JP6874953B2 - ヒトiPS細胞から、ヒト歯原性上皮細胞やヒト歯原性間葉細胞を製造する方法 - Google Patents
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(1)以下の工程A及びBを有することを特徴とする、ヒト歯原性上皮細胞の製造方法;工程A:レチノイン酸、骨形成タンパク質−4及びエナメルマトリックスタンパク質を含有する角化細胞増殖用培養液で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程;及び
工程B:工程Aで得られた細胞を、エナメルマトリックスタンパク質を含有する角化細胞増殖用培養液で培養する工程や、
(2)工程Aの培養液におけるエナメルマトリックスタンパク質の濃度が1〜600μg/mLの範囲内であり、工程Bの培養液におけるエナメルマトリックスタンパク質の濃度が1〜600μg/mLの範囲内であることを特徴とする上記(1)に記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法や、
(3)エナメルマトリックスタンパク質が、エナメルマトリックスデリバティブであることを特徴とする上記(1)又は(2)に記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法や、
(4)工程Aの培養期間が2〜5日間の範囲内であり、工程Bの培養期間が4〜10日間の範囲内であることを特徴とする上記(1)〜(3)のいずれかに記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法や、
(5)ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞であることを特徴とする上記(1)〜(4)のいずれかに記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法や、
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法により製造されるヒト歯原性上皮細胞に関する。
(7)以下の工程C及びDを有することを特徴とする、ヒト歯原性間葉細胞の製造方法;工程C:神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程;
工程D:工程Cで得られた細胞を、エナメルマトリックスタンパク質、神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液で培養する工程や、
(8)神経細胞増殖用成分が、Neurobasal(登録商標)Medium(Life Technologies社製)、Gem21 neuroplex(登録商標)(Gemini Bio-Products社製)及びN-2 Supplement(Life Technologies社製)からなる群から選択される1種又は2種以上であり、分化誘導因子が、線維芽細胞増殖因子−2(bFGF)、上皮成長因子(EGF)及び哺乳動物の血清からなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする上記(7)に記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法や、
(9)エナメルマトリックスタンパク質が、エナメルマトリックスデリバティブであることを特徴とする上記(7)又は(8)に記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法や、
(10)工程C及び工程Dにおける細胞の培養が、浮遊培養であることを特徴とする上記(7)〜(9)のいずれかに記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法や、
(11)工程Cの培養期間が3〜5日間の範囲内であり、工程Dの培養期間が5〜11日間の範囲内であることを特徴とする上記(7)〜(10)のいずれかに記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法や、
(12)ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞であることを特徴とする上記(7)〜(11)のいずれかに記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法や、
(13)上記(7)〜(12)のいずれかに記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法により製造されるヒト歯原性間葉細胞に関する。
本発明のヒト歯原性上皮細胞の製造方法としては、以下の工程A及びBを有する方法である限り特に制限されない。
工程A:レチノイン酸、骨形成タンパク質−4及びエナメルマトリックスタンパク質を含有する角化細胞増殖用培養液で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程;
工程B:工程Aで得られた細胞を、エナメルマトリックスタンパク質を含有する角化細胞増殖用培養液で培養する工程;
とができる。
含まれる。
本発明のヒト歯原性間葉細胞の製造方法としては、以下の工程C及びDを有する方法である限り特に制限されない。
工程C:神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程;
工程D:工程Cで得られた細胞を、エナメルマトリックスタンパク質、神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液で培養する工程;
本発明には、上記の工程A及びB、並びに、上記の工程C及びDをすべて含む、ヒト歯原性上皮細胞及びヒト歯原性間葉細胞の製造方法も包含される。
1−1 方法
1−1−1 ヒトiPS細胞からヒト歯原性上皮細胞への分化誘導処理 ヒトiPS細胞が接着した6ウェルプレートからmTeSR1培養液を除き、PBSで細胞を洗浄した後、1μM レチノイン酸(Sigma-Aldrich社製)、25ng/mL BMP−4(R&D Systems社製)、及び、30μg/mL エムドゲイン(Biora社製のエナメルマトリックスデリバティブ)を含有させたKeratinocyte-SFM培養液[keratinocyte serum free medium、Life Technologies社製])を加え、3〜4日間、細胞を培養した(本発明の工程Aに相当)。次いで、培養液を除いた後、レチノイン酸及びBMP−4を含有させず、30μg/mL エムドゲイン(Biora社製のエナメルマトリックスデリバティブ)を含有させたKeratinocyte-SFM培養液を加え、さらに6〜7日間、細胞を培養した(本発明の工程Bに相当)。
上記「1−1 ヒトiPS細胞からヒト歯原性上皮細胞への分化誘導処理」の項目に記載の方法にしたがって製造したヒト歯原性上皮細胞を、4%パラホルムアルデヒド存在下で20分間固定処理し、5.0% スキムミルク、0.4%(v/v) Trition X-100及び10μg/mL BlockingOne(ナカライテスク社製)を含有させたPBS中で1時間ブロッキング処理した後、2種類の歯原性上皮特異的マーカー(アメロゲニン、アメロブラスチン)に対する抗体(1次抗体)及び3種類の上皮特異的マーカー(p63、サイトケラチン18、及びE−カドヘリン)に対する抗体(1次抗体)の存在下、4℃で一晩1次抗体処理を行い、PBSで洗浄した後、かかる1次抗体に対する抗体(2次抗体)の存在下、室温で1時間2次抗体処理を行い、PBSで洗浄した後、細胞核を、1μg/mL Hoechst 33342(Sigma-Aldrich社製)で染色した。共焦点蛍光画像は、Zeiss LSM 710 laser scanning microscope(Carl Zeiss社製)又はKEYENCE BZ-9000(株式会社キーエンス製)を用いて取得した。なお、歯原性上皮特異的マーカー及び上皮特異的マーカーの検出に用いた1次抗体及び2次抗体を以下の表1に示す。
上記「1−1−1 ヒトiPS細胞からヒト歯原性上皮細胞への分化誘導処理」の項目に記載の方法にしたがって製造したヒト歯原性上皮細胞を、ヒトiPS細胞からヒト歯原性上皮細胞への分化誘導を開始してから10日目に顕微鏡により観察したところ、上皮細胞の特徴の一つである敷石状に整列した形態が観察された(図1参照)。また、かかる細胞における1種類の歯原性上皮特異的マーカー(アメロゲニン)及び3種類の上皮特異的マーカー(p63、サイトケラチン18、及びE−カドヘリン)の発現を、免疫組織染色法を用いて解析したところ、エムドゲイン(エナメルマトリックスデリバティブ)非存在下でヒト歯原性上皮細胞へ分化誘導を試みた場合には、上皮特異的マーカーの発現は多少検出されたものの、歯原性上皮特異的マーカー(アメロゲニン)の発現は検出されなかったのに対して(図2A参照)、エムドゲイン(エナメルマトリックスデリバティブ)存在下でヒト歯原性上皮細胞へ分化誘導した場合には、上皮特異的マーカー及び歯原性上皮特異的マーカー(アメロゲニン)の発現が検出された(図2B参照)。この結果は、本発明のヒト歯原性上皮細胞の調製方法を用いると、ヒトiPS細胞からヒト歯原性上皮細胞を分化誘導できることを示すとともに、かかる分化誘導には、エナメルマトリックスデリバティブ等のエナメルマトリックスタンパク質が必要であることを示している。なお、同様の免疫組織染色法を、アメロゲニン以外のもう一つの歯原性上皮特異的マーカーであるアメロブラスチンについても行った。エムドゲイン(エナメルマトリックスデリバティブ)存在下でヒト歯原性上皮細胞へ分化誘導した場合には、アメロブラスチンの発現が検出された。歯原性上皮特異的マーカーであるアメロゲニンとアメロブラスチンの両方の発現が検出されたことから、得られた細胞がヒト歯原性上皮細胞であることが確認された。
2−1 方法
2−1−1 ヒトiPS細胞からヒト歯原性間葉細胞への分化誘導処理
ヒトiPS細胞が接着した6ウェルプレートからmTeSR1培養液を除き、PBSで細胞を洗浄した。次いで、2mg/mL コラゲナーゼIV(Sigma-Aldrich社製)を含有させたKnockOut DMEM培養液(Life Technologies社製)で、1時間30分、37℃、5%CO2条件下にて、剥離処理した後、ヒトiPS細胞の細胞塊(スフェア)を回収した。この細胞塊を、マトリゲル未コートの6ウェルプレートに播種し、「神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液」(250mL DMEM/F12 with Glutamax[Life Technologies社製]、2.5mL 100X Glutamax[Life Technologies社製]、250mL Neurobasal培養液[Life Technologies社製]、5mL Gem21 NeuroPlex[Gemini. Bio. Products社製]、2.5mL N2サプリメント[Life Technologies社製]、10μg/mL ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子[hbFGF;R&D Systems社製]、10μg/mL ヒト上皮成長因子[hEGF;R&D Systems社製]、2.5mL ペニシリン/ストレプトマイシン、を含有させた培養液)中で4日間培養した(本発明の工程Cに相当)。かかる工程Cにより、ヒトiPS細胞を、ヒト神経堤細胞の前駆段階であるヒト神経上皮細胞へ分化誘導した(図3参照)。かかるヒト神経上皮細胞の細胞塊を回収し、「エナメルマトリックスタンパク質、神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液」中でさらに6日間培養した(本発明の工程Dに相当)。かかる培養は、ウェルプレートに加えて、セルカルチャーインサート(コーニングインタナショナル社製又は日本ミリポア社製)を用いて行った。セルカルチャーインサートの底面は、透過性のメンブレンで構成されており、ウェルプレートのウェル内の培養液と、セルカルチャーインサート内の培養液は、そのメンブレンを通して互いに緩やかに混合される。かかる工程Dに相当する培養において、セルカルチャーインサート内には、前述の細胞塊と、前述の工程Cに相当する培養に用いた培養液とを入れ、ウェルプレート内には、エムドゲインを含有する培養液(20%FBS、1%ストレプトマイシン[すべて、Life Technologies社製]、及び30μg/mL エムドゲイン[Biora社製のエナメルマトリックスデリバティブ]を含有する500mL DMEM培養液[Life Technologies社製])を入れた。セルカルチャーインサート内の前述の培養液と、ウェルプレート内の前述の培養液は、体積比で1:1の量をそれぞれ用いた。このような工程Dにより、工程Cで得られた細胞を、ヒト歯原性間葉細胞へ分化誘導した(図4参照)。
上記「1−1−2 歯原性上皮特異的マーカーの発現解析」の項目に記載の方法にしたがって、歯原性間葉特異的マーカー(象牙質シアロリンタンパク質;DSPP)に対する1次抗体として、抗DSPP抗体[Bioss 社製、bs-8557R、1/200 or Santa Cruz Biotechnology社製、sc-73632、1/200倍希釈]を用い、また、かかる1次抗体に対する2次抗体として、Alexa Fluor 488抗ラビット抗体[Invitrogen社製、A-21206、1/500倍希釈]又はAlexa Fluor 555抗マウス抗体[Invitrogen社製、A-21127 or 31570、1/500倍希釈]を用いた免疫組織染色を行った。また、抗ペリフェリン(Peripherin)抗体、抗β3チューブリン抗体、抗GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)抗体及び抗平滑筋抗体(SMA)等を用いた免疫組織染色も行った。
上記「2−1−1 ヒトiPS細胞からヒト歯原性間葉細胞への分化誘導処理」の項目に記載の方法にしたがって、ヒトiPS細胞から神経上皮細胞への分化誘導を行った(本発明の工程Cに相当)。かかる神経上皮細胞への分化誘導を開始してから4日目の細胞を顕微鏡で観察した結果を図3に示す。図3から、神経上皮細胞がスフィア(塊)を形成していることが分かる。次に、上記「2−1−1 ヒトiPS細胞からヒト歯原性間葉細胞への分化誘導処理」の項目に記載の方法にしたがって、前述の神経上皮細胞のスフィアからヒト歯原性間葉細胞への分化誘導を行った(本発明の工程Dに相当)。かかるヒト歯原性間葉細胞への分化誘導を開始してから6日目の細胞を顕微鏡で観察した結果を図4に示す。また、かかる6日目の細胞におけるDSPPの発現を、免疫組織染色法を用いて解析した結果を図5に示す。図5の結果から、エナメルマトリックスデリバティブ非存在下でヒト歯原性間葉細胞へ分化誘導を試みた場合には、歯原性間葉特異的マーカー(DSPP)の発現は検出されなかったのに対して(図5Aの右パネル参照)、エナメルマトリックスデリバティブ存在下でヒト歯原性間葉細胞へ分化誘導した場合には、歯原性間葉特異的マーカー(DSPP)の発現が検出された(図5Bの右パネル参照)。この結果は、本発明のヒト歯原性間葉細胞の製造方法を用いると、ヒトiPS細胞からヒト歯原性間葉細胞を分化誘導できることを示すとともに、かかる分化誘導には、エナメルマトリックスデリバティブ等のエナメルマトリックスタンパク質が必要であることを示している。また、本発明のヒト歯原性間葉細胞の製造方法により製造されたヒト歯原性間葉細胞は、間葉系リネージ(lineage)である骨細胞(図6A参照)、軟骨細胞(図6B参照)、脂肪細胞(図6C参照)、神経細胞(図6D参照)、グリア細胞(図6E参照)、及び平滑筋細胞(図6F参照)へ分化誘導が可能であることも確認された。かかる結果は、マウス歯原性間葉細胞は多分化能を有することが示された文献(Yamazaki, et al., Stem Cells 25; 78-87, 2007)の結果を支持するものである。
3−1 方法
ホタル由来発光タンパク質ルシフェラーゼとオワンクラゲ由来蛍光タンパク質(Venus)を融合させた蛍光発光融合タンパク質であるフォルティシモ・ルシフェラーゼ(ffLuc)(Biochem Biophys Res Commun. 419(2):188-193, 2012)を導入し得るレンチウイルスを用意した。ffLucは、高い発光活性を有しており、それを発現する細胞を高感度に検出することができる。
共培養開始から1週間経過後の可視化歯原性間葉細胞について、上記1−1−2や上記2−1−2と同様の免疫染色法にて解析した。可視化歯原性間葉細胞を抗ペリフェリン(Peripherin)抗体やHoechst 33342で染色した結果を図7に示し、抗E−カドヘリン抗体やHoechst 33342で染色した結果を図8に示す。
Claims (11)
- 以下の工程A及びBを有することを特徴とする、ヒト歯原性上皮細胞の製造方法;
工程A:レチノイン酸、骨形成タンパク質−4及びエナメルマトリックスタンパク質を含有する角化細胞増殖用培養液で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程;及び
工程B:工程Aで得られた細胞を、エナメルマトリックスタンパク質を含有する角化細胞増殖用培養液で培養する工程。 - 工程Aの培養液におけるエナメルマトリックスタンパク質の濃度が1〜600μg/mLの範囲内であり、工程Bの培養液におけるエナメルマトリックスタンパク質の濃度が1〜600μg/mLの範囲内であることを特徴とする請求項1に記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法。
- エナメルマトリックスタンパク質が、エナメルマトリックスデリバティブであることを特徴とする請求項1又は2に記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法。
- 工程Aの培養期間が2〜5日間の範囲内であり、工程Bの培養期間が4〜10日間の範囲内であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法。
- ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載のヒト歯原性上皮細胞の製造方法。
- 工程C:神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程;及び、
工程D:工程Cで得られた細胞を、エナメルマトリックスタンパク質、神経細胞増殖用成分及び分化誘導因子を含有する細胞増殖用培養液で培養する工程;
を有すること、並びに、
前記分化誘導因子が、線維芽細胞増殖因子−2(bFGF)、上皮成長因子(EGF)及び哺乳動物の血清からなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする、ヒト歯原性間葉細胞の製造方法。 - 神経細胞増殖用成分が、Neurobasal(登録商標)Medium(Life Technologies社製)、Gem21 neuroplex(登録商標)(Gemini Bio-Products社製)及びN-2 Supplement(Life Technologies社製)からなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする請求項6に記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法。
- エナメルマトリックスタンパク質が、エナメルマトリックスデリバティブであることを特徴とする請求項6又は7に記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法。
- 工程C及び工程Dにおける細胞の培養が、浮遊培養であることを特徴とする請求項6〜8のいずれかに記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法。
- 工程Cの培養期間が3〜5日間の範囲内であり、工程Dの培養期間が5〜11日間の範囲内であることを特徴とする請求項6〜9のいずれかに記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法。
- ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞であることを特徴とする請求項6〜10のいずれかに記載のヒト歯原性間葉細胞の製造方法。
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