【発明の詳細な説明】
モルフォゲン誘導性ぞうげ質再生
発明の分野
本発明は、一般には、歯科分野および生物医学的分野に関する。特定の実施態
様において、より詳細には、本発明は、哺乳動物のぞうげ芽細胞の刺激および哺
乳動物のぞうげ質の形態発生の誘導のための方法および組成物に関する。
発明の背景
哺乳動物において、歯肉炎のような歯周病は、感染性物質（例えば、口内微生
物）、栄養欠乏（例えば、壊血病）、または新生物性疾患（例えば、白血病およ
びリンパ腫）による歯周組織の衰弱から生じ得る。歯周病は、しばしば、炎症、
出血、組織後退および／または潰瘍により特徴付けられる。適切に処置されなけ
れば、歯周病は歯の損失の一因となり得る。例えば、歯肉損傷は、細菌性プラー
クが歯／歯肉境界面に付着し、そして歯肉の局所炎症および／またはは後退を引
き起こす場合に生じ得る。初期において、歯肉炎は、圧力および／または温度の
知覚に対する歯の感受性に関連する。例えば、冷たい刺激または熱い刺激との接
触の際に、罹患した歯はずきずきと痛み得る。処置しなければ、これは、最終的
には歯随組織、歯周靭帯、または歯槽の歯槽骨の感染に結びつく、重篤な連続的
なずきずきする痛みへと進行する。未処置の損傷が罹患した個体の血流への侵入
口に口内微生物を提供する場合、より重篤な合併症（例えば、心内膜炎）が生じ
得る。Harrison's Principles of Internal Medicine、第12版、1991（Wilsonら
編）、242〜243頁。現行の処置は、プラークおよび歯石を除去するための専門職
による清掃、口腔殺菌剤の使用、局所的および／もしくは全身的な抗生物質療法
、ならびに／または歯周組織損傷および壊死から形成された歯周ポケットを取り
除くための手術手順を包含する。従って、歯肉炎は、損傷した歯肉および罹患し
た歯または損傷部位に隣接する歯根表面の創面切除により処置される。処置した
歯肉損傷は、損傷部位において、瘢痕組織の形成を介して治癒する。歯の損失
が今にも起こりそうであるか、または歯周病の結果として既に生じている場合、
補綴用の歯または取り外し可能なブリッジが天然の歯と置換される。
一般に、虫歯もまた、感染性物質または栄養の原因による歯組織の衰弱の原因
となり得る。穴または虫歯損傷は、しばしば、口内微生物によるコロニー形成お
よび無機質化した歯組織（例えば、エナメル質またはぞうげ質）の分解に関与す
る。処置しなければ、損傷部位は拡大し、そして衰弱し得、無機質化した歯壁を
貫通し、そして歯髄組織を感染の危険に曝す。従って、未処置の虫歯損傷部位は
また、血流への侵入口を口内微生物に提供し得る。虫歯の従来の処置は、損傷し
たぞうげ質を除去して罹患していない残っているぞうげ質の新しい表面を露出さ
せ、続いて歯科での使用に適切な不活性な材料（例えば、銀アマルガム、合成プ
ラスチック、金、または陶材）で閉塞および修復することを包含する。感染が歯
髄組織まで広がっていれば、不活性な材料で閉塞および再構成する前に、抜歯ま
たは歯髄腔および根管の内容物の除去が必要となる。両方のアプローチは、時間
と共に脆くなり得るブリッジまたは歯冠のような永久歯科用補綴物の構築を必要
とする。
哺乳動物において歯周組織の形態発生およびぞうげ質形成を誘導し得る方法お
よび組成物（治療上有効濃度のモルフォゲンを含有する）が以前に開示されてい
る（米国特許出願第08/155,343号（WO94/06399として公開））。しかし、虫歯お
よび歯肉炎を包含する歯周病の改善された処置の必要性が残っている。歯の損失
、ならびにぞうげ質、歯肉、および歯髄組織を包含する関連組織を緩和する改善
された処置方法および組成物の特定の必要性が残っている。虫歯、またはぞうげ
質組織、歯髄、セメント質、歯周靭帯、歯肉などを包含する歯周損傷の切除後の
機能的な歯組織の再生治癒を可能にする改善された方法および組成物のなおさら
に特定の必要性が残っている。
発明の要旨
本発明の目的は、哺乳動物における歯組織の損失を阻害するための手段、およ
びその再生を誘導するための手段を提供することである。本発明の目的は、哺乳
動物、特に霊長類におけるぞうげ芽細胞の増殖および分化を刺激するための手段
を提供することである。本発明の目的はまた、ヒトの歯髄組織のような霊長類の
歯髄組織を包含する哺乳動物の歯髄組織により、無機質化ぞうげ質マトリクスの
産生を包含するぞうげ芽細胞の表現型の発現を刺激するための手段を提供するこ
とである。別の目的は、歯肉炎を包含する歯周および他の歯肉病に関連する歯周
病損傷および歯の損失を阻害するための手段を提供することである。さらなる目
的は、圧力または温度の知覚に対して歯を減感するための手段、および修復ぞう
げ質組織の形成の誘導により歯の穴を閉塞するための手段を提供することを包含
する。これらおよび他の目的は、本明細書中で開示する本発明の利点および特性
とともに、以下の記載、図面、および請求の範囲から明らかである。
本発明は、哺乳動物（特にヒト）における歯周および歯組織（ひとまとめにし
て、歯組織）の損失を阻害するための方法および組成物を提供する。これは、損
傷組織の再生および／またはそれに対するさらなる損傷を阻害することを包含す
る。本発明の方法および組成物は、歯肉炎および他の歯周病に関連する歯の損失
を防止および／または阻害するために使用され得る。本方法および組成物はまた
、圧力および／または温度の知覚、ならびに虫歯および歯肉炎においてそれに関
連する痛みに対して歯を減感するために使用され得る。さらに、本発明は、ぞう
げ芽細胞の増殖および分化を刺激することを包含する、哺乳動物ぞうげ質の形態
発生を刺激するための方法および組成物を提供する。詳細には、本発明は、哺乳
動物（霊長類を包含する）の歯髄組織によるぞうげ質マトリクスの産生を包含す
るぞうげ芽細胞の表現型の発現を刺激するための方法および組成物を提供する。
本発明は、修復ぞうげ質の形成を誘導することにより、哺乳動物の歯の穴を閉塞
するために使用され得る。従って、本発明は、歯髄組織が危険にさらされる虫歯
または他の歯の損傷のための処置としての抜歯または根管療法の必要性を減少さ
せる。
本発明の方法および組成物は、真核生物起源の特定のタンパク質（本明細書中
でモルフォゲンと規定される）が高等真核生物（特に、ヒトを包含する哺乳動物
）の機能的細胞、組織、および器官の形態発生を誘導するという発見を利用する
。すなわち、モルフォゲンは、細胞および分子の形態発生事象の十分に集積され
た発生カスケードを誘導または再誘導する。この事象は、形態発生が誘導され
る状況または局所環境に適切なタイプの十分に分化した機能的組織の形成（天然
に存在する組織に特徴的である血管新生、結合組織形成、脈状化などのいずれか
を包含する）において最高に達する。従って、形態発生は、瘢痕組織（例えば、
繊維状結合組織）が形成され、そして損傷または他の欠損を分化した機能的細胞
で充填する単純な修復治癒プロセスと著しく異なる。さらに、形態発生は、形態
発生（例えば、再生または再生治癒）を妨がないかまたは抑制しない局所環境を
意味する「許容可能な環境」において生じる。許容可能な環境は、例えば、胚組
織または手術介入に供される組織を包含する損傷もしくは疾患組織において存在
する。しばしば、許容可能な環境は、分化している細胞をしっかり固定し得る適
切なマトリクスまたは基層を包含する。許容可能な環境の他の成分は、代表的に
は、分化の組織特異性を指向するシグナル（例えば、細胞表面マーカーまたは細
胞外マトリクス成分）を包含する。
一般に、モルフォゲンは、１つ以上の真核生物（例えば、哺乳動物）細胞、組
織、または器官の形態発生を誘導する二量体タンパク質である。哺乳動物の歯に
おける歯もしくは歯周損傷部位の修復ぞうげ質、またはそれらに適切な修復ぞう
げ質の形成を包含する、哺乳動物のぞうげ質の形態発生を少なくとも誘導するモ
ルフォゲンが本発明で特に目的とするところである。モルフォゲンは、折りたた
まれた場合、生じる二量体タンパク質が、このモルフォゲンに特異的なレセプタ
ーを提示する細胞および組織において形態発生応答を誘導するのに十分な配置を
とるポリペプチドの対を包含する。すなわち、モルフォゲンは、一般に、形態発
生的な可能な環境において以下の生物学的機能の全てを誘導する：始原細胞の増
殖の刺激；始原細胞の分化の刺激；分化細胞の増殖の刺激；ならびに分化細胞の
増殖および維持の支持。「始原」細胞は、１つ以上の特定のタイプの分化細胞に
分化し得る拘束されない細胞であり、これはそれらのゲノムレパートリーおよび
形態発生が誘導される可能な環境の組織特異性に依存する。さらに、モルフォゲ
ンは、表現型および／または組織機能の老化または休止に関連した損失の開始を
遅らせ得るかまたは緩和し得る。なおさらに、モルフォゲンは、その代謝的およ
び／または機能的（例えば、分泌）特性の発現を包含する、分化細胞の表現型発
現を刺激し得る。さらに、モルフォゲンは、適切な環境条件下で拘束された細胞
の再分化を誘導し得る。上記のように、ぞうげ質マトリクスの形成を包含する、
哺乳動物のぞうげ芽細胞の増殖および分化を少なくとも誘導する、および／また
は哺乳動物のぞうげ芽細胞の増殖、維持、および機能特性を支持するモルフォゲ
ンは、本発明で特に目的とするところである。本発明の目的に関して、「ぞうげ
芽細胞」は、哺乳動物の歯髄組織で生じるまたは発生する、ぞうげ質マトリクス
を産生し得る任意の分化細胞である。
好ましい実施態様において、モルフォゲンポリペプチドの対は、それぞれが参
照モルフォゲンのアミノ酸配列と規定された関係を共有する配列を含有するアミ
ノ酸配列を有する。本明細書中において、好ましいモルフォゲンポリペプチドは
、形態発生的に活性なヒトOP-1（配列番号４）に存在する配列と規定された関係
を共有する。しかし、本明細書中で開示される任意の１つ以上の天然に存在する
配列か、または生合成配列は、同様に参照配列として使用され得る。好ましいモ
ルフォゲンポリペプチドは、少なくともヒトOP-1のＣ末端の６個のシステインド
メイン（配列番号４の残基43〜139）と規定された関係を共有する。好ましくは
、モルフォゲンポリペプチドは、少なくともヒトOP-1のＣ末端の７個のシステイ
ンドメイン（配列番号４の残基38〜139）と規定された関係を共有する。すなわ
ち、形態発生活性を有する二量体タンパク質の好ましいモルフォゲンポリペプチ
ドは、それぞれ、参照配列に対応する配列か、またはそれと機能的に等しい配列
を含有する。
機能的に等しい配列は、参照配列内に位置するシステイン残基の機能的に等し
い配置を含有し、これはこれらのシステインの一次配置を変化させるが、二量体
モルフォゲンタンパク質の折りたたまれた構造におけるそれらの関係（モルフォ
ゲン活性のために必要であり得るような鎖内または鎖間ジスルフィド結合を形成
する能力を含む）を実質的には損なわないアミノ酸の挿入または欠失を包含する
。機能的に等しい配列は、この差異がモルフォゲン活性を破壊しない場合、１つ
以上のアミノ酸残基が参照モルフォゲン配列の対応する残基（例えば、ヒトOP-1
のＣ末端の７個のシステインドメイン（本明細書中で保存された７個のシステイ
ン骨格とも称される））と異なる配置をさらに含有する。この差異はモルフォゲ
ン活性を破壊しない。従って、参照配列における対応するアミノ酸の保存的な置
換
が好ましい。参照配列における対応する残基の「保存的な置換」であるアミノ酸
残基は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似するアミノ酸残基（例え
ば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を包含
する化学的特性など）である。特に好ましい保存的な置換は、Dayhoffら（1978
）、5 Atlas of Protein Sequence and Structure、増刊第３巻、第22章、（354
〜352頁）、Natl．Biomed．Res．Found.，Washington，D.C．20007における「受
容された点変異」として規定された特徴を満たす保存的な置換である。
特定の実施態様において、参照モルフォゲンポリペプチドに機能的に等しいと
考えられるポリペプチドが、Align program（DNAstar，Inc）のようなコンピュ
ータープログラムにより容易に実行されるNeedlemanら（1970），48 J.Mol.Biol .
443-453の方法を用いてそれとともに整列される。上記のように、候補配列中
の内部ギャップおよびアミノ酸の挿入は、アミノ酸配列の相同性または同一性の
レベルとして従来示されている、候補配列と参照配列との間で規定される関係を
計算する目的のために考慮から外される。「アミノ酸配列の相同性」は、アミノ
酸配列の類似性を意味することが本明細書中において理解される。相同な配列は
、同一または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで類似の残基は、整列された参
照配列中の対応するアミノ酸残基の保存的な置換か、またはその「許容可能な点
変異」である。従って、参照配列と70％のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペ
プチド配列は、任意の整列された残基の70％が、参照配列中の対応する残基に同
一であるか、または参照配列中の対応する残基の保存的な置換であるかのいずれ
かであるポリペプチド配列である。
本明細書中で特に目的のモルフォゲンは、哺乳動物の歯槽における歯および／
または顎骨表面に提供される場合、損失または損傷している歯周組織で歯周組織
形成を誘導するモルフォゲンである。本明細書中でなおさらに特に目的のモルフ
ォゲンは、ぞうげ質表面のような歯表面に適用される場合、新しいまたは修復ぞ
うげ質の形態発生を誘導するモルフォゲンである。このようなモルフォゲンは、
歯の穴を閉塞するために、または圧力および／または温度の知覚に対して歯を減
感させるために使用され得る。
あるいは、本発明は、モルフォゲンの代わりにモルフォゲン刺激剤を含む方法
および組成物により実施され得る。「モルフォゲン刺激剤」は、損傷した歯組織
を再生するおよび／またはそれに対するさらなる損傷を阻害するに十分な、哺乳
動物の体内において治療上有効濃度の内生モルフォゲンのインビボ産生（例えば
、発現）を刺激する化合物である。このような化合物は、哺乳動物に投与された
ときに、哺乳動物のゲノム内にコードされるモルフォゲンを、通常、産生および
／または分泌し得る組織（単数または複数）または器官（単数または複数）の細
胞に作用し、そして変化されるべき哺乳動物の体内で内生レベルのモルフォゲン
をもたらす物質を包含することが理解される。内生または投与されたモルフォゲ
ンはエンドクリン、パラクリン、オートクリン因子として作用し得る。すなわち
、内生モルフォゲンは、分泌された内生モルフォゲンが形態発生部位へ、例えば
、個体の血流により運ばれる環境において、形態発生応答が近位の細胞により、
または遠位の組織の細胞により誘導される細胞により合成され得る。好ましい実
施態様において、この薬剤は、歯組織（例えば、歯槽骨、歯周組織、セメント質
、ぞうげ質、または歯髄組織細胞）中の内生モルフォゲンの量を増加させるため
に、内生モルフォゲンの発現および／または分泌を刺激する。
本発明の特定の好ましい局面において、本明細書中に記載のモルフォゲンは、
哺乳動物の歯における損傷したまたは損失したぞうげ質組織の再生を誘導し得る
。モルフォゲンは、歯組織に、局所的に提供されるか、または別の方法で投与さ
れ得る。例えば、モルフォゲンは、生体適合性の多孔質キャリア材料に分散され
得、次いで、それは損傷したぞうげ質組織に局所的に提供される。有用なキャリ
アは、米国特許出願第07/971,091号（WO94/10203として公開）、同第08/155,343
号（WO94/06399として公開）および同第08/174,605号（WO94/06420として公開）
に記載される無細胞性マトリクスを作製するために、組織を脱無機質化およびグ
アニジン抽出することにより、適切な器官特異的組織（例えば、骨またはぞうげ
質）から処方され得る。合成材料もまた使用され得る。いくつかの実施態様にお
いて、存在する歯組織は適切なマトリクスを提供する。処方されたマトリクスま
たはキャリアが使用される場合、それは移動性の始原細胞を分化および増殖させ
得、そして形態発生的に許容可能な環境に寄与するような容積を有する生体適合
性の適切に修飾された無細胞性マトリクスであるべきである。好ましくは、マト
リクス
は細胞接着を可能にし、そして生分解性または生体吸収性である。モルフォゲン
およびマトリクスが適用される組織部位が、形態発生の組織特異性を指向するた
めに十分な内生シグナルを欠く場合、マトリクスは、好ましくは、組織特異的成
分をさらに含有するか、または所望のタイプの組織から得られる。マトリクスは
、例えば、組織を溶媒で処理して細胞性の非構造成分を組織から実質的に除去す
ることにより、脱水された器官特異的組織から形成され得る。あるいは、マトリ
クスは、生体適合性のインビボ生分解性構造分子から調製され得、必要に応じて
、適切な組織特異的細胞接着因子で処方され得る。従って、コラーゲン、ラミニ
ン、ヒアルロン酸および／またはその他の同種類のものが、ポリ乳酸、ポリ酪酸
、ポリグリコール酸などの合成ポリマーまたはコポリマーと同様に使用され得る
。本願において、好ましい構造分子は、組織特異的コラーゲンを包含する。本願
において、好ましい細胞接着因子は、グリコサミノグリカンおよびプロテオグリ
カンを包含する。好ましくは、歯組織中に天然に見出されるコラーゲン、グリコ
サミノグリカン、および／またはプロテオグリカンと同じタイプのコラーゲン、
グリコサミノグリカン、および／またはプロテオグリカンが使用される。必要で
あれば、マトリクスは、細胞流入および接着に適切な骨格構造を作出するように
、その多孔性を増大するために有効な薬剤で処理され得る。
あるいは、モルフォゲンは、モルフォゲンを適用部位で実質的に維持し、そし
て／またはモルフォゲンの制御された送達を、形態発生が誘導されるべき部位で
実質的に増大させるキャリアと結合させて適用され得る。このようなキャリアは
また、米国特許出願第07/971,091号（WO94/10203として公開）、同第08/155,343
号（WO94/06399として公開）および同第08/174,605号（WO94/06420として公開）
に開示されている。有用なキャリアは、例えば、グリセロールなどにより提供さ
れる高粘度を有する組成物、ならびに細胞外マトリクスから処方されるキャリア
材料そして／あるいはラミニン、コラーゲン、および／または生体適合性合成ポ
リマー（例えば、ポリ酪酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらのコポリ
マー）を含むキャリア材料を包含する。
従って、本発明のモルフォゲンは、哺乳動物の歯において新しいまたは修復ぞ
うげ質の形態発生を刺激するために使用され得、これは、成熟した、分化した、
または新しく形成されたぞうげ芽細胞（すなわち、歯髄組織のコンピテント細胞
）によるぞうげ質マトリクスの形成を包含する。すなわち、本発明のモルフォゲ
ンは、ぞうげ質マトリクスを形成し得る哺乳動物細胞（ぞうげ芽細胞および／ま
たは歯髄結合組織細胞を含む）の増殖、分化、および／または表現型発現を刺激
し得る。このモルフォゲン活性は、哺乳動物の歯における修復ぞうげ質の形成を
担う。従って、本発明のモルフォゲンは、哺乳動物の歯壁の厚さを増大するため
に使用され得る；すなわち、口内環境から生存可能な歯髄組織を分離している無
機質化組織（ぞうげ質、エナメル質および／またはセメント質）の厚さを増大す
るために使用され得る。その結果、本発明のモルフォゲンは、特に、歯壁が歯肉
損傷部位または穴との結合により薄いかまたは弱くなった部位で歯壁の破砕の危
険を減少するために使用され得る。
従って、本発明は、哺乳動物における歯、特にヒトの歯のような霊長類の歯に
おける歯の穴（第Ｖ期の穴までおよびこれを含む）を閉塞するために使用され得
る。好ましくは、虫歯組織は穴部位から除去されて、そこに残っているぞうげ質
の新しい表面を、好ましくは、歯内部の歯小管の内腔を横断して露出させる。残
っているぞうげ質表面は、歯髄腔壁から（すなわち、ぞうげ質／歯髄境界面の成
熟したぞうげ芽細胞層から）、好ましくは約１mmまで、より好ましくは約0.5mm
まで、なおさらに好ましくは約0.2mmまでに位置する。適切な材料による虫歯損
傷の部位の充填を包含する、歯の再構築前または同時のモルフォゲンのこの表面
への適用は、再構築した歯の内部での修復ぞうげ質マトリクスの形成を誘導する
。この様式で、残っているぞうげ質の破砕の危険、および根管療法または抜歯に
よるその後の処置を回避し得る。
同様に、本発明は、歯周病（例えば、歯肉炎）に罹患した個体において、圧力
および／または温度の知覚に対して哺乳動物の歯を減感するために使用され得る
。細菌性プラークまたは歯石の除去を包含する歯肉損傷内の表面の創面切除後、
モルフォゲンは、歯肉損傷内において露出されたぞうげ質表面に、好ましくは、
その表面に極めて適切な修復ぞうげ質の形成を刺激するために有効な量で適用さ
れる。そのように形成した修復ぞうげ質は、処置した歯の歯髄腔内または歯髄腔
外部に存在し得、そして歯髄組織と口内環境との間の増大した保護バリアとして
働
く。さらに、損傷部位に隣接する健康な歯肉表面に適用されたモルフォゲンは、
歯肉再生を促進し、そして／または歯肉後退を遅延する。
上記実施態様において、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤が、例えば、
局所的にまたは局所注入により、歯表面（例えば、ぞうげ質表面）に適用される
。好ましくは、この表面は、液体微接触が適用されたモルフォゲンと歯内部に存
在するぞうげ芽細胞または歯髄組織との間で確立され得るように、天然に形成し
た歯のぞうげ質内部の歯小管の内腔を横断する。モルフォゲンは、生理学的条件
下で蒸発し、モルフォゲン残渣を歯の表面に吸着させておくための生理学的に適
合可能な液体ビヒクル（例えば、生理学的生理食塩水溶液を包含する）またはビ
ヒクル（例えば、エタノールを包含する）に可溶化またはそうでなければ分散し
て（コロイド懸濁液またはエマルジョンとして）適用され得る。あるいは、モル
フォゲンは、哺乳動物の歯の欠損を閉塞するかまたは充填するために適切である
生体適合性、無細胞性のマトリクス（例えば、上記）のようなマトリクス上で吸
着され得る。所望であれば、モルフォゲン閉塞欠損は、従来の歯再構築材料を用
いて、元の歯の容積を回復するために充填または再構築され得る。
全てのこのような実施態様において、モルフォゲン処置ぞうげ質表面は、口内
微生物が実質的に存在しないようにされるべきであり、そして無菌状態が、モル
フォゲン活性が誘導される期間の間、処置部位において維持されるべきである。
本発明のモルフォゲンおよびモルフォゲン刺激剤はまた、歯周組織および／ま
たは歯組織に、損傷した歯組織の処置において有益な効果を有することが知られ
る他の分子（「補因子」）、特に歯組織の損傷および／または損失に代表的に関
連する症状を緩和し得るかまたは軽減し得る補因子とともに提供され得る。この
ような補因子の例としては、クロロヘキシジンおよびヨウ化チベゾニウムのよう
な殺菌剤、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、ペニシリンお
よびセファロスポリンを包含する抗生物質、麻酔剤および鎮痛剤、ならびに他の
非ステロイド性抗炎症剤が挙げられる。
図面の簡単な説明
本発明の上記および他の目的、特性および利点、ならびに本発明自身は、添付
の図面と共に読まれる場合に、好ましい実施態様の以下の記載からより十分に理
解される。ここで：
図１は、歯槽中の健康な哺乳動物の歯の概略図である。
図２、パネル2-1から2-12は、ヒトOP-1の好ましい参照配列（配列番号４の残
基38〜139）とともに種々の天然に存在するモルフォゲンの配列のアラインメン
トを示す。図４で示すモルフォゲンもまた、表１、上記および配列表において規
定される。
図３は、モルフォゲンで処理した霊長類の歯の代表的な組織切断面のデジタル
化ビデオ映像であり、そしてその組織切断面におけるモルフォゲン誘導性修復ぞ
うげ質を示す。棒は0.5mmであり、元の倍率の2.5倍である。
図４は、モルフォゲン刺激による新しいまたは修復ぞうげ質形成が投与量依存
的であることを確立する結果の棒グラフ図である。この図において、組換えヒト
OP-1の適用した投与量をＸ軸にμgで示し、そして誘導されたぞうげ質の表面積
をmmでＹ軸に示す。
図５は、残っている天然ぞうげ質の薄いブリッジの下においてモルフォゲンが
新しいまたは修復ぞうげ質形成を刺激することを確立する結果の折れ線グラフ図
である。この図において、等量（例えば、10μg）の組換えヒトOP-1を、Ｘ軸に
沿って示される厚さの残っているぞうげ質ブリッジに適用した。
図６は、残っているぞうげ質の薄いブリッジの下において新しいまたは修復ぞ
うげ質の刺激の際の、従来の薬剤（Ca(OH)2）に対する組換えヒトOP-1の効果を
比較する結果の折れ線グラフ図である。ここでも同様に、等量（例えば、10μg
）の組換えヒトOP-1またはCa(OH)2を、Ｘ軸に示される厚さの残っているぞうげ
質ブリッジに示されるように適用した。
好ましい実施態様の詳細な説明
本明細書中に記載のモルフォゲンが、損失または損傷した哺乳動物の歯組織(
ぞうげ質を含む)の形態発生または再生を含む、組織形成を刺激し得ることが発
見された。本発明は、歯を減感するため、歯肉の後退を防ぐため、穴を塞ぐため
、歯壁の厚さを増加させるため、および歯壁の破砕の危険を減少させるために用
い
られ得る。本発明は、本明細書中に記載の手順に従い、本明細書中に定義される
ように、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を用いて実施される。
以下に提供されたものは、歯の解剖学および有用なモルフォゲンの記載であり
、それらの生産および処方方法、ならびに(1)本発明の方法における本明細書中
に記載のモルフォゲンの適切性を証明する、および(2)候補のモルフォゲンをそ
れらの効力について試験するためのアッセイを提供する例的、非限定的な実施例
を含む。Ｉ．歯の解剖学
歯槽内の哺乳動物の歯の縦断面が、図１に図式的に示されている。歯の歯冠６
は、エナメル質８およびぞうげ質22から構成される。歯髄腔12が、歯冠６の内部
および根10の中心に見られる；これは骨領域14,16,18へと下方に伸び、そして根
10の先端の、微小な開口部、尖端の小孔20付近で開く。歯髄腔12は、尖端の小孔
20を通じて腔内に入る血管および神経を豊富に供給する粗雑な結合組織である歯
髄を含む。歯髄組織のいくつかの細胞、すなわち、ぞうげ芽細胞、ぞうげ質22の
前駆体が、歯髄腔12の壁上に、一般に単層で、配置されている。歯の発達の間に
、ぞうげ芽細胞は円柱状になるが、その後、ぞうげ質22が完全に形成された後、
これらは平たくなりそして骨芽細胞に似る。
成熟した歯の固体部分または無機質化した壁は、ぞうげ質22、エナメル質８、
および、根25の表面に位置するセメント質24の薄い層を含む。エナメル層８は、
歯の発達過程の間に、アミロブラストから形成され、そしてセメント質24は、セ
メントブラストから形成される。完全発達した歯において、歯の主要な部分は、
コラーゲン繊維の強固なメッシュネットワーク中に埋まったヒドロキシアパタイ
ト結晶からなるぞうげ質22を含む。ぞうげ質は、密な均質の物質であるマトリク
ス中に埋まった、歯小管と呼ばれる多数の微小な波状かつ枝分かれした管を含む
。歯小管は互いに平行で、そしてそれらの内部末端で歯髄腔12へと通じている。
ぞうげ質のマトリクスは半透明であり、そして多くのぞうげ質の無機質部分を含
んでいる。これは、歯髄の小繊維と連続する多数の微細繊維を含む。無機物質が
歯を弱酸中に浸すことにより除去された後、残っている有機物質は、その管の方
向
を横切って歯髄腔12と平行する薄層で穴をあけられ得る。
セメント質24は、歯根を覆う薄い無機質化層として配置されている。これはエ
ナメル質が終わる場所から、各根の先端(これは通常非常に薄い)へと伸びる。セ
メント質は、これが、まれに、本物の骨を特徴付ける裂孔および小管を含むセメ
ント質において構造および化学組成の点で骨に似ている；より厚い部分のセメン
ト質においては、骨に特徴的な薄層、ハーバース管がまた見出される。老化の結
果として、セメント質は厚みを増し、そして歯髄腔はまた部分的に、ぞうげ質と
骨との間の構造の媒介物である硬い物質(本明細書中で「骨様ぞうげ質」といわ
れる)で満たされるようになる。これは、縮むかまたは消失さえする、歯髄の緩
慢な転換により形成されるようである。
その歯周靭帯または歯周膜26は、セメント質24と骨14、16、18との間にクッシ
ョンを形成する歯周組織の層である；これは、顎骨の腔(歯槽)中にこの層を支持
することにより歯を正しい位置に保持する。歯周靭帯は歯周の繊維芽細胞から形
成される高度に組織化された組織である。これは、顎骨からセメント質へと直接
的に通じるコラーゲン繊維を組織する。
従って、本明細書中で用いる「歯」は、歯冠および歯根を含む固体の歯の全体
を有する天然の哺乳動物の歯の形を本質的に規定する天然のまたは合成の組成物
をいう。「歯周組織」は、歯槽内で歯を囲みそして歯周靭帯およびセメント質の
両方を含む組織と定義される。「歯肉」は、上顎および下顎の歯槽骨(歯槽)突起
を覆う口の粘膜、ならびにそれが歯周組織から出現するに従い無機質化した歯壁
により覆われた密な繊維組織と定義する。「生育可能な」組織は、生きており、
本質的に微生物がおらず、そしてそれと関連した感染もない実質的に健常な組織
を意味する。特に、生育可能な組織は、エナメル質、ぞうげ質、歯髄、歯肉、セ
メント質、および歯周靭帯のような生育可能な歯組織を意味する。歯組織の「生
育強化」は、損傷したまたは罹患した組織の臨床状態の改善を含む、生育してい
る組織の構造的および機能的保全の改善を意味する。「生育可能な歯」は、生育
している歯根を有する移植した天然の歯を指す。本明細書中で用いられる歯組織
の「損失阻害」は、歯組織への損傷および/または歯組織の損失を阻害すること
を意味し、そして損失、損傷、または罹患した組織を再生することおよび/また
はこれらに対するさらなる損傷を阻害することを含む。
「残っているぞうげ質」は、天然に形成された、健常なぞうげ質組織(例えば
、う蝕または歯肉損傷、特に感染したぞうげ質が除去されたおよび/または細菌
性のプラークまたは歯石の除去による損傷に隣接する)を意味する。天然に形成
されたぞうげ質組織は、歯髄腔壁に並ぶぞうげ芽細胞の層からぞうげ質を通じて
一般的に放射状に伸びている歯小管である管を含む(図１と関連して先に記載さ
れている)。従って、「歯小管の内腔を横断する」ぞうげ質表面は、１つまたは
それ以上の歯小管の内腔に平行というよりもむしろ横断する任意の平面上に配置
されたぞうげ質表面である。「ぞうげ質」表面は、天然に形成されたぞうげ質の
天然の境界、または穴開けまたは他の歯科技術によるかまたは歯壁の破壊もしく
は削除により曝露されたぞうげ質の新鮮な表面と定義し得る。ぞうげ質表面への
「適切な」処置または刺激は、ぞうげ質表面の近位またはすぐ隣りの近位(例え
ば、残っているぞうげ質のような約１mmまでの厚さの介在組織により前記表面か
ら離された)における処置または刺激を意味する。「修復ぞうげ質」は、歯髄結
合組織の成熟もしくは増殖するぞうげ芽細胞または他のコンピテント細胞により
作り出された管状のぞうげ質マトリクスを含み、そして哺乳動物の歯髄腔内に形
成され得る。
「症状緩和補因子」は、所望であれば、本発明の組成物中に含ませ得、そして
歯組織の損失または損傷と典型的に関連した１つまたはそれ以上の症状を緩和ま
たは軽減する、１つまたはそれ以上の従来の薬剤をいう。典型的な補因子として
、抗生物質、殺菌剤、非ステロイド性抗炎症剤、麻酔剤、および鎮痛剤が挙げら
れる。II ．有用なモルフォゲン
本発明において有用なモルフォゲンとして、もともと骨形成タンパク質(米国
特許第5,011,691号を参照のこと)として同定された真核生物タンパク質が挙げら
れる。例えば、OP-1、OP-2、OP-3、およびCBMP2タンパク質(配列番号４〜９、15
〜22、25および26)、ならびに、例えばDPP(配列番号10、Drosophila由来)、Vgl(
配列番号11、Xenopus由来)、Vgr-1(配列番号12、マウス由来)、GDF-1(配列番号
13、30、および31、ヒト由来、Lee(1991)，88 PNAS 4250-4254を参照のこと)、6
0A(配列番号23および24、Drosophila由来、Whartonら(1991)、88 PNAS 9214-921
8を参照のこと)、ドルサリン-1(ニワトリ由来、Baslerら(1993)、73 Cell 687-7
02およびGenBank登録番号L12032を参照のこと)、およびGDF-5(マウス由来、Stor
mら(1994)，368 Nature 639-643を参照のこと)のようなアミノ酸配列の関連した
タンパク質である。さらに有用なモルフォゲンとして生合成モルフォゲン構築物
が挙げられる(例えばCOP-１、３〜５、７および16、米国特許第5,011,691号に開
示される)。米国特許第4,968,590号を参照のこと。
本明細書中でモルフォゲンと同定および/または認識された天然に存在するタ
ンパク質は、TGFβスーパーファミリーまたはスーパー遺伝子ファミリーとして
知られる配列関連タンパク質の緩やかな進化的グループ内に異なるグループを形
成する。天然に存在するモルフォゲンは、それらのＣ末端領域(ドメイン)におい
て実質的なアミノ酸配列相同性を共有している。代表的には、前述の天然に存在
するモルフォゲンは、Ｎ末端シグナルペプチド配列(代表的には約30残基未満)、
それに続く成熟Ｃ末端ドメインを生じるように切断される「プロ」ドメインを有
する前駆体として転写される。シグナルペプチドは、Von Heijne(1986),14 Nucl eic Acids Research
4683-4691に記載の方法を用い、所定の配列中の予測され得
る切断部位で、転写時に迅速に切断される。プロドメインは代表的には、完全に
プロセスされた成熟Ｃ末端ドメインの約３倍以上の大きさである。本明細書中で
は、モルフォゲンの「プロ」形態は、モルフォゲンポリペプチドのプロおよび成
熟ドメインをそれぞれ有する折りたたまれた１組のポリペプチドを含むモルフォ
ゲンをいう。代表的には、モルフォゲンのプロ形態は、生理的条件下では成熟型
よりも可溶性である。プロ形態が培養された哺乳動物細胞から分泌される主要な
形態のようである。
表Ｉ(下)に、本明細書中で用いられているそれらの名称、それらの配列番号レ
ファレンス、および配列表中には含まれていない全長タンパク質のアミノ酸配列
の出版物供給源を含む、現在までに同定された種々の天然に存在するモルフォゲ
ンを要約する。表Ｉに記載したそれぞれの一般的名称のそれぞれは、以下に言及
したおよび配列表に記載した同定配列をコードする核酸から発現された形態発生
的に活性なタンパク質、または形態発生的に活性なフラグメントもしくはその前
駆体(天然に存在するようなその機能的等価物およびその生合成的変異体を含む)
を含むことが意図され、そして理解されるべきである。天然に存在するこれらの
変異体は、単一の生物学的種の他の個体から単離された対立遺伝子的変異体形態
、および系統発生的に異なる生物学的種から単離された系統発生的等価物(種)変
異体形態を含む。
表Ｉ
「OP-1」は、一般的に配列番号４(「hOP-1」 )に開示されるヒトOP-1タンパク質
をコードし、そして少なくともマウスOP-1、配列番号５(「mOP-1」)を含む核酸
から発現される形態発生的に活性なタンパク質をいう。ヒトおよびマウスOP-1(
配列番号４および５)のそれぞれにおいて、保存された７個のシステイン骨格が
、残基38から残基139までに同定される。そこにコードされ、そして全長タンパ
ク質に相当する、cDNA配列およびアミノ酸配列が、配列番号15および16(hOP1)な
らびに配列番号17および18(mOP1)に提供される。成熟タンパク質は残基293〜431
(hOP1)および残基292〜430(mOP1)により定義される。切断されて成熟な形態発生
的に活性なタンパク質を生じるタンパク質の「プロ」領域は、残基30〜292(hOP1
)および残基30〜291(mOP1)により本質的に定義される。
「OP-2」は、一般的に配列番号６(「hOP-2」)に開示されるヒトOP-2タンパク質
をコードし、そして少なくともマウスOP-2(「mOP-2」、配列番号７)を含む核酸
から発現される形態発生的に活性なタンパク質をいう。ヒトおよびマウスOP-2の
それぞれにおいて、保存された７個のシステイン骨格が、配列番号６および７の
残基38から残基139までに定義される。そこにコードされ、そして全長タンパク
質に相当する、cDNA配列およびアミノ酸配列が、配列番号19および20(hOP2)なら
びに配列番号21および22(mOP2)に提供される。成熟タンパク質は残基264〜402(h
OP2)および残基261〜399(mOP2)により本質的に定義される。切断されて成熟な形
態発生的に活性なタンパク質を生じる「プロ」領域は、残基18〜263(hOP2)およ
び残基18-260(mOP1)により本質的に定義される。
「OP-3」は、一般的に配列番号26(「mOP-3」)に開示されるマウスOP-3タンパク
質をコードする核酸から発現される形態発生的に活性なタンパク質をいう。その
保存された７個のシステインドメインは、相当するmOP-2およびhOP-2配列と79％
より大きいアミノ酸同一性、および相当するOP-1配列と66％より高い同一性を共
有する、配列番号26の残基298〜399により定義される。上記のアミノ酸配列をコ
ードするcDNA配列が、配列番号25に提供される。OP-3は、今日までに同定された
モルフォゲンの中で、保存された７個のシステインドメイン中の９位の残基(例
えば、配列番号26の残基315)がセリンである点で(他のモルフォゲンが代表的に
はこの位置がトリプトファンであるのに対して)珍しい。
「CBMP2」は、一般的にCBMP2タンパク質(少なくともヒトCBMP2A(「CBMP2A(fx)」
、配列番号８)およびヒトCBMP2B(「CBMP2B(fx)」、配列番号９)を含む)をコード
する核酸から発現される形態発生的に活性なタンパク質をいう。BMP2AおよびBMP
2B、またはBMP2およびBMP4として文献中でいわれる、その全長タンパク質のアミ
ノ酸配列が、Wozneyら、(1988),242 Science 1528-1534中に明らかにされる。BM
P2(BMP2A)のプロドメインは残基25〜248を含むようである；成熟タンパク質は残
基249〜396を含むようである。BMP4(BMP2B)のプロドメインは残基25〜256を含む
ようである；成熟タンパク質は残基257〜408を含むようである。
「DPP(fx)」は、Drosophila DPP遺伝子によりコードされ、そして保存された７
個のシステイン骨格(配列番号10)を特徴とするタンパク質をいう。その全長タン
パク質のアミノ酸配列はPadgettら(1987),325 Nature 81-84に明らかにされる。
そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基456へ伸びているようで
ある；その成熟タンパク質は残基457〜588により定義されるようである。
「Vgl(fx)」は、Xenopus Vgl遺伝子によりコードされ、そして保存された７個の
システイン骨格(配列番号11)を特徴とするタンパク質をいう。その全長タンパク
質のアミノ酸配列はWeeks(1987),51 Cell 861-867に明らかにされる。そのプロ
ドメインはシグナルペプチド切断部位から残基246へ伸びているようである；そ
の成熟タンパク質は残基247〜360により定義されるようである。
「Vgr-1(fx)」は、マウスVgr-1遺伝子によりコードされ、そして保存された７個
のシステイン骨格(配列番号12)を特徴とするタンパク質をいう。その全長タンパ
ク質のアミノ酸配列はLyonsら(1989),86 PNAS 4554-4558に明らかにされる。そ
のプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基299へ伸びているようであ
る；その成熟タンパク質は残基300〜438により定義されるようである。
「GDF-1(fx)」は、ヒトGDF-1遺伝子によりコードされ、そして保存された７個の
システイン骨格(配列番号13)を特徴とするタンパク質をいう。その全長タンパク
質のcDNAおよびコードされたアミノ酸配列は、配列番号30および31に提供される
。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基214へ伸びているよう
である；その成熟タンパク質は残基215〜372により定義されるようである。
「60A」は、一般的に60Aタンパク質または形態発生的に活性なそのフラグメント
をコードする核酸(例えば、Drosophila 60A遺伝子)から発現される形態発生的に
活性なタンパク質(配列番号23および24を参照のこと、ここではその全長タンパ
ク質のcDNAおよびコードされたアミノ酸配列が提供される)をいう。「60A(fx)」
は、保存された７個のシステイン骨格(配列番号24の残基354〜455)を特徴とする
タンパク質配列をいう。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基
324へ伸びているようである；その成熟タンパク質は残基325〜455により定義さ
れるようである。60Aタンパク質は、本明細書中ではヒトおよびマウスOP-1遺伝
子の系統形態学的に等価な変異体であるようである；Sampathら(1993)、90 PNAS
6004-6008。
「BMP3(fx)」は、ヒトBMP3遺伝子によりコードされ、そして保存された７個のシ
ステイン骨格(配列番号26)を特徴とするタンパク質をいう。その全長タンパク質
のアミノ酸配列は、Wozneyら(1988)，242 Science 1528-1534に明らかにされる
。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基290へ伸びているよう
である；その成熟タンパク質は残基291〜472により定義されるようである。
「BMP5(fx)」は、ヒトBMP5遺伝子によりコードされ、そして保存された７個のシ
ステイン骨格(配列番号27)を特徴とするタンパク質をいう。その全長タンパク質
のアミノ酸配列は、Celesteら(1991)，87 PNAS 9843-9847に明らかにされる。そ
のプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基316へ伸びているようであ
る；その成熟タンパク質は残基317〜454により定義されるようである。
「BMP6(fx)」は、ヒトBMP6遺伝子によりコードされ、そして保存された７個のシ
ステイン骨格(配列番号28)を特徴とするタンパク質をいう。その全長タンパク質
のアミノ酸配列は、Celesteら(1990)，87 PNAS 9843-5847に明らかにされる。そ
のプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基374へ伸びているようであ
る；その成熟配列は残基375〜513により定義されるようである。
図２に示すように、OP-2およびOP-3タンパク質は、このファミリーの他の既知
のタンパク質に共通の保存されたシステイン骨格またはドメインに加えて、保存
されたＣ末端領域に付加的なシステイン残基(例えば、配列番号６および７の残
基41を参照のこと)を有する。GDF-1タンパク質は、保存された骨格内に４つのア
ミノ酸挿入(配列番号13の残基44〜47)を有するが、この挿入物は、折りたたまれ
た構造内でのシステイン残基の関係に干渉しないようである。さらに、CBMP2タ
ンパク質は、システイン骨格内の１つのアミノ酸残基を欠いている。従って、こ
れらのモルフォゲンポリペプチドは、ヒトOP-1の好ましい参照モルフォゲン配列
(配列番号４の残基38〜139)について、本明細書中で用いられたアラインメント
の原理を例証する。
特定の好ましい実施態様において、本明細書中で有用なモルフォゲンとして、
モルフォゲンポリペプチドのアミノ酸配列が、前述の天然に存在するモルフォゲ
ンから選択される参照モルフォゲンと、少なくとも70％のアミノ酸相同性または
「類似性」、そして好ましくは80％の相同性または類似性を共有する配列を有す
るモルフォゲンポリペプチドのアミノ酸配列を含むモルフォゲンが挙げられる。
好ましくは、参照モルフォゲンはヒトOP-1であり、そしてこの参照配列は、形態
発生的に活性な形態のヒトOP-1中に存在するＣ末端の７個のシステインドメイン
(配列番号４の残基38-139)である。従って、本明細書中で有用なモルフォゲンと
して、好ましい参照配列の対立遺伝子的、系統発生的等価物、およびその他の変
異体(天然に存在するものでも生合成的に生産されたものでもいずれにしても(例
えば、「ムテイン」または「変異タンパク質」を含む))、ならびに先に記載およ
び同定されたモルフォゲン(例えば表Ｉ)を含むタンパク質のモルフォゲンファミ
リーの新規のメンバーが挙げられる。特定の特に好ましいモルフォゲンポリペプ
チドは、好ましいヒトOP-1の参照配列と少なくとも60％のアミノ酸同一性、さら
に好ましくはそれと少なくとも65％のアミノ酸同一性を共有する。
別の好ましい実施態様において、本発明において有用なモルフォゲンポリペプ
チドのファミリー、およびそのメンバーは、一般的なアミノ酸配列により定義さ
れる。例えば、下に開示した一般配列７(配列番号１)および一般配列８(配列番
号２)は、少なくともOP-1、OP-2、OP-3、CBMP2A、CBMP2B、BMP3、60A、DPP、Vgl
、BMP5、BMP6、Vgr-1、およびGDF-1(配列番号４〜15、24、および26〜29)を含む
、現在までに同定された好ましいモルフォゲンタンパク質ファミリーのメンバー
間で共有される相同性を有する。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、本明細
書中(配列表を参照のこと)および/または当該分野で記載されている(先に要約し
たように)。この一般配列は、６個および７個のシステイン骨格(それぞれ一般配
列７および８)により特徴付けられる、Ｃ末端ドメイン中のこれらの配列により
共有されるアミノ酸同一性、ならびにその配列内の可変位置の別の残基の両方を
含む。一般配列は、分子間または分子内ジスルフィド結合が形成され得る適切な
システイン骨格を提供し、そして折りたたまれたタンパク質の三次元構造に影響
を与え得るようである特定の重要なアミノ酸を含む。さらに、一般配列は、41位
(一般配列７)または46位(一般配列８)の付加的システインを可能にし、それによ
りOP-2およびOP-3の形態発生的に活性な配列を含む。
ここで、各Xaaは、独立して、以下のように定義される１つまたはそれ以上の特
定のアミノ酸の群から選択される：「Res.」は「残基」を意味し、そして残基２
のXaa＝(TyrまたはLys)；残基３のXaa＝(ValまたはIle)；残基４のXaa＝(Ser,As
pまたはGlu)；残基６のXaa＝(Arg，Gln，Ser，LysまたはAla)；残基７のXaa＝(A
spまたはGlu)；残基８のXaa＝(Leu，ValまたはIle)；残基11のXaa＝(Gln，Leu，
Asp，His，AsnまたはSer)；残基12のXaa＝(Asp，Arg，AsnまたはGlu)；残基13の
Xaa＝(TrpまたはSer)；残基14のXaa＝(IleまたはVal)；残基15のXaa＝(Ileまた
はVal)；残基16のXaa＝(AlaまたはSer)；残基18のXaa＝(Glu，Gln，Leu，Lys，P
roまたはArg)；残基19のXaa＝(GlyまたはSer)；残基20のXaa＝(TyrまたはPhe)；
残基21のXaa＝(Ala，Ser，Asp，Met，His，Gln，LeuまたはGly)；残基23のXaa＝
(Tyr，AsnまたはPhe)；残基26のXaa＝(Glu，His，Tyr，Asp，Gln，AlaまたはSer
)；残基28のXaa＝(Glu，Lys，Asp，GlnまたはAla)；残基30のXaa＝(Ala，Ser，P
ro，Gln，IleまたはAsn)；残基31のXaa＝(Phe，LeuまたはTyr)；残基33のXaa＝(
Leu，ValまたはMet)；残基34のXaa＝(Asn，Asp，Ala，ThrまたはPro)；残基35の
Xaa＝(Ser，Asp，Glu，Leu，AlaまたはLys)；残基36のXaa＝(Tyr，Cys，His，Se
rまたはIle)；残基37のXaa＝(Met，Phe，GlyまたはLeu)；残基38のXaa＝(Asn，S
erまたはLys)；残基39のXaa＝(Ala，Ser，GlyまたはPro)；残基40のXaa＝(Thr，
LeuまたはSer)；残基44のXaa＝(Ile，ValまたはThr)；残基45のXaa＝(Val，Leu
，MetまたはIle)；残基46のXaa＝(GlnまたはArg)；残基47のXaa＝(Thr，Alaまた
はSer)；残基48のXaa＝(LeuまたはIle)；残基49のXaa＝(ValまたはMet)；残基50
のXaa＝(His，AsnまたはArg)；残基51のXaa＝(Phe，Leu，Asn，Ser，AlaまたはV
al)；残基52のXaa＝(Ile，Met，Asn，Ala，Val，GlyまたはLeu)；残基53のXaa＝
(Asn，Lys，Ala，Glu，GlyまたはPhe)；残基54のXaa＝(Pro，SerまたはVal)；残
基55のXaa＝(Glu，Asp，Asn，Gly，Val，ProまたはLys)；残基56のXaa＝(Thr，A
la，Val，Lys，Asp，Tyr，Ser，Gly，IleまたはHis)；残基57のXaa＝(Val，Ala
またはIle)；残基58のXaa＝(ProまたはAsp)；残基59のXaa＝(Lys，LeuまたはGlu
)；残基60のXaa＝(Pro，ValまたはAla)；残基63のXaa＝(AlaまたはVal)；残基65
のXaa＝(Thr，AlaまたはGlu)；残基66のXaa＝(Gln，Lys，ArgまたはGlu)；残基6
7のXaa＝(Leu，MetまたはVal)；残基68のXaa＝(Asn，Ser，AspまたはGly)；残基
69のXaa＝(Ala，ProまたはSer)；残基70のXaa＝(Ile，Thr，ValまたはLeu)；残
基71のXaa＝(Ser，AlaまたはPro)；残基72のXaa＝(Val，Leu，MetまたはIle)；
残基74のXaa＝(TyrまたはPhe)；残基75のXaa＝(Phe，Tyr,LeuまたはHis)；残基7
6のXaa＝(Asp，AsnまたはLeu)；残基77のXaa＝(Asp，Glu，Asn，ArgまたはSer)
；残基78のXaa＝(Ser，Gln，Asn，TyrまたはAsp)；残基79のXaa＝(Ser，Asn，As
p，GluまたはLys)；残基80のXaa＝(Asn，ThrまたはLys)；残基82のXaa＝(Ile，V
alまたはAsn)；残基84のXaa＝(LysまたはArg)；残基85のXaa＝(Lys，Asn，Gln，
His，ArgまたはVal)；残基86のXaa＝(Tyr，GluまたはHis)；残基87のXaa＝(Arg,
Gln，GluまたはPro)；残基88のXaa＝(Asn，Glu，TrpまたはAsp)；残基90のXaa＝
(Val，Thr，AlaまたはIle)；残基92のXaa＝(Arg，Lys，Val，Asp，GlnまたはGlu
)；残基93のXaa＝(Ala，Gly，GluまたはSer)；残基95のXaa＝(GlyまたはAla)お
よび残基97のXaa＝(HisまたはArg)。
一般配列８(配列番号２)は、一般配列７の全てを含みそしてさらにそのＮ末端
に以下の配列(配列番号14)を含む。
従って、残基７で始まる一般配列８中の各「Xaa」は、一般配列７について記載
した各残基番号が一般配列８では５個シフトする相違を有する、一般配列７につ
いて定義された特定のアミノ酸である。従って、一般配列７の「残基２のXaa＝(
TyrまたはLys)」は、一般配列８の残基７のXaaをいう。一般配列８においては、
残基２のXaa＝(Lys、Arg、Ala、またはGln)；残基３のXaa＝(Lys、Arg、またはM
et)；残基４のXaa＝(His、Arg、またはGln)；および残基５のXaa＝(Glu、Ser、H
is、Gly、Arg、Pro、Thr、またはTyr)。
上記のように、本発明において有用な特定の本発明の好適なモルフォゲンポリ
ペプチド配列は、hOP-1の好適な参照配列を特徴とするアミノ酸配列と、60％よ
り高い同一性、好ましくは65％より高い同一性を有する。これらの特に好適な配
列はOP-1およびOP-2タンパク質(Drosophila 60Aタンパク質を含む)の対立遺伝子
的および系統発生的等価変異体を含む。従って、特定の特に好適な実施態様にお
いて、有用なモルフォゲンとして、７個のシステイン骨格を定義しそしていくつ
かの同定されたOP1およびOP2の変異体との間で相同性を有する、本明細書中で「
OPX」(配列番号３)といわれる一般的アミノ酸配列中のポリペプチド鎖の対を含
む活性なタンパク質が挙げられる。本明細書中に記載したように、所定の位置の
各Xaaは、マウスまたはヒトOP1またはOP2(配列番号４〜７および/または配列番
号15〜22を参照のこと)のＣ末端配列中の対応する位置に存在する残基から独立
して選択される。
さらに別の好適な実施態様において、有用なモルフォゲンポリペプチドは、ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照モルフォゲン配列（例え
ば、OP1またはOP2の保存された７個のシステインドメインを特徴とするＣ末端配
列(例えば、それぞれ配列番号15および19のヌクレオチド1036〜1341およびヌク
レオチド1390〜1695))をコードするDNAまたはRNAにハイブリダイズする核酸によ
りコードされる配列を含むアミノ酸配列を有する。本明細書中で使用したように
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、40%ホルムアミド、5×SSPE
5×Denhardt溶液、および0.1%SDS中に37℃で一晩、そして0.1×SSPE、0.1%SDS中
で50℃で洗浄のような公知の技術に従うハイブリダイゼーションとして定義され
る。
上記のように、本発明において有用なモルフォゲンは一般的に折りたたまれた
１対の上記のポリペプチドを含む二量体タンパク質である。モルフォゲンは還元
されると不活性であるが、酸化されたホモ二量体として、そして本発明の他のモ
ルフォゲンと組み合わせて酸化してヘテロ二量体を生じた場合、活性である。従
って、形態発生的に活性なタンパク質における折りたたまれた１対のモルフォゲ
ンポリペプチドのメンバーは、上記の任意の特定のモルフォゲンポリペプチドか
ら独立して選択され得る。
本発明の方法、組成物、およびデバイスにおいて有用なモルフォゲンとして、
上記のポリペプチド鎖のいくつかを含むタンパク質(天然に存在する供給源から
単離されるか、または組換えDNAもしくはその他の合成技術により生産されるか
のいずれかである)、そしてこれらのタンパク質の対立遺伝子的および系統発生
的等価変異体、ならびにそれらの生合成的変異体(ムテイン)、および種々の短縮
化された構築物および融合構築物が挙げられる。欠失または付加変異体がまた活
性であることが予見され、これは、保存されたＣ末端の６個または７個のシステ
インドメインを改変し得、その改変が折りたたまれた構造においてこれらのシス
テイン残基の関係を機能的に破壊しないものを含む。従って、このような活性形
態は、本明細書中に開示された特別に記載された構築物の等価物と考えられる。
このタンパク質は、変化する糖化パターン、変化するＮ末端、アミノ酸配列相同
性領域を有する関連タンパク質のファミリー、および天然のタンパク質または生
合成タンパク質の活性な短縮化されたまたは変異された形態(宿主細胞中で組換
えDNAの発現により生産)を含み得る。
形態発生的タンパク質は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中でイン
タクトなもしくは短縮化されたcDNAから、または合成DNAから発現され得、そし
て精製、切断、リフォールディング、および二量体化され、形態発生的に活性な
組成物を形成し得る。本発明において好ましい宿主細胞として、E．coliまたは
哺乳動物細胞(例えば、CHO、COS、またはBSC細胞)が挙げられる。本発明の方法
、組成物、およびデバイスにおいて有用なモルフォゲンの詳細な記載は、同時継
続中の米国特許出願第07/752,764号(WO92/15323として公開された)(1991年８月3
0日に出願された)、および同第07/667,724号(同第07/752,764号のために放棄さ
れた)(1991年３月11日に出願された)に開示されている。
従って、本開示にかんがみて、熟練した遺伝子工学技術者は、適切なアミノ酸
配列をコードするcDNAまたは種々の異なる生物種の遺伝子ライブラリーから遺伝
子を単離し得るか、またはオリゴヌクレオチドからDNAを構築し得、次いで、哺
乳動物の歯組織の形態発生を刺激、および/または哺乳動物の歯組織に対する損
傷を阻害し得る大量の活性タンパク質を産生するために、種々のタイプの宿主細
胞中(原核生物および真核生物の両方を含む)でこれらを発現させ得る。
上記のように、タンパク質が新しい、器官特異的な組織の形成を完結させる細
胞的および分子的事象の発生学的カスケードを誘導する場合、本明細書中ではタ
ンパク質は一般的に形態発生的である。好ましくは、モルフォゲンは、配列番号
４に含まれるヒトOP-1の、少なくとも保存されたＣ末端の６個または７個のシス
テイン骨格に一致または機能的に等価である配列を有する１対のポリペプチドを
含む。そのモルフォゲンは、一般的に、形態発生的に許容可能な環境において以
下の生物学的機能の全てを誘導する能力を有する；始原細胞の増殖を刺激するこ
と；始原細胞の分化を刺激すること；分化した細胞の増殖を刺激すること；なら
びに分化した細胞の増殖および維持を支持すること。本発明において有用なモル
フォゲンが最初にどのようにして同定されたかの詳細、ならびにどのようにして
作製し、使用し、そしてそれらを形態発生活性に関して試験したかは、米国特許
出願第07/752,764号(WO92/15323として公開された)、および同第07/667,274号
(同第07/752,764号のために放棄された)に開示されている。本明細書中に開示す
るように、モルフォゲンは、天然に供給される材料から精製され得るかまたは、
本明細書中に開示する遺伝子配列を用いて、原核生物または真核生物宿主細胞か
ら組換え的に生産され得る。あるいは新規な形態発生的配列は、本明細書中に開
示する手順に従って同定され得る。
典型的に有用なモルフォゲンとして、配列表および図２に開示する１つまたは
それ以上の配列を含むアミノ酸配列である、１対のポリペプチドを含む天然由来
のタンパク質が挙げられる。他の有用な配列として、天然由来のモルフォゲンド
ルサリン-1およびGDF-5(表Ｉと関連して本明細書中で考察した)の配列、ならび
に米国特許第5,011,691号に開示される生合成構築物(例えば、COP-1、COP-3、CO
P-4、COP-5、COP-7、およびCOP-16)が挙げられる。
従って、本発明の方法および組成物において有用な特定の好ましいモルフォゲ
ンは、上記の参照モルフォゲン配列(例えば、配列番号４の残基38〜139)と70％
、または、好ましくは、80％の相同性(類似性)を共有するアミノ酸配列を有する
、形態発生的に活性なタンパク質として記載され得る(ここで「相同性」は、本
明細書中で先に定義されるものと同じである)。あるいは、別の好ましい実施態
様において、本明細書中に開示される方法および組成物において有用なモルフォ
ゲンは、一般配列７(配列番号１)、より好ましくは一般配列８(配列番号２)によ
り記載されるポリペプチドのファミリー内に入る。
本明細書中の図２は、本明細書中でモルフォゲンとして同定または認識される
天然に存在するタンパク質の活性な領域のアミノ酸配列のアラインメントを記載
し、これは以下を含む：ヒトOP-1(hOP-1、配列番号４および15〜16)、マウスOP-
1(mOP-1、配列番号５および17〜18)、ヒトおよびマウスOP-2(配列番号６、７お
よび19〜22)、マウスOP-3(配列番号25〜26)、CBMP2A(配列番号８)、CBMP2B(配列
番号９)、BMP3(配列番号27)、DPP(Drosophila由来、配列番号10)、Vgl(Xenopus
由来、配列番号11)、Vgr-1(マウス由来、配列番号12)、GDF-1(マウスおよび/ま
たはヒト由来、配列番号13、30および31)、60Aタンパク質(Drosophila由来、配
列番号23および24)、BMP5(配列番号28)、およびBMP6(配列番号29)。これらの配
列は本質的には、Needlemanら(1970)，48 J．Mol．Biol.，443-453の方法に従っ
て並べられ、Align Program(DNAstar，Inc.)を用いて計算される。図２において
、３つの点は、その位置のアミノ酸が、hOP-1における対応するアミノ酸と同一
であることを示す。３つのダッシュは、その位置にはアミノ酸が存在しないこと
を示し、そして相同性を例示する目的を含む。例えば、CBMP-2AおよびCBMP-2Bの
アミノ酸残基60は「欠失」である。もちろん、この領域におけるこれらのアミノ
酸配列の両方は、Asn-Ser(残基58、59)を含む(CBMP-2AがLysおよびIleを含み、
一方CBMP-2BがSerおよびIleを含むとともに)。図２はまた、モルフォゲンアミノ
酸配列における挿入の操作を示す：BMP3の残基56と57との間に、Val残基が挿入
される；GDF-1の残基43と44との間にアミノ酸配列、Gly-Gly-Pro-Proが挿入され
る。参照モルフォゲン配列由来のそのような偏向は、例えば、GDF-1とhOP-1との
間の定義された関係を計算する目的のためには無視される。図４に記載したアミ
ノ酸配列の比較から明らかなように、形態発生的活性を保有する一方、重要なア
ミノ酸変化が参照配列からなされ得る。例えば、図４に図示したGDF-1タンパク
質配列は、本明細書中に記載するhOP-1配列と約50％のアミノ酸同一性しか共有
せず、そのGDF-1配列はhOP-1配列と70％より大きいアミノ酸相同性(または「類
似性」)を共有する(ここで「相同性」または「類似性」は、並べた配列内の可能
な保存的アミノ酸置換を含む)。例えば、Dayhoffら、(1979)５Atlas of Protein Sequence and Structure
増刊号第３巻，345-362頁(M.O.Dayhoff編，Nat'l Bio
Med．Res．Fd'n、Washington D.C.)。
本発明においてモルフォゲンとして有用な、本発明の最も好ましいタンパク質
配列として、hOP-1の保存された６個または７個のシステイン骨格を特徴とする
アミノ酸配列(例えば、配列番号５の残基43〜139または38〜139)と、60％より大
きな同一性、好ましくは65％より大きな同一性を有する配列が挙げられる。これ
らの最も好ましい配列として、OP-1およびOP-2タンパク質(Drosophila 60Aタン
パク質を含む)の対立遺伝子的および系統発生的等価変異体の両方が挙げられる
。従って、さらに別の好ましい局面において、本発明は、７個のシステインドメ
インを特徴とし、そして種々の同定されたOP1およびOP2タンパク質との間に同一
性および相同性を有する、本明細書中で「OPX」といわれる一般的アミノ酸配列
を有する種々のポリペプチド鎖を含むモルフォゲンを包含する。OPXを配列番号
３
に示す。本明細書中に記載するように、所定の位置の各Xaaは、マウスまたはヒ
トOP1またはOP2(図２ならびに配列番号４〜７および/または配列番号15〜22を参
照のこと)のＣ末端配列中の対応する位置に存在する残基から独立して選択され
る。
あるいは、哺乳動物中の内生モルフォゲンレベルの刺激能のある有効量の薬剤
が、本明細書中に記載の任意の経路で投与され得る。例えば、歯周組織、歯肉、
歯槽中の歯槽骨組織、または歯髄組織からのモルフォゲンの産生および/または
分泌の刺激能のある薬剤が、例えば、歯組織へのモルフォゲン刺激剤の直接投与
により、哺乳動物に提供され得る。あるいは、モルフォゲン刺激剤は、遠位(例
えば、歯組織以外の組織部位)でのモルフォゲンの発現および/または分泌を誘導
し得、そして発現したモルフォゲンは、モルフォゲンを取り込みおよびそれに応
答し得る歯組織へ循環する。所定の組織での内生モルフォゲンのレベルを調節す
る能力のある薬剤を同定または試験するための方法が、先に示した米国特許出願
第07/938,021号(WO93/05172として公開)および第07/752,859号(WO93/05751とし
て公開)に詳細に記載されている。簡潔には、候補化合物は、試験組織もしくは
その細胞、またはそれらに由来する培養細胞株を用い、その化合物の産生(すな
わち、その組織の細胞により産生されたモルフォゲンの発現および/または分泌)
に影響を与えるに十分な時間のインビトロでのインキュベーションにより、同定
および試験され得る。ここでは、適切な組織、または適切な組織の培養細胞は、
好ましくは腎臓上皮、歯繊維芽細胞、セメント芽細胞、ぞうげ芽細胞、および骨
芽細胞から選択され得る。III ．投与のための処方物および方法
モルフォゲンを歯組織の表面、例えば、ぞうげ質または歯肉の表面に、任意の
適切な手段によって提供し得る。好ましくは、モルフォゲン、またはモルフォゲ
ン刺激剤を局所投与により直接的に組織表面に提供する。あるいは、モルフォゲ
ンを、例えば、局所注入により組織に提供し得る。本願では好ましくないが、全
身注入はまた、進行したまたは慢性の疾患状態の処置、または疾患の最大の危険
における個々の予防策のような、特定の環境下で実行可能な投与経路であり得る
。
経口および非経口投与を含む全身投与についての考察の詳細な記載は、例えば、
米国特許出願第08/165,511号(WO93/04692として公開)に開示されている。
モルフォゲンをぞうげ質表面に直接的に提供する場合、モルフォゲンを液体、
ゲル、または固体であり得る、生体適合性処方物の一部として投与し得る。例え
ば、モルフォゲンを哺乳動物の生理学的な液体または塩のバランスを損なわない
水性培地中に分散し得る。従って、モルフォゲンのための水性培地は、pＨ7.0〜
7.4で、通常の生理食塩水(0.85％、または0.15Ｍ NaCl)を含み得る。水性モルフ
ォゲン処方物を、例えば、モルフォゲンを、0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)または
0.1％ HCl中のアセトニトリルを含む50％エタノール、または同等の溶媒中に溶
解させて作製し得る。次いで、得られた溶液の１倍量を、例えば、10倍量のリン
酸緩衝化生理食塩水(PBS)(0.1〜0.2％のヒト血清アルブミン(HSA)または別の受
容可能なキャリアタンパク質をさらに含み得る)に添加する。得られた溶液を、
好ましくは、長時間、ボルテックスする。さらに、モルフォゲンを、投与部位で
モルフォゲンを維持し得るキャリア中に分散および会合し得る。本明細書中のい
くつかの実施態様のための有用な処方物は、粘性成分および蒸発性成分を含む。
処方物の粘性を増加させる生体適合性組成物はグリセロール、ポリエチレングリ
コールのようなポリアルキレングリコール、野菜由来の油、水素化ナフタレンな
どを含む。有用な蒸発性成分は、組織表面上にモルフォゲンの残留物を維持する
ように生理学的条件下で蒸発する、生理学的に受容可能な、例えば、生物学的に
不活性な液体を含む。蒸発性の液体は、低分子量の有機または無機化合物(水、
エタノール、イソプロパノール、酢酸など)を含み、蒸発前に組織の機能または
組織構造の完全性に有害に作用しない。
処方物はまた、制御放出送達ビヒクルとして働くインビボ生体吸収性キャリア
材料を含み得る。有用なキャリアは、例えば、細胞外マトリクス（例えば、コラ
ーゲン、ラミニン、ヒアルロン酸など)、またはポリマー材料(例えば、ポリ乳酸
、ポリ酪酸、ポリグリコール酸)由来の生体適合性の、好ましくは生体分解性の
構造成分を含み得る。キャリアはまた、脱塩しグアニジン抽出した骨、ぞうげ質
、歯周靭帯、またはセメント質マトリクスのような非構造成分を実質的に消失し
た、無細胞性の組織マトリクスを包含し得る。このようなマトリクスの調製法の
詳細
は、米国特許出願第07/752,764号(WO92/15323として公開)に開示される。モルフ
ォゲンを分散し得る他の有用な制御放出キャリアは、米国特許第4,975,526号お
よび同第4,919,939号に記載される。このようなキャリアは、モルフォゲンが穴
を塞ぐために使用される場合に、特に有用であることが示される。
粘性で蒸発性であるか、または生体吸収性キャリアを含有するモルフォゲン組
成物は、好ましくは、ぞうげ質または歯肉表面への局所投与に適しており、そし
て後退を阻害するか、または歯肉組織の再生治癒ならびにぞうげ質組織の形態発
生の刺激を増強し得る。
所望である場合、得られたモルフォゲンを適切な分子と会合させることによっ
て、水性組成物中でより溶解させ得る。例えば、形態発生タンパク質のプロ形態
は、代表的には、その対応する成熟形態よりも生理学的溶液により可溶性または
分散性である。実際、内生モルフォゲンはこの形態で哺乳動物体内で輸送(例え
ば、分泌および循環)されると考えられている。タンパク質のこの可溶性形態は
、モルフォゲン分泌哺乳動物細胞(例えば、モルフォゲンをコードし、そして発
現し得る核酸でトランスフェクトした細胞)の培養培地から得られ得る。あるい
は、可溶性種を、成熟二量体(またはその活性フラグメント)とモルフォゲンプロ
ドメインまたはその可溶性を増大するフラグメント(下記でさらに十分に示す)と
の混合により処方し得る。種々の血清タンパク質を含む他の成分はまた、モルフ
ォゲンの可溶性の増強に有用であり得る。
最終的に、本明細書中で提供されるモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を
、単独または他の分子、特に症状を緩和する補因子との組み合わせで投与し得る
。歯組織への損傷に関連する症状の緩和に有用な薬学的補因子は、殺菌剤、抗生
物質、麻酔剤、および鎮痛剤を含む。本発明の系での使用に好ましい殺菌剤は、
クロルヘキシジンおよびヨウ化チベゾニウムを含み；好ましい抗生物質は、テト
ラサイクリン、アミノグリコシド(例えば、ネオマイシン、ゲンタマイシン、カ
ナマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、シソマイシン、アミカマイシン
、それらの硫酸塩、または他の誘導体)、マクロライド(例えば、エリスロマイシ
ン、その塩および他の誘導体、スピラマイシン、ジョサマイシン、またはミオカ
マイシン)、ペニシリン(例えば、アンピシリン、アモキシリンなど)、およびセ
ファ
ロスポリン(例えば、セファクロアー、セファドロキシル、セファゾリン、セフ
ォペラゾン、セフォタキシム、セファロチン、セファレキシン、セフォラニド、
セフォニシド、またはセフトリアクソン)を含む。好ましい麻酔剤／鎮痛剤は、
アミド型局所麻酔剤(例えば、リドカイン、メピバカイン、ピロカイン、ブピバ
カイン、プリロカイン、エチドカイン)、または他の広範に使用される鎮痛剤(例
えばプロカイン)を含む。
他の補因子は、非ステロイド性抗炎症剤を含む。しかし、本明細書中で記載さ
れるモルフォゲン自身は、初期の組織損傷に対する体の炎症／免疫応答を調節し
得る。特に、そして、米国特許出願第08/165,511号(WO93/04692として公開)に詳
細に記載されるように、モルフォゲンの存在下で、組織損傷部位へ移動するよう
に誘導された前炎症性エフェクター細胞は、有意に活性化されない。任意の得ら
れた論理に限定されることなく、モルフォゲンの存在下で、損傷を受けた組織が
組織形態発生の反復を受けないよう誘導されると考えられる。ここで、始原細胞
は組織特異的な様式で増殖しそして分化するように誘導され、そして新しく、機
能的で、組織化した組織が形成され、非組織化線維性瘢痕組織よりもむしろ損傷
したまたは損失した組織と入れ替わる。
処方した組成物は、治療有効量のモルフォゲン(例えば、ぞうげ質の形態発生
および／またはそれらに適切なぞうげ質マトリクスの産生を刺激するに十分な時
間、ぞうげ質表面に適切な濃度のモルフォゲンを提供する量)を含む。当業者に
理解されるように、本発明の治療組成物において記載される成分の濃度は、多く
の因子に依存して変化し、その因子は、選択したモルフォゲンの生物学的効力、
使用した化合物の化学的特徴(例えば、疎水性)、化合物賦形剤の処方、投与経路
、および示した処置(修復ぞうげ質が適用部位から、例えば、約0.5mmまでの距離
で誘導されるか否かを含む)を含む。投与されるべき好ましい用量はまた、歯組
織、特にモルフォゲンが適用されるぞうげ質表面の状態、処置されるべき歯また
はぞうげ質表面のサイズ、歯組織の損失または後退の範囲、および特定の患者の
総合的な健康状態のような変化因子に依存するようである。一般に、0.10001mg
〜1000mgのモルフォゲンがヒトの歯を含む霊長類の歯に対して十分な量であり、
0.0001〜100mgが好ましく、そして0.001〜10mgがさらに好ましい。明確なモルフ
ォゲ
ン誘導性異常損傷は、成熟モルフォゲン(例えば、OP-1、20mg)が正常発育ラット
に21日間連続して毎日投与された場合、発生しない。さらに、10mgの全身注入用
モルフォゲン(例えば、0P-1)を10日間毎日注入された正常新生マウスは、いかな
る著しい異常も生じなかった。
本発明のさらに好ましい局面および実施態様を含む本発明の実施は、下記の実
施例によりさらになお十分に理解され、この実施例は、本明細書中で例示のため
にのみ示され、そして本発明をいかなるようにも限定するものとして解釈される
べきではない。
IV ．実施例
実施例１：哺乳動物の歯におけるモルフォゲン誘導性ぞうげ質形成
下記の研究は、モデル哺乳動物のぞうげ質組織形態発生の誘導におけるモルフ
ォゲンの効力を示す。ヒト歯髄が損傷に対し非予測的に応答することは観察され
ていた。現在、このことは歯科技術における基本的な臨床上の問題を表している
。従って、霊長類を、本明細書中でモデル哺乳動物としてぞうげ質組織再生の実
証のために使用する。歯科の当業者は、ヒトの歯科生物学とヒトではない霊長類
の歯科生物学との間の相関関係を理解しそして評価する。
組換えヒト骨形成タンパク質-1(hOP-1、配列番号４)は、新鮮に切り出された
霊長類の残っているぞうげ質に適用された場合、水酸化カルシウムペースト(従
来の処置)よりも修復ぞうげ質形成を有意に刺激した。OP-1に対する応答は、穴
のかぶせ物として歯に適用された濃度ならびに残っているぞうげ質の厚さに依存
した。水酸化カルシウムに対する応答は同様に、残っているぞうげ質の厚さに依
存した。
ぞうげ質マトリクス(matices)は、骨形態発生タンパク質(BMP)活性(Bangおよ
びUrist(1967)、94 Arch．Surg．781-789; YoumansおよびUrist(1967)、12 Arch
．Oral．Biol．999-1008; Butlerら、(1977)、56 J．Dent．Res．288-232; Bess
hoら、(1990)、70 J．Dent．Res．171-175)、成長因子(Finklemenら、(1990)、5
J．Bone Min．Res．717-723)およびぞうげ質形成活性(AnnerothおよびBang(197
2)、23 Odont．Rev．315-328; Nakashima,M.(1989)、5 Endodont．Dent．Trauma
t．279-286; Nakashima，M.(1990)，35 Arch．Oral．Biol.493-497; Nakashima
，M.(1990)，35 Arch．Oral．Biol．277-281; TziafasおよびKolokuris(1990)、
69 J．Dent．Res 75-81; Tziafasら、(1992)、37 Arch．Oral．Biol．119-128;
Smithら、(1994),39 Arch．Oral．Biol．13-22)を含むことが示されている。BMP
活性を有するぞうげ質の不純な抽出物(Nakashima，M.(1990)，35 Arch．Oral．B
iol．493-497; Nakashima，M.(1990)，35 Arch．Oral．Biol.277-281)、組換えB
MP-2、およびBMP-4(Nakashima，M.(1994)，73 J．Dent．Res．1515-1522)および
組換えヒト骨形成タンパク質-1(OP-1、BMP-7)(Rutherfordら、(1993)，38 Arch
．Oral．Biol．571-576; Rutherfordら、(1994)，39 Arch．Oral．Biol.833-838
)は、成熟した成人の歯において部分的に切断された歯髄に配置された場合、修
復ぞうげ質形成を誘導する。米国特許出願第07/752,764号(WO92/15323として公
開)および同第08/155,343号(WO94/06399として公開)もまた参照されたい。さら
に、歯髄(Vainoら、(1993),75 Cell．45-58; Heikinheimo，H．(1994)，73 J．D
ent．Res．590-597)または歯髄由来の細胞(Takedaら、(1994)，15 Bone 467-470
)は、いくつかのモルフォゲン遺伝子を特異的に発現する。従って、本研究では
、可溶化したOP-1が、サル永久歯において新鮮に切り出されたぞうげ質表面に配
置された場合、ぞうげ質形成を誘導するか否かを調査した。
90の門歯、前臼歯、および臼歯永久歯を血管収縮神経薬を用いずにCarbocaine
(Cook-Waite)で麻酔し、ゴム製ダムで単離し、冷却剤で洗浄した。歯髄底部領域
の変化は10％未満であり、そして残っている底部ぞうげ質の平均の厚さは異なる
歯間で約0.1から0.9mmで変化した(組形熊計量的(histmorphometrically)に計測
して)。歯髄底部を、酸アルコール(28.5％エタノール、0.025％塩酸)中に0.01、
0.1、１または10μgのOP-1を含む一定容量の蒸発性溶液、酸アルコール単独、水
酸化カルシウムペースト(Dycal,L.D.Caulk,Wilmington DE)の薄層で覆うか、ま
たはかぶせ物なしで充填した(無処置)。穴は標準的な再構築技術に従って、Keta
c Silver(ESPE-Premier，Norristown，PA)で充填した。任意の標準的歯再構築素
材が使用され得ると認識される。動物を外科処置の２ヶ月後に安楽死させ、被験
体を得、そして文献に記載のように分析した(Rutherfordら、(1993),38 Arch．O
ral．Biol．571-576)。
上記のそして動物を含む全ての手順は、ヒトではない霊長類を処置する広範な
実験により、認可された動物処置施設で承認されそして行われた。これらの研究
を、５匹の青年期の(混合歯列の)雄マカカザル(それぞれ体重約４〜６kg)を使用
して行った。歯科手順を、例えば、局部口腔内浸潤麻酔剤(血管収縮神経薬を含
まずに)を補給したケタミン(15mg/kg体重)およびアセプロマジン(0.55mg/kg体重
)で強度に鎮静した動物で行った。
本研究で代表的に観察された修復ぞうげ質の種々の量は、切断ぞうげ質小管の
内腔を横断するぞうげ質表面の領域に限定された。図３は、標準的組織学的技術
によってOP-1処置された動物から調製した代表的な組織部位のデジタル化ビデオ
像である。図３は、修復ぞうげ質が、歯の調製の間にこれらの切断ぞうげ質小管
深部に、形成されることを示す。多くの場合、修復ぞうげ質は、穴調製物の歯髄
底部および基盤歯髄腔がともに明らかな、全ての部位に存在した。歯髄底部に対
する修復ぞうげ質の大部分の空間的関係は、歯の長軸および小管を横断する切断
ぞうげ質の表面領域に対するぞうげ質小管の位置づけに決定されているようであ
った。この空間的位置づけはOP-1がぞうげ質小管を通じて拡散することを示唆す
る。
実際、モルフォゲン処置の２ヶ月後の新しいぞうげ質形成の領域は、適用され
たOP-1の用量にさらに依存した。図４は、この関係を示す組織形態計量的結果を
示す。残っているぞうげ質の平均的な厚さを、穴調製物の表面領域の75％以上に
分散した５つの各部位で、３つの別々のそして代表的な組織形態計量的測定値の
平均により決定した。図４において、修復ぞうげ質の平均領域を、穴調製物の表
面領域の75％以上に分散した５つの組織部位において３回繰り返した組織形態量
的測定値の平均により決定した。対照的に、かぶせ物を適用しない(無処置)歯に
おける切断ぞうげ質小管の深部の修復ぞうげ質の量と、蒸発性キャリア単独で処
置した歯における切断ぞうげ質小管の深部の修復ぞうげ質の量との間に、有意な
差異はなかった。
図５および６に見られるように、等量のOP-1(例えば、各歯あたり一定等量で
ある10μg)は、試みられた他の全ての処置(水酸化カルシウムを含む)よりも、処
置２ヶ月後の修復ぞうげ質を有意に刺激した。刺激の程度は、歯髄腔壁からモル
フォゲン適用部位を分離する残っているぞうげ質の厚さと関連し、そして残って
いるぞうげ質の厚さが0.2mmに近づいたときに特に明白になる。各グラフ化され
た残っているぞうげ質の値(0.2、0.45、0.75および0.9mm)は、±0.15mmまでで変
動する算出された値のグループを表す。従って、穴を10μgのOP-1、水酸化カル
シウムの薄層、または蒸発性キャリア単独で充填した２ヶ月後に存在する復ぞう
げ質の領域を、歯髄底部に残留する残っているぞうげ質の厚さの関数として表現
し得る。修復ぞうげ質は、水酸化カルシウム処置の歯よりもOP-1の処置の歯にお
いて(ANOVA,Scheffe's F,P<0.05)、キャリア処置の歯よりも水酸化カルシウム処
置の歯において(P<0.05)、そしてキャリア処置の歯よりもOP-1処置の歯において
(p<0.01)存在する。１μgのOP-1および水酸化カルシウムは、残っているぞうげ
質の厚さの範囲の間では等力であった(データは示さない)。より少ない量のOP-1
は、本研究で評価したサイズの穴において効果は不十分であった。
ぞうげ質小管の切除により、特により深部の調製物において、ぞうげ芽細胞死
が引き起こされ得る(Leeら、(1992)，AM．J．Den．64-68)。しかし、利用した歯
の調製手順は、最も深部の調製物においてでさえ、ぞうげ芽細胞を保護し得る(S
mithら、(1994)，39 Arch．Oral．Biol．13-22)。このように、本研究で形成さ
れたぞうげ質は、元のぞうげ芽細胞の表現型機能の刺激により形成された反応ぞ
うげ質であり得るか、または損失したぞうげ芽細胞の深部で新しく分化した細胞
により形成された修復ぞうげ質であり得る(Lesotら、(1993)，3 Cells and Mate
rials 201-217; Smithら、（1994）39 Arch．Oral．Biol．13-22)。本研究で利
用したデザインは、切断ぞうげ質小管の深部のぞうげ芽細胞層の一時的な観察を
許容しなかった。先の研究は、不溶性コラーゲンベースキャリアと複合体化した
OP-1の、部分的に切断された歯髄に直接配置した場合の修復ぞうげ質を刺激する
能力を示した(米国特許出願第08/155,343号(WO94/06399として公開)およびRuthe
rfordら、(1993)，38 Arch．Oral．Biol．571-576; Rutherfordら、(1994)，39A
rch．Oral．Biol．833-838)。部分的な歯髄の切断はぞうげ芽細胞の層を明らか
に除去し、より深部の歯髄の線維状結合組織を露出する。ヒト歯髄細胞はインビ
トロでOP-1に応答性であり、このことはさらに歯髄それ自身が反応性(応答能を
有する)細胞を含むことを示唆する。これらのOP-1応答性歯髄細胞の特異的表現
型は、まだ最終的に同定されていない。実施例２．ぞうげ質形成刺激に有用な可溶性モルフォゲン複合体の調製
水溶液において可溶性を増強した本明細書中で有用なモルフォゲンの本願にお
いて好ましい形態は、二量体の形態発生タンパク質である。このタンパク質は、
モルフォゲンファミリーに特徴的なＣ末端の７個のシステインドメインを少なく
とも含み、モルフォゲンファミリーのメンバーのプロ領域を含むペプチド、その
可溶性増強フラグメント、またはその対立遺伝子、種もしくは他の配列の変異体
と複合体化する。好ましくは、二量体形態発生タンパク質は、２つのプロ領域ペ
プチドと複合体化する。また、二量体形態発生タンパク質は、好ましくは、プロ
領域ペプチドと非共有的に複合体化する。プロ領域ペプチドは、好ましくは、得
られた天然に存在するモルフォゲン、またはその対立遺伝子もしくは系統発生の
片方の変異体のプロドメインを規定するＮ末端の18アミノ酸を少なくとも含む。
他の好ましい実施態様において、全長プロドメインを実質上規定するペプチドが
使用される。
他の可溶性形態のモルフォゲンは、これらのタンパク質の切断されていないプ
ロ形態の二量体、ならびに「ヘミ二量体」を含む。このヘミ二量体は、二量体の
１つのサブユニットがタンパク質の切断されていないプロ形態であり、そしても
う一つのサブユニットがタンパク質の成熟形態を含む。この成熟形態は、その端
を切断した形態、好ましくは、切断されたプロドメインペプチドと非共有的に会
合する形態を含む。
上記および来国特許出願第08/040,510号(WO94/03600として公開)に記載される
ように、有用なプロドメインは全長プロ領域を含み、ならびにその種々の端を切
断した形態、特にプロドメインポリペプチド内のタンパク質分解Arg-Xaa-Xaa-Ar
g(配列番号32)切断部位で切断された端を切断した形態を含む。例えば、OP-1に
おいて、可能なプロ配列は、残基30-292(全長形態)；48〜292；および158〜292
により規定される配列を含む。可溶性OP-1複合体の安定性は、プロ領域が、残基
48〜292である端を切断した形態のような端を切断した形態よりも全長の形態を
含む場合、最高に増強される。ここで、残基30〜47は、他のモルフォゲンのＮ末
端部分と配列相同性を示し、そして本願において全てのモルフォゲンについて複
合体安定性を増強するに特に有用であると考えられている。従って、本願におい
て好ましいプロドメインは、少なくともＮ末端フラグメント(例えば、天然に存
在するモルフォゲンプロドメインのアミノ酸残基30〜47、または天然に存在する
ペプチドの特性を増強する可溶性および／または安定性を保持しているその生合
成的変異体)を含有するペプチドを含む。
当業者に理解されるように、プロ領域をコードする有用な配列は、公知のモル
フォゲンをコードする遺伝的配列から得られ得る。あるいは、キメラプロ領域は
１つ以上の公知のモルフォゲンの配列から構築され得る。さらにもう１つの選択
肢は、１つ以上の公知のプロ領域配列の合成配列変異体を作製することである。
別の好ましい局面において、有用なプロ領域ペプチドは、少なくともOP1また
はOP2のプロ領域配列のＮ末端の18アミノ酸をコードするDNAまたはRNA配列(例え
ば、それぞれ配列番号15および19のヌクレオチド136〜192および152〜211)とス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ
酸配列を含有するポリペプチド鎖を含む。
２．１馴化培地または体液からの可溶性モルフォゲン複合体の単離
モルフォゲンは哺乳動物細胞から可溶性複合体として発現される。しかし、代
表的には、複合体は一般に精製溶液にしばしば添加される変性剤(例えば、界面
活性剤、アルコール、有機溶媒、カオトロピック剤および溶液のpHを下げるため
に添加される化合物)に曝すことにより、精製の間に解離している。以下に提供
するのは、非変性条件下で、馴化培地(または、必要に応じて、血清、脳脊髄ま
たは腹膜液のような体液)から可溶性タンパク質を精製するための本願において
好ましいプロトコルである。この方法は、迅速で再現可能であり、そして、実質
的に純粋な形態の単離された可溶性モルフォゲン複合体をもたらす。
可溶性モルフォゲン複合体は、馴化培地から、変性剤の比存在下で行われる単
純な３つの工程のクロマトグラフィープロトコルを使用して単離され得る。プロ
トコルは、培地(または体液)をアフィニティーカラムに通すこと、その後イオン
交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを行うことを含む。下記のアフィニティ
ーカラムはZn-IMACカラムである。本プロトコルは種々のモルフォゲンの精製に
対する一般的な適用性を有し、それらの全ては下記のプロトコルを若干改変した
ものを使用することにより単離され得ることが明らかである。有用性を有すると
また考えられる別のプロトコルはイムノアフィニティーカラムを含み、このカラ
ムは標準的な手順、および、例えば、得られたモルフォゲンプロドメインに対し
て特異的な抗体(例えば、プロテインＡ結合Sepharoseカラムに結合)を使用して
作製される。イムノアフィニティーカラムを開発するプロトコルは、当該分野に
おいてよく記載されている(例えば、Guide to Protein Purification，M．Deuts
cher編、Academic Press，San Diego，1990，特にその第VII節および第XI節を参
照のこと)。
本研究において、当該分野で記載されるようにOP-1は哺乳動物(CHO、チャイニ
ーズハムスター卵巣)細胞で発現された(例えば、国際特許出願US90/05903(WO91/
05802を参照のこと)。0.5％FBSを含むCHO細胞馴化培地を最初に固定化金属イオ
ンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用して精製した。馴化培地から
得た可溶性OP-1複合体は極めて選択的にZn-IMAC樹脂に結合し、そして高濃度の
イミダゾール(50mMイミダゾール、pH8.0)が結合した複合体の効果的な溶出に必
要である。Zn-IMAC工程により大部分の混入血清タンパク質(通過画分および35mM
イミダゾール洗浄画分中に溶出する)から可溶性OP-1が分離される。Zn-IMAC精製
可溶性OP-1を、次いで、50mM NaClとともに20mM NaPO4(pH7.0)で平衡化したＳ-S
epharoseカチオン交換カラムに適用した。このＳ-Sepharose工程は、後のゲル濾
過工程のために、調製において、可溶性OP-1複合体をさらに精製および濃縮する
。タンパク質をTBSで平衡化したSephacryl S-200HRカラムに適用した。実質的に
同じプロトコルを使用して、可溶性モルフォゲンはまた、血清、脳脊髄液または
腹腔液を含む１種以上の体液より単離され得る。
IMACを、カラム容積の３倍の0.2M ZnSO4で帯電させたChelating-Sepharose(Ph
armacia)を使用して行った。馴化培地をpH7.0に滴定し、そして500mM NaClとと
もに20mM HEPES(pH7.0)で平衡化したZn-IMAC樹脂に直接適用した。Zn-IMAC樹脂
を樹脂１mlあたり80mLの出発馴化培地とともに充填した。充填後、カラムを平衡
緩衝液で洗浄し、そして混入タンパク質のほとんどを、平衡緩衝液中の35mMイミ
ダゾール(pH7.0)で溶出した。可溶性OP-1複合体を、次いで、20mM HEPESおよび5
00mM NaCl中の50mMイミダゾール(pH8.0)で溶出した。
可溶性OP-1複合体を含む50mMイミダゾール溶出液を、９倍量の20mM NaPO4(pH7
.0)で希釈し、そして50mM NaClとともに20mM NaPO4(pH7.0)で平衡化したＳ-Seph
arose(pharmacia)カラムに適用した。Ｓ-Sepharose樹脂を、等量の樹脂１mlあた
り800mLの出発馴化培地とともに充填した。充填後、Ｓ-Sepharoseカラムを平衡
緩衝液で洗浄し、そして20mM NaPO4(pH7.0)中の100mM NaCl、次いで300mMおよび
500mM NaClで溶出した。300mM NaClのプールを、ゲル濾過クロマトグラフィーを
用いてさらに精製した。50mlの300mmNaCl溶出液をTris緩衝化食塩水(TBS)、50mM
Tris、150mM NaCl(pH7.4)で平衡化した5.0×90cmのSephacryl S-200HR(Pharmac
ia)に適用した。カラムを流速５ml/分で溶出し、10mLの画分を集めた。可溶性OP
-1の見かけ上の分子量を、タンパク質分子質量標準(アルコールデヒドロゲナー
ゼ(ADH、150kDa))、ウシ血清アルブミン(BSA、68kDa)、カルボン酸アンヒドラー
ゼ(CA、30kDa)およびシトクロムＣ(cytC、12.5kDa)と比較することにより決定し
た。S-200カラム画分の純度を、クマシーブルーで染色した標準15％ポリアクリ
ルアミドSDSゲル上で分離することにより決定した。成熟OP-1およびプロドメイ
ンの同一性を、成熟OP-1を標準逆相C18 HPLCを使用してプロドメインから分離し
た後、Ｎ末端配列分析により決定した。
可溶性OP-1複合体は、見かけ上の分子量110kDaで溶出する。このことは、２つ
のプロドメイン(各39kDa)が会合する１つの成熟OP-1二量体(35〜36kDa)を含む可
溶性OP-1複合体の予想した組成物とよく一致する。最終複合体の純度を、縮小し
た15％ポリアクリルアミドゲルにおいて適切な画分を泳動することで確認し得る
。
複合体組成物を、S-200またはS-200HRカラムからの複合体含有画分を逆相C18H
PLCカラムに通過させ、そしてアセトニトリルグラディエント(0.1％TFA中)で溶
出することにより、標準的な手順を用いて、確認し得る。複合体をこの工程で分
離し、そしてプロドメインおよび成熟種は、分離種として溶出する。これらの分
離種は、次いで標準的な手順(例えば、Guide to Protein Purification，M．Deu
tscher編、Academic Press，San Diego，1990，特に602〜613頁を参照のこと)、
ならびに成熟モルフォゲンおよび単離され切断されたプロドメインとしてそれぞ
れ確認された、単離された36kDa、39kDaのタンパク質の同一性を用いてＮ末端配
列決定に供され得る。OP-1を産生した哺乳動物細胞由来の単離プロドメインのＮ
末端配列は、２つの形態のプロ領域、すなわち完全な形態(配列番号16の残基30
から始まる)、および端を切断した形態(配列番号16の残基48から始まる)を示し
た。単離された成熟種のポリペプチドサブユニットのＮ末端配列決定は、成熟配
列についてのＮ末端の範囲を示し、配列番号16の残基293、300、313、315、316
および318から始まり、それらの全ては米国特許出願第07/752,764号(WO92/15323
として公開)に記載される標準骨形態発生アッセイにより示されるように活性で
ある。
２．２インビトロでの可溶性モルフォゲン複合体形成
培養培地または体液から可溶性複合体を精製する別の方法として、可溶性複合
体を精製プロドメインおよび成熟二量体種から処方し得る。十分な複合体形成に
は、これらの分子の折り畳まれた構造を、ジスルフィド結合に作用せずに弛緩さ
せるに十分な変性条件下での成分の会合が必要である。好ましくは、変性条件は
、切断されたプロドメインが弛緩した折り畳み条件下で成熟二量体種と会合する
機会を有するように細胞内小胞の環境を十分に模倣する。次いで、溶液中の変性
剤の濃度を、プロドメインと二量体との会合を維持しながら二量体およびプロ領
域を適切に再折り畳みするように、制御された、好ましくは段階的な様式で減少
する。有用な変性剤は、pH４〜10、好ましくはpH６〜８の緩衝化溶液中の４〜６
Ｍ尿素またはグアニジン塩酸(GuHCl)を含む。可溶性複合体を、次いで、最終変
性剤濃度0.1〜2Ｍ未満の尿素またはGuHCl、好ましくは１〜２Ｍ尿素またはGuHCl
を有する溶液中で制御された透析または希釈により形成し得、これを、次いで、
好ましくは生理学的緩衝液中で希釈し得る。タンパク質精製／再生の手順および
考察は当該分野でよく記載され、そして適切な再生プロトコルを容易に開発する
ための詳細は、当業者により決定され得る。この目的に対する一つの有用なテキ
ストは、Guide to Protein Purification，M．Deutscher編、Academic Press，S
an Diego，1990，特に第Ｖ節である。複合体形成はまた、１つ以上のシャペロン
タンパク質の添加により補助され得る。
２．３可溶性モルフォゲン複合体の安定性
生理学的緩衝液、例えば、トリス緩衝化生理食塩水(TBS)およびリン酸緩衝化
生理食塩水(PBS)中の高度に精製された可溶性モルフォゲンの安定性は、任意の
多くの手段により増強され得る。本願において好ましい手段は、少なくともプロ
配列の最初の18アミノ酸(例えば、OP-1の配列番号16の残基30〜47)を含むプロ領
域、そして好ましくは全長のプロ領域を使用することである。残基30〜47は他の
モルフォゲンのＮ末端部分に対して配列相同性を示し、そして全てのモルフォゲ
ンについて複合体の安定性を増強する特定の有用性を有すると考えられている。
可溶性モルフォゲン複合体の安定性を増強する他の有用な手段は、３つの種類の
添加剤を含む。これらの添加剤は、塩基性アミノ酸(例えば、L-アルギニン、リ
ジンおよびベタイン)；非イオン性界面活性剤(例えば、Tween80またはNonIdetP-
120)；およびキャリアタンパク質(例えば、血清アルブミンおよびカゼイン)を含
む。これらの添加剤の有用な濃度は、１〜100mM、好ましくは10〜70mMの塩基性
アミノ酸(50mM塩基性アミノ酸を含む)；0.01〜1.0％、好ましくは0.05〜0.2％の
非イオン性界面活性剤(0.1％(v/v)の非イオン性界面活性剤を含む)；そして0.01
〜1.0％、好ましくは0.05％〜0.2％のキャリアタンパク質(0.1％(w/v)キャリア
タンパク質を含む)である。