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte podem se usados para tratamento de uma infecção causada por bactéria juntamente com ou sem a presença de um antimicrobiano. Bactérias gram negativas a serem tratadas com a substância de esmalte ativa seriam cocci, tais como, Neisseria (por exemplo N. meningitis, N. gonorrhoeae), e Acinetobacter ou bastões, tais como Bacteroides (por exemplo B. fragilis), Bordetella (por exemplo B. pertussis, B. parapertussis), Brucella (por exemplo B. mefitends, B. abortus Bang, B. suis), Campylobacter (por exemplo C. jejuni, C. coli, C. fetus), Citrobacter, Enterobacter, Escherichia (por exemplo E. coli), Haemophilus (por exemplo H. influenzae, H.para-influenzae), Klebsiella (por exemplo K. pneumoniae), Legionella (por exemplo L. pneumophila), Pasteurella (por exemplo P, yersinia, P. multocida), Proteus (por exemplo P. mirabilis, P. vulgaris), Pseudomonas (por exemplo P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei}, Salmonella (por exemplo S. enteriddis, S. intantitisS. Dublin S. typhi, S. paratyphi, S. schottmalled, S. choleraesuis, S. typhimurium, ou qualquer um dos outros 2.500 outros serotipos), Serratia (por exemplo S, marscences, S.fiquifaciens), Shigella (por exemplo S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae, S. boydii), Vibrio (por exemplo V. cholerae, V. el tor), e Yersinia (por exemplo Y. enterocolitica, Y. pseudo tuberculosis, Y. pestis), Bactérias gram positivas a serem tratadas com a substância de esmalte ativa seriam cocci, tais como, Streptococcus (por exemplo. S, pneumoniae, S. viridans, S. taeca fis, S. pyogenes), Staphylococcus (por exemplo S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. albus), e bastões, tais como, Actinomyces (por exemplo A. israeffi), Bacillus (por exemplo B. cereus, B. subtilis, B. anthracis), Clostridium (por exemplo C. botulinum, C. tetani, C. perfringens, C. difficile), Corynebacterium (por exemplo C. diphtheriae), Listeria, e Providencia, Outras bactérias que causam infecções incluem Propionobacterium acne e Pityosporon ovale. A matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte podem também ser usados para o tratamento de uma infecção causada por espirochete, tal como, por exemplo, Borrefia, Leptospira, Treponema ou Pseudomonas.

Um antímícrobíano a ser usado em combinação com a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte podería ser um antimicrobiano que tenha uma ação anti-microbiana através da inibição da síntese das paredes da célula, tais como, β-lactamas e vancomicina, preferivelmente penicilinas, tais como, amdinocilina, ampicilina, amoxicilina, azlocilina, bacampicilina, benzatina penicilina G, carbenicilina, cloxacilina, ciclacilina, dicloxacilina, metilcilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina e ticarcilina; cefalosporinas, tais como, os medicamentos de primeira geração cefadroxila, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefapirina e cepradina, os medicamentos de segunda geração, cefaclor, cefamandole, cefonicida, ceforanida, cefoxitina e cefuroxima e os medicamentos de terceira geração cefalosporinas cefoperazona, cefotaxima, cefoterana, ceftazidina, ceftizoxima, ceftriaxona e moxalactama; carbapenemas tais como imipenem ou monobactamas, tais como, aztreonam.

Outros medicamentos antimicrobianos com ação através da inibição de síntese de proteína, tais como, cloranfenicol; outras tetraciclinas preferivelmente demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, minociclina e oxitetraciclina; aminoglicosídeos tais como, amikacina, gentamicina, canamicina, neommicina, netilmicina, paromonicina, espectinomicina, estreptomicina e tobramicina; polimixinas tais como, colistina, colistimatato e polimixina B e eritromicinas e lincomicinas; antimicrobianos com ação através da inibição de síntese de ácido nucleico especificamente sulfonamidas, tais como, sulfacitina, sulfadiazina, sulfisoxazole, sulfametoxazol, sulfametizol e sulfapiridina; trimetoprima, quinolonas, novibiocina, pirimetamina e rifampina.

Em uma concretização específica da invenção, a infecção está presente na cavidade oral e a infecção pode ser uma condição bacteriana.

Bactérias orais a serem inibidas por contato ou de outra forma combatidas. Exemplos (não condições) incluem: - bactérias que causam as cáries, por exemplo, Streptococcus mutans, Lactobacillus spp. bactérias que causam doença periodontal por exemplo Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter (Fusobacteria, Staphylococci), B. forsythus; - bactérias que causam alveolite etc., por exemplo Staphylococcus, Actinomyces e Bacillus; - bactérias que causam lesões periapicais, por exemplo Spirochetes e todas acima.

EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO A presente invenção também se refere aos usos de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte como agentes terapêuticos ou profiláticos possuindo efeito anti-inflamatório. Vários medicamentos são empregados para combater as manifestações de inflamação, incluindo os adrenocorticosteróides, o maior número compreendendo os assim chamados medicamentos anti-inflamatórios não esteróides ou NSAIDs e medicamentos tais como agentes imunosupressivos. Adrenocordicosteróides e especialmente glucocorticóides possuem efeitos anti-inflamatórios potentes quando usados em doses farmacológicas. Eles inibem especificamente a fase vascular anterior do processo inflamatório por diminuição da permeabilidade vascular e pelo que, migração de granulócito. Glucocorticóides também interferem com os processos inflamatórios tardios e reparativos, pelo que eles inibem a proliferação de células mesenquimais e a produção de macromoléculas extracelulares, incluindo proteoglicanos e colágeno. Foi verificado experimentalmente que glucocorticóides inibem, por exemplo, função macrófago, produção de anticorpos humorais, imunidade celular e possivelmente a liberação de enzimas lisossômicas. A gravidade do dano ao tecido pode depender da reação de antigeno/anticorpo do organismo, bem como o grau de retenção de produtos inflamatórios na área afetada. 0 acúmulo de mediadores de inflamação acelera o processo. Na maioria dos casos o processo é lento, com imunoinfiltração do tecido e formação de tecido de granulação que contém células inflamatórias.

No presente contexto, o termo "efeito anti-inflamatório" denota uma neutralização ou supressão da inflamação.

DESCRIÇÃO GERAL E ESPECÍFICA DO TIPO DE CONDIÇÕES INFLAMATÓRIAS A SEREM TRATADAS A condição inflamatória a ser tratada de acordo com a presente invenção pode, naturalmente, ser qualquer condição inflamatória em/sobre qualquer parte do corpo ou qualquer condição inflamatória presente no tecido macio ou rígido. Em uma concretização da invenção, a condição inflamatória está presente na cavidade oral. Exemplos de condições na cavidade oral são alveolites, cheilitis, necrose óssea (após trauma), fraturas.

Em outra concretização da invenção, a condição inflamatória está presente em um sítio doador ósseo. Em uma terceira concretização da invenção, a condição inflamatória está presente em uma cavidade de junção. Exemplos de tais condições inflamatórias são artrite reumatóide e condições correlatas.

ANTI-BACTERIANO VERSUS ANTI-INFLAMATÓRIO

Em contraste com muitos agentes antibióticos usados correntemente, as proteínas de matriz de esmalte não comprometerão a cura da ferida e a cura rápida da ferida, por sua vez, não deixa espaço para processos inflamatóríos crônicos ou de longa duração. Também, a reorganização dos tecidos apropriados, tal como descrito após aplicação de derivados de matriz de esmalte nos defeitos periodontais, é claramente favorecida por uma cura de ferida rápida, sem bactérias ou reações inflamatórias. A aplicação de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte conduz à cura rápida da ferida de incisões cirúrgicas, possivelmente por criação de uma superfície que em contato com a bactéria inibe seu crescimento, porém ao mesmo tempo melhora a migração de fibroblastos e síntese de colágeno. Se o estágio inflamatório for encurtado, os sinais típicos tais como aquecimento, vermelhidão, oedema e dor são menos percebidos. MATRIZ DE ESMALTE, DERIVADOS DE MATRIZ DE ESMALTE E/OU PROTEÍNAS DE MATRIZ DE ESMALTE Matriz de esmalte é um precursor do esmalte e pode ser obtida de qualquer fonte natural relevante, isto é, um mamífero no qual os dentes estão em desenvolvimento. Uma fonte apropriada ê o desenvolvimento de dente de animais sacrificados, tais como, bezerros, porcos ou carneiros. Outra fonte por exemplo é a pele do peixe. A matriz de esmalte pode ser preparada de dentes em desenvolvimento, conforme descrito anteriormente (EP-B-0 337.867 e EP-B-0 263.086). A matriz de esmalte é raspada e os derivados de matriz de esmalte são preparados, por exemplo, por extração com solução aquosa, tal como um tampão, um ácido diluido ou base ou uma mistura de água/solvente, seguido por exclusão por tamanho, desalinização ou outras etapas de purificação, opcionalmente seguidas por secagem em congelamento. As enzimas podem ser desativadas por tratamento com calor ou solventes, quando os derivados podem ser armazenados na forma liquida sem secagem em congelamento.

No presente contexto, os derivados de matriz de esmalte são derivados de matriz de esmalte que incluem uma ou várias proteínas de matriz de esmalte ou parte de tais proteínas, produzidas naturalmente por corte ou processamento alternado, ou por divagem enzimática ou química de uma proteína de comprimento natural ou por síntese de polipeptídeos in vitro ou ín vivo {processos de DNA recombinante ou cultivo de células diplóides). Os derivados de proteína de matriz de esmalte também incluem polipeptídeos ou proteínas relacionados à matriz de esmalte. Os polipeptídeos ou proteínas podem ser ligados a uma molécula veículo biodegradável apropriada, tal como, ácidos poliamino ou polissacarídeos ou combinações dos mesmos. Adicionalmente, o termo derivados de matriz de esmalte também englobam substâncias análogas sintéticas.

Proteínas são macromoléculas biológicas constituídas por resíduos de aminoácido ligados em conjunto por ligações de peptídeo. As proteínas, como polímeros lineares de aminoácidos, são também denominadas polipeptídeos. Tipicamente, as proteínas possuem 50-800 resíduos de aminoácido e consequentemente, possuem pesos moleculares na faixa de cerca de 6.000 a cerca de vários milhares de Daltons ou mais. Proteínas pequenas são denominados peptídeos ou oligopeptídeos.

Proteínas de matriz de esmalte são proteínas que normalmente estão presentes na matriz de esmalte, isto é, o precursor para o esmalte (Tem Cate: Oral Histology, 1994/ Robinson: Eu. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1:282-91), ou proteínas que podem ser obtidas por divagem de tais proteínas. Em geral, tais proteínas possuem um peso molecular abaixo 120.000 dalton e inclui amelogeninas, não anelogeninas, não amelogeninas ricas em prolina, amelinas (ameloblastina, sheathlina) e tuftelinas.

Exemplos de proteínas para uso de acordo com a invenção são amelogeninas, não amelogeninas ricas em prolina, tuftelina, proteínas tuft, proteínas de soro, proteínas salivares, amelina, ameloblastina, sheathlina e derivados das mesmas e misturas dos mesmos. Uma preparação contendo uma substância de esmalte ativo para uso de acordo com a invenção pode conter, pelo menos, duas das substâncias proteináceas mencionadas acima. Um produto comercial * compreendendo amelogeninas e possivelmente outras proteínas de matriz de esmalte é comercializado como EMDOGAIN® (Biora AB) .

Em geral, as proteínas principais de uma matriz de esmalte são conhecidas como amelogeninas. Elas constituem cerca de 90% em peso/peso das proteínas de matriz. Os restantes 10% peso/peso incluem não amelogeninas riscas em prolina, tuftelina, proteínas tuft, proteínas de soro e pelo menos uma proteína salivar; contudo, outras proteínas podem também estar presentes, tais como, por exemplo, amelina (ameloblastina, sheathlina) que foram identificadas em associação à matriz de esmalte. Adicionalmente, as várias proteínas podem ser sintetizadas e/ou processadas em vários tamanhos diferentes (isto é, pesos moleculares diferentes). Assim, as proteína dominantes na matriz de esmalte, amelogeninas, existem em vários tamanhos diferentes, que juntos formam agregados supramoleculares. Existem substâncias marcantemente hidrófobas que, formam agregados em condições fisiológicas. Elas podem transportar ou ser barreiras para outras proteínas ou peptídeos.

Outras substâncias de proteína são também contempladas como sendo apropriadas para uso de acordo com a presente invenção. Exemplos incluem proteínas, tais como, proteínas ricas em prolina e poliproteínas. Outros exemplos de substâncias que são contempladas como sendo apropriadas para uso de acordo com a invenção são agregados de tais proteínas, de derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte, bem como metabólitos de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte. Os metabólitos podem ser de qualquer tamanho, variando do tamanho das proteínas aqueles de peptídeos curtos.

Conforme mencionado acima, as proteínas, polipeptídeos ou peptídeos para uso de acordo com a invenção tipicamente possuem um peso molecular de no máximo cerca de 120 kDa, tais como, por exemplo, no máximo 100 kDa, 80 kDa, 70 kDa ou 60 kDa conforme determinado por eletroforese de SDS Page.

As proteínas para uso de acordo com a invenção são normalmente apresentadas na forma de uma preparação, onde o teor da proteína da substância de esmalte ativa na preparação está na faixa de cerca 0,05% peso/peso a 100% peso/peso tal como, por exemplo, cerca de 5-99% peso/peso, cerca de 10-95% peso/peso, cerca de 15-90% peso/peso, cerca de 20-90% peso/peso, cerca de 30-90% peso/peso, cerca de 40-85% peso/peso, cerca de 50-80% peso/peso, cerca de 60-70% peso/peso, cerca de 70-90% peso/peso, ou cerca de 80-90% peso/peso. A preparação da substância de esmalte ativa para uso de acordo com a invenção pode também conter uma mistura de substâncias de esmalte ativas com diferentes pesos moleculares.

As proteínas da matriz de esmalte podem ser divididas em uma parte de peso molecular alto e uma parte de peso molecular inferior, e foi verificado que uma fração bem definida de proteínas de matriz de esmalte possui propriedades valiosas com relação ao tratamento dos defeitos periodontais (isto é, feridas periodontais). Esta fração contém proteínas que podem ser extraídas de ácido acético, geralmente referidas como amelogeninas e constituem a parte de peso molecular de uma matriz de esmalte (conforme EP-B-0 337.967 e EP-B-0 263.086).

Conforme discutido acima, o peso molecular inferior de uma matriz de esmalte possui uma atividade apropriada para induzir ligação entre os tecidos rigidos nos defeitos periodontais. No presente contexto, contudo, as proteínas ativas não são restritas ao peso molecular inferior de uma matriz de esmalte. No presente, proteínas preferidas incluem proteínas de matriz de esmalte tais como, amelogenina, amelina, tuftelina, etc. com pesos moleculares (conforme medido in vitro com SDS-PAGE) abaixo de cerca de 60.000 daltons, porém proteínas possuindo um peso molecular acima de 60.000 daltons, também possuem propriedades promissoras como candidatas a agentes de cura de feridas, agentes antibacerianos e/ou anti-inflamatórios.

Consequentemente, é contemplado que a substância de esmalte ativa para uso de acordo com a invenção possui um peso molecular de até cerca de 40.000, tal como, por exemplo, um peso molecular entre cerca de 5.000 e cerca de 25.000, Dentro do escopo da presente invenção também encontram-se os peptídeos como descrito no WO 97/02730, isto é, peptídeos que compreendem pelo menos um elemento de seqüência selecionado do grupo consistindo de tetrapeptídeos DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala) , VTKG (Val-Thr-Lys-Gly), EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) e DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu) e que adicionalmente compreende a seqüência de aminoácido a partir da qual um cordão consecutivo de 20 aminoácidos é idêntico a um grau de pelo menos 80% com um cordão de aminoácidos possuindo o mesmo comprimento selecionado do grupo consistindo de seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 e uma seqüência consistindo de aminoácidos 1 a 103 da SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 6 para 324 de SEQ ID NO: 2. O termo "identidade de seqüência" significa a identidade na seqüência de aminoácidos na combinação com relação a identidade e posição dos aminoácidos de peptideos. Uma fenda é contada como não identidade para um ou mais aminoácidos conforme apropriado.

Tais peptideos podem compreender de 6 a 300 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 30 aminoácidos, tais como, pelo menos 60 aminoácidos, pelo menos 90 aminoácidos e pelo menos 120 aminoácidos, pelo menos 150 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos.

Um processo para isolamento das proteínas de matriz de esmalte envolve a extração das proteínas e remoção de cálcio e íons fosfato de hidroxiapatita solubilizada por um processo apropriado, por exemplo, filtração por gel, diálise ou ultrafiltração (vide por exemplo, Janson, J-C & Rydén, L. (Eds.), Protein Purification, VCH Publishers 1989 e Harris, ELV & Angal, S., Protein Purification Methods - A practical approach, IRL Press, Oxford 1990).

Uma preparação de proteína liofilizada típica pode principal ou exclusivamente até 70-90% conter amelogeninas com um peso molecular (MW) entre 40.000 e 5.000 daltons, os 10-30% sendo feitos de peptideos menores, sais e água residual. As faixas de proteína principal estão a 20 kDa, 12-14 kDa e ao redor de 5 kDa.

Separando-se as proteínas, por exemplo, por precipitação, cromatografia por troca de íon, eletroforese preparatória, cromatografia de permeação por gel, cromatograf ia de fase inversa ou cromatograf ia por afinidade, as melogeninas de peso molecular podem ser purificadas. A combinação de amelogeninas de peso molecular pode ser variada, a partir do composto de 20 kDa dominante para um agregado de amelogeninas com muitos pesos moleculares diferentes entre 40 e 5 kDa, e para um composto 5 kDa dominante. Outras proteínas de matriz de esmalte tais como, amelina, tuftelina ou enzimas proteolíticas normalmente encontradas na matriz de esmalte, podem ser adicionadas e transportadas pelo agregado de amelogenina.

Como uma fonte alternativa dos derivados de matriz de esmalte ou proteínas pode-se também usar geralmente rotas sintéticas aplicáveis bem conhecidas dos versados na técnica ou uso de células cultivadas ou bactérias modificadas por técnicas de DNA recombinante (vide, por exemplo, Sambrook, J. e outros: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

PROPRIEDADES FÍSICQ-QUÍMICAS DE MATRIZ DE ESMALTE, DERIVADOS DE MATRIZ DE ESMALTE E PROTEÍNAS DE MATRIZ DE ESMALTE

Em geral, a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte são substâncias hidrófobas, isto é, solúveis em água, especialmente em temperaturas aumentadas. Em geral, estas proteínas são solúveis em valores de pH não fisiológicos e em uma temperatura inferior, tal como cerca de 4-20°C, enquanto elas agregarão e precipitar-se-ão em temperatura do corpo (35~37°C) e pH neutro. A matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte para uso de acordo com a invenção também incluem uma substância de esmalte ativa, onde pelo menos uma parte da substância de esmalte ativa está na forma de agregados ou após aplicação in vivo é capaz de formar agregados. 0 tamanho da partícula dos agregados está na faixa de cerca de 20 nm a cerca de 1 μιη. É contemplado que as propriedades de solubilidade da matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteinas de matriz de esmalte são de importância em conexão com a atividade profilática e terapêutica das substâncias. Quando a composição contendo a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte (no que se segue também referido "substância de esmalte ativa” como um termo comum) é administrada por exemplo a um ser humano, as substâncias proteináceas precipitarão devido ao pH que normalmente prevalece sob condições fisiológicas. Assim, uma camada de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteinas de matriz de esmalte é formada no sítio de aplicação e esta camada (que também pode ser uma camada molecular naqueles casos onde os agregados foram formados) é difícil de enxaguar sob condições fisiológicas. Adicionalmente, devido as propriedades bioadesivas das substâncias (vide a seguir) a camada precipitada é firmemente ligada ao tecido também na margem entre a camada precipitada e o tecido. A camada proteinácea assim cobre o tecido sobre o qual a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte ou composições da mesma foram aplicadas e as substâncias de esmalte ativo ou composições da mesma foram aplicadas e as substâncias de esmalte ativo são mantidas no local por um período de tempo prolongado, isto é, não é necessário administrar a{s) substância(s) ativa(s) com intervalos curtos.

Adicionalmente, a camada formada in situ pode quase ser comparada a uma atadura oclusiva, isto é, a camada formada protege o tecido sobre o qual a camada é formada das cercanias. No caso de um tecido de ferida, um tecido infectado ou um tecido inflamado, tal como uma camada protege o tecido de contaminação adicional de microorganismos presentes nas cercanias. Adicionalmente, a camada proteinácea pode exercer seu efeito por contato direto com o tecido ou com microorganismos presentes em/ou no tecido. A fim de permitir que uma camada proteinácea seja formada no local após aplicação pode ser vantajoso incorporar uma substância tampão apropriada ou composição cosmética da matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte; a finalidade de tal substância tampão seria evitar a dissolução da substância de esmalte ativa no sítio de aplicação. A matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte também foram observadas (pelos presentes inventores) como possuindo propriedades bioadesivas, isto é, elas possuem a capacidade de aderir à pele ou superfícies das mucosas. Estas propriedades são mais valiosas em conexão com o tratamento terapêutico e/ou profilático pelo menos pelas seguintes razões: - substância(s) profilática e/ou terapeuticamente ativas podem ser mantidas no sitio de aplicação por um período de tempo prolongado, por exemplo, i) a freqüência de administração pode ser reduzida, ii) um efeito de liberação controlada da substância ativa é obtido e/ou iii) um tratamento local no sitio de aplicação é aperfeiçoado) - as substâncias podem propriamente ser adequadas como veículos para outras substâncias profilática ou terapeuticamente ativas devido ao veículo contendo a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte podem ser formuladas como um veículo bioadesivo (isto é, um novo sistema de liberação de medicamento bioadesivo com base nas propriedades bioadesivas da matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte). TEORIAS COM RELRÇÃO AO MECANISMO DE AÇÃO A matriz de esmalte é um exemplo de uma matriz de proteína extracelular que adere as superfícies minerais, bem como as superfícies proteináceas. Em pH fisiológico e temperatura, as proteínas formam um agregado supra-molecular insolúvel (Fincham e outros em J. Struct. Biol. 1994 Março-Abril; 112(2): 103-9 e em J. Struct. Biol. 1995 Julho- Agosto; 115(1):50-9), que é gradualmente degradado por enzimas proteolíticas {ocorre tanto in vivo quanto in vitro contanto que as proteases não tenham sido sujeitas a inativação). A observação recente de que a matriz de esmalte é formada e temporariamente presente durante a formação de raiz e cimento de raiz pode explicar como a aplicação de matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte promovem a regeneração do tecido periodontal. Contudo, a observação subjacente a presente invenção é que a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte também tenham um efeito positivo na cura de imperfeições de tecido macio como a cura de ferida é surpreendente. 0 mesmo se aplica as observações com relação ao efeito antiinfeccioso e anti-inflamatório.

Em muitas espécies, fragmentos de matriz de esmalte são encontrados em coroa recentemente mineralizada quando um dente está apontando na cavidade oral. Pode ser questionado que um novo dente seria muito vulnerável ao ataque da bactéria a partir da bactéria oral comum, a menos que ele tenha uma proteção natural durante esta fase inicial. A aplicação de matriz de esmalte insolubilizante, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte com propriedades antibacterianas e/ou anti-inf lamatòrias em uma superfície ferida melhorará e aperfeiçoará a cura.

Conforme demonstrado na seção experimental aqui, a matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte ou agregados de proteína impedem o crescimento bacteriano por inibição de contato, enquanto as células expostas aparentemente alcançam a matriz de esmalte como um ambiente normal que suprime as respostas inflamatórias.

De acordo com a presente invenção, uma matriz de esmalte, derivado de matriz de esmalte e/ou proteína de matriz de esmalte podem ser usadas para fins curativos, bem como para fins preventivos. Adicionalmente, uma matriz de esmalte, derivado de matriz de esmalte e/ou proteína de matriz de esmalte podem ser usadas em conjunto com outras substâncias medicamentosas ativas, tais como, por exemplo, substâncias antibacterianas, anti-inflamatórias, antivirais, antífungos ou em combinação com fatores de crescimento, tais como, por exemplo, TGFP, PDGF, IGF, FGF, fator de crescimento de ceratinócito ou análogos de peptídeo do mesmo (acredita-se que EGF promova a cura por melhorar a migração e divisão de célula de células epiteliais; adicionalmente, EGF aumenta os números de fibroblastos em feridas resultando em produção de colágeno maior). Enzimas - tanto inerentemente presente na matriz de esmalte ou preparação dos mesmos ou adicionado - podem também ser usados em combinação com uma matriz de esmalte, derivado de matriz de esmalte e/ou proteína de matriz de esmalte, especialmente proteases. A preparação da substância de esmalte ativa é normalmente formulada como uma composição farmacêutica ou cosmética. Tal composição pode naturalmente consistir de preparação proteinácea ou ela pode compreender adicionalmente um excipiente farmacêutica ou cosmeticamente aceitável. Especialmente os excipíentes apropriados para uso nas composições farmacêuticas ou cosméticas são propileno glicol alginato ou ácido hialurônico ou sais ou derivados dos mesmos.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU COSMÉTICAS

Nos exemplos que se seguem, são fornecidas composições apropriadas contendo a(s) substância (s) de esmalte ativa. Dependendo do uso da substância de esmalte ativa, uma composição pode ser uma composição farmacêutica ou cosmética. No que se segue, o termo "composição farmacêutica" destina-se a englobar composições cosméticas, bem como composições pertencendo a área assim chamada cinza, entre os farmacêuticos e cosméticos, denominadas cosmeceuticas.

Para a administração a um animal {um animal ou ser humano), a matriz de esmalte, derivado de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte (no que se segue também denominadas "substância de esmalte ativa") e/ou uma preparação da mesma são formuladas em uma composição farmacêutica contendo a substância de esmalte ativa e, opcionalmente, um ou mais excipíentes farmaceuticamente aceitáveis.

As composições podem estar na forma de, por exemplo, composições sólidas, semi-sólidas ou fluidas, tais como, por exemplo, emplastros bioabsorviveis, ataduras, ataduras de hidrogel, ataduras hidrocolóides/ peliculas, espumas, folhas, bandagens, emplastros, dispositivos de liberação, implantes, pós, grânulos, cápsulas, agarose ou contas de chitosan, comprimidos, pilulas, pelotas, microcápsulas, microesferas, nanoparticulas, aspersões, aerossóis, dispositivos de inalação, géis, hidrogéis, pastas, ungüentos, cremes, sabões, supositórios, vagitórios, pasta de dente, soluções, dispersos, suspensões, emulsões, misturas, loções, enxágüe bucal, xampus, enemas, conjuntos contendo por exemplo dois recipientes separados, onde o primeiro dos recipientes contém a substância de esmalte ativa opcionalmente misturada com outra substância medicamentosa ativa e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis e o segundo recipiente contendo um meio apropriado destinado a ser adicionado ao primeiro recipiente, antes do uso a fim de obter uma composição pronta para uso; e em outras formas apropriadas, tais como, por exemplo, implantes, ou revestimentos para implantes ou na forma apropriada para uso em conexão com implante ou transplante.

Composições para aplicação à pele ou à mucosa são consideradas mais importantes em conexão com a presente invenção. Assim, uma composição compreendendo uma substância de esmalte ativa a ser administrada pode ser adaptada para administração por qualquer via apropriada, por exemplo, por administração tópica (dérmica), oral, bucal, nasal, aural, retal ou vagina ou por administração a uma cavidade do corpo tal como, por exemplo, uma raiz de dente ou canal de raiz de dente. Adicionalmente, uma composição pode ser adaptada para administração em conexão com cirurgia, por exemplo, em conexão com a incisão dentro do corpo, a fim de promover cura de feridas internas e danos ao tecido macio.

Conforme mencionado acima uma composição de substâncias de esmalte ativa pode ser apropriada para uso durante a cirurgia, por exemplo, para aplicação local (por exemplo na cavidade oral) na forma de gel, película ou pelota seca ou como uma solução de enxágüe ou tratamento com uma pasta ou creme no tecido ou superfícies para impedir ataque bacteriano. Em conexão com cirurgia ou implante na área do canal da raiz do dente, uma pasta para vedação da cavidade pode ser empregada.

As composições podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional, vide, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences” e "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology” editada por Swarbrick, J. & J. C. Boylan, Marcei Dekker, Inc., New York, 1988.

Conforme mencionado acima, a aplicação de uma composição compreendendo uma substância de esmalte ativa destina-se à pele ou mucosa. Outras aplicações podem naturalmente ser relevantes, tais como, por exemplo, aplicação em dentaduras, próteses, implantes e aplicação as cavidades do corpo, tais como oral, nasal e vaginal. A mucosa é preferivelmente selecionada de mucosa oral, bucal, nasal, aural, retal e vaginal. Adicionalmente, a aplicação pode ser em ou sobre a ferida ou outros danos ao tecido macio.

Adicionalmente, a aplicação dentro da área dental/odontologica é também de grande importância. Exemplos revelantes são aplicação as bolsas periodontais (dentais), a gengiva ou as feridas da gengiva ou outras feridas localizadas na cavidade oral, ou em conexão com a cirurgia oral. É adicionalmente antecipado que, devido as propriedades antibacterianas da substância de esmalte ativa descrita aqui, ela pode ser vantajosamente aplicada aos dentes ou raiz dos dentes para prevenção de cáries e/ou placa. Para sustentar este uso, foi demonstrado (Weinamann, J.P. e outros: Hereditary disturbances of enamel formation and calcification, J. Amer. Dent. Ass. 32:397-418, 1945; Sundell S, Hereditary amelogenesis imperfecta. Na epidermiological, genetic and clinicai study in a Swedish child population, Swed Dent J. Suppl. 1985; 31: 1-38) que os dentes que são desenvolvidos de modo imperfeito (amelogenesis imperfecta) e consequentemente contém grande quantidade de amelogeninas são marcantemente resistentes às cáries.

Uma composição farmacêutica compreendendo uma substância de esmalte ativa serve como um sistema de liberação de medicamento. No presente contexto, o termo "sistema de liberação de medicamento" denota uma composição farmacêutica (uma formulação farmacêutica ou uma forma de dosagem) que, mediante administração, apresenta a substância ativa ao corpo de um ser humano ou um animal. Assim, o termo "sistema de liberação de medicamento" engloba composições farmacêuticas planas, tais como, cremes, ungüentos, líquidos, pós, comprimidos, etc. bem como formulações mais sofisticadas tais como aspersões, emplastros, bandagens, ataduras, dispositivos, etc.

Fora a substância de esmalte ativa, uma composição para uso de acordo com a invenção pode compreender excipientes farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis.

Um excipiente farmacêutica ou cosmeticamente aceitável é uma substância que é substancialmente não perigosa ao indivíduo ao qual a composição será aplicada. Tal excipiente normalmente preenche os requisitos dados pelas autoridades de saúde. Farmacopéias oficiais tais como, a British Pharmacopoeia, a United States of Americana Pharmacopoeia e a European Pharmacopoeia estabeleceram padrões para os excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Quando um excipiente farmaceuticamente aceitável é apropriado para uso em uma composição farmacêutica, ele geralmente depende do tipo de forma de dosagem que é escolhido para uso em um tipo específico de feira. No que se segue, são dados exemplos de excipientes farmaceuticamente apropriados e aceitáveis para uso em tipos diferentes de composições para uso de acordo com a invenção.

No que se segue, é feita uma análise das composições farmacêuticas relevantes para uso de acordo com a invenção. A análise baseia-se na via específica de administração Contudo, é apreciado que naqueles casos onde um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser empregado em formas de dosagem diferentes ou composições, a aplicação de um excipiente farmaceuticamente aceitável não é limitada a forma de dosagem especifica ou de uma função específica do excipiente. A escolha do(s) excipiente(s) farmaceuticamente aceitável (eis) em uma composição para uso de acordo com a invenção e a ótima concentração do mesmo geralmente não pode ser prevista e deve ser determinada com base na avaliação experimental da composição final. Contudo, um versado na técnica de formulação farmacêutica pode guiar-se, por exemplo, na "Remington'S Pharmaceutical Sciences", 18a edição, Mack Publishing Company, Easton, 1990.

COMPOSIÇÕES TÓPICAS

Para aplicação à mucosa da pele, as composições para uso de acordo com a invenção podem conter convencionalmente veiculos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis incluindo microesferas e lipossomos.

As composições para uso de acordo com a invenção incluem todos os tipos de composições sólidas, semi-sólicas e fluidas. As composições de relevância especifica são, por exemplo, pastas, ungüentos, ungtientos hidrófilos, cremes, géis, hidrogéis, soluções, emulsões, suspensões, loções, revestimentos, xampus, geleias, sabões, bastões, sprays, pós, películas, espumas, almofadas, esponjas (por exemplo, esponjas de colágeno), almofadas, ataduras (tais como por exemplo, ataduras absorventes para feridas), bandagens, emplastros e sistemas de liberação transdérmica.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem incluir solventes, agentes de tamponamento, preservantes, umectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizantes, agentes de emulsão, agentes de suspensão, agentes de formação de gel, bases de ungüento, melhoradores de penetração, perfumes e agentes de proteção da pele.

Exemplos de solventes são, por exemplo, água, álcoois, óleos vegetais e marinhos, (por exemplo, óleos comestíveis como óleo de amêndoas, óleo de rícino, manteiga de cacau, óleo de coco, óleo de semente de algodão, óleo de semente de linho, óleo de oliva, óleo de palma, óleo de amendoim, óleo de semente de papoula, óleo de semente de colza, óleo de gergelim, óleo de soja, óleo de girassol) óleos minerais, óleos graxos, parafina líquida, polietileno gi icóis, propileno glicóis, polialquilsiloxanos líquidos e misturas dos mesmos.

Exemplos de agentes de tamponamento são, por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido hidrogenfosfórico, dietilamina, etc.

Exemplos apropriados de preservantes para uso nas composições são parabenos, tais como, metil, etil, propil p-hidroxibenzoato, butilparabeno, isobutilparabeno, isopropilparabeno, sorbato de potássio, ácido sórbico, ácido benzóico, benzoato de metila, fenoxietanol, bronopol, bronidox, MDM hidrantoina, butílcarbamato de iodopropinil, EDTA, cloreto de benzalcônio e álcool benzílico ou misturas de preservantes.

Exemplos de umectantes são glicerina, propileno glicol, sorbitol, ácido láctico, uréia e misturas dos mesmos.

Exemplos de agentes quelantes são EDTA de sódio e ácido cítrico.

Exemplos de antioxidantes são anisol hidróxi butilado (BHA.) , ácido ascórbico e derivados dos mesmos, tocofereol e derivados dos mesmos, cisteína e misturas dos mesmos.

Exemplos de agentes emulsificantes são gomas que ocorrem naturalmente, por exemplo, goma acácia ou goma tragacanto; fosfatídeos que ocorrem naturalmente, por exemplo, lecitina de soja; derivados de monooleato de sorbitan; gorduras de lã; álcoois de lã; ésteres de sorbitan; monoglicerideos; álcoois graxos; ésteres de ácido graxo (por exemplo, triglicerídeos de ácidos graxos) e misturas dos mesmos.

Exemplos de agentes de suspensão são, por exemplo, celuloses e derivados de celulose, tais como, por exemplo, carboximetil celulose, hidroxietilcelulose, hidropropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carragenan, goma acácia, goma arábica, tragacanto e misturas dos mesmos.

Exemplos de bases gel, agentes de aumento de viscosidade ou componentes que são capazes de absorver exudado de uma ferida são: parafina líquida, polietileno, óleos graxos, sílica coloidal ou alumínio, sabões de zinco, glicerol, propileno glicol, tragacanto, polímeros de carboxivinila, silicatos de magnésio-alumínio, Carbopol®, polímeros hidrófilos, tais como, por exemplo, amido ou derivados de celulose, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose e outros derivados de celulose, hidrocolóides umectáveis em água, carragenans, hialuronatos (por exemplo, gel de hialuronato opcionalmente contendo cloreto de sódio) e alginatos incluindo alginato de propileno glicol.

Exemplos de bases de ungüento são por exemplo, cera de abelha, parafina, cetanol, palraitato de cetila, óleos vegetais, ésteres sorbitan de ácidos graxos (Span), polietileno glicóis e produtos de condensação entre ésteres de sorbitan de ácidos graxos e óxido de etileno, por exemplo, monooleato de polioxietileno sorbitan (Tween)» Exemplos de bases de ungüento hidrófobas ou de emulsificação em água são parafinas, óleos vegetais, gorduras animais, glicerídeos sintéticos, ceras, lanolina e polialquilssiloxanos líquidos.

Exemplos de bases de ungüento hidrófilas são macrogóis sólidos (polietileno glicóis).

Outros exemplos de bases de ungüento são sabões trietanolamina, álcool graxo sulfatado e polissorbatos.

Exemplos de componentes em pó são: alginato, colágeno, lactose, pó que é capaz de formar um gel quando aplicado a uma ferida (absorve liquido/exudado da ferida). Normalmente, os pós que destinam-se a aplicação em feridas grandes abertas devem ser estéreis e as partículas presentes devem ser micronizadas.

Exemplos de outros excipientes são polímeros, tais como, carmelose, carmelose de sódio, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, pectina, goma xantana, goma de feijão locust, goma acácia, gelatina, carbomer, emulsificantes como citamina E, estearato de glicerila, glucosídeo de cetanila, colágeno, carragenan, hialuronatos e alginatos e citosanos.

Ataduras e/ou bandagens são também sistemas de liberação importantes para uma substância de esmalte ativa. Quando as ataduras são suadas na forma de dosagem, a substância de esmalte ativa pode ser administrada com outro material/ingrediente antes ou durante a fabricação da atadura ou, a substância de esmalte ativa pode, de algum modo, ser revestida na atadura, por exemplo, por imersão da atadura em uma solução ou dispersão de substância de esmalte ativa ou por aspersão da solução ou dispersão de substância de esmalte ativa na atadura. Alternativamente, a substância de esmalte ativa pode ser aplicada na forma de um pó à atadura. As ataduras podem estar na forma de ataduras de ferida absorventes para aplicação aos exudados da ferida. As ataduras podem também estar na forma de ataduras hidrogel (por exemplo, polímeros reticulados, tais como, Intrasite® que contém carboximetilcelulose, propileno glicol ou polissacarídeo, dissacarídeo e proteínas} ou na forma de ataduras oclusivas, tais como, por exemplo, alginatos, chitosan, película de poliuretano hidrófila, folhas de colágeno, placas, pós, espumas, ou esponja, espumas (por exemplo, poliuretano ou silicone), hidrocolóides (por exemplo, carboximetilcelulose, CMC), colágeno e ataduras a base de ácido hialurônico incluindo combinações das mesmas.

Alginato, chitosan e ataduras hidrocolóides absorvem o exudado da ferida quando colocados sobre a ferida. Em se fazendo isto, eles produzem um gel aquoso sobre a superfície da ferida e este gel, acredita-se, seja benéfico para a cura da ferida devido a retenção de umidade na ferida. É também previsto que a substância de esmalte ativa pode ser incorporada em um adesivo de tecido também compreendendo, por exemplo, fibrinogeno e trombina e opcionalmente Fator XIII ou outro fator de coagulação de plasma para prover hemostase. 0 adesivo de tecido ode tanto ser preparado como uma premix de substância de esmalte ativa, fibrinogeno e opcionalmente Fator XIII, trombina sendo adicionada à premix imediatamente antes do tecido adesivo se aplicado à ferida. Alternativamente, a premix de fibrinogeno e a substância de esmalte ativa e opcionalmente o Fator XIII podem ser aplicados na ferida antes da aplicação de trombina. No local, a trombina converte fibrinogeno em fibrina para, desta forma, reproduzir o processo de coagulação ocorrendo naturalmente na cura da ferida. A presença da substância de esmalte ativa no adesivo de tecido pode servir para acelerar o processo de cura da ferida conforme discutido acima. Um produto comercial apropriado para inclusão da substância de esmalte ativa é Tisseel®, um vedante de fibrina de dois componentes produzido pela Immuno, AG, Vienna, Áustria.

Em uma formulação de pasta de dente ou formulação para enxágüe bucal ou outra formulação para aplicação aos dentes ou raiz do dente, a substância de esmalte ativa pode tanto estar presente em um estado dissolvido em um veiculo de pH ligeiramente ácido ou como uma dispersão em um veículo de pH neutro. É antecipado que em uso a substância de esmalte ativa pode formar uma camada protetora sobre a superfície dos dentes, pelo que impedindo a anexação de bactérias que produzem cáries (conforme exemplo 4 a seguir). Em tais preparações de cuidado dental, a substância de esmalte ativa pode ser formulada juntamente com um ou mais outros compostos que possuem um efeito preventivo sobre as cáries, notavelmente flúor ou outro elemento de traço, tal como, vanádio ou molibdênio. Em pH neutro, o elemento de traço acredita-se seja ligado a (por exemplo, por ligações de íon) ou embutido na substância de esmalte ativo a partir da qual ele é liberado para exercer seu efeito preventivo de cáries, quando a substância de esmalte ativo é dissolvida em um pH de cerca de 5,5 ou menos, devido a produção de ácido pelas bactérias que produzem a cárie.

As composições mencionadas acima para administração tópica são mais adequadamente para aplicação diretamente às feridas ou elas podem ser apropriadas par aplicação a ou para introdução nos orifício(s) relevante(s) do corpo, por exemplo, reto, uretra, vagina, aura, nasal, ou oral. A composição pode simplesmente ser aplicada diretamente à parte a ser tratada, tal como, por exemplo, sobre a mucosa, ou por qualquer via de administração conveniente.

Composições que provaram ser de importância em conexão com a aplicação tópica são aquelas que possuem propriedades tixotrópicas, isto é, a viscosidade da composição é afetada por exemplo, por agitação, de modo que a viscosidade da composição na hora da administração pode ser reduzida e quando a composição tiver sido aplicada, a viscosidade aumenta, de modo que a composição permanece no sitio de aplicação.

COMPOSIÇÕES PARA USO ORAL Qü PARA APLICAÇÃO À MUCOSA OU PELE

Composições apropriadas para uso de acordo com a invenção podem também ser apresentadas na forma de suspensões, emulsões ou dispersões. Tais composições contém a substância de esmalte ativa em mistura com um agente de dispersão ou umectante, agente de suspensão, e/ou um ou mais preservantes e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições podem também ser apropriadas para uso na liberação de uma substância de esmalte ativa a por exemplo, uma mucosa intacta ou danificada tal como, oral, bucal, nasal, retal ou vaginal ou para administração a pele intacta ou danificada, ou feridas.

Agentes de dispersão ou umectação apropriados são, por exemplo, fosfatideos que ocorrem naturalmente, por exemplo, lecitina, ou lecitina de soja; produtos de condensação de óxido de etileno, com por exemplo, ácido graxo, um álcool alifático de cadeia longa, ou um éster parcial derivado de ácidos graxos, e um hexitol ou anidrido de hexitol, por exemplo, estearato de políoxíetileno, monooleato de polioxietileno sorbitol, monooleato de polioxietileno sorbitan, etc.

Agentes de suspensão apropriados são, por exemplo, gomas que ocorrem naturalmente, tais como, por exemplo, goma acácia, goma xantana, ou goma tragacanto; celuloses, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, celulose microcristalina (por exemplo, Avicel® RC 591, metilcelulose); alginatos e chitosans, tais como, por exemplo, alginato de sódio, etc.

Exemplos apropriados de preservantes para uso nas composições de acordo com a invenção são os mesmos que os mencionados acima.

Composições para uso de acordo com a invenção podem também ser administradas por via oral. Composições orais apropriadas podem estar na forma de uma formulação em partículas ou na forma de uma forma de dosagem sólida, semi-sólida ou fluida.

Composições para uso oral incluem formas de dosagem sólida, tais como, por exemplo, pós, grânulos, granulados, sachets, comprimidos, cápsulas, comprimidos efervecentes, comprimidos mastigáveis, pastilhas, comprimidos de liberação intermediária e comprimidos de liberação modificada, bem como formulações fluidas ou líquidas, tais como, por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, dispersões e misturas. Adicionalmente, a composição pode estar na forma de pós, pós dispersáveis ou grânulos apropriados para preparação de uma suspensão aquosa por adição de um meio líquido, tal como, por exemplo, um meio aquoso.

Com relação as formas de dosagem sólida para uso oral ou tópico, uma composição para uso de acordo com a invenção contém normalmente a substância de esmalte ativa e qualquer substancia adicionalmente ativa, opcionalmente em mistura com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes ou cargas, tais como, sacarose, sorbitol, açúcar, manitol, celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, lactose, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e desintegração, por exemplo, derivados de celulose incluindo celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, croscarmelose de sódio, alginatos ou ácido alginico e chitosans; agentes de ligação, por exemplo, sucrose, glucose, sorbitol, acácia, ácido alginico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pregelatinizado, celulose microcristalina, silicato de magnésio sódio, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, etilcelulose, polivinilpirrolidona, polivinilacetato ou polietileno glicol e chitosans; agentes de lubrificação incluindo gluidantes e antiadesivos, por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados ou talco.

Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, umectantes, agentes de tamponamento, etc.

Naqueles casos onde a composição farmacêutica está na forma de uma dosagem sólida ou dosagem unitária (por exemplo um comprimido ou cápsula), a forma de dosagem unitária pode ser provida com um revestimento como um ou mais revestimentos mencionados acima.

Naqueles casos onde a composição está na forma de um comprimido, cápsula ou uma composição unitária múltipla, a composição ou unidades individuais ou um comprimento ou cápsula contendo as unidades individuais pode ser revestida por exemplo, com revestimento de açúcar, uma película de revestimento (por exemplo, com base em hidroxipropil metilcelulose, metilcelulose, metil hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, copolímeros de acrilato (eudragit), polietileno glicóis e/ou polivinilpirrolidona) ou um revestimento entérico (por exemplo, com base no copolímero de ácido metacrílico (eudragit), ftalato de acetato de celulose, hidroxipropil metilcelulosfe ftalato, succínato acetato de hidroxipropil metilcelulose, ftalato de acetato de polivinila, shellac e/ou etilcelulose). Adicionalmente, um material de retardo de tempo, tal como, por exemplo, monoestearato glicerila ou diestearato de glicerila pode ser empregado.

COMPOSIÇÕES RETAIS E/OU VAGINAL

Para aplicação à mucosa retal ou vaginal, composições apropriadas de acordo com a invenção incluem supositórios (emulsões ou tipo de suspensão) enemas, e cápsulas de gelatina retal (soluções ou suspensões). Bases de supositôrio farmaceuticamente apropriadas aceitáveis incluem manteiga de cacau, ácidos graxos esterificados, gelatina glicerinada e várias bases solúveis em água ou dispersáveis como polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo polioxietileno sorbitan. Vários aditivos como por exemplo, melhoradores ou tensoativos podem ser incorporados.

COMPOSIÇÕES NASAIS

Para aplicação à mucosa nasal (bem como à mucosa oral), sprays e aerossóis para inalação são composições apropriadas de acordo com a invenção. Em uma composição nasal critica, a substância de esmalte ativa está presente na forma de uma formulação em partículas opcionalmente dispersa em um veículo apropriado. Os veiculos farmaceuticamente aceitáveis e excipientes e opcionalmente outros materiais farmaceuticamente aceitáveis presentes na composição, tais como, diluentes, melhoradores, agentes aromatizantes, preservantes, etc. são todos selecionados de acordo com a prática farmacêutica convencional, em uma maneira entendida pelos versados na técnica de formulações farmacêuticas. DOSAGENS DE MATRIZ DE ESMALTE, DERIVADOS DE MATRIZ DE ESMALTE E PROTEÍNAS DE MATRIZ DE ESMALTE Em uma composição farmacêutica para uso de acordo com a invenção sobre a pele ou mucosa, uma substância de esmalte ativa está geralmente presente em uma concentração variando de cerca de 0,01% a cerca de 99,9% peso/peso. A quantidade da composição aplicada normalmente resultará em uma quantidade de proteína total por cm2 de área de ferida/pele/tecido correspondendo a cerca de 0,01 mg/cm2 a cerca de 20 mg/cm2 tal como de cerca de 0,1 mg/cmz a cerca de 15 mg/cm2. A quantidade aplicada da composição depende da concentração da substância de esmalte ativa na composição e da razão de liberação da substância de esmalte ativa da composição, porém geralmente está na faixa correspondendo a no máximo cerca de 15-20 mg/cm2.

Nos casos onde a substância de esmalte ativa é administrada na forma de uma composição fluida, a concentração da substância de esmalte ativa na composição está na faixa correspondendo a cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/ml. Concentrações maiores são desejáveis em alguns casos, e podem também ser obtidas tal como concentração de pelo menos cerca de 100 mg/ml.

Quando a composição é aplicada à cavidade oral, as doses que se seguem são relevantes: Áreas de defeito experimental (em macacos) na cavidade oral tipicamente possuem um tamanho de cerca de 4 x 2 x 5-6 mm correspondendo a 50 μg ou cerca de 0,025 a cerca de 0,15 mg de proteína total/mm2 ou cerca de 2,5-15 mg/cm2. Geralmente até 0,5 tal como, por exemplo, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1 ml de uma composição possuindo uma concentração total de cerca de 1-40 mg/ml, tal como, por exemplo, 5-30 mg/ml é aplicada. Áreas de defeitos em seres humanos na cavidade oral e devido a doenças periodontais tipicamente possuem um tamanho de cerca de 5-10 x 2-4 x 5-10 mm correspondendo a cerca de 200 μΐ e normalmente na maioria cerca de 0,5-1 ml tal como cerca de 0,2-0,3 ml por dente é aplicado de uma composição contendo uma concentração de cerca de 1-40 mg de proteína total/ml, tal como, por exemplo, 5-30 mg/ml são aplicados. 0,2-0,3 mg/ml correspondem a cerca de 6 mg de proteína por 25-100 mm2 ou cerca de 0,1 mg/mm2 se calculado apenas na superfície da raiz. Normalmente, um volume excessivo é aplicado para permitir cobertura de todas as superfícies. Mesmo uma camada múltipla apenas necessitaria de uma pequena fração das quantidades mencionadas acima.

Geralmente, cerca de 0,1-0,5 ml tal como, por exemplo, cerca de 0,15-0,3 ml ou cerca de 0,25-0,35 ml de uma composição compreendendo a substância de esmalte ativa é aplicada em volumes de defeito na extração alveolar (orifícios após extração dos dentes). A concentração da substância de esmalte ativa na composição é normalmente de cerca de 1-40 mg de proteína total/ml, tal como, por exemplo, 5-30 mg/ml. Quando 0,3-0,4 ml é aplicado de tal composição ao dente, este volume corresponde a cerca de 0,1 mg/cm2 {alvéolo calculado como cilindro com raio de 5 mm e altura de 20 mm). A concentração da substância de esmalte ativa em uma composição farmacêutica depende na substância de esmalte específica, sua potência, a gravidade da doença a ser prevenida ou tratada e a idade e condição do paciente. Processos apropriados para selecionar concentrações relevantes de substância de esmalte ativa na composição farmacêutica são bem conhecidas dos versados e podem ser realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas para normas da boa prática clínica (GCP) ou Investigational New Drug Exemption (IND) conforme descrito, por exemplo, no International Standard ISSO/DIS 14155 Clinicai Investigation of medicai devices, 1994, and ICH {International Coromittee for Harmonisation): Harmonised tripartite guideline for good clinicai practice, Brookwood Medicai Publications, Ltd, Surrey, UK, 1996. Um versado na técnica será capaz, utilizando os processos descritos nos livros padrão, diretrizes e normas conforme descritas aqui, bem como conhecimento geral no campo, ser capaz de selecionar o regime de dosagem exato a ser implementado para qualquer substância de esmalte ativa e/ou selecionada de outras substâncias ativas e forma de dosagem usando meramente procedimentos de experimentação de rotina.

Em outros aspectos a invenção refere-se aos processos para i) prevenção e/ou tratamento de feridas, ii) diminuição da infecção e iii) prevenção e/ou tratamento da inflamação, os processos compreendendo administração ao mamífero que necessite de tal tratamento, de uma quantidade eficaz de uma substância de esmalte ativa.

Conforme será entendido, detalhes e particulares relacionados ao uso de uma substância de esmalte ativa para a prevenção e/ou tratamento de ferida serão os mesmos ou análogos aos detalhes e particulares concernentes aos outros aspectos de uso (aspectos antibacteriano e anti-inflatório) e os aspectos do processo discutido acima e isto significa que se apropriado, as declarações acima relacionadas a uma substância de esmalte ativa, uma preparação contendo uma substância de esmalte ativa, uma composição farmacêutica contendo uma substância de esmalte ativa, preparação de i) uma substância de esmalte ativa, ii) uma preparação contendo uma substância de esmalte ativa, iii) uma composição farmacêutica contendo substância de esmalte ativa/ bem como propriedades aperfeiçoadas e usos relacionados a todos os aspectos da invenção. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção é adicionalmente revelada com referência aos desenhos apensos onde: A figura 1 é um gráfico mostrando síntese de DNA em células PDL de seres humanos estimuladas com EMD ou células não estimuladas; A figura 2 é um gráfico mostrando produção TGF-βΙ em células PDL humanas estimuladas com células EMD e não estimuladas; A figura 3 é um desenho esquemático de uma câmara de fluxo e sistema de computador usados no experimento de fluxo descrito nos Exemplos 3 e 4 a seguir;

As figuras 4, 5 e 6 são gráficos mostrando os resultados de três experimentos separados mostrando a anexação de Actinomyces viscosus às placas de vidro tratadas com EMD e ácido acético/ respectivamente;

As figuras 7, 8 e 9 são gráficos mostrando os resultados de três experimentos separados mostrando a anexação de Streptococcus mutans às placas de vidro tratadas com EMD e ácido acético, respectivamente. A figura 10A é uma fotografia de raio-x mostrando dano pós-operatórios seguindo remoção de um dente ciso; e A figura 10B é uma fotografia de raio-x mostrando a regeneração do ligamento periodontal seguindo tratamento com EMD conforme descrito no Exemplo 12 a seguir. SEÇÃO EXPERIMENTAL Materiais e Processos Derivado de Matriz de Esmalte, EMDOGAIN®, da BIORA AB, S-205 12 Malmõ, Suécia, contendo 30 mg de proteína de Matriz de Esmalte seca em congelamento (no que se segue abreviado para EMD) e 1 ml de Solução de Veículo (Propileno Glicol Alginato) que são misturados antes da aplicação, a menos que a proteína e o veículo sejam testados separadamente. A razão em peso é de cerca de 85/5/10 entre os picos de proteína principais a 20, 14 e 5 kDa, respectivamente. EMD tratado com calor é EMD que foi aquecido por 3 horas a cerca de 80°C a fim de inativar as proteases residuais.

Proteína amelogenina 20 kDa e Peptídeo Amelogenina Rico em Tirosina (TRAP) 5 kDA foram isolados de EMD usando cromatografia de permeação de gel HPLC (TSK G-2000 SW equilibrada com 30% de acetonitrila em 0,9% NaCl) e purificada por cromatografia de fase inversa (Pro-RPC, HR 5/10, Pharmacia-Upjohn, Suécia) usando um gradiente de acetonitrila. Os polipeptídeos/proteína separados foram então adicionados em várias quantidades à Solução de Veículo de EMDOGAIN® a menos que testados separadamente. Ácido hialurônico era HMT-0028 (MW 990.000) da Seikagaku Corporation, Tóquio, Japão.

Bactéria e levedura foram todas primariamente isoladas de pacientes, classificadas por propriedades metabólicas e antigênicas de acordo cora os procedimentos padrão. As espécies de bactéria e a levedura usadas são listadas na tabela a seguir.

Albumina de Soro (bovina) e Colágeno Tipo 1 (bovino) foram ambos obtidos da Sigma, St. Louis, USA.

As placas de agar eram todas "Brain Hart Infusion agar" da Difco suplementadas com células sangüineas vermelhas humanas (100 ml por litro de agar). EXEMPLOS EXEMPLO 1 Proliferação de Célula e Produção de TGF-βΙ nas Células PPL

Tratadas com EMDOGAIN® Uma solução de estoque de EMD foi preparada por dissolução de uma ampola (contendo 30 mg de EMD) em 3 ml de HAc estéril, filtrado a 0,1%. 60 μΐ da solução de estoque de EMD foram adicionados a 6000 μΐ de Meio de Eagle Modificado da Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal e 1% de uma solução de penicilina-estreptomicina. 300 μΐ da mistura foram adicionados a cada poça das placas de microtitulação de 96 poças (NUNC A/S, Dinamarca, Cat. Número 167008) . 1000 células de ligamento periodontal (PDL) (obtidas dos tecidos periodontais humanos saudáveis de indivíduos sofrendo extrações de premolares por razões ortodônticas, e cultivados substancialmente conforme descrito em Somerman e outros, J. Dental Res. 67, 1988, páginas 66-70) foram adicionados a cada poça e incubados a 37°C, 5% CO2 por 5 dias. Células PDL usadas como controle foram cultivadas em um Meio Eagle Modificado da Dulbecco substancialmente conforme descrito acima, porém na ausência de EMD.

Após incubação, as células foram submetidas a um imunoensaio de proliferação de célula medindo a incorporação de 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim, Cat. Número 1647 229). Neste procedimento, BrdU é incorporado ao invés de timidina no DNA de células em crescimento. A incorporação de BdrU é detectada por ensaio ELISA, e a quantidade de BrdU medida no ensaio é uma indicação da razão de síntese de DNA e consequentemente a razão da proliferação de células das células PDL.

Os resultados aparecem da figura 1 mostrando que as células PDL cultivadas em presença de EMD exibem uma razão significativamente maior de proliferação do que as células PDL cultivadas em ausência de EMD. À 100 μΐ de sobrenadante de célula da placa de microtitulação foram adicionados 20 μΐ de IN HC1 seguido por incubação por 10 minutos em temperatura ambiente. A mistura de incubação foi neutralizada com 20 μΐ de IN NaOH/0,5 M HEPES. 100 μΐ desta mistura foram adicionados a 400 μΐ de um tampão de diluição. 200 μΐ da diluição foram submetidos ao ELISA usando o kit Quantikines® (Cat. Número DB100) disponível da R&D Systems, Reino Unido, de acordo com as instruções do fabricante.

Os resultados são mostrados na figura 2, mostrando um aumento pronunciado na produção de TGF-βΙ nas células PDL incubadas com EMD em relação as células PDL não incubadas com EMD. EXEMPLO 2 Investigação do Crescimento de Microorganismos em Presença dos Derivados de Matriz de Esmalte e Proteína de Matriz de Esmalte A finalidade deste exemplo é demonstrar a influência de inibição dos derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte no desenvolvimento microbiano in vitro.

As proteínas usadas neste exemplo foram dissolvidas em salmoura tamponada com fosfato (PBS) com pH ajustado para 5,5 com ácido acético. Os micróbios empregados foram suspensos em PBS pH 6,8 a uma concentração final possuindo um OD60o de 0,4. 50 microlitros de EMDOGAIN® (30 mg de EMD em 1 ml de PGA) e 50 microlitros de EMD, EMD tratado com calor, frações de EMD A, B, C e H (todas com 10 mg de proteína por ml de tampão PBS) foram pingados sobre uma· placa agar e deixados secar ao ar na placa superior da placa (9 cm de diâmetro, agar padrão para determinação de suplementos adicionados para resistência conforme necessário pelos micróbios individuais). Uma suspensão homogênea de micróbios (1 ml, ODZ8o = 0,5) foi então adicionada por espalhamento da solução na parte superior das placas de agar, e as placas foram incubadas a 35°C por 3 dias (culturas aeróbicas) ou 14 dias (culturas anaeróbicas) em uma atmosfera enriquecida com CO2 ou sob condição aneróbica de acordo com os requisitos de crescimento individuais. Todas as culturas foram inspecionadas diariamente. Colágeno tipo 1 e albumina de Soro (ambos bovinos) foram testados sob as mesmas condições de controle. Propilenoglicolalginato não diluído (veículo PGA-EMD), tampão PBS e ácido hialurônico (HÁ - veiculo EMD alternativo) foram também aplicados como controles negativos.

Os resultados são mostrados na Tabela 1. Apenas os derivados de matriz de esmalte ou proteínas de matriz de esmalte ou derivados inibiram o desenvolvimento de determinados micróbios. Não houve sinal de zonas de difusão ao redor da proteína, indicando que as proteínas EMD aplicadas agregaram-se à superfície de agar e que apenas micróbios em contato direto com as proteínas foram inibidos no crescimento. Quando as amostras foram colhidas das zonas de inibição e cultivadas no meio líquido (caldo LB com suplementos) mono-culturas de micróbios originais seriam revividas sugerindo que as proteínas ativas não são microbiocidas. Todos os controles testados eram negativos indicando que nenhum mecanismo não específico influenciou os resultados. TABELA 1 Desenvolvimento (+/-) Na parte Superior da Substância de Teste Fração A de EMD: a maior parte de amelogenina -26-20 kDa, Fração B de EMD: -17=13 kDa proteínas Fração C de EMD = -10-5 kDa pepetídeos Fração H de EMD = todas as proteínas em EMD acima de 27 kDa de peso molecular. + indica desenvolvimento normal de micróbios, - indica desenvolvimento de micróbios totalmente inibido, + /- indica alguma inibição de desenvolvimento quando comparado aos controles negativos.

Todos os resultados na tabela são registrados no segundo dia (culturas aeróbicas) ou após cindo dias (culturas anaeróbicas) de incubação.

Estes resultados mostram que EMD continha proteínas ou peptídeos, quando deixado agregar-se a uma superfície, pode inibir o desenvolvimento de determinados bastões gram negativos e alguns cocci gram positivos. Com base nas características comportamentais básicas de proteínas EMD (ref. Jpc) e uma vez que o efeito não é microbiocida, uma explicação razoável para o efeito observado é que os agregados de proteína formam barreira que separa os micróbios do substrato(s) de desenvolvimento necessários. EXEMPLO 3 Efeito de EMD na Razão de Anexação de Actinomyces viscosus in vitro O efeito de EMD na anexação inicial de Actinomyces viscosus, um organismo oral que ocorre amplamente na placa dentária, porém comumente não é considerado como estando associado a periodontite grave, foi explorado. Embora este organismo possa formar agregados com Porphyromonas gingivalis e pode assim ter uma influência sobre a colonização da superfície da raiz com patogens periodontais em potencial, Actinomyces spp são encontrados em proporções relativamente grandes em sítios subgengivais saudáveis (estas verificações corroboram com aquelas de Liljemark e outros, Microbiol. Immunol. 8, 1993, páginas 5-15, que verificaram que, seguindo o tratamento periodontal, as proporções de Actinomyces spp. eram significativamente aumentadas. Haffajee e outros, J, Clin. Periodont. 24, 1997, páginas 767-776, concluiu das contagens microbiológicas na placa subgengival, que em indivíduos com uma boa resposta ao tratamento periodontal inicial A. viscosus e T. denticola eram relativamente abundantes.

MATERIAIS

Actinomyces viscosus HG85 foi provido pelo Dr. A . J. van Winkelhoff (Dept. of Roral Microbiology, ACTA) . Emdogain® foi provido por BIORA (Malmõ, Suécia). Detergente RBS foi adquirido da Fluka (Fluka Chemie AG, Buch, Suiça). DESENVOLVIMENTO BACTERIANO E COLHEITA A. viscosus foi incubado de placas agar sangüineas em cultura de batelada em meio de caldo de Schaedler por 24 horas a 37°C. Esta cultura foi usada para inocular uma segunda cultura no caldo de Schaedler que cresceu por 16 horas. As células foram colhidas por centrifugação (5 minutos a 6500 x g) e lavadas duas vezes com água desmineralizada. Subseqüentemente, microorganismos foram sonicados por 20 segundos a 30 W (Vibra cell modelo 375, Sonics and materiais Inc., Danbury, CT, USA) para romper as cadeias bacterianas e agregados. A sonicação foi realizada intermitentemente, enquanto resfriando em um banho com gelo e água. As células foram contadas por utilização de um contador de célula Bürker-Türker. Finalmente, A. viscosus foi suspenso em tampão de adesão (2 raM de fosfato de potássio, 50 mM de cloreto de potássio e 1 mM de cloreto de cálcio, pH 6,8). REVESTIMENTO DE PLACAS DE VIDRO Placas de vidro foram limpas completamente por sonicação em detergente 5% RBS, enxágüe extensivo com água de torneira, lavagem eia metanol e finalmente enxágüe com água destilada. Este procedimento rende um ângulo de contato de água de zero graus. EMD foi dissolvido em 0,01 M de ácido acético em uma concentração de 7,5 mg/ml. As placas de vidro foram divididas em duas metades por uso de marcador teflon (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca). Ácido acético (0,01 M) foi aplicado a um local; 250 μg de EMD a outro. As placas de vidro foram secas ao ar em um gabinete de fluxo por 4-6 horas.

EXPERIMENTO DE FLUXO A câmara de fluxo e o sistema de computação usados neste experimento são mostrados esquematicamente na figura 3. Antes de cada experimento, todos os tubos e a câmara de fluxo foram enchidos com tampão de adesão, sendo tomado cuidado de modo que o sistema não contivesse bolhas de ar. As placas de vidro revestidas formaram-se na parte inferior da câmara de fluxo. A razão de fluxo foi estabelecida em 2,5 ml/min (que é comparável a razão de fluxo médio de saliva em seres humanos). A suspensão bacteriana foi circulada através do sistema por aproximadamente 3-4 horas e o número de bactérias aderindo ao substrato foi contado. Três experimentos independentes foram realizados. Todos os experimentos foram realizados com 3xl08 células por 250 ml de tampão de adesão. Durante o experimento, as imagens foram tomadas a cada 10-15 minutos em 6 sitios predeterminados sobre ambas as placas de controle de revestidas com EMD. A altura do canal da câmara de fluxo paralelo foi de 0,6 mm.

ANÁLISE DE DADOS

Após contagem das células de adesão em todas as imagens, os dados foram transformados para bactérias por centímetro quadrado. Para cada experimento, o número final de microorganismos por cm2 foi usado para análise estatística (teste Studenfs t, para observações emparelhadas usando n como o número de experimentos).

RESULTADOS

Experimento 1 (figura 4) mostrou um aumento gradual na quantidade de microorganismos anexados especialmente durante os primeiros 150 minutos de fluxo. Após este intervalo de tempo, o número de microorganismos anexados ao EMD tinha alcançado um platô de 2,0 x 106 bactérias por cm2 que foi cerca de 4 vezes mais alto do que no aspecto tratado com ácido acético da placa de vidro.

Também no experimento 2 (figura 5), EMD estimulou dramaticamente a anexação de A. viscosus ao substrato. Contudo, no começo do experimento, o feito era menos claro. Talvez isto seja devido a uma densidade mais baixa dos organismos usados no sistema de fluxo. Após 90 minutos o número de anexação de bactéria ao EMD aumentou gradualmente em relação ao controle, alcançando um máximo de 1,4 x 106 por cm2 após 3 horas, um aumento de três vezes. O terceiro experimento (figura 6) mostrou um estímulo de aderência de A. viscosus ao revestimento EMD já após 5 minutos de fluxo. EMD induziu um rápido aumento no número de organismos anexados durante os primeiros 45 dias. Após isto, a anexação continuou progressivamente. Anexação ao lado tratado com ácido acético mostrou um padrão semelhante, porém com menos aderência de microorganismos. Após 200 minutos, anexação ao revestimento de EMD era duas vezes maior do que na superfície tratada com ácido acético.

Nos três experimentos, tomados juntos, a diferença provou ser estatisticamente significante (p < 0,05).

Dos resultados, parece que EMD, usado como um revestimento sobre a superfície de vidro, tem um efeito estimulador considerável in vitro na anexação de A viscosus. Embora ainda não seja sabido quais fatores são responsáveis por esta anexação inicial melhorada, presume-se que o organismo interaja com os resíduos de prolina que estão rícamente presentes no componente de amelogenina da mistura de proteína disponível comercialmente. Adesão bacteriana é freqüentemente determinada por reconhecimento de proteína-peptídeo e lectina-carbohidrato específico. Sabe-se que A. viscosus, com suas fímbrias do tipo 1, pode ligar às proteínas ricas em prolina, como Proteínas Ricas em Prolina salivares (PRPTs) e colágenos do tipo I e III.

Interações específicas entre EMD e determinados microorganismos orais podem ter conseqüências importantes para a composição da biopelícula na cavidade oral, uma vez que a ecologia da placa pode alterar. Se mudanças ecológicas pudessem ser feitas na direção de promoção de organismos, não associados à doença periodontal, aplicação de EMD pode resultar no aperfeiçoamento da condição periodontal, apenas por aquela ação. Isto naturalmente está fora dos outros efeitos benéficos de EMD. EXEMPLO 4 Efeito de EMD na Razão de Anexação de Streptococcus mutans in vivo INTRODUÇÃO

Existe uma grande evidência para um papel causativo de organismos de placa na patogenese de doenças orais como periodontite e cárie. De acordo com o modelo corrente de formação de placa supragengival, Streptococcus spp são vistos como sendo os colonizadores predominantes da superfície do dente. Subsequentemente, a placa desenvolve-se por crescimento bacteriano e adicionalmente por acréscimo de outras espécies bacterianas. Este acréscimo pode ocorrer através da ligação de bactérias-bactérias ou pode ser mediado por moléculas salivares. A constituição da placa é também facilitada pela produção de macromoléculas extracelulares. S. mutans é agora considerado como sendo uma das espécies de biopelícula que pode receber atenção especial, devido a sua associação as cáries dentárias. Embora várias bactérias gram positivas (isto é, S. mutans) tenham mostrado causar perda de osso alveolar em animais genotobíóticos, estes microorganismos não parecem ser os principais contribuidores para a ecologia do desenvolvimento da bolsa periodontal. Não obstante, microorganismos potencialmente patogênicos devem se capazes de evadir ambos da defesa do hospedeiro e mecanismos imunes, bem como iniciando a destruição do tecido hospedeiro.

MATERIAIS

Streptococcus mutans NS foi gentilmente provido pelo Dr. H. van der Mei (Matéria Technica, University of Groningen) . EMDOGAIN® foi fornecido pela BIORA (Malmõ, Suécia). Detergente RBS foi adquirido da Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Suíça).

DESENVOLVIMENTO BACTERIANO E COLHEITA S. mutans foram inoculados de placas agar de sangue em cultura de batelada em meio de caldo Todd Hewitt por 24 horas a 37°C. Esta cultura foi usada para inocular uma segunda cultura no meio de caldo de Todd Hewitt, que foi deixada crescer por 16 horas. As células foram colhidas por centrifugação (5 minutos a 6500 x g) e lavadas duas vezes com água desmineralizada. Subseqüentemente, os microorganismos foram sonicados por 20 segundos a 30 W (Vibra Cell modelo 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) para romper cadeias bacterianas e agregados. A sonicação foi feita intermitentemente enquanto resfriando em um banho com gelo e água. As células foram contadas por uso de um contador de célula Büker-Türker. Finalmente, S. mutans foi suspenso no tampão de adesão (2 itíM de fosfato de potássio, 50 mM de cloreto de potássio e 1 mM de cloreto de cálcio, pH 6,8). REVESTIMENTO DE PLACAS DE VIDRO Placas de vidro foram limpas completamente por sonicação em detergente 5% RBS, enxágüe extensivo com água de torneira, lavagem em metanol e finalmente enxágüe com água destilada. Este procedimento rende um ângulo de contato de água de zero graus. EMD foi dissolvido em 0,01 M de ácido acético em uma concentração de 7,5 mg/ml. As placas de vidro foram divididas em duas metades por uso de marcador teflon (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca). Ácido acético (0,01 M) foi aplicado a um local; 250 μg de EMD a outro. As placas de vidro foram secas em um gabinete de fluxo por 4-6 horas.

ANÁLISE DE DADOS

RESULTADOS

Em cada um dos três experimentos, EMD mostrou um efeito inibidor na razão de anexação de S. mutans (Figuras 7, 8, 9; p < 0,05). A inibição ficou em cerca de 40-70% quando comparada aos controles tratados por ácido acético. 0 primeiro experimento (figura 7) mostrou já após 10 minutos de fluxo uma inibição da quantidade de S. mutans anexado a superfície da placa revestida com EMD. Após 2 horas a anexação foi inibida para cerca de 60% do controle.

No segundo experimento (figura 8) EMP começou a inibir a anexação de S. mutans após 1 hora e meia de fluxo. O número de S. mutans aderindo ao EMD alcançou uma marca de 0,5 milhões por cm2 após cerca de 40 minutos de fluxo. Após 3 horas e meia, as contagens foram de cerca de 25% comparadas aos controles. 0 terceiro experimento (figura 9) mostrou inibição da anexação de S. mutans sob a influência de EMD já do começo do procedimento de fluxo. Como no experimento 1 remontou até 60% dos valores de controle, após 3 horas de fluxo. O presente estudo mostra que EMD tem um efeito inibidor significante na aderência de S. mutans às superfícies de vidro. Uma explicação possível para esta inibição pode ser a presença de compostos hidrófobos na mistura EMD. Uma das proteínas abundantemente presente na mistura é amelogenina, uma proteína que contém, além da sequência de terminal C hidrófila ácida, um núcleo hidrófobo contendo 100-300 resíduos enriquecido em prolina, leucina, metionina e glutamina. Saito e outros, Arch. Oral Biol. 42, 1997, páginas 539-545 verificou que a aderência de várias cepas S. mutans à proteína hidrófoba imobilizada (OAIS) foi inibida. Os autores ressaltam o efeito para carga negativa na superfície da célula dos microorganismos (que é o caso para S. mutans). Outras características de superfície podem também ser envolvidas na aderência afetada ao substrato. S. mutans contém um antígeno de superfície I/II que possui uma parte terminal N especificamente enriquecida em alanina e inclui repetições em tandem. Esta região é prevista como sendo alfa-helicoidal, adotando uma conformação em espiral, e pode contribuir par a hidrofobicidade da superfície ■ da célula associada à expressão do antígeno I/II. EXEMPLO 5 Efeito de EMD no desenvolvimento de determinados periopatogens Provotella intermedia e Porphyromonas gingivalis foram pré-cultivadas por 10-16 horas a 37°C em caldo tioglicolato suplementado com 0,5 mg/1 de Vitamina K e 5 mg/1 de hemina em uma atmosfera aeróbica gerada por envelopes GasPakPlus em jarras apropriadas. Quando as culturas alcançaram um OD600 de 0,1-0,2 correspondendo as densidades de células de 106-107 cfu (unidades de formação de colônia) por ml, alíquotas de 100 μΐ foram drenadas e as bactérias foram precipitadas por centrifugação. As bactérias foram resuspensas em 100 μΐ de uma mistura preparada frescamente de soro humano e salmoura estéril, e as suspensões contendo 105-106 células foram transferidas para tubos Eppendorf de 1,5 ml estéreis e misturados com o) 100 μΐ de preparação EMD (3 mg EMD em 0,1 ml PGA), (ii) 100 μΐ de veiculo PGA ou (iii) 100 μΐ de mistura de solução de soro/NaCl como controle de desenvolvimento. Alíquotas de 10 μΐ para os ensaios de crescimento foram tomadas após 0, 3, 6 e 24 horas. As alíquotas foram serialmente diluías em 0,9% de solução NaCl estéril e 10 μΐ das etapas de diluição foram colocadas em placas no agar Schaedler. Condições de cultura foram as mesmas para as pré-culturas. Placas agar foram incubadas por 3-4 dias e cfus e densidades de célula (cfu/ml) foram subseqüentemente calculadas. Todos os experimentos foram repetidos seis vezes.

Resultados (dados como cfu/ml em porcentagem da concentração em tempo 0) 1) Culturas de controle em diferentes pontos de tempo 2) Culturas em presença de veículo PGA em diferentes pontos de tempo 3) Culturas em presença de EMD em diferentes pontos de tempo As culturas foram mardacamente inibidas pela presença de EMD quando comparado aos controles com veiculo sozinho ou sem qualquer adição de EMD. EXEMPLO 6 Investigação de efeito aperfeiçoado de cura em ferida de tecido macio de EMDOGAIN® após cirurgia periodontal A finalidade deste exemplo é mostrar a influência dos derivados de matriz de esmalte e/ou proteinas de matriz de esmalte em cura aperfeiçoada de ferida de tecido macio após cirurgia periodontal.

Imperfeições experimentais no periodontium marginal em dentes de mais de 50 macacos Macaca foram criados por remoção do cimento dental, membrana periodontal e osso alveolar marginal a uma distância cérvico-apical de aproximadamente 5 mm com uma broca dental. Nada (controle) ou derivado de matriz de esmalte (obtido de EMDOGAIN® tanto como pó liofilizado não reconstituído como com a composição reconstituída) foi então aplicado as imperfeições experimentais. A concentração de proteínas na composição reconstituída foi de cerca de 5-30 mg/ml e o volume aplicado estava na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 0,2 ml por imperfeição. A cura da ferida foi visualmente avaliada durante as 8 semanas seguintes. Nas imperfeições onde EMDOGAIN® foi aplicado houve boa cura (nenhuma vermelhidão ou inchaço) e placa não noticiável após 2 semanas quando as suturas foram removidas, boa cura e pouca gengivite após 5 semanas e cura sem complicações após 8 semanas, quando os experimentos terminaram. Em contraste, as imperfeições de controle mostraram inflamação com retrações e placa abundante após 2 semanas, com retrações graves e gengivite após 5 semanas e após 8 semanas. EXEMPLO 7 Investigação do efeito de cura da ferida de derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte após cirurgia periodontal A finalidade deste exemplo é mostrar a influência dos derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte na cura rápida de ferida em pacientes após cirurgia periodontal.

Cinqüenta e cinco (55) pacientes que precisam de cirurgia periodontal foram divididos em dois grupos, um com cirurgia convencional com técnica Widman flap modificada (20 pacientes) e o outro com o mesmo procedimento mais aplicação de EMDOGAIN® (35 pacientes) (concentração foi de 30 mg de proteína/ml e cerca de 0,3 ml foi aplicado por dente). Nenhum dos pacientes recebeu antibiótico na hora da cirurgia porém todos foram instruídos a usar uma solução de enxágüe bucal asséptica diariamente (clorhexidina). O questionamento ativo dos pacientes foi realizado na hora da remoção das suturas (1-3 semanas após a cirurgia). Enquanto 3 (15%) dos pacientes de controle tiveram eventos pós-cirúrgicos requerendo antibióticos, apenas um (3%) dos pacientes tratados com EMDOGAIN® precisaram de tal tratamento. EXEMPLO 8 Investigação do efeito de cura de ferida dos derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte apôs extração de dente A finalidade deste exemplo é mostrar a influência de proteínas de esmalte/derivados de matriz de esmalte na cura de ferida após extrações do terceiro molar.

Os pacientes com 30 anos de idade ou mais velhos com os terceiros molares mandibulares simétricos impactados ou semi-impactados precisando remoção tiveram um terceiro molar extraído pelo processo clássico envolvendo elevação de uma aba vertical para realizar a osteoctomia necessária e seccionamento, quando o segundo foi extraído e os alvéolos foram enchidos com EMDOGAIN® antes da sutura. Todos os pacientes receberam antibióticos (3 g de Amoxicilina ou 1 g de Eritromicina) 1-2 horas antes da cirurgia e receberam ibuprofen (600 mg x 3) após a cirurgia. Eles foram então instruídos a fazer enxágue com Clorhexidina (0-1%, 10 ml x 2) por 4 semanas.

As suturas foram removidas após 2 semanas. A cura de EMDOGAIN® e sítios de controle foi avaliada por ambos paciente e dentista. Em um centro, 9 pacientes tiveram extração contralaterais com/sem EMDOGAIN®. Um paciente teve irritação leve das suturas em ambos os lados, enquanto ou paciente teve dor grave no sítio de controle, porém apenas sem problemas no sítio tratado com EMDOGAIN®. No segundo centro, três pacientes dos 6 tiveram dor apenas nos sítios de controle. Finalmente, em um terceiro centro, um paciente teve um evento sério, alveolite, que foi diagnosticado no sítio de controle de um paciente. 0 sítio de EMDOGAIN® tratado sarou sem problemas. Outro paciente teve irritação leve das suturas em ambos os sítios de extração, porém apenas um sitio de controle estava inflamado e dolorido e precisou de irrigações repetidas com salmoura para ingresso dos exterminadores de dor.

Estes resultados clínicos indicam que a aplicação de EMDOGAIN® nos alvéolos de extração após extração do dente ciso podem melhorar a cura e reduzir de outra forma os inchaços doloridos freqüentes. EXEMPLO 9 Invesgitação do Efeito de Derivados de Matriz de Esmalte e proteínas de Matriz de Esmalte na Cura de Alveolite Sicca A finalidade deste exemplo é mostrar a influência de proteínas de esmalte/derivado de matriz de esmalte na cura de alveolite sicca (bolsa seca).

Após remoção de 35 radix relíctos infectados, um paciente homem, de 70 anos, experimentou dor aguda e inchaço em relação a extração dos alvéolos. Quando examinado por seu dentista, ficou claro que ele havia desenvolvido uma condição de alveolite sicca, na qual o coágulo inicial havia se desintegrado e a parede do osso dos alvéolos estava necrosada. 0 osso adjacente e os tecidos macios estavam inflamados. 0 paciente tinha um histórico de falha cardíaca e foi tratado com o anticoagulante Marev an. Como resultado de sua condição ele :tinha circulação sanguínea periférica reduzida. Ele também fumava regularmente vários cigarros ao dia. A alveolite foi tratada do modo tradicional com remoção de osso necrótico e indução de novo sangramento. Também, a gengiva foi mobilizada e uma sutura foi aplicada para fechar os alvéolos. 0 paciente foi então tratado com penicilina (apocilina 660 mg, 2 comprimidos pela manhã e a noite por sete dias) para combater a infecção e também instruído para enxágüe da boca duas vezes ao dia com uma solução de chlorhexidina. Após cinco dias, após término do regime antibiótico, o paciente queixou-se na clínica dentária de dor aguda. A inspeção da área de operação foi realizada visualmente e por apalpação e mostrou que a alveolite persistia e que mais osso necrosado estava presente. Raio-x revelou destruição do osso e necrose de toda a parte inferior para a parte apical do alvéolo. A área de operação foi limpa uma vez mais e a lesão do osso resultante foi enchida com ENDOGAIN® (30 mg/ml, max. 0,5 ml foi aplicado) e uma nova sutura foi colocada na gengiva para fechar o alvéolo. Nenhum tratamento adicional foi instituído, porém o paciente continuou a enxaguar com solução de clorhexidina. Dois dias mais tarde, o paciente reportou na clínica que ambos a dor e o inchaço haviam desaparecido. O exame clínico e remoção da sutura uma semana após tratamento com EMDOGAIN® revelou boa cura sem sinais de tecidos necrosados ou inflamação e uma gengiva intacta sem vermelhidão ou inchaço cobriu a área ferida. Nenhum sangramento ou dor quando sondado e apalpado. Nenhuma odor ou gosto ou exudado foi observado. 0 paciente não reportou dores ou outros sintomas. EXEMPLO 10 Investigação do efeito profilático de derivados de matriz de esmalte e proteína de esmalte na alveolite seca A finalidade deste exemplo é mostrar o efeito profilático dos derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte para atacar a alveolite sicca.

Uma paciente de 82 anos de idade experimentou uma fratura longitudinal da raiz no dente 44. Este dente era um pilar em uma ponte entre o dente 35 ao 4 6, e tinha sofrido tratamento endodóntico vários anos antes. Clinicamente, a gengiva circundando o dente estava inflamada e havia uma bolsa gengival por todo o apex do dente no lado lingual. Raio-x mostrou periodontite local grave do dente 44. A paciente tinha boa higiene oral, porém devido a condição cardíaca tratada com Marevan (anti-coagulante), sangramento da gengiva foi facilmente provocado por sondagem. Seis meses mais parte, a paciente teve seu dente 35 removido cirurgicamente devido a grave periodontite. Após aquela operação, ela experimentou uma condição de longa duração da alveolite sicca. Ela estava apreensiva de que a remoção do dente 44 não causasse as mesmas complicações pós-cirúrgicas que ela havia experimentado. Ela foi informada de que a combinação de sua idade, tratamento com Marevan e raiz infectada além de bolsa gengival aumentaram dramaticamente o risco para complicações pós-operatórias como alveolite, porém não houve alternativa sem não remover cirurgicamente os fragmentos de raiz. A paciente concordou em ter o dente 44 removido e, como um experimento, sofre tratamento profiláctico com EMDOGAIN® para prevenir o desenvolvimento de alveolite sicca. A paciente foi anestesiada com incisão e remoção do osso bucal para permitir remoção do fragmento de raiz sem afrouxar a ponte. Após remoção, o alvéolo vazio foi mecanicamente limpo e cheio com EMDOGAIN® (30 mg/ml, max. 0,5 ml foi aplicada) e a aba foi reposicionada com uma sutura. No mesmo evento, o paciente reportou (por telefone) sangramento prolongado da área de operação (tratamento com Marevan não foi parado antes da cirurgia), porém sem outros sintomas. Quando a sutura foi removida cinco duas após a cirurgia, a ferida de tecido macio havia sarado completamente. 0 paciente não reportou qualquer sintoma como dor ou inchaço após cirurgia e era geralmente muito agradável com o tratamento. EXEMPLO 11 Investigação do efeito de derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte na cura de complicações pòs- traumáticas A finalidade deste exemplo é mostrar a influência das proteínas de esmalte/derivado de matriz de esmalte na cura de complicações pós-traumáticas em um paciente Após um acidente um paciente teve o dente frontal superior afetado, ligado em uma clínica de emergência. O dentista verificou que os dentes 11 e 21 tinham fraturas avital, dentes 12 e 22 tinham faturas mesio-incisal classes I e II. A gengiva marginal estava gravemente inflamada e aderida fracamente às superfícies dos dentes. 0 paciente teve dores e queixou-se de dormência, inchaço, e gosto e cheiro desagradáveis. Não houve evidência de dano ao ligamento periodontal nas regiões apicais dos dentes 11 e 21. Ambos os incisores central foram limpos e as raízes cheias com Ca(OH)2 misturado recentemente.

Após quatro semanas a cura da ferida foi tida como sendo insatisfatória. A condição evoluiu para uma inflação crônica e os dentes foram considerados perdidos. O tratamento padrão desta condições seria a extração de todos os quatro cisos e substituição com uma ponte ou implantes. Contudo, o paciente opôs-se fortemente ao tratamento e como uma última tentativa de salvar os dentes, uma cirurgia da aba da gengiva foi realizada em todos os quatro dentes afetados (11, 12, 21, 22) . Dois frascos de EMDOGAIN® foram usados (60 mg em 3 ml).

Na maior parte, 0,2 ml de EMDOGAIN® (30 mg/ml) por dente foi aplicado com uma seringa antes das abas serem suturadas de novo com 7 pontos. Quatro das suturas foram removidas 5 dias após a cirurgia. Houve então um aperfeiçoamento marcante nas condições subjetivas e clínicas. 0 paciente não se queixou mais de dor, a sensação de dormência passou e não havia mais cheiro ou gosto desagradáveis na área afetada. Após duas semanas as suturas foram removidas. A gengiva não mostra qualquer sinal de inflamação e o paciente não teve queixas. A gengiva estava curada e não haviam sinais de inflamação; ela foi firmemente anexada ao dente e/ou osso alveolar, tinha cor rosa (nenhum vermelho distinto foi observado nas áreas inflamadas)e com papila interdental normal (não inchada). Adicionalmente, um aperfeiçoamento marcado foi observado como reaparecimento do ligamento periodontal nas partes afetadas dos dentes e deposições de novo osso alveolar conforme visualizado por exame de raio-x. EXEMPLO 12 Cura de feridas traumáticas nas vizinhanças dos dentes e nervos RELATO DO CASO

Uma paciente de 39 anos experimentou uma pericoronite grave após retirar seu dente ciso (48) . Ma clínica dentária pública o dente foi parcialmente removido, deixando a metade apical do dente na mandíbula seguindo uma fratura da raiz iatrogênica. Com dores, a paciente foi indicada a um especialista em cirurgia oral no dia seguinte para remoção cirúrgica do fragmento da raiz.

Dois dias após a cirurgia a paciente foi ao seu dentista par controle. Ela tinha o lado esquerdo inchado e apresentava um bloco persistente e completo do nervo esquerdo mandibular. 0 exame clínico e fotografias de raio-X mostrou que durante a cirurgia, danos graves por broca foram feitos ao osso da mandíbula, à terceira aplica das raízes distais do dente 37 e ao canal do nervo mandibular. (vide raio-x na figura IA) . A profundidade da bolsa distai do dente 37 era de 25 mm do topo da coroa do dente que passou o ápice da raiz distai.

Em um esforço para induzir a cura do osso e do nervo e regeneração do ligamento periodontal perdido no dente 37, a ferida da operação foi aberta e cuidadosamente examinada. Após limpeza com salmoura o osso exposto, superfície de raiz distai do 37 e nervo mandibular foi recoberto com ENDOGAIN® (30 mg/ml, aplicado após cerca de 1 ml) e a ferida foi costurada juntamente com três suturas. Ela foi instruída a fazer enxágüe da boca com solução de chlorhexidina (corsodyl®) duas vezes ao dia pelos próximos cinco dias e um tratamento profilático de cinco dias com penicilina (Ampicilina, 660 mg x 4) foi iniciado.

Após dez dias a paciente retornou para controle e remoção das suturas. Neste período, o inchaço havia sumido e a cura do tecido macio era muito boa. Contudo, a anestesia completa do nervo mandibular persistiu e o paciente foi informado do prognóstico de que um nervo partido, no melhor, era incerto. Neste ponto, tornou impossível testar a viabilidade do dente 37. Normalmente, um dano a raiz como o apresentado aqui conduz a necrose da polpa e anquilose do dente. Para prevenir estas complicações, o tratamento endotôntico é indicado. Contudo, para ver se o tratamento experimental promoveria uma cura do ligamento periodontal, o paciente acordou em deixar o dente não tratado por algum tempo. 0 paciente foi então marcado para controles mensais.

Dois meses após o controle acima a paciente tinha hiperestesia local em seu lábio inferior esquerdo, um sinal de cura do nervo. O tecido macio na região 37-38 estava perfeitamente curado sem cicatrizes. Raios-x também revelaram a formação de um novo osso no alvéolo de extração. 0 dente 37 e o tecido circundante ainda sofriam de anestesia.

Quatro meses após o tratamento a anestesia havia desaparecido e o dente 37 mostrou vida, porém hipersensível, quanto a temperatura e testes de eletricidade. Os raios-x mostraram que o enchimento do osso no alvéolo de extração foi significante e haviam sinais de regeneração periodontal na raiz distai do dente 37.

Cinco meses após tratamento inicial com EMDOGAIN®, a vitalidade do dente 37 pareceu normal. Nesta hora, uma regeneração completa de um ligamento periodontal funcional era evidente no raio-X (figura 1B) e osso alveolar formado recentemente de aparência normal tinha enchido os defeitos do osso e alvéolo de extração. Não houve sinais de anquilose. A profundidade da bolsa distai no dente 37 era agora de apenas 10 mm que estava aproximadamente 1 mm abaixo da junção do esmalte de cimento. Após estes controle, o paciente foi tido como estado completamente curado e marcado para revisões comuns em intervalos de um ano.

COMENTÁRIOS A cura completa e rápida das feridas traumáticas nas vizinhanças dos dentes e nervos após remoção cirúrgica dos dentes cisos são raras. Comumente complicações tão graves como a reportada acima terminam com remoção completa do dente danificado ou pelo menos uma remoção endotóntica da polpa do dente e enchimento da raiz seguido por cura do osso com anquilose. Um nervo partido normalmente leva 8 a 12 meses para sarar, se isto tudo, e freqüentemente algumas regiões com parestesia persistem por vários anos. A qualidade rápida e boa da cura reportada acima é muito incomum e deve ser considerada como um sinal de capacidade de cura do EMDOGAIN®.

RAIOS-X A: Paciente dois dias após remoção do dente 38. Observe o grande defeito distai no dente 37 e o envolvimento do canal mandibular. Também, o osso alveolar distobucal no dente 37 foi removido durante a cirurgia. B: Paciente cinco meses após a cirurgia. Observa-se sinais de ligamento periodontal funcional completo (lâmina dura) no defeito da parte distai da raiz do dente 37. Não existem sinais de anquilose. 0 contorno do canal mandibular pode agora ser visto e o alvéolo de extração está completamente cheio com osso. .Observa-se também a nova formação de osso alveolar distobucal ao redor do dente 37. EXEMPLO 13 Investigação do efeito dos derivados de matriz de esmalte e proteínas de matriz de esmalte na cura de ulcus cruris (úlcera venosa) PACIENTE 1 0 paciente era do sexo masculino, nascido em 1926 e tinha um histórico de doença de trombose repetida com síndrome pós trombótica ruim e úlceras venosas recorrentes. Ele foi tratado sistemicamente com derivados de coumarina anticoagulante e as úlceras foram tratadas localmente com Crupodex (monômero de dextran) BIOGAL e 3% de solução de ácido bórico.

Na época da inicialização do tratamento com EMDOGAIN®, ele tinha uma úlcera venosa possuindo um tamanho oval de 5 x 4 cm e uma profundidade de 0,5 mm que estava no estágio de granulação com epitelização muito ruim. A ferida foi desinfetada com 3% H2O2, e 500 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados gota a gota e espalhados igualmente por meio de um bastão estéril. O EMDOGAIN® foi deixado por 10 minutos ao ar e então a ferida foi coberta com atadura de raion de inadina (Johnson & Johnson) impregnada com ungüento de iodo Povidona a 10%.

Após 5 dias, a epiteliz ação na parte proximal da úlcera tinha acontecido e a úlcera diminuiu por 1,8 x 2,2 cm e não houve reação colateral (inflamação). Nenhum EMDOGAIN® foi aplicado. Após 12 dias, epitelização adicional na parte proximal e nova epitelização na parte lateral haviam acontecido em uma área de cerca de 2 x 2 cm. Quase a metade da úlcera havia sarado. 400 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados.

Após 19 dias, epitelização adicional nas partes proximal e lateral da úlcera havia acontecido, porém não na parte distai onde a úlcera era mais profunda (cerca de 1 mm). Mais do que a metade da úlcera havia sarado. 300 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados. Com o inicio do tratamento com EMDOGAIN® o paciente não sentiu mais dores na úlcera, em contraste aquela que ele sentia antes do inicio do tratamento. EMDOGAIN® foi então aplicado uma vez por semana por 40 dias (a 200 μΐ) e a úlcera foi considerada completamente curada após 47 dias. PACIENTE 2 0 paciente era uma mulher/ nascida em 1949 e tinha duas varizes, insuficiência venosa crônica e úlceras venosas recorrentes. Ela tinha alergia polivalente a produtos farmacêuticos (medicamentos) bem como, exceraa varicosum. Ela havia sido tratada anteriormente com gotas de Otosporina (sulfato de polimixina B + sulfato de neomicina + hídrocortisona) e uma compressa de hidrocortisona.

Na época do início do tratamento com EMDOGAIN® sua úlcera venosa tinha 1 cm de diâmetro e 2 mm de profundidade. 300 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados.

Após 5 dias, a epitelização era de 2 mm ao redor da ferida (circunferencialmente) e não houve reação colateral (inflamação). Nenhum EMDOGAIN® foi aplicado. Após 12 dias, o tamanho da úlcera havia diminuído para cerca de 2 mm de diâmetro, 100 μΐ EMDOGAIN® foram aplicados.

Após 19 dias, a úlcera ainda possuía 2 mm de diâmetro, porém a parte inferior era granulada e a úlcera não estava não profunda (cerca de 0,2 mm). 100 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados. O mesmo paciente possuía outra úlcera na outra perna de cerca de 0,3 x 1 cm. 200 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados.

Após 7 dias, nova epitelização foi apresentava e boa granulação na parte inferior e o tamanho havia diminuído para cerca de 0,2 x 0,5 cm. 100 μΐ de EMDOGAIN® foram então aplicados a cada úlcera, até uma semana antes do dia 40, e as úlceras foram consideradas completamente saradas após 47 dias. Nenhuma reação alérgica ao EMDOGAIN® foi observada.

Outra úlcera havia se formado na mesma perna possuindo um tamanho de 0,5 x 0,3 cm à qual foram aplicados 100 μΐ de EMDOGAIN®. PACIENTE 3 O paciente era uma mulher, nascida em 1929 e tinha trombose venosa profunda após erisipelas, e na época do inicio do tratamento com EMDOGAIN® ela tinha uma ulcus cruris muito grande de 15 x 19 cm no estado de progressão próxima, a qual úlcera foi considera quase desenganada após vários tratamentos. 700 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados na área ao redor de 3 cm a partir da margem superior.

Após 7 dias, nenhuma epitelização estava presente, porém a área tratada era mais transparente (mais semelhante a estrutura) com áreas de granulação pequenas difundidas e hão havia dor nesta área e nem sinais de progressão. 700 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados à mesma área.

Após 4 semanas, a paciente desenvolveu uma infecção, acredita-se causada por Pseudomonas, na parte distai da úlcera não tratada com EMDOGAIN®. 700 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados. A infecção desapareceu após 7 dias. PACIENTE 4 O paciente era uma mulher, nascida em 1947 e tinha varizes com tromboflebite superficial após erisipelas, e na época do inicio do tratamento com EMDOGAIN® ela tinha uma ulcus cruris com um tamanho de 2 x 0,8 cm com fundo limpo, porém não granulado. 300 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados.

Após 7 dias, o tamanho da úlcera havia diminuído para cerca de 0,7 x 0,3 cm e a epitelização estava presente ao redor, além de granulação no fundo. 200 μΐ de EMDOGAIN® foram aplicados, seguido por 100 μΐ de EMDOGAIN® uma vez por semana por cinco semanas. A úlcera foi considerada completamente curada após cinco semanas. EXEMPLO 14 EMDOGAIN® como adjunto ao tratamento periodontal não cirúrgico nos sítios de superfície plana OBJETIVO O objetivo da investigação foi o de avaliar se a aplicação de EMDOGAIN® pode melhorar o resultado de cura do tratamento periodontal não cirúrgico. O objetivo específico deste estudo foi o de avaliar o efeito em sítios de superfície plana.

PROJETO DE ESTUDO 0 estudo foi conduzido como um teste longitudinal intra-indívíduo de 6 meses de duração. O estudo tem um projeto aleatorizado controlado por placebo, de boca dividida, duplamente obscuro.

INDIVÍDUOS 14 pacientes recomendados pela Clinic of Periodontics, Department of Periodontology, Gõteborg University para tratamento ' de doença periodontal moderadamente avançada.

CRITÉRIOS DE INCLUSÃO - Pelo menos 3 sítios de superfície plana de dente em cada ura dos 2 quadrantes contralaterais com profundidade de bolsa maior ou igual a 5 mm, e pelo menos um par de sítios com uma profundidade maior ou igual a 6 mm. - Os dentes selecionados tinham uma polpa vital conforme determinado por estímulo térmico ou elétrico ou, se submetidos a tratamento de canal de raiz, são assintomáticos e sem observações técnicas.

TRATAMENTO

Após um exame de linha de base, todos os pacientes receberam uma apresentação do caso e instruções quanto a medidas de controle de placa subgengival. Escamação e aplainamento da raiz foram realizados.

Quando o sangramento das bolsas cessou, gel EDTA a 24% (obtido da Biora AB, Suécia) foi aplicado nas bolsas por 2 minutos. As bolsas foram então cuidadosamente irrigadas com salmoura seguido por aplicação tanto da substância de teste (EMDOGAIN®) ou de controle (gel PGA).

AVALIAÇÕES

Exame de linha de base, acompanhamentos de 1, 2, 3, 8 e 24 semanas incluiram as variáveis: 1 - estado da higiene oral - presença/ausência de placa 2 - condição da gengiva - (índice da gengiva; Lõe 1967) 3 - Exame de profundidade da bolsa 4 - Exame do nível de anexação 5 - Exame de sangramento - presença/ausência (15 segundos) 6 - Hipersensibilidade da dentina - seguindo estímulo com sopro de ar (sim/não) 7 - Grau de desconforto - registro nos exames de acompanhamento das 1, 2 e 3 semanas usando um 10 cm < <

Visual Analogue Scale (VAS). PLACA; média (padrão) ÍNDICE DE GENGIVA; média (padrão) EXAME DE SANGRAMENTO; %_________________________________________ AVALIAÇÃO SUBJETIVA DO PACIENTE; classificação VAS Semana 1 Semana 3_______________________________________________________ CONCLUSÃO

Os pacientes tiveram menos problemas pós-operatórios, menos sangramento, menos placa e um índice de gengiva aperfeiçoado. Estes resultados sustentam o efeito de cura de ferida do EMDOGAIN®. EXEMPLO 15 Estudo Piloto de Cura de Ferida em Porcos INTRODUÇÃO

OBJETIVO O objetivo deste estudo piloto é avaliar o processo de cura das feridas de espessura dividida em porcos e avaliar o efeito de EMD nestas feridas.

RAZÃO DE ESCOLHA DAS ESPÉCIES DE ANIMAL 0 porco é selecionado como o modelo de teste porque estas espécies provaram ser um bom modelo para avaliação de cura de ferida em humanos. MATERIAIS E PROCESSOS Animais 0 experimento será realizado em 4 porcos fêmea SPF (cruzamento de Yorkshire e Duroc Dinamarqueses). No inicio do período de aclimatação o peso corpóreo dos animais será de 35 kg.

Um período de aclimatização de uma semana será permitido durante o qual os animais serão observados diariamente, a fim de rejeitar um animal apresentando uma condição fraca. Todas as observações serão registradas.

ALOJAMENTO 0 estudo acontecerá em um recinto para animais provido com ar filtrado em uma temperatura de 21°C mais ou menos 3°C, umidade relativa de 55% mais ou menos 15% e troca de ar 10 vezes/hora. O recinto será iluminado para fornecer um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. A luz será de 06 as 18 horas.

Os animais serão alojados individualmente em recintos gradeados.

CAMAS

As camas serão de serragem de madeira macia "LIGNOCEL Η H" da Hahn & CO, D-24796 Bredenbek-Kronsburg. São realizadas análises regulares para contaminantes possíveis relevantes.

DIETA

Uma dieta para porcos disponível comercialmente, "Altrommin 9033" da Chr. Petersen A/S, DK-4100 Ringsted será oferecida (cerca de 800 g duas vezes ao dia). Análise quanto aos componentes nutritivos principais e possíveis contaminantes relevantes são realizadas regularmente.

ÁGUA PARA BEBER

Duas vezes ao dia, será oferecida água para beber de qualidade doméstica. Análises quanto a possíveis contaminantes relevantes são realizadas regularmente.

FERIMENTO

As feridas serão estabelecidas no dia 1. Os animais serão anestesiados com Stresnil® Vet. Janssen, Bélgica (40 mg azaperona/ml 1 ml/10 kg) e Atropin DAK, Dinamarca (1 mg atropina/ml, 0,5 ml/10 kg) dada como uma injeção intramuscular simples seguido por injeção i.v. de Hypnodil® Janssen, Bélgica (50 mg metomidato/ml, cerca de 2 ml) .

Uma área dorso-lateral em cada lado da parte posterior do animal será raspada, lavada com sabão e água, desinfetada com 70% de etanol que será enxaguado com salmoura estéril, e finalmente seco com gaze estéril.

Oito feridas de espessura dividida (25 x 25 x 0,4 mm) serão feitas na área preparada, 4 em cada lado da espinha, usando um ACCU-Dermatom (GA 630, Aesculap®) . As feridas serão numeradas 1 (maior parte cranial) a 4 (a maior parte caudal) no lado esquerdo do animal e 5 (a maior parte cranial) para 8 (maior parte caudal) no lado direito do animal.

Sangue coagulado será removido com gaze estéril. Imediatamente após cirurgia, cerca de 8 horas após término da cirurgia, e se fosse necessário, após isto os animais receberíam uma injeção intramuscular de Anorfin®, A/S GEA, Dinamarca (0,3 mg buprenorfina/ml, 0,04 ml/kg).

DOSAGEM

Após o corte das feridas, as mesmas serão tratadas como se segue:__________________________________________________________ A = controle B « EMD

Cerca de 15 minutos após a dosagem, a formulação EMD será preparada de acordo com as instruções do fabricante. A formulação de EMD será usada dentro de 2 horas após preparação. Para feridas do tratamento B, EMD será aplicado como uma camada fina na superfície da ferida. Um frasco de EMD será usado para 4 feridas.

ATADURA PARA FERIDA

As feridas receberão ataduras com Tegaderm®. As ataduras serão cobertas com uma bandagem de gaze fixada por Fixomul®. As ataduras, a gaze e o Fixomul® serão mantidas no corpo do animal. Bend-a-rete® (Tesval, Itália). As ataduras serão observadas em uma base diária.

As ataduras serão trocadas no dia 2 {todos animais) e 3 (animais números 3 e 4).

Antes de cada alteração, os animais serão anestesiados com uma injeção intramuscular no pescoço (1,0 ml/10 kg de peso corpóreo) de uma mistura de Zoletil 50®Vet., Virbac, França (125 mg de tiletamina e 125 mg de zolazepam em 5m de solvente, 5 ml) Rompund® Vet., Bauer, Alemanha (20 mg xilazina/ml, 6,5 ml) e Methadon® DAK, Nycomed DAK, Dinamarca (10 mg de metadon/ml, 2,5 ml).

OBSERVAÇÃO COM RELAÇÃO AS FERIDAS

Cada ferida será observada e fotografada no dia 2 (todos os animais), 3 (todos animais) e 4 (animais números 3 e 4) . O grau de exudação e inflamação será avaliado. A aparência da epiderme enxertada será descrita em detalhes.

SINAIS CLÍNICOS

Todos sinais visíveis de doença e qualquer alteração de comportamento será registrado diariamente. Qualquer desvio do normal será registrado com relação ao tempo de início, duração e intensidade.

PESO CORPÓREO

Os animais serão pesados na chegada, no dia do ferimento e ao término do estudo.

OBSERVAÇÕES FINAIS

No dia 3 {cerca de 56 horas após o ferimento), os animais números 1 e 2 serão mortos por um corte na veia subclaviana e artéria após atordoamento com uma pistola de pregos.

No dia 4 (cerca de 72 horas após ferimento) , os animais 3 e 4 serão mortos por um corte na veia subclaviana e artéria após atordoamento com uma pistola de pregos.

AMOSTRAGEM DO TECIDO

Cada ferida será cortada como um bloco separado do tecido muscular esqueletal. Se qualquer aderência ocorrer ao músculo esqueletal subjacente, parte do músculo será incluído no material para fixação. Cada bloco será fixado no fosfato tamponado neutro 4% de formaldeído. prepãraçAo histológica Após fixação, quatro amostras representantes de todas as feridas serão embebidas em parafina, cortadas em uma espessura nominal de 5 μη e manchadas com hematoxilina e eosina. Após manchamento, os slides serão observados sob luz de microscópio usando uma grade. Isto permite medições do comprimento total da ferida e comprimento da superfície epitelizada. Esta razão será expressa em porcentagem da ferida coberta por células epiteliais por slide. Os valores médios de cada ferida serão recolhidos, após o que os valores de grupo médio serão calculados.

ESTATÍSTICA

Os dados serão processados para fornecer valores médios de grupo e desvios padrão onde apropriado. Partes separadas possíveis serão identificadas também, Após isto, cada variável contínua será testada quanto a homogeneidade de variação com teste de Bartlett. Se a variação for homogênea, análise de variação será realizada para a variável. Se qualquer diferença signifícante for detectada, as possíveis diferenças do intergrupo serão avaliadas com teste de Dunnett. Se a variação for heterogênea, cada variáveis será testada quanto a normalidade pelo processo Shapiro-Wilk. No caso de distribuição normal, possíveis diferenças intergrupo serão identificadas com Studenfs t-test. De outra forma, as possíveis diferenças de intergrupo serão avaliadas por teste de Kruskal-Wallis. Se quaisquer possíveis diferenças forem detectadas, a identificação subsequente dos grupos será realizada com teste Wilcoxon Rank-Surn.

As análises estatísticas serão feitas com procedimentos SAS® {versão 6.12) descritas em "SAS/STAT® User’s Guide, versão 6, quinta edição, volume 1 + 2", 1989, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina 27513, USA.

REIVIN DICAÇOES

Claims

1. Uso de uma preparação de substância ativa de esmalte, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica ou cosmética para cura de uma ferida na pele ou mucosa.

2. Uso de uma preparação de substância ativa de esmalte, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica ou cosmética para aperfeiçoar a cura de uma ferida na pele ou mucosa.

3. Uso de uma preparação de substância ativa de esmalte, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma de uma composição farmacêutica ou cosmética para regeneração ou reparo da pele ou mucosa.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida está presente na mucosa, na cavidade oral.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é um ferimento corpóreo ou um trauma associado a cirurgia oral incluindo cirurgia periodontal, extração do dente(s), tratamento endodóntico, inserção de implantes dentários, aplicação e uso de próteses dentárias.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pdo fato dc 4'Uc d ftsiiOd é selecionada do grupo consistindo de feridas assépticas, feridas por contusão, feridas por incisão, feridas laceradas, feridas por não penetração, feridas abertas, feridas por penetração, feridas por perfuração, feridas por punção, feridas sépticas, feridas por infartação e subcutâneas.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é selecionada do grupo consistindo de úlceras isquêmicas, machucados por pressão, fistulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas em locais de doadores.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é uma ferida aftosa, uma ferida traumática ou uma ferida associada ao herpes.

9. Uso de uma preparação de substância ativa de esmalte, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de uma infecção.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção é causada por um microorganismo.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de ser empregado na prevenção de ou no tratamento de desenvolvimento bacteriano na superfície de mucosa.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pei o fato de ser cm^icyctuu na prevonçao ue ou no tratamento de desenvolvimento bacteriano em unhas ou na superfície dos dentes.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção está presente na cavidade orsl.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de ser empregado na profilaxia e/ou no tratamento de uma condição bacteriana na cavidade oral.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-14, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção é causada por bactérias que causam a cárie, por exemplo Streptococcus mutans; bactérias que causam doença periodontal por exemplo Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter (Fusobacteria, Staphylococci) , B. forsythus; bactérias que causam alveolite etc., por exemplo Staphylococcus, Actinomyces e Bacillus; e bactérias que causam lesões periapicais, por exemplo Spirochetes.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-11, CARACTERIZADO pelo fato de que as bactérias estão presentes sobre a pele.

17. Uso de uma preparação de substância ativa de esmalte, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de condição inflamatória.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato dc que a condição infldiucitoiid está presente na cavidade oral.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a condição inflamatória está presente em um local do doador de osso.

20. Uso, de acoruo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância ativa de esmalte é uma matriz de esmalte, derivados de matriz de esmalte e/ou proteínas de matriz de esmalte.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância ativa de esmalte é selecionada do grupo consistindo de enamelinas, amelogeninas, não amelogeninas, não amelogeninas ricas em prolina, amelinas (ameloblastina, sheathlin), tuftelinas, derivados e misturas das mesmas.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância ativa de esmalte possui um peso molecular de no máximo cerca de 120 kDa tal como, por exemplo, no máximo 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa ou 60 k6a conforme determinado por eletroforese de SDS Page.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a preparação de uma substância ativa de esmalte contém uma mistura de substâncias ativas de esmalte com pesos moleculares diferentes.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fatu dt: quê a preparação de uma substância ativa de esmalte compreende pelo menos duas substâncias selecionadas do grupo consistindo de amelogeninas, não amelogeninas ricas em prolina, tuftelina, proteínas tuft, proteínas de soro, proteínas salivares, ameiina, ameloblastina, sheatnlin, e derivados das mesmas.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância ativa de esmalte possui um peso molecular de até cerca de 40.000.

26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância ativa de esmalte possui um peso molecular entre cerca de 5.000 e cerca de 25.000.

27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a maior parte da substância ativa de esmalte possui um peso molecular de cerca de 20 kDa.

28. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma parte da substância ativa de esmalte está na forma de agregados ou após aplicação in vivo é capaz de formar agregados.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que os agregados possuem um tamanho de partícula de cerca de 20 nm a cerca de 1 μιη.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das írcivind 1 co.çoc3 preceden tes, CARACTERIZADO |_>eli_> fdto qk que o teor de proteína da substância ativa de esmalte na preparação está em uma faixa de cerca de 0,05% peso/peso a 100% peso/peso tal como, por exemplo, cerca de 5-99% peso/peso, cerca de 10-95% peso/peso, cerca de 15-90% peso/peso, cerca de 20-90% peso/peso, cerca de 30-90% peso/peso, cerca de 40-85% peso/peso, cerca de 50-80% peso/peso, cerca de 60-70% peso/peso, cerca de 70-90% peso/peso, ou cerca de 80-90% peso/peso.

31. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição farmacêutica compreende adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável é alginato de propileno glicol.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável é ácido hialurônico ou sais ou derivados dos mesmos.

34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-33, CARACTERIZADO pelo fato de ser de 30 mg de EMD em 1 mL de PGA ou quaisquer proteínas ou peptídeos contidos para cura da ferida na pele ou mucosa.