KR20130037576A

KR20130037576A - Ｈｄａｃ 저해제와 알파칼슘설페이트를 유효성분으로 함유하는 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20130037576A
Application number: KR1020110102057A
Authority: KR
Inventors: 우경미; 김태일
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2011-10-06
Publication date: 2013-04-16
Also published as: KR101359571B1

Abstract

본 발명은 HDAC (Histone Deacetylase) 저해제와 알파칼슘설페이트를 유효성분으로 함유하는 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 치주 조직의 재생, 뼈조직의 재생, 백악모세포의 분화 또는 조골세포로의 분화를 유도하는 바, 치주질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＨＤＡＣ 저해제와 알파칼슘설페이트를 유효성분으로 함유하는 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING HISTONE DEACETYLASE INHIBITORS AND ALPHACALCIUM SULFATE AS ACTIVE INGREDIENTS FOR PERIODONTAL DISEASE}

본 발명은 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 HDAC (Histone Deacetylase) 저해제와 알파칼슘설페이트를 유효성분으로 함유하는 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

치아지지조직인 치주조직은 백악질, 치주인대, 치조골 및 치은으로 이루어져 있다. 치은염 및 치주염을 포함하는 치주질환은 세균에 의해 야기되는 치아지지 조직의 염증 상태로서, 출혈, 치주낭의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 인하여 치아의 상실을 가져올 수 있는 질환이다. 치주조직의 염증은 혐기성 그람음성세균들의 대사 산물인 황화수소, 암모니아 및 유독한 아민과 같은 세포독소와 혐기성 그람음성세균들의 세포벽 구성분인 리포폴리사카라이드 (Lipopolysaccharide)와 같은 내독소에 의해 직접 조직이 파괴되거나, 생체 면역계를 자극하여 자극된 체액성 및 세포성 면역계의 작용으로 세포외부로 분비된 활성산소, 프로스타글란딘, 루코트리엔, 히스타민, 인터루킨 등의 다양한 사이토카인에 의해 유발된다.

치주조직을 구성하는 네 가지 요소인 치은, 백악질, 치주인대, 치조골은 그 조직 특성이 모두 다르기에 치주질환으로 파괴된 병소를 재생하기 위한 치료는 아직까지 예지성있는 결과를 보여주는 것이 많지 않은 실정이다. 치태, 치석과 염증성 결합조직에 대한 비외과적 혹은 외과적 제거치료를 통해 치주질환은 치유단계에 접어들게 되지만, 상실된 치주조직은 이러한 전통적인 치료방식을 통해서는 치주조직 개개 구성요소들의 재생이 아닌 상피조직의 증식으로 불완전한 치유의 결과를 가져오게 된다. 골이식재를 활용한 치주조직재생 연구가 활발하나 치주조직재생에 필수적인 치주인대의 재생과 신생 백악질 형성이 잘 일어나지 않아 치주조직재생이 아닌 치조골재생이 보고되는 경우가 많다. 치주조직 재생 치료를 위해 조직유도재생술 (Guided tissue regeneration)이 제안되어 상부의 치은상피조직과 하부의 치주인대 및 치조골 부위를 물리적으로 분리하여 선택적인 치주조직의 증식을 도모하였으나, 이때 사용되는 재생재인 조직재생용막은 술후 합병증을 일으키는 경우가 많다. 또한 예후 예측가능성이 낮음이 문제가 된다. 예후 예측가능성이 높은 술식으로 국내외적으로 인정받는 치료법은 아직 개발되어야 할 실정이며, 또한 고가의 진료비용은 장벽이 되고 있다.

상기 종래의 문제점을 해결하기 위하여 본 출원의 발명자들은 효과적인 치주질환 치료 및 예방 제제 개발에 예의 노력한 결과, 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개발하기에 이르렀다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 HDAC (Histone Deacetylase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 HDAC 저해제는 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 벤즈아마이드 (benzamide), 친전자성 케톤 (electrophilic ketone), 발프로산 (valproic acid) 및 부틸레이트 (butyrate)로 이루어진 그룹에서 1이상 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 부틸레이트일 수 있다.

또한 상기 조성물은 칼슘설페이트를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 칼슘설페이트는 알파칼슘설페이트일 수 있다. 또한, 바람직하게는 상기 칼슘설페이트는 뼈재생 촉진제, 서방형 제제 또는 상처부위의 차단막 역할을 수행할 수 있다.

상기 치주질환은 치은염, 치주염 중 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 치주질환 예방 및 치료는 치주 조직의 재생, 뼈조직의 재생, 백악모세포의 분화 또는 조골세포로의 분화를 통한 예방 및 치료일 수 있다.

또한 상기 조성물을 충전제 조성물일 수 있으며, 상기 충전제 조성물을 피브린으로 치근 처치 후 청전하는 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 치주 조직의 재생, 뼈조직의 재생, 백악모세포의 분화 또는 조골세포로의 분화를 유도하는 바, 치주질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 mFibrin, collagen, collagen 치주처치후 HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트를 충전한 실험군 (collagen/αCS) 및 mFibrin 치주처치후 저해제 함유 알파칼슘설페이트를 충전한 실험군 (mFibrin/αCS)를 이용하여 충전한 뒤 8주 지나서 비글견을 희생하고 고정한 후 microCT 촬영하였으며, 이를 이용하여 3D 이미지를 재건한 결과이다.
도 2는 외과적으로 치주조직 손상을 준 시점과 각 재생재료를 충전하고 8주 후에 probing depth를 측정하고 그 차이인 -Δ(probing depth)를 나타낸 도면이다.
도 3은 microCT 촬영 후 치아 시편을 탈회하고 파라핀 포매 (paraffin embedding)하여 조직 절편을 얻고 이를 H&E 염색하여 조직 소견을 관찰이다. 화살표시는 외과적으로 치주조직을 손상시킨 협측의 치조골 및 백악질에서의 조직 재생 높이를 나타내며, 화살머리표시는 손상시키지 않은 설측 치조골 및 백악질의 높이를 나타낸다.
도 4는 일차배양한 사람 치주인대 섬유모세포가 HDAC 저해제-함유 알파칼슘설페이트에 의한 경조직 형성 세포로 분화 유도를 생체 무기질 형성과 관련된 분자들의 발현을 real-time PCR을 수행하여 관찰한 결과이다.
도 5는 백악모세포 OCCM30에서 HDAC 저해제인 Butyrate가 생체 무기질 형성과 관련된 분자들의 발현을 증가시키는지 여부를 확인한 결과이다

본 발명은 HDAC (Histone Deacetylase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 “Histone Deacetylase”란 히스톤을 탈아세틸화 시키는 효소에 해당한다. 히스톤 단백질의 염색질 구조는 아세틸화와 같은 화학적 변형으로 조절되며, 이러한 염색질 구조, 즉 DNA가 풀린 정도는 DNA로부터 mRNA로의 전사에 영향을 미친다. 히스톤 단백질의 아세틸화는 histone acetyltransferases과 histone deacetylases의 작용에 의해 조절된다. “HDAC 저해제”는 히스톤의 hyperacetylation을 초래하여 유전자 발현 변화를 유발하는 작용을 수행한다. HDAC 저해제는 세포보다 암세포에 선택적인 세포증식 억제 및 세포독성 작용을 나타내기 때문에 항암제로 개발되고 있다. 본 발명에서는 경조직 형성 세포 (백악모세포 및 조골세포) 분화 유도와 분화 촉진 작용 및 치주조직 재생 효과를 바탕으로 치주질환 치료의 새로운 용도를 발견하였다.

HDAC 저해제는 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 벤즈아마이드 (benzamide), 친전자성 케톤 (electrophilic ketone), 발프로산 (valproic acid) 또는 부틸레이트 (butyrate)일 수 있으며, 바람직하게는 부틸레이트이다.

또한 상기 조성물은 칼슘설페이트를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 “칼슘설페이트 (calcium sulfate) (CaSO₄)”는 칼슘의 황산염으로, 무수물, 이수화물 또는 반수화물의 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명에서 칼슘설페이트는 바람직하게는 반수화물이며, 더욱 바람직하게는 알파(α)형일 수 있다.

본 발명의 칼슘설페이트는 그 자체로 뼈재생을 촉진 할 수 있으며, 기계적 강도에 따라 생체내에서 변형 없이 재생이 요구되는 공간을 유지시키며, 조직 형성과 유사한 속도로 생체에 흡수되어 조직 재생에 이상적인 서방형 제제로 이용될 수 있다. 또한, 상처부위와 조직부위를 차단하는 차단막의 역할을 수행 할 수 있다.

본 발명에 있어서 “치주질환 (periodontal disease)”은 치주조직과 치아 사이의 V자 모양의 틈 (sulcus)에 박테리아가 공격하여 치주인대와 인접조직을 손상시키는 것을 의미한다. 병의 정도에 따라 치은염 (gingivitis)과 치주염 (periodontitis)으로 나뉜다. 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라고 하고, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다.

본 발명에 있어서, 치주질환 예방 및 치료는 치주 조직의 재생, 뼈조직의 재생, 백악모세포의 분화 또는 조골세포로의 분화를 통하여 치주질환을 예방하거나 치료 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 조성물이 동물실험에서의 치주 조직의 재생효과를 나타냄과 더불어, 치주인대 섬유모세포의 경조직 형성세포로의 분화를 확인하였으며, 백악모세포의 분화를 촉진시켰다.

본 발명에 따른 치주질환 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명은 치주질환의 효과적인 예방 및 치료를 위하여 다양한 형태로 제공될 수 있으며, 예를 들어 통상의 구강용 조성물의 제형을 갖을 수 있으며 구체적으로는 치약, 구강세정제 또는 구강청정제 등의 제형을 가질 수 있다. 본 발명에서 제공하는 구강용 조성물은 그 제형에 따라 제제화에 필요한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 예를 들면, 구강용 조성물의 제형이 치약류인 경우, 연마제, 습윤제, 기포제, 결합제, 감미제, pH조절제, 방부제, 약효성분, 향료, 증백제, 색소, 용제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명은 손상된 치주조직에 충전제 제형으로 제공될 수 있으며, 바람직하게는 피브린으로 치근 처치 후 충전하는 방식으로 충전 될 수 있으며, 상기 피프린은 강화된 피브린 (modified fibrin, mFibrin)일 수 있다. 치근 처치는 치근 활택술 (root planning) 후 치주인대세포의 이주, 백악모세포의 분화를 도모하기 위함이다. mFibrin은 aminocaproic acid/ chitosan 나노입자로 강화된 피브린 젤을 지칭한다 (특허 출원: #10-2011-0047413).

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예1 > HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트 시편의 제작

HDAC 저해제는 Sodium butyrate (Sigma)를 사용하고, 알파칼슘설페이트 (αCS, Silky-Rock yellow model stone; Whip-Mix) 시편을 테프론 주형을 이용하여 제작하고 EO gas로 멸균 후 세포배양실험에 사용하였다.

< 실시예2 > HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트의 동물 실험 효능 평가

2-1: 치주조직 파괴병소 적합 동물모델 준비

비글견(웅성, 13kg 내외) 하악 좌우측 P3, P4 부위에 3급 치근분지부 골결손 (Furcation Class III defect)를 주었다 (임계손상). 즉, 분지부 시작부에서 Apical 방향으로 5mm의 수평적 골 결손부 형성하였다. 골의 삭제후 치근면 백악질 제거를 위해 치주 큐렛 (periodontal curette) 으로 치근활택술을 실시하였다. 작은 surgical round bur를 사용하여 원래의 crestal bone 위치와 apcial 골삭제 부의 치근 내면에만 CEJ 에 평행으로 형성하여 Notch를 형성하였다. mFibrin 또는 Collagen을 치근 활택술이 시행된 치근표면에 도포하고 HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트를 충전 (실험군)하고 8주 후 희생시켰다. 대조군은 mFibrin 또는 Collagen으로 충전하였다.

2-2: HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트 이식 결과 - ① microCT re - cosntructed 3D images

mFibrin처치군, collagen 처치군, collagen 치근처치후 HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트를 충전한 실험군 (collagen/αCS) 및 mFibrin 치근처치후 저해제 함유 알파칼슘설페이트를 충전한 실험군 (mFibrin/αCS)를 이용하여 충전한 뒤 8주 지나서 비글견을 희생하고 고정한 후 microCT 촬영하였으며, 이를 이용하여 3D 이미지를 재건하였다 (도2). 아래 그림은 실험한 비글견 한 마리에서 얻은 결과를 제시한 것으로 실험한 3마리 모두 유사한 양상을 보였다. 즉, HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트 군에서 치주 조직 및 뼈조직의 재생에 있어서 현저히 좋은 결과를 나타내었으며, 특히 mFibrin/aCS군에서 가장 좋은 재생 효과 나타내었으며, 특히 치근 분지부 대부분이 새로운 뼈조직으로 채워져 있었다 (도1).

또한, microCT 실험성적으로 치근분지부에 새로이 형성된 뼈조직의 부피를 측정한 결과 mFibrin/aCS군에서 다른 군들보다 2배정도 뼈조직이 형성되어 있음을 확인하였다.

2-3: HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트 이식 결과 - ② Probing depth

외과적으로 치주조직 손상을 준 시점 (A)과 각 재생재료를 충전하고 8주 후 (B)에 probing depth를 측정하고 그 차이인 -Δ(probing depth)를 살펴보았다 (도2).

HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트를 이식하였을 때, mFibrin (modified fibrin with ACA/chitosan bead) 치근처치군과 Collagen 치근처치군 모두에서 유의한 probing depth의 감소를 가져왔으며, 그 정도는 mFibrin 치근처치군에서 더 컸다.

2-4: HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트 이식 결과 - ③ 조직학적 관찰

microCT 촬영 후 치아 시편을 탈회하고 파라핀 포매 (paraffin embedding)하여 조직 절편을 얻고 이를 H&E 염색하여 조직 소견을 관찰하였다 (도3).

도3에서 화살표시는 외과적으로 치주조직을 손상시킨 협측의 치조골 및 백악질에서의 조직 재생 높이를 나타내며, 화살머리표시는 손상시키지 않은 설측 치조골 및 백악질의 높이를 나타낸다. 실험군에서 치근 상아질 표면에 백악질이 새로이 형성되어 있었으며, 그 정도는 αCS 처리군들이 αCS 없이 mFibrin이나 collagen으로 처리된 군들보다 재생 높이가 현저하게 높았다. 또한, mFibrin 처치한 군 (mFibrin/αCS) 이 collagen을 처치한 군 (collagen/αCS) 보다 백악질 형성 정도가 다소 높음을 확인 할 수 있었다. 치조골의 재생 경향도 백악질 재생 양상과 유사하였다.

< 실시예3 > HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트에 대한 치주조직 구성 세포 반응 평가

3-1: 치주조직 구성 세포 증식 및 분화 평가 - ① 치주인대 섬유모세포의 조골세포 분화

일차배양한 사람 치주인대 섬유모세포에서 HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트에 대한 세포 분화 반응을 real-time PCR을 수행하여 관찰하였다. 또한, 혈관 신생 형성을 유도할 수 있는 것으로 알려진 proline hydroxylase 저해제 DMOG를 병용 처리 시 반응을 살펴보았다.

알파칼슘설페이트 (aCS)의 효과를 검증하기 위하여 대조군으로 세포배양접시 (tissue culture dish, TCD)를 사용하였으며, HDAC 저해제와 proline hydroxylase 저해제 처리의 대조군으로 아무 약물을 포함하지 않은 군을 대조군으로 하였다 (예, TCD 또는 aCS 군). 일차배양한 사람 치주인대 섬유모세포는 ScienCell (San Diego, CA) 사의 것을 구입하여 사용하였으며, 4~6회 계대 배양 후 식립하여 10% fetal bovine serum, 50 mg/ml ascorbic acid 및 5mM beta-glycerophosphate 가 함유된 alpha MEM으로 7일간 세포 배양하였다

그 결과, 일차배양한 사람 치주인대 섬유모세포에서, 생체 무기질화 관련 분자 (경조직 형성 세포 분화표지자)인 ALP, BSP, OCN는 모두 일반배양접시와 비교하여 HDAC 저해제 함유 알파칼슘설페이트 위에서 발현이 현저히 증가되었음을 알 수 있었다 (도4). 또한 HDAC 저해제는 치주인대 섬유모세포의 경조직 형성 세포로의 분화를 더욱 촉진한 것으로 나타났다.

3-2: 치주조직 구성 세포 증식 및 분화 평가 - ② HDAC 저해제가 백악모세포 OCCM30의 분화에 미치는 영향

백악모세포에서 HDAC 저해제에 대한 세포 분화 반응 (생체 무기질 형성과 관련된 분자들의 발현)을 PCR을 수행하여 관찰하였다 (도 5). 백악모세포주 OCCM30를 Sommerman 박사 (University of Washington)에게 분양받아 사용하였다. 10% fetal bovine serum, 50 mg/ml ascorbic acid 및 5mM beta-glycerophosphate 가 함유된 alpha MEM으로 7일간 세포 배양하였다.

그 결과, RunX2, Osterix, Colα(1)l, BSP, OCN alc GAPDH가 HDAC 저해제인 Butyrate 농도의존적으로 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다.

Claims

HDAC (Histone Deacetylase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 벤즈아마이드 (benzamide), 친전자성 케톤 (electrophilic ketone), 발프로산 (valproic acid) 및 부틸레이트 (butyrate)로 이루어진 그룹에서 1이상 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 칼슘설페이트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 칼슘설페이트 (calcium sulfate)는 알파칼슘설페이트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 칼슘설페이트는 뼈재생의 촉진, 서방형 제제 또는 상처부위의 차단막 역할을 수행하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치주질환은 치은염, 치주염 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 상기 치주질환 예방 및 치료는 치주 조직의 재생, 뼈조직의 재생, 백악모세포의 분화 또는 조골세포로의 분화를 통한 예방 및 치료인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1 내지 7항에 있어서, 상기 조성물은 충전제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 충전제 조성물은 피브린으로 치근 처치 후 충전하는 것을 특징으로 하는 조성물.