ES2334977T3

ES2334977T3 - Composiciones de proteinas de la matriz para la regeneracion de dentina.

Info

Publication number: ES2334977T3
Application number: ES01940884T
Authority: ES
Inventors: Stale Petter Lyngstadaas; Stina Gestrelius
Original assignee: Institut Straumann AG
Current assignee: Institut Straumann AG
Priority date: 2000-06-20
Filing date: 2001-06-20
Publication date: 2010-03-18
Anticipated expiration: 2021-06-20
Also published as: EP1292325B1; DE60140191D1; JP2003535904A; CA2413253A1; JP5095063B2; EP1292325A1; ATE445409T1; AU2001274374A1; WO2001097834A1

Abstract

Uso de una preparación de una sustancia de esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica para la formación o regeneración de dentina después de procedimientos dentales que implican exposición de tejido de pulpa dental vital.

Description

Composiciones de proteínas de la matriz para la regeneración de dentina.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere al uso de matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y/o proteínas de la matriz del esmalte para la regeneración de la dentina.

Antecedentes de la invención

Las proteínas de la matriz del esmalte, tales como las presentes en la matriz del esmalte, son muy conocidas como precursores del esmalte dental. Las proteínas de la matriz del esmalte y los derivados de la matriz del esmalte han sido previamente descritos en la bibliografía para inducir la formación de esmalte (documento US 4.672.032, Slavkin) o ligazón entre diferentes tipos de tejido mineralizado tal como cemento y hueso (documentos EP-B-0 337 967 y EP-B-0 263 086). Además, las proteínas y derivados de la matriz del esmalte han sido descritos para fomentar la curación de heridas en tejidos blandos como piel y mucosa (documento WO 99/43344). El uso de proteínas de la matriz del esmalte o derivados de la matriz del esmalte para la regeneración de la dentina no ha sido, hasta donde llega el conocimiento de los inventores, comunicado previamente.

La exposición de la pulpa dental vital es una complicación común, ya sea accidentalmente o por diseño, durante los procedimientos restauradores y prostodóncicos dentales normales y también después de las fracturas de la corona, trauma y caries. Tradicionalmente, las exposiciones mínimas de la pulpa dental se tratan ya sea aplicando una pasta de Ca(OH)_{2} o un material de relleno (por ejemplo, materiales compuestos) directamente sobre la pulpa para inducir la necrosis superficial a veces seguida por la esclerotización y formación de dentina reactiva profundamente en el tejido de la pulpa. Esta estrategia, no obstante, rara vez restaura una barrera mineralizada entre la pulpa y el (los) material(es) restaurador(es) y, en casos frecuentes, la pulpa dental queda inflamada y tiene que ser tratada mediante pulpectomía (eliminación de toda la pulpa) o pulpotomía (eliminación de una gran porción de la pulpa) y posterior rellenado endodóncico con materiales sintéticos (por ejemplo, gutapercha). En los casos donde una gran parte de la pulpa está expuesta, el tratamiento siempre incluye una pulpectomía y rellenado endodóncico.

Los dientes tratados con endodoncia pierden su aporte de sangre, innervación y capacidad para producir tejido duro reactivo (dentina secundaria). Como resultado, estos dientes se vuelven quebradizos y también son más propensos a trauma inducido por la masticación y caries graves (debido a la falta de sensibilidad, los pacientes no sienten dolor). Esto hace la vida de los dientes tratados con endodoncia mucho más corta que la de dientes vitales y, por lo tanto, menos útiles como pilares para sustituciones del diente prostodóncicas.

Si se pudiera encontrar una vía para inducir la formación de nueva dentina que pueda cubrir y sellar eficazmente la pulpa dental expuesta, constituiría un progreso mayor en la odontología conservadora.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que la matriz del esmalte, los derivados de la matriz del esmalte o las proteínas de la matriz del esmalte (denominados colectivamente "sustancia de esmalte activa" en lo sucesivo) son capaces de inducir la formación de dentina en células de pulpa dental.

Por consiguiente, la invención se refiere al uso de una preparación de una sustancia de esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica para la formación o regeneración de dentina después de procedimientos dentales que implican la exposición de tejido de pulpa dental vital.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para fomentar la formación o regeneración de dentina después de procedimientos dentales que implican la exposición de tejido de pulpa dental vital, comprendiendo el método aplicar una cantidad efectiva de una sustancia de esmalte activa sobre el tejido de pulpa dental vital expuesto después de procedimientos dentales.

La observación de que las proteínas de la matriz del esmalte son capaces de inducir la formación de dentina en el tejido de pulpa vital se hizo primero en experimentos con dientes en desarrollo donde células de pulpa fueron expuestas accidentalmente a matriz del esmalte durante un procedimiento quirúrgico para eliminar el órgano del esmalte de dientes en desarrollo en ratas. Los hallazgos han sido confirmados más tarde por experimentos repetidos tanto en ratas como en cerdos. Además, los inventores han desarrollado un modelo de trauma dental en cerdos adultos que confirma que el uso de una composición de proteína de la matriz del esmalte es altamente eficiente para inducir la formación de tejido duro en la pulpa dental expuesta. Que las proteínas del esmalte fomentan la formación de dentina en tejido de pulpa desarrollado es sorprendente puesto que estas proteínas están sólo presentes naturalmente en dientes en desarrollo y nunca presentes en otros tejidos o en tejidos dentales maduros (es decir, en adultos o chicos de más de alrededor de 12 años de edad).

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Sin desear estar limitados a ninguna teoría particular, se asume que debido a que la acción de estas moléculas durante la formación del diente está asociada con el comienzo de la mineralización tanto de la dentina como del esmalte, estas proteínas es probable que sean parte de un mecanismo para la formación de tejido dental duro. Basado en los presentes hallazgos, parecería que aunque las proteínas de la matriz del esmalte estén completamente eliminadas de del tejido dental tras el desarrollo del diente, las células en la pulpa dental del adulto mantienen su capacidad para responder a estas proteínas induciendo procedimientos de desarrollo durmientes para la formación de dentina.

Parecería que el mecanismo por el cual las proteínas de la matriz del esmalte inducen la formación de dentina difiere significativamente del mecanismo que induce la formación de cemento comunicada por L. Hammarström, J. Clin. Periodontol. 24, 1997, pp. 658-668, donde la aplicación de proteínas de la matriz del esmalte a cavidades experimentales taladradas en superficies de la raíz expuestas dio como resultado la formación de cemento cuando los dientes experimentales fueron replantados en contacto con ligamento periodontal. En el caso comunicado por Hammarström, la formación de cemento se produjo directamente sobre la superficie de tejido duro ya formado. Según la presente invención, por otra parte, se forma dentina ectópica, es decir, las proteínas de la matriz del esmalte son capaces de estimular la formación de dentina en sitios donde no se encuentran tejidos duros preexistentes.

La formación característica de nueva dentina inducida en heridas en la pulpa por DME, como se muestra en la presente invención, muestra que el DME mantiene el potencial para ser usado también para el tapado directo de la pulpa en dientes tanto traumatizados como cariados. Ya en el mercado y aprobado para aplicaciones clínicas, el DME podría usarse rápidamente para expandir las indicaciones clínicas para procedimientos exitosos de tapado directo de la pulpa.

Descripción detallada de la invención

Los dientes están compuestos de tres tejidos duros (mineralizados), a saber: esmalte, dentina y cemento, y centralmente se sitúa el tejido blando, llamado pulpa dental. La pulpa dental está compuesta principalmente de fibroblastos y contiene vasos sanguíneos y nervios. La pulpa dental de un diente completamente formado (diente maduro) está envuelta por dentina en todas las caras excepto por un pequeño orificio en el extremo apical de la raíz. La dentina es el principal tejido dental y está formada por células específicas denominadas odontoblastos. Se han distinguido diferentes tipos de dentina. La mayor parte de la dentina se forma durante el desarrollo del diente y se denomina dentina primaria. Después del periodo de desarrollo del diente, continúa cierta formación de dentina pero a una velocidad marcadamente más lenta. La dentina formada después del desarrollo del diente se denomina dentina secundaria. Ciertos eventos, tales como la aparición de caries dental, preparación de cavidad y trauma pueden inducir una forma acelerada de dentina denominada reactiva, reparadora o dentina terciaria.

Morfológicamente, la dentina primaria y secundaria es un tejido dental no celular mineralizado que contiene estrechos canales llamados túbulos dentinarios que se extienden desde la pulpa hacia la periferia. Junto a la pulpa, hay una delgada capa no mineralizada denominada predentina. La dentina reparadora puede tener ocasionalmente una morfología más irregular con distribución más irregular de los túbulos dentinarios. Ocasionalmente, la dentina puede contener células encerradas en cuyo caso se denomina osteodentina. Para una discusión adicional de la morfología dental, se hace referencia a la obra de A. R. Ten Cate, Oral Histology. Development, Structure and Function, 5ª ed. Mosby 1998, pp. 150-196.

Como se indica anteriormente, se ha encontrado sorprendentemente que la sustancia de esmalte activa es capaz de fomentar la formación de dentina reactiva en el tejido de pulpa dental incluso en dientes maduros (es decir, dientes de adultos o chicos de más de alrededor de 12 años de edad), que no estén naturalmente expuestos a matriz del esmalte o proteínas presentes en ella. En una realización particular, la invención se refiere por lo tanto al uso de una sustancia de esmalte activa para la regeneración de dentina secundaria en tejido de pulpa dental vital. La regeneración de dentina secundaria es particularmente ventajosa porque la dentina secundaria tiene una estructura que es se parece fielmente a la de la dentina primaria, y la aplicación de sustancia de esmalte activa por lo tanto participa en la restauración de la pulpa dental con una organización estructural que le da propiedades similares a la pulpa dental formada originalmente en el diente.

Por otra parte, no obstante, la sustancia de esmalte activa también es útil en la formación de dentina reparadora u osteodentina en el tejido de pulpa dental vital, asegurando por ello un rápido proceso reparador en la pulpa dental, aunque esto tiene como resultado la formación de dentina de una calidad algo peor que la dentina primaria o secundaria puesto que la composición y estructura no se parecen a la de la dentina primaria. El proceso reparador se produce principalmente tras un trauma dental importante que implica exposición de pulpa dental, o tras procedimientos dentales importantes tales como pulpotomía o pulpectomía.

Como se indica anteriormente, el uso de la sustancia de esmalte activa es particularmente útil para fomentar la formación o regeneración de dentina en tejido de pulpa dental vital en dientes salidos en los que las proteínas de la matriz del esmalte no están presentes naturalmente en cantidades suficientes para dar un efecto curativo después de procedimientos dentales. Éste es el caso tanto para adultos como chicos cuyos dientes permanentes se han desarrollado.

La capacidad de la sustancia de esmalte activa para fomentar o inducir la formación de dentina también se puede explotar junto con la preparación de la cavidad, especialmente cavidades profundas donde es deseable aumentar el grosor de la pared de dentina para evitar o reducir el riesgo de exposición de la pulpa, para evitar o reducir la exposición de la pulpa a sustancias tóxicas o irritantes, o para reducir o eliminar la hipersensibilidad que aparece a menudo tras el tratamiento dental.

Según el presente uso, la preparación de sustancia de esmalte activa se aplica preferiblemente sobre la pulpa dental antes de la aplicación de un material de relleno después de procedimientos dentales que implican la exposición de tejido de pulpa dental vital. Composiciones farmacéuticas apropiadas para tal aplicación se discuten a continuación con más detalle.

Matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y proteínas de la matriz del esmalte

La matriz del esmalte es un precursor para el esmalte y se puede obtener de cualquier fuente natural relevante, es decir, un mamífero en el que los dientes están bajo desarrollo. Una fuente apropiada son los dientes en desarrollo de animales sacrificados tales como, por ejemplo, terneras, cerdos o corderos. Otra fuente es, por ejemplo, piel de pescado.

La matriz del esmalte se puede preparar a partir de dientes en desarrollo como se describe previamente (documentos EP-B-0 337 967 y EP-B-0 263 086). La matriz del esmalte se quita raspando y se preparan derivados de la matriz del esmalte, por ejemplo, por extracción con solución acuosa tal como un tampón, un ácido o base diluidos o una mezcla de agua/disolvente, seguido por exclusión de tamaños, desalación u otras etapas de purificación, seguido opcionalmente por secado por congelación. Las enzimas se pueden desactivar por tratamiento con calor o disolventes, en cuyo caso los derivados se pueden almacenar en forma líquida sin secado por congelación.

En el presente contexto, los derivados de la matriz del esmalte son derivados de la matriz del esmalte que incluyen una o varias proteínas de la matriz del esmalte o partes de tales proteínas, producidas naturalmente por empalme o procesamiento alternos, o por rotura o enzimática o química de una proteína de longitud natural o por síntesis de polipéptidos in vitro o in vivo (métodos de ADN recombinante o cultivo de células diploides). Los derivados de proteínas de la matriz del esmalte también incluyen polipéptidos o proteínas relacionados con la matriz del esmalte. Los polipéptidos o proteínas se pueden unir a una molécula soporte biodegradable apropiada, tal como poliaminoácidos o polisacáridos, o sus combinaciones. Además, la expresión derivados de la matriz del esmalte también abarca sustancias análogas sintéticas.

Las proteínas son macromoléculas biológicas constituidas por residuos de aminoácidos unidos por enlaces de péptido. Las proteínas, como polímeros lineales de aminoácidos, también se llaman polipéptidos. Típicamente, las proteínas tienen 20-800 residuos de aminoácidos y por lo tanto tienen pesos moleculares en el intervalo desde alrededor de 6.000 hasta alrededor de varios cientos de miles de dáltones o más. Las proteínas pequeñas (menores que alrededor de 20 aminoácidos) se llaman normalmente péptidos u oligopéptidos.

Las proteínas de la matriz del esmalte son proteínas que están presentes normalmente en la matriz del esmalte, es decir, el precursor del esmalte (Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Enero, 1998, 106 Supl. 1:282-91), o proteínas que se pueden obtener por rotura de tales proteínas. En general, tales proteínas tienen un peso molecular por debajo de 120.000 dáltones e incluyen amelogeninas, no amelogeninas, no amelogeninas ricas en prolina, amelinas (ameloblastina, proteína de la funda de esmalte (sheathlin, en su nombre inglés)), tuftelinas, sialoproteína dentinaria (DSP) o sialofosfoproteína dentinaria (DSPP).

Ejemplos de proteínas para uso según la invención son amelogeninas, no amelogeninas ricas en prolina, tuftelina, proteínas de los penachos, proteínas de suero, proteínas salivales, amelina, ameloblastina, proteína de la funda de esmalte (sheathlin), y sus derivados y sus mezclas. Una preparación que contenga una sustancia de esmalte activa para uso según la invención también puede contener al menos dos de las sustancias proteináceas anteriormente mencionadas. Un producto comercial que comprende amelogeninas está comercializado como EMDOGAIN® (Biora AB) y comprende alrededor de 30 mg/ml de sustancia de esmalte activa en alginato de propilenglicol (PGA).

En general, las principales proteínas de una matriz del esmalte son conocidas como amelogeninas. Constituyen alrededor del 90% p/p de las proteínas de la matriz. El 10% p/p restante incluye no amelogeninas ricas en prolina, tuftelina, proteínas de los penachos, proteínas de suero y al menos una proteína salival; no obstante, también pueden estar presentes otras proteínas tales como, por ejemplo, amelina (ameloblastina, proteína de la funda de esmalte (sheathlin)) que han sido identificadas en asociación con la matriz del esmalte. Además, las diversas proteínas pueden ser sintetizadas y/o procesadas en diversos tamaños diferentes (es decir, diferentes pesos moleculares). Así, se ha encontrado que las proteínas dominantes en la matriz del esmalte, amelogeninas, existen en diversos tamaños diferentes que juntas forman agregados supramoleculares. Son sustancias marcadamente higroscópicas que, bajo condiciones fisiológicas, forman agregados. Pueden soportar o ser soportes para otras proteínas o péptidos.

También están contempladas otras sustancias proteínicas por ser apropiadas para uso según la presente invención. Los ejemplos incluyen proteínas tales como proteínas ricas en prolina y poliprolina. Otros ejemplos de sustancias que están contempladas por ser apropiadas para uso según la presente invención son agregados de tales proteínas, de derivados de la matriz del esmalte y/o de proteínas de la matriz del esmalte así como metabolitos de la matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y proteínas de la matriz del esmalte. Los metabolitos pueden ser de cualquier tamaño que varíe desde el tamaño de las proteínas hasta el de pequeños péptidos.

Como se menciona anteriormente, las proteínas, polipéptidos o péptidos para uso según la invención tienen típicamente un peso molecular de a lo sumo alrededor de 120 kDa, tal como, por ejemplo, a lo sumo 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa o 60 kDa, según se determina por electroforesis en SDS Page.

Las proteínas para uso según la invención se presentan normalmente en forma de una preparación en la que el contenido de proteína de la sustancia de esmalte activa en la preparación está en un intervalo desde alrededor de 0,05% p/p hasta 100% p/p tal como, por ejemplo, alrededor de 5-99% p/p, alrededor de 10-95% p/p, alrededor de 15-90% p/p, alrededor de 20-90% p/p, alrededor de 30-90% p/p, alrededor de 40-85% p/p, alrededor de 50-80% p/p, alrededor de 60-70% p/p, alrededor de 70-90% p/p, o alrededor de 80-90% p/p.

Una preparación de una sustancia de esmalte activa para uso según la invención también puede contener una mezcla de sustancias de esmalte activas con diferentes pesos moleculares.

Las proteínas de una matriz del esmalte se pueden dividir en una parte de peso molecular alto y una parte de peso molecular bajo, y se ha encontrado que una fracción bien definida de proteínas de la matriz del esmalte posee propiedades valiosas con respecto al tratamiento de los defectos periodontales (es decir, heridas periodontales). Esta fracción contiene proteínas extraíbles con ácido acético denominadas generalmente como amelogeninas y constituye la parte de peso molecular bajo de una matriz del esmalte (cf. los documentos EP-B-0 337 967 y EP-B-0 263 086).

Como se discute anteriormente, la parte de peso molecular bajo de una matriz del esmalte tiene una actividad apropiada para inducir la unión entre tejidos duros y defectos periodontales. En el presente contexto, no obstante, las proteínas activas no están restringidas a la parte de bajo peso molecular de una matriz del esmalte. Actualmente, las proteínas preferidas incluyen proteínas de la matriz del esmalte tales como amelogenina, amelina, tuftelina, DSP, etc. con pesos moleculares (como se miden in vitro con SDS-PAGE) por debajo de alrededor de 60.000 dáltones.

Por consiguiente, se contempla que la sustancia de esmalte activa para uso según la invención tiene un peso molecular de hasta alrededor de 40.000, tal como, por ejemplo, un peso molecular de entre alrededor de 5.000 y alrededor de 25.000.

Dentro del alcance de la presente invención está también el uso según la invención de péptidos como los descritos en el documento WO 97/02730, es decir, péptidos que comprenden al menos una secuencia de elementos seleccionados del grupo que consiste en tetrapéptidos DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), VTKG (Val-Thr-Lys-Gly), ERGE (Glu-Lys-Gly-Glu) y DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu) y que comprenden además una secuencia de aminoácidos de la cual una cadena consecutiva de 20 aminoácidos es idéntica hasta un grado de al menos 80% a una cadena de aminoácidos que tengan la misma longitud seleccionados del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1 y una secuencia que consiste en los aminoácidos 1 hasta 103 de la SEQ ID NO:1 y aminoácidos 6 hasta 324 de la SEQ ID NO:2.

Con la expresión "identidad secuencial" se quiere decir la identidad en la secuencia de aminoácidos en la coincidencia con respecto a la identidad y posición de los aminoácidos de los péptidos. Un espacio se cuenta como sin identidad para uno o más aminoácidos según sea apropiado.

Tales péptidos pueden comprender desde 6 hasta 300 aminoácidos, por ejemplo, al menos 20 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, tal como al menos 60 aminoácidos, al menos 90 aminoácidos, al menos 120 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos o al menos 200 aminoácidos.

Un método para el aislamiento de las proteínas de la matriz del esmalte implica la extracción de las proteínas y la eliminación de los iones calcio y fosfato del hidroxiapatito solubilizado mediante un método apropiado, por ejemplo, filtración sobre gel, diálisis o ultrafiltración (véase, por ejemplo, el trabajo de Janson, J-C y Rydén, L. (Eds.), Protein purification, VCH Publishers 1989, y Harris, ELV y Angal, S., Protein purification methods-A practical approach, IRL Press, Oxford 1990).

Una preparación de proteína liofilizada típica puede contener principal o exclusivamente hasta 70-90% de amelogeninas con un peso molecular (MW) entre 40.000 y 5.000 dáltones, estando completado el 10-30% de péptidos menores, sales y agua residual. Las bandas de proteína principal son a 20 kDa, 12-14 kDa y alrededor de 5 kDa, como se determina por SDS-PAGE.

Separando las proteínas, por ejemplo, por precipitación, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis preparativa, cromatografía de penetración en gel, cromatografía de fase inversa o cromatografía de afinidad, se pueden purificar las amelogeninas de diferente peso molecular.

La combinación de amelogeninas de peso molecular se puede variar, desde un compuesto dominante de 20 kDa hasta un agregado de amelogeninas con muchos pesos moleculares diferentes entre 40 y 5 kDa, y hasta un compuesto dominante de 5 kDa. Otras proteínas de la matriz del esmalte, tales como amelina, tuftelina, o enzimas proteolíticas encontradas normalmente en la matriz del esmalte, se pueden añadir y llevar por el agregado de amelogenina.

Como una fuente alternativa de derivados o proteínas de la matriz del esmalte también se pueden usar vías sintéticas generalmente aplicables muy conocidas para una persona experta en la técnica o usar de células cultivadas de bacterias modificadas mediante técnicas de ADN recombinante (véase, por ejemplo, el trabajo de Sambrook, J., et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Propiedades físico-químicas de la matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y proteínas de la matriz del esmalte

En general, la matriz del esmalte, los derivados de la matriz del esmalte y las proteínas de la matriz del esmalte son sustancias hidrófobas, es decir, poco solubles en agua, especialmente a temperaturas aumentadas. En general, estas proteínas son solubles a valores de pH no fisiológicos y a baja temperatura, tal como alrededor de 4-20ºC, mientras que se agregarán y precipitarán a temperatura corporal (35-37ºC) y pH neutro.

La matriz del esmalte, los derivados de la matriz del esmalte y/o las proteínas de la matriz del esmalte para uso según la invención también incluyen una sustancia de esmalte activa, en la que al menos una parte de la sustancia de esmalte activa está en forma de agregados o después de la aplicación in vivo es capaz de formar agregados. El tamaño de partículas de los agregados está en un intervalo desde alrededor de 20 nm hasta alrededor de 1 \mum.

También se ha observado (por los presentes inventores) que la matriz del esmalte, los derivados de la matriz del esmalte y las proteínas de la matriz del esmalte poseen propiedades bioadhesivas, es decir, tienen capacidad para adherirse firmemente a superficies de tejidos. Estas propiedades son las más valiosas en relación con el tratamiento endodóncico no menor debido a que aseguran un contacto rápido e íntimo entre las proteínas de la matriz del esmalte y los odontoblastos que producen dentina para facilitar el proceso de regeneración de la raíz dental.

Teorías con respecto al mecanismo de acción

La matriz del esmalte es un ejemplo de una matriz de proteína extracelular que se adhiere a las superficies minerales así como a superficies proteináceas. A pH y temperatura fisiológicos, las amelogeninas presentes en la matriz del esmalte forman un agregado supramolecular insoluble (Fincham et al., en J. Struct. Biol. 1994 marzo-abril; 112(2):103-9 y en J. Struct. Biol. 1995 julio-agosto; 115(1):50-9), que se degrada gradualmente mediante las enzimas proteolíticas (ocurre tanto in vivo como in vitro con tal que las proteasas no hayan sido sometidas a inactivación).

La reciente observación de que la matriz del esmalte se forma y está presente temporalmente durante la formación de la raíz y del cemento de la raíz puede explicar cómo la aplicación de matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y/o proteínas de la matriz del esmalte fomenta la regeneración del tejido periodontal. No obstante, la observación que sostiene la presente invención de que la matriz del esmalte, los derivados de la matriz del esmalte y/o las proteínas de la matriz del esmalte también ejercen un efecto positivo sobre la formación o regeneración del tejido endodóncico, es decir, el tejido de la pulpa dental, es muy sorprendente.

En una realización de la presente invención, se usa cemento de vidrio-ionómero para la restauración de una cavidad después del procedimiento de tapado de la pulpa y no el sistema de resina adhesiva. En ello se usa DME para inducir la curación de la herida de la pulpa y la rápida formación de dentina, significando que los dientes tratados con DME desarrollan características de curación de heridas clásica, es decir, capa superficial o postilla, que consiste en proteínas de matriz extracelular y restos de células necróticas, cubriendo una zona de infiltrado de células inflamatorias crónico. El DME en esta realización fomenta además la formación de un puente de nueva dentina, sellando la herida desde el tejido de la pulpa sana, en el que el tejido de la pulpa subyacente a la nueva dentina está libre de signos de inflamación. Además, se forma una capa intacta de odontoblastos funcionales, que linda con la dentina nuevamente
formada.

Estos hallazgos sugieren que el DME tiene el potencial para inducir rápidamente la formación de nueva dentina cuando se aplica sobre una herida de la pulpa de la corona sin afectar a la parte más apical del tejido de la pulpa. El aislamiento del tejido herido del tejido de la pulpa sana residual se puede ver como una forma ideal de curación de la pulpa para uso clínico. El efecto del DME se parece al efecto de una postilla durante la curación de una herida dérmica, fomentando la cascada de curación de una herida clásica y la subsiguiente regeneración o reparación del tejido.

Se ha mostrado previamente en experimentos clínicos que la capa de proteína formada por el DME se mantiene sobre la superficie de la herida durante al menos una semana después de la aplicación (Gestrelius, S., Anderson, C., Johansson, A.C., Persson, E., Brodin, A., Rydhag, L., Hammarstrom, L. (1997), Formulation of enamel matrix derivative for surface coating. Kinetics and cell colonization. J. Clin. Periodontol.: 678-684). Recientemente, también se ha comunicado que el crecimiento de bacterias gram-negativas se inhibe por la presencia de DME. Por lo tanto, los componentes de DME pueden actuar no solamente como una señal para la diferenciación y maduración de células mesenquimales en el tejido de la pulpa herida, sino también formando una matriz extracelular estable que actúa como una costra protectora que cubre la herida como una postilla.

El (los) mecanismo(s) que soporta(n) la inducción de formación de nueva dentina por DME no se conoce(n) aún en detalle. No obstante, hallazgos de laboratorio recientes sugieren que el DME induce una señal intracelular de AMP-cíclico que pone en funcionamiento la expresión de crecimiento de la autocrina a partir de células de fibroblastos en una cascada bien orquestada (Lyngstadaas, S.P., Lundberg, E., Ekdahl, H., Andersson, C. y Gestrelius, S. (2000). Autocrine growth factors in human periodontal ligament cells cultured on enamel matrix derivative. J. Clin. Periodontol. (en prensa)). A continuación de la liberación de los factores de crecimiento, las células expuestas a DME proliferan y madurar entonces en células que segregan matriz extracelular. Mecanismos similares también pueden estar en juego cuando la herida de la pulpa se cura en presencia de DME.

En una realización de la presente invención, el DME por lo tanto proporciona al menos un ambiente protector favorable para la curación de las heridas de la pulpa. No obstante, la gran cantidad de dentina que se forma rápidamente delineada por nuevos odontoblastos funcionales sugiere que el DME actúa más directamente induciendo la diferenciación de células mesenquimales y/o la maduración de células precursoras de odontoblastos que residen en la pulpa.

Una preparación de la sustancia de esmalte activa se formula normalmente como una composición farmacéutica. Tal composición puede consistir, por supuesto, en la preparación proteinácea o puede comprender además un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. El diluyente puede ser típicamente agua en la que se disuelve la sustancia de esmalte activa antes de la aplicación al tejido endodóncico.

Composiciones farmacéuticas

En lo siguiente, se dan ejemplos de composiciones apropiadas que contienen la sustancia de esmalte activa.

Para la administración a un individuo (un animal o un ser humano), la matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y/o proteínas de la matriz del esmalte (en lo sucesivo también denominados "sustancia de esmalte activa") y/o una preparación de la misma se formulan preferiblemente en una preparación farmacéutica que contiene la sustancia de esmalte activa y, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones pueden estar en forma de, por ejemplo, composiciones sólidas, semisólidas o líquidas tales como, por ejemplo:

polvos, gránulos, granulados, cápsulas, perlas de agarosa o quitosán, comprimidos, pelets, microcápsulas, microesferas, nanopartículas o polvos, gránulos, granulados o pelets secados por congelación,

geles, hidrogeles, pastas,

soluciones, dispersiones, suspensiones, emulsiones, mezclas,

kits que contienen, por ejemplo, dos recipientes separados, en los que el primero de los recipientes contiene la sustancia de esmalte activa opcionalmente mezclada con otra(s) sustancia(s) medicamento(s) activa(s) y/o excipientes farmacéuticamente aceptables y conteniendo el segundo recipiente un medio apropiado destinado a ser añadido al primer recipiente antes del uso con el fin de obtener una composición lista para el uso.

Las composiciones se pueden formular según la práctica farmacéutica convencional, véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" y "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", editada por Swarbrick, J.&J. C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1988.

Aparte de la sustancia de esmalte activa, una composición farmacéutica para uso según la invención puede comprender excipientes farmacéuticamente aceptables.

Un excipiente farmacéuticamente aceptable es una sustancia que es sustancialmente inofensiva para el individuo al cual se va a administrar la composición. Tal excipiente cumple normalmente los requerimientos dados por las autoridades sanitarias nacionales. Las farmacopeas oficiales, tales como, por ejemplo, la farmacopea británica, la farmacopea de los Estados Unidos de América y la Farmacopea europea establecen estándares para los excipientes farmacéuticamente aceptables.

La elección de excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s) en una composición para uso según la invención y la óptima concentración de la misma no se puede predecir generalmente y debe ser determinada sobre la base de una evaluación experimental de la composición final. No obstante, una persona experta en la técnica de la formulación farmacéutica puede encontrar guía en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18ª edición, Mack Publishing Company, Easton, 1990.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir disolventes, agentes de tamponamiento, conservantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizadores, agentes de suspensión y agentes formadores de gel.

Ejemplos de disolventes son, por ejemplo, agua, alcoholes u otros disolventes hidrófilos o etéreos tales como ácidos débiles con un pH de alrededor de 5,5-6,0 que faciliten la posterior aplicación de los materiales de relleno en el diente.

Ejemplos de agentes de tamponamiento son, por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido hidrogenofosfórico, dietilamina, etc.

Ejemplos apropiados de conservantes para uso en las composiciones son los parabenes, tales como p-hidroxibenzoato de metilo, etilo, propilo, butilparabén, isobutilparabén, isopropilparabén, sorbato potásico, ácido sórbico, ácido benzoico, benzoato de metilo, fenoxietanol, bronopol, bronidox, hidantoína MDM, butilcarbamato de yodopropinilo, cloruro de benzalconio y alcohol bencílico, o mezclas de conservantes.

Ejemplos de antioxidantes son hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico y sus derivados, tocoferol y sus derivados, cisteína, y sus mezclas.

Ejemplos de agentes de suspensión son, por ejemplo, celulosas y derivados de celulosas tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina (por ejemplo Avicel® RC 591), carragenina, goma de acacia, goma arábiga, tragacanto, y sus mezclas.

Ejemplos de bases de gel o agentes que incrementan la viscosidad son parafina líquida, polietileno, aceites grasos, sílice coloidal o jabones de aluminio y cinc, glicerina, propilenglicol, tragacanto, polímeros de carbovinilo, silicatos de magnesio-aluminio, Carbopol®, polímeros hidrófilos tales como, por ejemplo, almidón o derivados de celulosa tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa y otros derivados de celulosa, hidrocoloides que se hinchan con agua, carragenanos, hialuronatos, y alginatos incluyendo alginato de propilenglicol.

Ejemplos de componentes del polvo son: alginato, colágeno o lactosa. Normalmente, los polvos destinados para aplicación sobre pulpas dentales deben ser estériles y las partículas presentes deben estar micronizadas.

Ejemplos de otros excipientes son polímeros tales como carmelosa, carmelosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, pectina, goma de xantano, goma de algarrobilla, goma de acacia, gelatina, carbómero, emulsionantes como vitamina E, estearatos de glicerilo, glucósido de cetanilo, colágeno, carragenina, hialuronatos y alginatos y quitosanes.

Las composiciones apropiadas para uso según la invención también se pueden presentar en forma de suspensiones, emulsiones o dispersiones. Tales composiciones contienen la sustancia de esmalte activa en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión, y/o uno o más conservantes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Los agentes dispersantes o humectantes apropiados son, por ejemplo, fosfatidas que se presentan naturalmente, por ejemplo, lecitina o lecitina de soja; productos de condensación de óxido de etileno con, por ejemplo, un ácido graso, un alcohol alifático de cadena larga o un derivado de éster parcial de ácidos grasos y un hexitol o un anhídrido de hexitol, por ejemplo, estearato de polioxietileno, monooleato de sorbitol y polioxietileno, monooleato de sorbitán y polioxietileno, etc.

Dosificaciones de la matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y proteínas de la matriz del esmalte

En una composición farmacéutica para uso según la invención, una sustancia de esmalte activa está generalmente presente en una concentración que varía desde alrededor de 0,01% hasta alrededor de 99,9% p/p. La cantidad de composición aplicada dará como resultado normalmente una cantidad de proteína total por cm^{2} de área de pulpa dental que corresponde a desde alrededor de 0,005 mg/mm^{2} hasta alrededor de 5 mg/mm^{2}, tal como desde alrededor de 0,01 mg/mm^{2} hasta alrededor de 3 mg/mm^{2}.

En aquellos casos donde la sustancia de esmalte activa se administra en forma de una composición líquida, la concentración de la sustancia de esmalte activa en la composición está en un intervalo que corresponde a desde alrededor de 0,01 hasta alrededor de 50 mg/ml, por ejemplo, desde alrededor de 0,1 hasta alrededor de 30 mg/ml. En algunos casos, son deseables mayores concentraciones y también se pueden obtener, tal como una concentración de al menos alrededor de 100 mg/ml. Las áreas defectuosas en la pulpa dental en seres humanos típicamente tienen un tamaño de alrededor de 5-10 x 2-4 x 5-10 mm que corresponden a alrededor de 200 \mul y normalmente se aplica a lo sumo alrededor de 0,5-1 ml, tal como alrededor de 0,2-0,3 ml por diente de una composición que tiene una concentración de alrededor de 1-40 mg de proteína total/ml, tal como, se aplica, por ejemplo, 5-30 mg/ml. 0,2-0,3 mg/ml corresponde a alrededor de 6 mg de proteína por 25-100 mm^{2} o alrededor de 0,1 mg/mm^{2} si se calcula sólo sobre la superficie de la raíz. Normalmente, se aplica un volumen excesivo para cubrir las superficies afectadas adecuadamente. Incluso una multicapa sólo requeriría una pequeña fracción de las cantidades anteriormente mencionadas.

La presente invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos que no están destinados en forma alguna a limitar el alcance de la invención tal como se reivindica.

Leyendas de las figuras

Figura 1

La Figura 1 muestra una micrografía que muestra dientes premolares dos semanas después del tratamiento con DME.

La herida de la pulpa tiene características de una herida activa clásica, es decir, una capa superficial necrótica que cubre una zona estrecha de infiltrado de células inflamatorias crónico. El tejido similar a nueva dentina (ND) se forma en el borde entre el tejido herido y el tejido de la pulpa subyacente sano. Secciones teñidas con H y E, la barra de escala es 1 mm.

Figura 2

Muestra una micrografía que muestra dientes premolares dos semanas después del tratamiento con Ca(OH)_{2}. Se puede observar tejido de pulpa que parece normal sin células inflamatorias adyacente a la herida de la pulpa, semejando una herida inactiva típica para una quemadura química. No se observó nueva dentina u odontoblastos en o cerca de la herida en estos dientes. Secciones teñidas con H y E, la barra de escala es 1 mm.

Figura 3

Que muestra dientes premolares cuatro semanas después del tratamiento con DME. La herida de la pulpa muestra ahora características de una curación de una herida clásica, es decir, una capa superficial o postilla, que consiste en proteínas de matriz extracelular y restos de células, que cubren una zona de infiltrado de células inflamatorias crónico. Subyacente a la herida que se cura, se está formando un puente de nuevo tejido similar a dentina (ND), sellando la herida desde la pulpa sana. Secciones teñidas con H y E, la barra de escala es 0,5 mm.

Figura 4

Muestra una mayor ampliación de la Fig. 3, el nuevo tejido duro está bordeado con células similares a odontoblastos y el tejido subyacente al puente que se forma es sano y libre de células inflamatorias. Secciones teñidas con H y E, la barra de escala es 1 mm.

Figura 5

Que muestra dientes premolares cuatro semanas después del tratamiento con Ca(OH)_{2}. Se puede observar tejido de pulpa que parece normal sin células inflamatorias adyacente a la herida de la pulpa inactiva. Se forma una pequeña cantidad de nueva dentina a lo largo de las paredes de la dentina preexistente adyacentes a la herida. C es la cavidad experimental. D es dentina, ND es tejido similar a dentina nuevamente formado y P es tejido de la pulpa. Secciones teñidas con H y E, la barra de escala es 0,5 mm.

Figura 6

Figura 7

Micrografías que muestran dientes premolares dos semanas después del tratamiento con DME o Ca(OH)_{2}.

La Figura 7a) muestra un diente tratado con DME. La herida de la pulpa muestra características de una herida activa clásica, es decir, una capa superficial necrótica que cubre una estrecha zona de infiltrado de células inflamatorias crónico. La nueva dentina (ND) se forma en el borde entre el tejido herido y el tejido de pulpa subyacente sano.

La Figura 7b) muestra un diente tratado con Ca(OH)_{2}. Se puede observar tejido de pulpa que parece normal sin células inflamatorias adyacente a la herida de la pulpa, pareciendo una herida inactiva típica para una quemadura química. No se observaron nueva dentina u odontoblastos en o junto a la herida en estos dientes. C es la cavidad experimental. D es dentina, ND es dentina nuevamente formado y P es tejido de pulpa. Secciones teñidas con H y E, la barra de escala es 1 mm.

Figura 8

Micrografías que muestran dientes premolares cuatro semanas después del tratamiento con DME o Ca(OH)_{2}.

La Figura 8a) muestra un diente tratado con DME. La herida de la pulpa muestra ahora características de una curación de herida clásica, es decir, una capa superficial o postilla, que consiste en proteínas de matriz extracelular y restos de células, que cubren una zona de infiltrado de células inflamatorias crónico. Subyacente a la herida que se cura se está formando un puente de nueva dentina (ND), sellando la herida desde el tejido de pulpa sana.

La Figura 8b) muestra una mayor ampliación de la 8a), la nueva dentina está bordeada con odontoblastos que parecen normales y el tejido subyacente al puente de dentina que se forma está sano y libre de células inflama-
torias.

La figura 8c) muestra un diente tratado con Ca(OH)_{2}. Se puede observar tejido de pulpa que parece normal sin células inflamatorias adyacente a la herida de la pulpa inactiva. Se forma una pequeña cantidad de nueva dentina a lo largo de las paredes de la dentina adyacentes a la herida. Ocasionalmente, se podrían observar pequeñas islas de dentina irregular en el tejido de pulpa circundante a cierta distancia del sitio de la herida. C es la cavidad experimental. D es dentina, ND es dentina nuevamente formada y P es tejido de pulpa. Secciones teñidas con H y E, la barra de escala es 1 mm (a y c) o 0,5 mm (b).

Figura 9

Gráfico que expresa la cantidad total de nueva dentina formada después de dos y cuatro semanas en dientes experimentales después de la aplicación de DME o Ca(OH)_{2} y sellado de la cavidad. La cantidad de nueva dentina se presenta en mm^{2}, medida por histometría en secciones en serie. En ambas etapas, la cantidad de nueva dentina formada en los dientes tratados con DME fue significativamente mayor que en los dientes tratados con Ca(OH)_{2}. n=11 en todos los tiempos. Las barras de error dan \pm DE. p<0,001 para ambas series.

Figura 10

Micrografías que muestran dientes incisivos 3, 4 y 8 semanas después del tratamiento con DME (Fig. 10-a, b, c) o Ca(OH)_{2} (Fig. 10-d,e,f).

a) Micrografía de pulpa amputada tratada con DME después de 3 semanas. La herida de la pulpa tiene características de una capa de "postilla" superficial necrótica que cubre una zona de infiltrado moderado de células inflamatorias.

b) Micrografía de pulpa amputada tratada con DME después de 4 semanas. Moderadas cantidades de nuevo tejido similar a dentina forman puente en toda la anchura de la cavidad en la interfaz entre el tejido de pulpa herido y el no dañado.

c) Micrografía de pulpa amputada tratada con DME después de 8 semanas. Se puede observar la formación de puente de dentina en la pulpa vital a cierta distancia del sitio amputado, sellando el tejido de pulpa herida y postilla con células inflamatorias (IC).

d) Micrografía de pulpa amputada tratada con Ca(OH)_{2} después de 3 semanas. Hay necrosis por licuefacción junto a la pasta de hidróxido cálcico (CA). Se observa una zona de predentina nuevamente formada formándose sobre y a lo largo de la pared de dentina circumpulpal subyacente al sitio de la amputación.

e) Micrografía de pulpa amputada tratada con Ca(OH)_{2} después de 4 semanas. Dentina secundaria nuevamente formada se forma directamente sobre y a lo largo de las paredes de dentina preexistente que lleva a un estrechamiento significativo de la cámara de la pulpa.

f) Micrografía de pulpa amputada tratada con Ca(OH)_{2} después de 8 semanas. El puente de dentina resultante es una capa significativamente más delgada que los puentes formados en los dientes tratados con DME.

D es dentina, P es tejido de pulpa, IC es células inflamatorias y CA es pasta de hidróxido cálcico (Ampliación del original x 20. Sección teñida con H y E, la barra de escala es 1 mm).

Figura 11

Mayor ampliación de la Fig. 10a y la Fig. 10d.

a) En los dientes tratados con DME es evidente un marcado aumento en la angiogénesis en la parte más profunda del tejido de la pulpa subyacente a los sitios de aplicación.

b) Nuevos vasos sanguíneos situados junto a los odontoblastos preexistentes indican una actividad aumentada en estas células.

D es dentina, P es tejido de pulpa, CA es pasta de hidróxido cálcico (Ampliación del original x 40. Sección teñida con H y E, la barra de escala es 0,5 mm).

Figura 12

Mayor ampliación de la Fig. 10b y la Fig. 10e.

a) En los dientes tratados con DME, una red de islotes de nuevo tejido duro en íntimo contacto con células similares a odontoblastos nuevamente formadas rodeaban el puente de nueva dentina sobre la cara apical.

b) En los dientes de control, el nuevo tejido duro parece dentina secundaria que se forma sólo sobre la pared del canal de la raíz y no se observó formación de puente en esta etapa.

D es dentina, P es tejido de pulpa y CA es pasta de hidróxido cálcico (Ampliación del original x 40. Sección teñida con H y E, la barra de escala es 0,5 mm).

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Figura 13

Mayor amplificación de la Fig. 10c y la Fig. 10f.

a) En los dientes tratados con DME, los puentes de dentina están bordeados con células similares a odontoblastos y el tejido subyacente al puente está sano y libre de células inflamatorias.

b) En los dientes de control, el puente de dentina formado es significativamente más fino que en los dientes tratados con DME.

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Sección experimental Ejemplo 1

Seis cerdos miniatura de Göttingen adultos (18 meses de edad o mayores) (disponibles de Mølleg\ring{a}rd (Dinamarca) se anestesiaron con Dormicum (un anestésico general disponible de Roche, Suiza) y también se anestesiaron localmente mediante inyección de Xylocaína y adrenalina. Las pulpas de premolares y molares maxilares permanentes (un total de 36 dientes) se expusieron en cavidades bucales de clase V usando una fresa de acero redonda (Nº 12) esterilizada con pulverización de solución salina. La parte más coronal de la pulpa se extrajo después para hacer una herida en la pulpa con un área mayor que 2 milímetros cuadrados. La vitalidad de la pulpa se demostró por el abundante sangrado que se controló usando pelets de algodón estériles. Después de que se hubiera detenido el sangrado, se aplicaron directamente sobre la pulpa expuesta un derivado de la matriz del esmalte (DME, Emdogain®, disponible de Biora AB) o pasta de Ca(OH)_{2} (Dycal Dentine, disponible de Dentsply De Trey, Suiza) como control. Las cavidades se sellaron con un relleno de vidrio-ionómero disponible comercialmente (GC Fuji II, Fuji Co., Japón) en un procedimiento que imita las situaciones clínicas ordinarias.

Después de dos o cuatro semanas, se sacrificaron los animales y se extrajeron los dientes experimentales y se metieron en parafina y las secciones histológicas se tiñeron con hematoxilina y eosina. La microscopia de las secciones histológicas reveló un grueso cierre similar a dentina de la cámara de la pulpa adyacente al material de relleno después de cuatro semanas en el lugar donde se había aplicado DME (Figs. 1-3). En los controles sin DME no o sólo se observó formación de dentina rudimentaria y ninguno de los dientes de control exhibieron cierres completos de la cámara de la pulpa (Figs. 4-6).

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Ejemplo 2

Tejido de pulpa coronal de premolares y molares maxilares permanentes en cerdos miniatura se expuso mediante cavidades bucales de clase V. La pulpa expuesta se tapó con DME. Se usó pasta de hidróxido cálcico como material de cobertura en los dientes de control contralaterales. Después del procedimiento, las cavidades fueron selladas con cemento de vidrio-ionómero. A 2 y 4 semanas tras la cirugía, se prepararon secciones en serie y se tiñeron con hematoxilina y eosina y se analizaron en ciego por histometría. En los dientes tratados con DME, grandes cantidades de dentina nuevamente formada con odontoblastos lindantes perfilaban la herida de la pulpa, aislando el área de la cavidad del tejido de pulpa sano restante. Células inflamatorias estaban presentes en la herida pero no subyacentes a la dentina nuevamente formada en estos dientes. Los dientes de control tratados con hidróxido cálcico mostraron sólo formación de nueva dentina fragmentaria. La cantidad de nueva dentina en los dientes tratados con DME era más del doble de la de los controles (p<0,001).

Procedimiento quirúrgico

En estos experimentos se usó un total de 22 dientes de 4 cerdos miniatura adultos. Los animales fueron anestesiados con una inyección intramuscular de 10 ml de Ketalar® y 8 ml de pentobarbital i.v. Los sitios quirúrgicos se infiltraron con Xylocain® (20 mg/ml) y adrenalina (12,5 \mug/ml). Cada pulpa de diente se expuso por trepanación a través de una cavidad bucal de clase V de 2 mm de diámetro usando fresas estériles y pulverización de solución salina estéril. El sangrado se controló con pelets de algodón estériles. El tejido de pulpa expuesto se tapó después con EMDOGAIN® (BIORA AB, Malmö, Suecia) o hidróxido cálcico (Dycal®: DENTSPLY, Konstanz, Alemania), y cada cavidad se rellenó con cemento de vidrio-ionómero (GC Fuji II®: GC Corporation, Tokio, Japón).

Examen histológico

A 2 y 4 semanas después de la cirugía, los animales fueron sacrificados mediante inyección de un bolo intracardiaca de 50 ml de pentobarbital sódico en etanol. Después de la eutanasia, todos los dientes experimentales y el hueso alveolar adyacente fueron extraídos en bloque y fijados en formaldehído tamponado neutro al 4% durante 24 horas. Las muestras fueron después desmineralizadas en EDTA al 12,5% y posteriormente metidas en parafina. Después del seccionamiento en serie (6 \mum), cada segunda sección se tiñó con hematoxilina y eosina. Después, se analizaron series de secciones que contenían tejido de pulpa coronal en un microscopio óptico equipado para histometría (Olympus Microimage®).

Análisis cuantitativo de la dentina nuevamente formada

La cantidad de nueva dentina formada adyacente a la cavidad calibrada en cada diente experimental se evaluó en las 20 secciones más centrales de cada diente midiendo el área de nueva dentina en cada segunda sección teñida. La distancia de corte apical se fijó a 3 mm desde la parte inferior de la cavidad experimental.

Resultados

Dos semanas después de la cirugía, se observó una capa necrótica cubriendo una zona de infiltrado de células inflamatorias moderado a crónico adyacente a las cavidades experimentales en los dientes tratados con DME. Nódulos de dentina nuevamente formada perfilados por una capa de odontoblastos distintos bordeaban la herida (Fig. 7a).

En los dientes tratados con Ca(OH)_{2}, no había signos de inflamación a esta edad, y se mostró tejido conjuntivo que parecía normal en íntimo contacto con el material de cubrición. No obstante, no había odontoblastos o nueva dentina presentes adyacentes a la cavidad experimental en estos dientes (Fig. 7b).

Cuatro semanas después de la cirugía, se había formado una gran cantidad de nueva dentina, formando puente en toda la anchura de la cavidad, en la interfaz entre el tejido herido y el tejido de pulpa vital en los dientes tratados con DME. En consecuencia, se observó formación de puente de dentina en la pulpa vital a cierta distancia de la parte más apical de la cavidad experimental, sellando la parte traumatizada de la pulpa incluyendo el tejido necrosado y las células inflamatorias (Figs. 8a y 8b). El tejido de la pulpa subyacente al puente de dentina parecía normal y libre de inflamación. Se pudo observar una capa distinta de odontoblastos funcionales lindando con la dentina nuevamente formada.

En los controles de hidróxido cálcico, sólo se observó una pequeña cantidad de nueva dentina dispersa en asociación con el sitio expuesto a cuatro semanas tras la cirugía, principalmente adyacente a la vieja dentina. En alguno de estos dientes, se pudieron demostrar pequeñas cantidades de un tejido duro, reactivo e irregular en la herida de la pulpa. No había signos de inflamación en los dientes tratados con Ca(OH)_{2} (Fig. 8c).

Los análisis cuantitativos de la dentina nuevamente formada calculada como la suma de áreas cubiertas por la nueva dentina en las cinco secciones más centrales de cada cavidad experimental revelaron un aumento significativo (p<0,001) en la formación de dentina en los dientes tratados con DME cuando se comparan con el tratamiento con Ca(OH)_{2} (Fig. 9). Después tanto de dos como de cuatro semanas, la cantidad de dentina en los dientes tratados con DME era más del doble de la de los controles.

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Ejemplo 3

Este estudio se diseñó para examinar si el derivado de la matriz del esmalte (DME) podría inducir la formación de dentina reparadora sin provocar efectos secundarios adversos en los dientes pulpotomizados. Para este fin, se llevaron a cabo pulpotomías en 36 dientes incisivos inferiores de 11 cerdos miniatura adultos. A continuación del procedimiento quirúrgico, se trató el tejido de pulpa expuesto con DME o se cubrió con una preparación de hidróxido cálcico. Después de un periodo de observación de 2, 3, 4 y 8 semanas, los dientes experimentales se extrajeron y examinaron histológicamente. Los resultados demostraron que en los dientes tratados con DME, la formación de cantidades sustanciales de tejido similar a dentina conducía consistentemente a una completa formación de puente de tejido duro de los defectos. El comienzo de la formación de tejido duro se pudo observar ya después de dos semanas y se localizó sólo en la región herida de la pulpa. La formación de dentina, aunque no en la misma extensión que la observada en los dientes tratados con DME, también se observó en los dientes tratados con hidróxido cálcico. No obstante, en estos dientes control el nuevo tejido duro se formó a expensas de la anchura de la cámara de la pulpa, produciendo estrechamiento del canal de la raíz y subsiguiente estrangulación del tejido de pulpa. La cantidad total del tejido mineralizado nuevamente formado en los dientes tratados con DME, calculada como área total usando análisis hitomorfométrico digital de las cinco secciones más centrales de cada cavidad experimental, era significativamente mayor (p<0,005) que en las muestras de control tratadas con hidróxido cálcico.

Conclusión: Estos resultados demuestran el potencial del DME como agente de arreglo de la pulpa biológicamente activo que induce específicamente la curación de heridas de la pulpa y la formación de dentina un dientes pulpotomizados sin afectar a la función normal de la pulpa restante.

Materiales y métodos Procedimiento quirúrgico

Se usó un número total de 36 dientes incisivos inferiores permanentes de 11 cerdos miniatura adultos con una edad media de 3 años. Los animales fueron divididos en tres grupos. Los tiempos de observación fueron tres semanas (n=4 dientes/tratados con DME, n=4 dientes/tratados con Ca(OH)_{2}), cuatro semanas (n=7 dientes/tratados con DME, n=7 dientes/tratados con Ca(OH)_{2}), y ocho semanas (n=7 dientes/tratados con DME, n=7 dientes/tratados con Ca(OH)_{2}), respectivamente. Los animales fueron anestesiados con una inyección de 10 ml de Ketalar® i.m. y 8 ml de pentobarbital i.v. Los sitios quirúrgicos se infiltraron con anestésico local de Xylocain® (20 mg/ml) y adrenalina (12,5 \mug/ml). Con el fin de facilitar la preparación de la cavidad durante la pulpotomía, se eliminaron las coronas de los incisivos en las cervices gingivales. Posteriormente, se prepararon las cavidades de acceso a través de la superficie oclusal con una fresa de diamante usada en un taladro de alta velocidad. Finalmente, se usó una fresa de acero redonda a baja velocidad para exponer la pulpa y extraerla. Durante todas las etapas del procedimiento operativo, el diente y los instrumentos de corte estuvieron irrigados con pulverización de solución salina estéril. El sangrado se controló con pelets de algodón estériles. El tejido de la pulpa expuesto se cubrió después con DME (EMDOGAM® Gel; 30 mg/ml en alginato de propilenglicol (PGA); BIORA AB, Malmö, Suecia) o hidróxido cálcico (Dycal®: DENTSPLY, Konstanz, Alemania). Posteriormente, cada cavidad se rellenó con cemento de vidrio-ionómero (GC Fuji II®: GC Corporation, Tokio, Japón) para asegurar el sellado de la cavidad y restaurar la función dental.

Examen histológico

A 3, 4 u 8 semanas después de la cirugía, los animales fueron sacrificados mediante una inyección de un bolo intracardiaca de 50 ml de pentobarbital sódico en etanol. Después de la eutanasia, todos los dientes experimentales fueron extraídos y fijados en formaldehído tamponado neutro al 4% durante 24 horas. Las muestras fueron después desmineralizadas en EDTA al 12,5% y posteriormente metidas en parafina. Después del seccionamiento en serie longitudinal (6 \mum), cada segunda sección se tiñó con hematoxilina y eosina. Después, se analizaron series de secciones que contenían tejido de pulpa en un microscopio óptico equipado para histometría.

Análisis cuantitativo de nuevos tejidos duros

La cantidad de nuevo tejido duro formado adyacente a la cavidad fue evaluada en las secciones centrales (n=5) de cada diente experimental. Las áreas cubiertas por tejido duro nuevamente formado en estas secciones se midieron usando equipo de histometría digital (Olympus Microimage®: Media Cybernetics, Maryland, EE UU). El límite para el análisis histométrico se fijó arbitrariamente a 2 mm apicalmente desde la parte inferior de la preparación de las cavidades experimentales.

Resultados

Tres semanas después de la aplicación de DME, se observó un tejido acelular cubriendo una zona con un infiltrado de células inflamatorias moderado en la herida de la pulpa en las secciones histológicas. Un notable aumento de la angiogénesis fue evidente en la parte más profunda del tejido de la pulpa debajo de los sitios de aplicación (Figs. 10a, 11a) y en la mitad de los dientes se observaron pequeñas islas que consistían en un tejido similar a osteodentina formándose subyacente al sitio de amputación. La representación histológica de los dientes tratados con DME semejaba fielmente el de la curación de heridas normal incluyendo la formación de una postilla, un infiltrado inflamatorio moderado debajo de la herida y un aumento local en la angiogénesis y proliferación celular. Ninguno de los dientes tratados con DME mostró signos de daño a la pulpa irreversible, necrosis parcial o infecciones. En esta etapa, los dientes de control tratados con Ca(OH)_{2} exhibieron una necrosis por licuefacción distinta del tejido próximo al material de cobertura. En la mayoría de los dientes de control, se observó una zona de predentina nuevamente formada formándose sobre y a lo largo de la pared de dentina circumpulpal subyacente al sitio de amputación. En el borde entre el tejido de pulpa vital y la capa superficial necrosada, estaba presente cierta actividad angiogenética (Figs. 10d y 11b). La situación en los dientes de control tratados con Ca(OH)_{2} se parece más fielmente a la de una quemadura química que exhibe un tejido necrótico superficial en el sitio de la herida con sólo baja actividad celular en la región subyacente.

En los dientes extraídos para seccionamiento cuatro semanas después de la cirugía y aplicación de DME, cantidades moderadas de nuevo tejido similar a dentina formaba puente en la anchura total de las cavidades en la interfaz entre el tejido de la pulpa herido y el no dañado. Una red de islotes de nuevo tejido duro en íntimo contacto con células similares a odontoblastos nuevamente formadas rodeaba el puente de dentina nuevamente formada en la cara apical (Figs. 10b, 12a). En los dientes de control con hidróxido cálcico extraídos a cuatro semanas después de la cirugía, nuevo tejido duro que semeja dentina secundaria se formó sólo sobre la pared del canal de la raíz y no se observó formación de puente en estos dientes en este tiempo. Esta dentina secundaria nuevamente formada se formó directamente sobre y a lo largo de las paredes de dentina preexistente conduciendo a un estrechamiento significativo de la cámara de la pulpa (Figs. 10e, 12b). Seis de cada siete dientes extraídos ocho semanas después de la aplicación de DME exhibieron extensa nueva formación de dentina en forma de puentes de dentina completos que sellaron eficazmente la pulpa sana que quedaba de los defectos experimentales incluyendo el tejido de la postilla. El tejido de la pulpa subyacente a los puentes parecía sano sin inflamación presente y sin resorciones internas (Figs. 10c, 13a). El último diente de este grupo mostró una extensa cantidad de formación de dentina reparadora, aunque el defecto no estaba aún completamente formado puente (Tabla 1). En comparación, cinco de los siete dientes de control tratados con hidróxido cálcico mostraban cierre completo de la herida de la pulpa. En dos de estos cinco dientes, la formación de nueva dentina secundaria fue a expensas de la cámara de pulpa de la raíz produciendo un severo estrechamiento del canal de la raíz. En los dos casos restantes sin cierre completo de la herida, uno exhibió un canal de la raíz tortuoso, mientras que el último no mostró casi formación de nueva dentina, sino más bien un infiltrado de inflamación moderado y signos de resorciones internas (p<0,005, Tabla 1).

TABLA 1

1

Cuando el grosor de los puentes de dentina formados en los dientes de control y tratados con DME después de ocho semanas se evaluó por histomorfometría, el grosor medio del tejido similar a dentina que forma puente en los defectos fue significativamente mayor en los dientes tratados con DME que en el grupo de control (p<0,001) (Figs. 10f, 13b y Tabla 1). También, la cantidad total de tejido mineralizado nuevamente formado en los dientes tratados con DME, calculada como área total usando análisis de histomorfometría digital de las cinco secciones más centrales de cada cavidad experimental, fue significativamente mayor (p<0,005) que en las muestras de control tratadas con hidróxido cálcico (Tabla 1). De hecho, ocho semanas después de la cirugía, la cantidad de tejido duro nuevamente formado en los dientes tratados con DME fue más del doble de la de los controles.

Lista de Referencias

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"Remington's Pharmaceutical Sciences", 18ª edición, Mack Publishing Company, Easton, 1990.

Claims

1. Uso de una preparación de una sustancia de esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica para la formación o regeneración de dentina después de procedimientos dentales que implican exposición de tejido de pulpa dental vital.

2. Uso según la reivindicación 1 para la regeneración de dentina secundaria en tejido de pulpa dental vital.

3. Uso según la reivindicación 1 para la formación de dentina reparadora u osteodentina en tejido de pulpa dental vital.

4. Uso según la reivindicación 1 para fomentar la formación de dentina en tejido de pulpa dental vital en dientes salidos.

5. Uso según la reivindicación 1, en el que la preparación de sustancia de esmalte activa se aplica sobre pulpa dental antes de la aplicación de un material de relleno después de procedimientos dentales que implican la exposición de tejido de pulpa dental vital.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la sustancia de esmalte activa es matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y/o proteínas de la matriz del esmalte.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que la sustancia de esmalte activa se selecciona del grupo que consiste en enamelinas, amelogeninas, no amelogeninas, no amelogeninas ricas en prolina, amelinas (ameloblastina, proteína de la funda del esmalte (sheathlin, en su nombre inglés)), tuftelinas, DSP, DSPP, y sus derivados y sus mezclas.

8. Uso según la reivindicación 6, en el que la sustancia de esmalte activa tiene un peso molecular de a lo sumo 120 kDa, tal como, por ejemplo, a lo sumo 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa o 60 kDa, determinado por electroforesis de SDS-PAGE.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que la preparación de una sustancia de esmalte activa contiene una mezcla de sustancias de esmalte activas con diferentes pesos moleculares.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que la preparación de una sustancia de esmalte activa comprende al menos dos sustancias seleccionadas del grupo que consiste en amelogeninas, no amelogeninas ricas en prolina, enamelinas, tuftelina, proteínas de los penachos, proteínas de suero, proteínas salivales, amelina, amelobastina, proteína de la funda del esmalte (sheathlin), DSP, DSPP, y sus derivados.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que la sustancia de esmalte activa tiene un peso molecular de hasta alrededor de 40.000.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que la sustancia de esmalte activa tiene un peso molecular de entre alrededor de 5.000 y alrededor de 25.000.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que la mayor parte de la sustancia de esmalte activa tiene un peso molecular de alrededor de 20 kDa.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6-13, en el que al menos una parte de la sustancia de esmalte activa está en forma de agregados o, después de la aplicación in vivo, es capaz de formar agregados.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que los agregados tienen un tamaño de partículas desde alrededor de 20 nm hasta alrededor de 1 \mum.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6-15, en el que el contenido de proteína de la sustancia de esmalte activa en la preparación está en un intervalo desde alrededor de 0,05% p/p hasta 100% p/p tal como, por ejemplo, alrededor de 5-99% p/p, alrededor de 10-95% p/p, alrededor de 15-90% p/p, alrededor de 20-90% p/p, alrededor de 30-90% p/p, alrededor de 40-85% p/p, alrededor de 50-80% p/p, alrededor de 60-70% p/p, alrededor de 70-90% p/p, o alrededor de 80-90% p/p.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que la preparación de la sustancia de esmalte activa está en forma secada por congelación.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que la composición farmacéutica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que el excipiente farmacéuticamente aceptable es alginato de propilenglicol.

20. Uso según la reivindicación 18, en el que el excipiente farmacéuticamente aceptable es ácido hialurónico o sus sales o derivados.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en el que la composición farmacéutica comprende alrededor de 30 mg/ml de sustancia de esmalte activa en alginato de propilenglicol (PGA).