ITMI20112437A1 - Uso di citochine, fattori di crescita e fattori antibatterici come materiale di sottofondo di cavita' per la terapia della carie penetrante dei denti e dell'infiammazione pulpare - Google Patents
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Description
“USO DI CITOCHINE, FATTORI DI CRESCITA E FATTORI ANTIBATTERICI COME MATERIALE DI SOTTOFONDO DI CAVITÀ PER LA TERAPIA DELLA CARIE PENETRANTE DEI DENTI E DELL’INFIAMMAZIONE PULPAREâ€
La presente invenzione ha per oggetto composizioni contenenti citochine, fattori di crescita e fattori antibatterici per la terapia della carie penetrante dei denti e dell’infiammazione pulpare.
Stato della tecnica
Le opinioni circa il metodo di scelta per il trattamento delle carie penetranti nei denti decidui sono molteplici e discordi [1]. Sulla scorta degli ormai storici studi istologici di Reeves e Stanley [2], à ̈ stato per molto tempo accettato dogmaticamente che tutta la dentina infetta debba essere rimossa completamente per arrestare l’evoluzione del processo carioso. Più recentemente, tuttavia, uno studio con un follow-up decennale [3] ha descritto l’arresto della progressione della carie in tessuto dentinale, mediante l’applicazione di otturazioni composite sigillanti. Ciò suggerisce che la completa toelettatura della carie non sia un prerequisito indispensabile per il suo arresto [4,5], fatto confortato pure da un trial randomizzato clinico [6].
Si aggiunga che l’incappucciamento indiretto, ossia l’applicazione di un materiale protettivo in prossimità della polpa dentale al fine di mitigarne la flogosi in presenza di carie penetranti, à ̈ tecnica sostenuta da vari Autori, come rivisto da Fuks [7]. L’infiammazione pulpare ha luogo non appena la carie interessa la dentina il cui spessore, dopo la rimozione della carie, à ̈ fondamentale per la determinazione delle condizioni pulpari [8,9]. Un reperto costante, infatti, à ̈ costituito dall’associazione delle carie penetranti a macrofagi, linfociti e plasmacellule [10], cui può -non necessariamentecorrispondere sintomatologia algica. Nonostante la consuetudine clinica che interpreta l’infiammazione come negativa e probabilmente foriera di necrosi pulpare, si sta incominciando a comprenderne meglio anche il potenziale nel processo di rigenerazione della polpa [11].
Nell’incappucciamento indiretto (ove permane uno strato di dentina cariosa a ridosso della polpa) ed in quello diretto (ove la polpa à ̈ esposta) à ̈ prevista l’applicazione di un materiale biocompatibile [12], come sottofondo di cavità . Con l’eccezione dei casi in cui i sintomi depongano per una pulpite palesemente irreversibile, sia che si giunga a scoprire la polpa durante le operazioni di rimozione della carie (eventualità in cui si deve praticare una pulpectomia parziale con incappucciamento diretto), sia che si possa procedere ad un incappucciamento indiretto, l’esigenza di materiali da sottofondo di cavità innovativi à ̈ grande.
In base alle ricerche che stanno alla base della presente invenzione, si ritiene che i fattori di crescita necessari per una rapida formazione di nuovo tessuto pulpare comprendano fra gli altri Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP2), basic FGF, PDGF, VEGF, GM-CSF, LIF, SDF-1°, TGFβ, IGFI, EGF, MGF, Eotaxina, MCP-1.
Descrizione dell’invenzione
Secondo la corrente letteratura scientifica, l’azione terapeutica delle cellule staminali può essere riconducibile a due meccanismi: differenziazione delle cellule staminali in cellule residenti e rilascio di fattori trofici rigenerativi da parte delle cellule staminali. I rispettivi contributi di questi due meccanismi rimangono da chiarire, anche se à ̈ stato ipotizzato che non siano le cellule staminali a trasformarsi in cellule mature del tessuto leso, ma che esse trasmettano dei fattori vitali a questo tessuto, che può così tornare a proliferare e a differenziarsi, rigenerandosi (Fig. 1 A.I. Caplan and J.E. Denni. Mesenchymal Stem Cells as Trophic Mediators. J. Cell Bioch 98:1076-1084; 2006).
La terapia con cellule staminali presenta molti problemi legati non solo ai costi e a complicazioni tecniche ed applicative, ma anche a scrupoli etici e religiosi. La terapia con cellule staminali à ̈ attuabile solo per via iniettiva o, in alcuni casi, topica, e non per via orale. Il sovranatante delle cellule staminali in coltura contiene fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici ecc. che si ritiene siano responsabili dell’effetto benefico della terapia staminale sulla crescita e/o riparazione dei tessuti.
L’eventuale utilizzo dei fattori vitali isolabili dal sovranatante delle cellule staminali presenta, tuttavia, non solo gli stessi problemi etici dell’uso delle cellule staminali stesse ma anche costi molto elevati.
Si à ̈ sorprendentemente scoperto che nei liquidi biologici e in alcuni tessuti dei mammiferi sono presenti gli stessi fattori attivi rilasciati dalle cellule staminali e pertanto presenti nel sovranatante delle colture delle cellule staminali stesse. Le migliori sorgenti di questi fattori sono il siero, la placenta e il colostro dei mammiferi.
La Tabella riporta il confronto qualiquantitativo fra i fattori presenti nel sovranatante delle colture di cellule staminali e i fattori isolati da queste nuove sorgenti da noi denominati POOL OF MATERNAL FACTORS (P.M.F.),
Tabella
P.M.F.
NAME (pg/ml) stem cells (pg/ml) IL-1 ra IL-1 receptor antagonist 29.05 0.0
IL-1b Interleukin-1b 0.09 0.0
IL-2 Interleukin-2 32.05 0.0
IL-4 Interleukin-4 0.17 21.12
IL-6 Interleukin-6 1.26 293.01
IL-8 Interleukin-8 0.71 359.56
IL-9 Interleukin-9 3.66 0.78
IL- 10 Interleukin-10 2.83 0.99
IL-12 Interleuk -12 1.73 0.0
IL- 15 Interleukin-1 5 4.33 0.5
IL- 17 Interleukin -17 21.95 0.32 Eotaxin Eotaxin 5.01 0.0
INF-γ Gamma - 5.97 11.14 MCP-1 Monocyte chemotactic factor- 1 4.12 11.23 PDGF Platelet derived growth factor 11.55 3.08 TNF Tumor necrosis factor 40.00 12.30
Vascular endothelial growth 41.00 208.04 VEGF factor
HGF Hepatocyte growth factor 52.3 100.74 FGF Fibroblast growth factor 180.15 18.21 TGF- 64.00 51.32 beta1 transformig growth factor
IGF-1 insulin-like growth factor 1.60 0.0
GM- monocyte - colony 183.85 0.0
CSF stimulating factor
LIF leukemia inhibitory factor 15.20 27.32 SCF stem cell factor 10.55 4.54
SDF-1 stramal derived factor- 1 41.75 28.8 NGF Nerve growth factor 8.33 0.0 BMP-2 Bone morphogenic protein 25.01 2.65
RNA 189 ngdnl 48 pg'ml
Presenza di fattori di crescita/citochine in P.M.F. (1 mg /ml) e nel di Cellule Staminali Mesenchimali (1 milione di cellule).
È evidente (tabella) la maggior concentrazione di quasi tutti i fattori presenti nel P.M.F. rispetto a quella presente nel sovranatante delle cellule staminali.
È inoltre evidente la possibilità di utilizzare concentrazioni terapeutiche anche molto alte di P.M.F., ad esempio dosi da 0,5/1 g per via topica o iniettiva e dosi fino a 20/30 g per via orale, rispetto alle massime concentrazioni terapeutiche utilizzate di cellule staminali che corrispondono a 1/2 milioni/Kg e pertanto a un massimo di 140 milioni per terapia e, dunque, a valori di fattori sempre dell’ordine dei picogrammi.
L’oggetto dell’invenzione à ̈ quindi una composizione (P.M.F.) contenente in altissima concentrazione tutti i fattori attivi presenti nel sovranatante delle cellule staminali ma isolati, con semplici metodiche estrattive, da fonti naturali molto economiche, di facile reperibilità e senza problemi etici.
Inoltre P.M.F., isolato dai liquidi biologici e dai tessuti di mammiferi, contiene anche fattori antibatterici (transferrina, lisozima, lactoperossidasi, lactoferrina) e anticorpi delle classi IgG e IgA. (P.M.F. Ab).
L’assenza di anticorpi e di antibatterici del sovranatante delle cellule staminali à ̈ un’ulteriore ragione per l’utilizzo di P.M.F. Ab in molti usi terapeutici, topici e per via orale.
Il siero presenta il massimo picco dei fattori negli ultimi giorni prima del parto, il colostro nelle prime ore dopo il parto e non oltre la 6° ora.
Già dopo 12 ore dal parto i fattori diminuiscono notevolmente, a 24 h molti di loro non sono più dosabili.
Questi fattori sono geneticamente molto conservati nelle varie specie e pertanto à ̈ possibile usare sull’uomo fattori isolati da altre specie di mammiferi come i bovini, gli equini, i cammelli, i mammiferi marini ecc. I fattori sono controllati con metodiche ELISA specifiche per la specie, anche se la cross reazione interspecie à ̈ altissima in quanto i fattori sono filogeneticamente molto conservati e, pertanto, solo qualitativamente sono misurabili anche con ELISA utilizzati per specie diverse (es: uomo-bovino e viceversa).
Si à ̈ visto che il siero di mammiferi negli ultimi giorni (5-15) prima del parto à ̈ molto ricco dei fattori attivi oggetto dell’invenzione rispetto a mammiferi non gravidi o ai primi mesi di gravidanza.
Una prima fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il siero di mammiferi che, negli ultimi giorni (5-15) prima del parto, à ̈ molto ricco dei fattori attivi oggetto dell’invenzione rispetto a mammiferi non gravidi o ai primi mesi di gravidanza. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione da siero.
Si preleva 1 litro di sangue in 4 giorni per 4 prelievi complessivi per non danneggiare l’animale, preferibilmente bovino o equino.
Il sangue viene sierato a temperatura ambiente per 24 h e quindi centrifugato per spremere il coagulo. Si recupera il siero (circa il 30/40% del volume totale) a cui si aggiungono, come agenti antisettici, fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%. Il siero così trattato viene quindi frazionato con i seguenti passaggi.
Ultrafiltrazione 300'000 Da
Il campione di siero (congelato a -20°C) ottenuto per coagulazione e centrifugazione da sangue di mammifero viene scongelato a temperatura ambiente e diluito con 2 volumi di acqua demineralizzata. La soluzione ottenuta viene ultrafiltrata su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300'000 Da ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C.
Il retentato e una frazione corrispondente a circa 1:10 del permeato vengono trasferiti in un tubi da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzati contro acqua demineralizzata.
Ultrafiltrazione 5'000 Da
Il restante permeato viene ultrafiltrato su membrana da 5000 Da. Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300'000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5000 ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C.
Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (con questa dialisi si eliminano anche i conservanti). Il composto à ̈ quindi immediatamente liofilizzato.
Una seconda fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ la placenta. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione.
Vengono utilizzate preferibilmente placente bovine o equine.
Omogeneizzazione
La placenta (congelata a -20°C) viene scongelata a temperatura ambiente, tagliata in piccoli pezzi, lavata con abbondante soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) fredda (4°C) e omogeneizzata tramite cutter Siramm in un buffer di lisi così composto: Tris/HCl 50 mM, EDTA 25mM, triton X-100 0,001% a pH 7,4. Alla sospensione ottenuta viene aggiunto NaCl fino ad una concentrazione dello 0,9%, e i conservanti (fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all1%). La sospensione viene posta sotto agitazione (agitatore magnetico) per 2 ore e mantenuta statica over night in camera fredda a 4°C.
Centrifugazione
La sospensione viene centrifugata a 13’000 rpm con centrifuga Sorvall RC6 e rotore SLA 15000 per 45 minuti a 4°C. Il surnatante della centrifugazione viene recuperato, prefiltrato sotto vuoto su Dicalite e su filtri in cellulosa rigenerata da 0,45 µm e 0,22 µm.
Ultrafiltrazione 300'000 Da
Il prodotto filtrato viene ultrafiltrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300'000 Da ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C.
Ultrafiltrazione 5'000 Da
Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5000 ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C. Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (si eliminano pertanto anche i conservanti) e quindi immediatamente liofilizzato.
Una ulteriore fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il colostro. Si usa preferibilmente colostro bovino per la facilità di approvvigionamento e le quantità disponibili. È particolarmente preferito il colostro da mucche di razza Holstein (Frisona) e Guernsey. È stato provato che tali mucche producono colostro con la maggior concentrazione di fattori attivi. Le mucche sono preferibilmente al secondo o terzo parto. Il colostro à ̈ preferibilmente raccolto fra la 1° e la 6° ora dal parto in quanto, in questo periodo, si assiste alla maggior concentrazione di attivi. Nel colostro a partire dalla sesta ora dal parto i fattori attivi diminuiscono rapidamente (dopo 24 ore ne sono presenti solo il 15%). Il colostro raccolto à ̈ sottoposto a test per tubercolosi, citotossicità su culture cellulari, controllo di micoplasmi, prioni e di virus umani e bovini.
Il colostro nella cisterna mammaria à ̈ praticamente sterile, ma una volta munto, nonostante ogni precauzione, per l’alta concentrazione di fattori di crescita, la sua carica batterica sale molto rapidamente durante la gelatura e la sgelatura, processi piuttosto lenti data l’alta densità del colostro nelle prime ore.
L’utilizzo di raggi γ permette di ottenere un colostro sterile solo se si utilizzano radiazioni superiori a 10 Kgy che tuttavia distruggono gran parte dei fattori attivi, e d’altronde questo metodo non impedisce la formazione di pirogeni il cui utilizzo à ̈ sconsigliabile per via topica e proibito per via parenterale.
È stata pertanto messa a punto una filiera di raccolta innovativa, per ottenere un composto anallergico sterile, senza conservanti e senza pirogeni.
Al colostro raccolto in taniche sterili (sterilizzate a vuoto a 25 Kgy) si aggiungono agenti antisettici in quantità tali da garantire la sterilità e l’assenza di pirogeni. Si impiegano preferibilmente fenossietanolo alla concentrazione del 2,5% e diazolidinil-urea a una concentrazione dell’1%.
Il colostro così trattato può, per brevi periodi (max 30 gg) non essere conservato congelato prima dei processi di estrazione dei fattori attivi, con evidente risparmio dei costi industriali.
I fattori attivi possono essere estratti con i seguenti passaggi:
Centrifugazione
Il colostro bovino viene diluito 1:10 con acqua demineralizzata, si aggiunge NaCl fino ad ottenere una concentrazione dello 0,9%.
La sospensione viene centrifugata in continuo a 8'000 rpm a temperatura di 20-25°C con una centrifuga Alfa Laval scartando il pellet corrispondente alla parte lipidica.
Ultrafiltrazione ceramica da 300'000 Da
Il prodotto ottenuto dalla centrifugazione viene ultrafiltrato su membrana ceramica con cut-off 300'000 Da ad una temperatura di 20-25°C recuperando il permeato.
Ultrafiltrazione su 5000 Da
Il permeato dell’ultrafiltrazione 300'000 Da viene concentrato su membrana a spirale avvolta da 5'000 Da in polyethersulfone ad una temperatura di 20-25°C e dializzato contro acqua demineralizzata fino ad una conducibilità del retentato di circa 600 µs/cm<2>(con questa dialisi si eliminano anche i conservanti).
Liofilizzazione
Il retentato dell’ultrafiltrazione da 5'000 Da viene filtrato sotto vuoto su filtri Millipore in cellulosa rigenerata da 0,2 µm, congelato a -20°C e liofilizzato.
Il composto, da qualunque sorgente isolato, Ã ̈ stato chiamato P.M.F. Ab.
Purificazione di P.M.F. Ab dagli anticorpi
Una soluzione di ammonio solfato satura viene aggiunta ad una soluzione di P.M.F. Ab isolati sia da siero, placenta o colostro sotto agitazione e ad un rapporto finale 1:1 (v/v). La miscela à ̈ mantenuta per due ore a temperatura ambiente o a 4°C per 12 ore, in ambiente sterile e successivamente centrifugata a 18.000 rpm. Il surnatante à ̈ quindi sottoposto a dialisi a 4°C contro acqua, utilizzando membrane con cut-off di 100 kDA. La frazione esterna alle membrane di dialisi, priva della componente immunoglobulinica, viene quindi liofilizzata e conservata a -20°C. La deplezione della componente immunoglobulinica viene verificata mediante analisi SDS-PAGE in condizioni riducenti e non utilizzando blue coomassie come colorante.
In alternativa o di seguito al precedente, la purificazione prevede l’utilizzo di colonne di affinità funzionalizzate con proteina G. La soluzione dei fattori attivi o la frazione preventivamente precipitata con ammonio solfato viene fatta eluire mediante pompa peristaltica ad un flusso di 1 ml/min attraverso una colonna funzionalizzata con proteina G in ambiente sterile. Dopo 20 minuti di perfusione, la soluzione à ̈ dializzata per ultrafiltrazione ad alta pressione per eliminare totalmente i conservanti e quindi liofilizzata. Si ottiene una polvere sterile, priva di pirogeni, priva di immunoglobuline animali, libera da conservanti, anallergica (caseina e lattoalbumina sono i responsabili di oltre il 95% delle allergie verso queste componenti animali) di altissima solubilità e con la massima concentrazione possibile di fattori attivi.
Qualunque sia la sorgente utilizzata si riscontra la presenza degli stessi fattori attivi misurati con l’ELISA.
Questa frazione, di seguito identificata con la denominazione POOL OF MATERNAL FACTORS (P.M.F.) contiene i seguenti fattori osteogenici:
Platelet-derived growth factor (PDGF)-BB: regola il reclutamento e la proliferazione dei progenitori pulpari ed il differenziamento degli stessi.
Fibroblast growth factor (FGF): regola il reclutamento e la proliferazione dei progenitori pulpari e la maturazione degli stessi.
Transforming growth factor (TGF-beta): stimola i progenitori a maturare e produrre matrice pulpare.
Leukemia inhibitory factor (LIF): agisce su progenitori già differenziati favorendo il rimodellamento pulpare.
Stromal derived factor-1 (SDF-1): recluta i progenitori ed insieme alla BMP-2 favorisce il differenziamento delle staminali mesenchimali.
Bone morphogenic protein-2 (BMP-2): proteina fondamentale nel processo di ossificazione, in particolare nel differenziamento di precursori osteogenici.
Vascular endothelial growth factor (VEGF): favorisce la vascolarizzazione della polpa.
Granulocyte colony stimulating factor (GM-CSF): stimola e favorisce la liberazione di progenitori immuni dal midollo osseo.
Insulin-like growth factor (IGF-1): Regola crescita e sviluppo cellulare.
Epidemal growth factor (EGF): agisce sullo sviluppo della mucosa, dell’epidermide e delle ghiandole mammarie.
Nerve growth factor (NGF): stimola l’attività e la regolazione della crescita e differenziazione dei neuroni simpatici di alcuni di tipo sensoriale. Eotaxina: si lega ai recettori delle chemochine per richiamare gli eosinofili nei tessuti infiammati.
Monocyte chemotactic factor-1 (MCP-1): favorisce l’aggregazione dei monociti ai tessuti infiammati.
RNA: modula le cellule bersaglio inducendo una riprogrammazione a livello genetico.
Transferrina: rilascia ferro ai globuli rossi e impedisce la chelazione del ferro da parte di batteri e virus.
Lactoferrina: toglie ai batteri e ai virus il ferro di cui necessitano per crescere.
Lisozima: ha effetti antibatterici, dovuti non solo alle sue proprietà enzimatiche, ma anche alle proprietà cationiche ed idrofobiche.
Lattoperossidasi: à ̈ il più potente enzima contenuto nel colostro. Inibisce il metabolismo batterico ossidando i gruppi sulfidrilici di proteine essenziali.
P.M.F. risulta indicato, per la sua origine naturale, l’azione antimicrobica, le proprietà trofiche antiapoptotiche ed immunomodulative, come elemento bioattivo dei sottofondi di cavità , nel trattamento di incappucciamento dei denti decidui.
La frazione così ottenuta può essere utilizzata per la preparazione di composizioni adatte per la terapia locale delle patologie pulpari, traumatiche e degenerative.
Tali composizioni potranno essere in forma di scaffolds, supporti, cementi, impianti riassorbibili e non.
La quantità di frazione dell’invenzione da somministrare o usata per impregnare gli scaffolds e i supporti può variare da 0,1 a 1 g.
L’invenzione à ̈ descritta in maggior dettaglio nella seguente parte sperimentale, data a titolo di esempio.
PROVE IN VITRO E IN VIVO
Prove in vitro
Il possibile effetto di P.M.F. sul mantenimento della vitalità pulpare à ̈ stato valutato in vitro mediante saggi di proliferazione e dosaggio di citochine anti-apoptotiche dopo stimolazione quali HGF (Hepatocyte Growth Factor) in cellule staminali primarie della polpa del dente deciduo. In vivo, l’attività P.M.F. à ̈ stata valutata in un modello di lesione pulpare in ratto.
Proliferazione
Gli effetti di P.M.F. sulla proliferazione cellulare sono stati valutati utilizzando MSC di origine dentale (Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth-SHED). Le SHED sono state isolate dalla polpa di denti decidui in fase di esfoliazione precoce, secondo protocolli di letteratura [13] e mantenute in RPMI supplementato con sodio piruvato, 10%, FCS, 100 U/ml penicillina, 100 mg/ml streptomicina e 250 ng/ml amfotericina B.
Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti e sottoposte a MTT test nei giorni 1, 3, 5 e 7 e sono state mantenute in atmosfera umidificata 5% CO2 in aria a 37°C. P.M.F. mostra un potente effetto proliferativo dose dipendente su tutte le linee studiate, massimale alla concentrazione di 5 mg/ml (Fig. 2).
Induzione di HGF
L’induzione di citochine anti-apoptotiche quali HGF à ̈ stata studiata in cellule mantenute in coltura in differenti condizioni (controllo: RPMI 10%FBS; terreno osteogenico paragonabile agli effetti del normale materiale di sottofondo di cavità : RPMI 10%FBS OM; terreno con supplementazione di P.M.F.: RPMI 2% FBS K) per 1, 3 e 7 giorni. Previa starvazione in terreno privo di siero per 18 ore, il mezzo di coltura à ̈ stato raccolto e analizzato mediante BIOPLEX Assay (BIORAD Corp, CA, USA) dimostrando un’induzione di HGF endogeno a 7 giorni molto più alta (statisticamente significativa per t-test, p<0.05) solo quando à ̈ impiegato P.M.F. (Fig. 3).
Lesione pulpare in ratto
Ratti Sprague-Dawley di 3 mesi sono stati impiegati per il modello di danno alla corona dentale e successiva otturazione secondo il protocollo di Garber et al. [14]. Brevemente, sotto anestesia con ketamina-xylezina, al giorno 0 sono stati praticati dei fori sulla superficie mesiale dei molari destri degli 8 ratti considerati ed applicate otturazioni con il materiale di sottofondo cavitario attualmente ritenuto gold standard (Idrossido di calcio) e P.M.F.
Due denti sono stati lasciati aperti come controllo positivo di infiammazione pulpare. I ratti sono stati mantenuti in condizioni di analgesia mediante buprenorfina cloridrato (farmaco oppioide che non interferisce con i processi infiammatori) ed infine soppressi dopo 14 giorni. I denti prelevati e demineralizzati sono stati inclusi in paraffina e colorati mediante ematossilina eosina. Mentre i controlli positivi mostrano un netto infiltrato infiammatorio (Fig. 4A) e l’idrossido di calcio induce un quadro di pulpite reversibile con iperemia edema (Fig. 4B), P.M.F. mantiene i caratteri di una polpa normale (Fig. 4C).
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Claims (6)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizioni contenenti citochine, fattori di crescita e fattori antibatterici isolati da siero, placenta e colostro, per l’uso come materiale sottofondo di cavità per la terapia della carie penetrante dei denti e dell’infiammazione pulpare.
- 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1 in cui i fattori di crescita, i fattori antibatterici e le citochine sono Platelet-derived growth factor (PDGF)-BB; Fibroblast growth factor (FGF; Transforming growth factor (TGF-beta); Leukemia inhibitory factor (LIF); Stromal derived factor-1 (SDF-1); Bone morphogenic protein-2 (BMP-2); Vascular endothelial growth factor (VEGF); Granulocyte colony stimulating factor (GM-CSF); Insulin-like growth factor (IGF-1); Eotaxina; Epidermal growth factor (EGF); Nerve growth factor (NGF); Monocyte chemotactic factor-1 (MCP-1); Transferrina; Lactoferrina; Lisozima; Lattoperossidasi.
- 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da siero di mammiferi.
- 4. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da placenta.
- 5. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da colostro.
- 6. Composizioni secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4 in forma scaffolds, supporti, cementi, impianti riassorbibili e non.
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