JP2010215661A - 歯周病と歯髄疾患の治療剤と治療方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】神経栄養因子を有効成分とする、歯周病や歯髄疾患の治療剤と治療方法、歯周組織再生用移植材、歯周組織の再生方法。神経栄養因子は、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン3、またはニューロトロフィン4/5である。
【選択図】図9B
Description
本発明の治療剤が、歯周組織を再生させることが好ましい。
本発明の治療剤が、歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することが好ましい。
本発明の治療剤において、神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン3、またはニューロトロフィン4/5であることが好ましい。
本発明の移植材が、歯周組織を再生させることが好ましい。
本発明の移植材が、歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することが好ましい。
本発明の移植材において、神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン3、またはニューロトロフィン4/5であることが好ましい。
本発明の再生方法が、歯周組織を再生させることが好ましい。
本発明の再生方法が、歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することが好ましい。
本発明の別の側面によれば、歯周病の治療方法であって、そうした状態に罹患しているまたは罹患しやすい対象に治療有効量の神経栄養因子を投与することを含む、歯周病の治療法が提供される。
本発明の治療法が、セメント質、歯周靭帯、歯槽骨または歯髄を再生させることが好ましい。
本発明の治療法が、歯髄腔における修復象牙質の産生を促進することが好ましい。また、歯髄腔内壁への修復象牙質の添加を促進することが好ましい。
本発明のさらに別の側面によれば、歯周病の治療に使用する薬剤を製造するための神経栄養因子の使用が提供される。
本明細書において「歯周組織」とは、歯肉、歯槽骨、歯周靱帯(歯根膜)、セメント質で構成される組織を意味する。
「歯周靭帯」とは、歯槽骨とセメント質の間に介在している結合組織のことであり、歯根膜とも呼ばれる。
「セメント質」は、歯根の最表層の硬組織であり、セメント細胞を有する有細胞性セメント質とセメント細胞を有さない無細胞性セメント質とに区分される。
「再生(regeneration)」とは、喪失組織、破壊された組織や損傷組織の再構成(reconstruction)および再構築(reproduction)のことであり、「歯周組織の再生」とは、歯周組織を元の状態に回復させ機能させることである。
「歯周組織再生用移植材」とは、歯周組織の再生を促す材料のことである。BDNF等の神経栄養因子を所定の生体部位(歯槽骨の欠損部位など)に一定の濃度で作用させるためには、何らかの足場(scaffold)が必要である。こうした足場となる材料とBDNF等の神経栄養因子を組合わせたものが本願の移植材である。
「修復象牙質」とは、外来刺激を受けた結果形成された象牙質を意味する。
「歯髄疾患」とは、歯髄の炎症性疾患、退行変性などを意味する。
本発明に使用する神経栄養因子、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5等は、遺伝子組換えや化学合成などで人工的に製造したものでも天然型(native)でもよい。
(1)使用細胞
(i) ヒト歯周靱帯由来線維芽細胞(HPL 細胞)
矯正治療のために便宜的に抜歯された健全なヒト小臼歯の歯周靭帯から、HPL 細胞を分離した。歯周靭帯周囲の他の結合組織からの細胞の混入を防ぐため、抜去ヒト小臼歯の歯頚部、根尖部を除く歯根中央部の健康な歯周靭帯を、メスを用いて剥離し、細切した。細切した組織を、直径60mmの細胞培養用シャーレ(CORNING、NY)に貼り付け、37℃、5%CO2気相条件で培養した。培地は、10%FBS(GIBCO、Buffalo、NY)、ペニシリン(100ユニット/ml)(明治製菓、東京)、ストレプトマイシン(100μg/ml)(明治製菓)、およびアンホテリシンB(1μg/ml)(GIBCO)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、日水製薬、東京)を使用した(ここで使用した培地を「培地A」と記す)。4〜8代継代したHPL 細胞を以下の実験に供した。
ヒト培養細胞を用いた実験の必要性および歯肉の使用目的などを患者に十分説明し、患者の同意を得た後に、歯肉の提供を受けた。智歯周囲炎の患者から、原因となった智歯を抜歯する際に、余剰の歯肉弁から歯肉片を獲得した。得られた歯肉片を、4℃で一昼夜、0.01%エチレンジアミン4酢酸(EDTA)と0.025%トリプシンを含むダルベッコPBS(−)(PBS(−),日水製薬)で処理して、HGKを分離した。ウシインシュリン(10μg/ml)(Sigma、St. Rouis, MO, USA)、ヒトトランスフェリン(5μg/ml)(Sigma)、2-メルカプトエタノール(10μM)、2-アミノエタノール(10μM)、亜セレン酸ナトリウム(10μM)、牛下垂体抽出液(50μg/ml)、ペニシリン(100ユニット/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)およびアンホテリシンB(50ng/ml)を含むMCDB153培地(Sigma)で初代培養を行った(ここで使用した培地を「培地C」と記す)。培養は、ウシI型コラーゲンがコートされた直径60mmのシャーレ(SUMILON セルタイトC-1、住友ベークライト、東京)を用いて、37℃、5%CO2気相条件で行った。3〜4代継代したHGKを以下の実験に供した。
HPL細胞およびヒト歯周靭帯におけるBDNFとTrkBのmRNA発現を、1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR(Roche、Indianapolis)を使用して、逆転写PCR法で調べた。
精製した総RNAのうち1μgの各RNAを、オリゴdTプライマ−を用いて逆転写し、得られたcDNAをPCR反応30サイクルにて増幅させた後、1.5%アガロースゲルに泳動した。コントロールとしてはグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)を使用した。
(i) HPL 細胞
上記(1)(i)で得られたHPL 細胞を、ウシI型コラーゲンがコートされた直径60mmのシャーレ(SUMILON セルタイトC-1)に、1シャーレあたり3.5×105個で、50μg/mlのL-アスコルビン酸を含む培地Aを用いて、37℃、5%CO2気相条件で13日間培養した(ここで使用した培地を「培地B」と記す)。培地は2日に1回交換した。14日目の培養終了前0、3、6、12または24時間において、細胞をDMEMで2回洗浄し、最終濃度0、1、10、50または100ng/mlのBDNF(Recombinant Human BDNF、R & D system、Minneapolis、 USA)を含む無血清培地(ペニシリン(100ユニット/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、アンホテリシンB(1μg/ml)(GIBCO)、およびL-アスコルビン酸(50μg/ml)を添加したDMEM)(ここで使用した培地を「培地D」と記す)に交換した。
上記(1)(ii)で得られたHGKを、ウシI型コラーゲンがコートされた96穴プレート(SUMILON セルタイトC-1プレート96F、住友ベークライト)に、2×103個/ウェルで接種し、37℃、5%CO2気相条件で、培地Cを用いて培養した。培地は2日に1回交換した。細胞増殖期にあたる培養4〜5日目に、プレートの細胞をMCDB153培地で2回洗浄し、最終濃度0、1、10、25、50または100ng/mlのBDNFを含む培地(牛下垂体抽出液を含まないこと以外は培地Cと同一の組成の培地)に交換し、24時間培養した。
(i) mRNAの発現
上記(3)(i)に記載の方法と同様にして、最終濃度0、1、10、50または100ng/mlのBDNFで処理したHPL 細胞から、ISOGENを用いて総RNAを抽出し、精製した。アルカリホスファターゼ(ALPase)、骨形成タンパク-2(bone morphogenetic protein-2、BMP-2)、骨形成タンパク-4(bone morphogenetic protein-4、BMP-4)、オステオポンチン(osteopontin、OPN)、オステオプロテジェリン(osteoprotegerin、OPG)のmRNA発現量は、ABI PRISM7700 (Applied Biosystems、東京)を用いて、PCRプロダクトの生成過程をリアルタイムでモニタリングし、定量的に解析した(Real-time PCR法)。コントロールとしてはGAPDHを使用した。
(ii) タンパク質の発現
上記(1)(i)で得られたHPL 細胞を、ウシI型コラーゲンがコートされた48穴プレート(SUMILON セルタイトC-1プレート 48F、住友ベークライト)に、1×104個/ウェルで播種し、培地Bを用いて13日間培養した。培地は2日に1回交換した。14日目の培養終了24時間前に、プレートの細胞をDMEMで2回洗浄し、最終濃度0、1、10、25、50または100ng/mlのBDNFを含む無血清培地Dに交換した。培養終了後に、上清を回収し、上清中の分泌OPN量、分泌BMP-2量を、ELISA法で測定した。分泌OPN量の測定にはサンドイッチELISAキット(IBL、群馬)を、分泌BMP-2量の測定にはサンドイッチELISAキット(R & D system)を使用した。
HPL細胞とHGKのDNA合成能に及ぼすBDNFの影響を、Cell Proliferation ELISA system, version 2(アマシャムファルマシアバイオテク)を用いて、ELISA法で測定した。
(6)HPL細胞のコラーゲン合成
上記(1)(i)で得られたHPL細胞をウシI型コラーゲンをコートした48穴プレートに播種し、培地Bを用いて13日間培養した。培地は2日に1回交換した。14日目の培養終了前0、3、6、12または24時間、プレートの細胞をDMEMで2回洗浄し、最終濃度0、1、10、25、50または100ng/mlのBDNFを含む無血清培地Dに交換した。
直径8mm×5mmのテルプラグ(商品名)(テルモ)に、濃度5、25、50μg/mlのBDNF溶液(滅菌生理食塩液中)の25μlをしみこませ、移植材とした。
図9Aのコントロール標本においては、セメント質、歯槽骨、歯周靱帯の再生がいくらか観察されたものの、骨欠損底部から歯冠側方向のほぼ1/2に留まっていた。根分岐部直下の欠損部にはセメント質再生、歯槽骨再生は認められず、上皮の進入も認められ、線維芽細胞、コラーゲン線維、血管を主体とした結合組織で埋めつくされていた。
(1)HPL細胞におけるNGFとそのレセプターの発現
上記実施例1(2)と同一の方法でHPL細胞から総RNAを回収し、精製した。得られた総RNAを試料として、NGFとTrkAとのmRNA発現をノーザンブロット法で測定した。コントロールとしてはGAPDHを使用した。
HPL 細胞の骨関連タンパク質のmRNA発現に及ぼすNGFの影響を測定した。
HPL 細胞を、最終濃度0、5、10、25、50または100ng/mlのNGF(Recombinant Human NGF、R & D system、Minneapolis、USA)をBDNFの代わりに使用すること以外は、実施例1(4)(i)と同一の方法で処理した。NGF処理したHPL 細胞のALPase、BMP-2、OPNの各mRNA発現量を、実施例1(4)(i)と同一の方法で測定した。
(3)HPL細胞とHGKの増殖
HPL細胞とHGKのDNA合成能に及ぼすNGFの影響を測定した。
(1)HPL細胞におけるNT-3とそのレセプターの発現
上記実施例1(2)と同一の方法でHPL細胞から総RNAを回収し、精製した。得られた総RNAを試料として、NT-3とTrkCのmRNA発現を、ノーザンブロット法で測定した。コントロールとしてはGAPDHを使用した。
HPL 細胞のALPase活性に及ぼすNT-3の影響を測定した。
HPL 細胞を、最終濃度0、1、10または50ng/mlのNT-3(Recombinant Human NT-3、R & D system、Minneapolis、USA)をBDNFの代わりに使用すること以外は実施例1(3)(i)と同一の方法で処理し、そのALPase活性をBessey-Lowry法に従って定量した。すなわち、NT-3処理したHPL 細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、10mMトリス塩酸緩衝液を加えた後、氷冷下で超音波処理を行い、試料を調製した。p-ニトロフェニルリン酸を基質とするALPase測定キット(和光純業)を使用して、試料中のALPaseの活性を測定した。
実施例1(1)と同一の方法で分離したHPL細胞を、最終濃度0、1、5、10、50または100ng/mlのNT-3をBDNFの代わりに使用すること以外は、実施例1(5)と同一の方法で処理し、そのDNA合成能を、実施例1(5)と同一の方法で測定した。
(1)HPL細胞のNT-4/5での処理
上記実施例1(1)(i)で得られたHPL細胞を、ウシI型コラーゲンがコートされた直径60mmのシャーレ(SUMILON セルタイトC-1)に、1シャーレあたり3.5×105個で、50μg/mlの培地Bを用いて、37℃、5%CO2気相条件で13日間培養した。培地は2日に1回交換した。14日目の培養終了前0、3、6、12または24時間において、細胞をDMEMで2回洗浄し、最終濃度50ng/mlのNT-4/5(R&D)を含む培地Dに交換した。
上記(3)(i)に記載の方法と同様にして、最終濃度50ng/mlのNT-4/5で処理したHPL 細胞から、ISOGENを用いて総RNAを抽出し、精製した。ALPase、BMP-2、OPN、オステオカルシン(OCN)、BMP-7、BMP-4、OPGのmRNA発現量は、ABI PRISM7700 (Applied Biosystems、東京)を用いて、PCRプロダクトの生成過程をリアルタイムでモニタリングし、定量的に解析した(Real-time PCR法)。コントロールとしてはGAPDHを使用した。
(1)使用細胞
便宜的歯髄除去時に得られた健全歯髄を細切した。細切した組織を、直径60mmの細胞培養用シャーレ(コーニング、NY)に貼り付け、37℃、5%CO2気相条件で培地Aにて培養した。4〜8代継代したHP細胞を以下の実験に供した。
NGF、BDNF、NT-3またはNT-4/5を培地Dに最終濃度0、5、10、25、50、100ng/mlで加えて、各種濃度の神経栄養因子含有培地を用意した。上記(2)で得られたHP 細胞を、ウシI型コラーゲンがコートされた直径60mmのシャーレ(SUMILON セルタイトC-1)に、1シャーレあたり3.5×105個で、培地Bを用いて、37℃、5%CO2気相条件で13日間培養した。培地は2日に1回交換した。14日目の培養終了前24時間において、細胞をDMEMで2回洗浄し、いずれかの神経栄養因子含有培地に交換した。
上記(1)で、各濃度のNGF、BDNF、NT-3、またはNT-4/5で24時間処理したHP細胞から、ISOGENを用いて総RNAを抽出し、精製した。ALPase、BMP-2、象牙質シアロタンパク(DSPP)、I型コラーゲン(collagen)、OPN、OCNのmRNA発現量は、ABI PRISM7700 (Applied Biosystems、東京)を用いて、PCRプロダクトの生成過程をリアルタイムでモニタリングし、定量的に解析した(Real-time PCR法)。コントロールとしてはGAPDHを使用した。
HP細胞のDNA合成能に及ぼすNGF、BDNF、NT-3、NT-4/5の影響を、Cell Proliferation ELISA system, version 2(アマシャムファルマシアバイオテク)を用いて、ELISA法で測定した。
(1)使用細胞
HMS細胞の分離は堤ら(S.Tsutsumi:BBRC, 26, 288(2), 2001)の方法に準じて行った。すなわち、十分なインフォームドコンセントを得た患者の智歯抜去時に下顎骨骨髄腔へ穿刺し、骨髄液を得た。得られた骨髄液をヘパリンナトリウム(200 U/ml,シグマ、米国)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、シグマ、米国)と速やかに混合し,遠心分離(150g,5 min)を行った。遠心分離後、上清を除去し、得られた細胞成分を10%のウシ胎児血清(FCS, Biological Industries, イスラエル)、100 units/mlのペニシリン(明治製菓、東京)、100 μg/mlのストレプトマイシン(明治製菓,東京)、1μg/mlのアンホテリシンB(ギブコ、米国)を含むDMEMに懸濁し、骨髄液が200〜500 μl/dish、培地が10 ml/dishとなるように、直径100 mmの細胞培養用シャーレ(コーニング、米国)に播種した。培養は37℃,5%CO2気相条件で行った。以後4日毎に培地交換を行った。増殖した細胞がコンフルエントに達する直前に、0.05% トリプシン(ディフコ、米国)、0.02% EDTA(片山化学、大阪)、100 units/mlのペニシリン,100 μg/mlのストレプトマイシンを含むリン酸緩衝生理食塩液(PBS,日水製薬,東京)を用いて細胞を分散させた。分散させた細胞は20% FCS、10%のジメチルスルホキシド(DMSO,片山化学,大阪)、100 units/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシンを含むDMEMに、細胞密度が1.0 x 106細胞/mlとなるよう懸濁し、セラムチューブ(住友ベークライト,東京)に1 mlずつ分注した後に−20℃で2時間、−80℃で通夜冷却した後に、液体窒素中に保存した。
(i) 細胞のNGF、BDNF、NT-3での処理
上記(1)で得られたHMS細胞を、10%FCSを含むDMEM(100 units/mlのペニシリン(明治製菓、東京)、100 μg/mlのストレプトマイシン(明治製菓,東京)、1μg/mlのアンホテリシンB(ギブコ、米国)を含む)に懸濁し、1.0 x 105 細胞/ウエルの密度で6穴細胞培養プレートに播種した。細胞を1週間培養し、細胞がコンフルエントになる直前の時点で培地をFCSを含まないDMEM(100 units/mlのペニシリン(明治製菓、東京)、100 μg/mlのストレプトマイシン(明治製菓,東京)、1μg/mlのアンホテリシンB(ギブコ、米国)を含む)に交換し、NGF、BDNF、NT-3のいずれかをそれぞれ100 ng/mlの濃度で12時間および24時間作用させた。培養終了後,ISOGEN(商品名)を用いて総RNAの抽出を行った。
ALPase、OCN、OPN、骨シアロタンパク(BSP)、I型コラーゲンに特異的なプライマーを用いてPCRを行った。PCR反応は、94℃で2分間変性を行った後、94℃、15秒間、アニーリング30秒間、72℃、50秒間を30サイクル(BSPのみ35サイクル)繰り返し、その後72℃、7分間の伸長によって行った。得られたPCR産物は0.002%臭化エチジウムを含む2%アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動後のバンドの濃さをNIH imageを用いて測定した。
上記(1)で得られたHMS細胞を、10%FCSを含むDMEM(日水製薬製)(100 units/mlのペニシリン(明治製菓、東京)、100 μg/mlのストレプトマイシン(明治製菓,東京)、1μg/mlのアンホテリシンB(ギブコ、米国)を含む)に懸濁し、96穴細胞培養プレート(コーニング、米国)上に5.0 x 103細胞/ウエルの密度で播種した。試験群については、培養開始24時間後から50 μg/mlのアスコルビン酸(シグマ、米国)、100 ng/mlのNGF(フナコシ,東京)、100 ng/mlのBDNF(フナコシ,東京)、あるいは100 ng/mlのNT-3(フナコシ、東京)をそれぞれ単独で培地に添加し、さらに7日間培養した。培地交換は4日目に行った。対照群は10%FCSを含むDMEM(日水製薬製です)(100 units/mlのペニシリン(明治製菓、東京)、100 μg/mlのストレプトマイシン(明治製菓,東京)、1μg/mlのアンホテリシンB(ギブコ、米国)を含む)で培養したものとした。7日間培養後、培地を全て10%FCS を含むDMEM(100 units/mlのペニシリン(明治製菓、東京)、100 μg/mlのストレプトマイシン(明治製菓,東京)、1μg/mlのアンホテリシンB(ギブコ、米国)を含む)に交換し、CellTiter 96(商品名)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit(Promega、米国)を用いて490 nmにおける吸光度を測定することにより、生細胞数を計測した。
直径8mm×5mmのテルプラグに、濃度5、25、50μg/mlのBDNF溶液(滅菌生理食塩液中)の25μlの代わりに濃度100μg/mlのNGF溶液(滅菌生理食塩液中)の25μlをしみこませたものと、濃度100μg/mlのNT-3溶液(滅菌生理食塩液中)の25μlをしみこませたものを、移植材として用いたこと以外は、実施例2と同様に実験を行った。作成した組織標本(ヘマトキシリン・エオジン染色)から、近遠心方向歯軸に平行でしかも根中央付近で薄切された標本を選択し、光学顕微鏡(ECLIPSE E600、NIKON)で観察した。
Claims (18)
- 神経栄養因子を有効成分とする、歯周病の治療剤であって、神経栄養因子が脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン3、またはニューロトロフィン4/5であり、治療剤が歯周組織を再生させることを特徴とする、前記治療剤。
- 歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することを特徴とする、請求項1に記載の治療剤。
- セメント質を再生させることを特徴とする、請求項1または2に記載の治療剤。
- 歯周靭帯を再生させることを特徴とする、請求項1〜3の何れか1項に記載の治療剤。
- 歯槽骨を再生させることを特徴とする、請求項1〜4の何れか1項に記載の治療剤。
- 歯髄を再生させることを特徴とする、請求項1〜5の何れか1項に記載の治療剤。
- 歯髄腔における修復象牙質の産生を促進することを特徴とする、請求項1〜6の何れか1項に記載の治療剤。
- 神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子である、請求項1に記載の治療剤。
- 神経栄養因子が、神経成長因子である、請求項1に記載の治療剤。
- 神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子である、請求項6に記載の治療剤。
- 神経栄養因子が、神経成長因子である、請求項6に記載の治療剤。
- 神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子である、請求項2〜5のいずれか1項に記載の治療剤。
- 神経栄養因子を含有する歯周組織再生用移植材であって、神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン3、またはニューロトロフィン4/5である、前記歯周組織再生用移植材。
- (a) セメント質を再生するため;
(b) 歯槽骨を再生するため;
(c) 歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止するため;
(d) 歯髄を再生するため;または
(e) 歯髄腔における修復象牙質の産生を促進するため
に使用する、請求項13に記載の歯周組織再生用移植材。 - 歯周靭帯を再生するために使用する、請求項13に記載の歯周組織再生用移植材。
- 神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子である、請求項13〜15の何れか1項に記載の歯周組織再生用移植材。
- (a) セメント質を再生するため;及び
(b) 歯槽骨を再生するため;及び
(c) 歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止するため
に使用する、請求項16に記載の歯周組織再生用移植材。 - 神経栄養因子を有効成分とする、修復象牙質の形成促進剤であって、神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン3、またはニューロトロフィン4/5である、前記修復象牙質の形成促進剤。
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