JP2008534674A - シースプロテインを含有するタンパク質、及びそれを導くポリペプチド断片あるいはペプチド断片、並びにシースプロテインを含有する会合体を含む成分 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図5
Description
なお、本願では、タンパク質のアミノ酸配列をSEQ ID ナンバーで表している。
エナメル質基質には、3つのエナメル質基質タンパク質と2つのプロテアーゼ酵素が存在する。これらのタンパク質とプロテアーゼのcDNAとそれらから由来するアミノ酸配列はすでに発表されている。加えて、2つの成長因子がブタの基質形成期エナメル質に見つかっている。
アメロゲニンは発育中のエナメル質基質に多量に存在し、溶液中では会合する性質を持っている。それらアメロゲニンは中性pH、室温下では不溶性で(凝集し沈殿物を形成する)、低温下では可逆的にその相を変え溶ける。タンパク化学的分析では、未分解の見かけ上25kDaの分子量を持つアメロゲニン(非特許文献23,24)がブタのアメロゲニン遺伝子産物としては最も多く、そのほかにアメロゲニンmRNAのスプライシングによって生ずる27、18、6.5kDaアメロゲニン(非特許文献25,26,27)がある。
シースリンは65kDaの分子量を持ち、ブタ新生幼若エナメル質中に最初に発見された13〜17kDa非アメロゲニンタンパクにつけられた名前のシースプロテイン(非特許文献3,24)の親タンパク質である。ブタシースリンは、エナメル芽細胞から分泌されると直ちにN末端から由来する17kDa シースプロテイン、C末端から由来する19kDaCa結合性タンパク質(非特許文献4,28,29)、分子の中央から由来する25kDa酸性タンパク質の3つのセグメントに分解される。 シースプロテインは将来プリズムシースになるところに凝縮され(非特許文献2,24)、発育の進んだ基質形成期中で15kDa、13kDaシースプロテインに低分子化していく。
エナメリンは155kDaの親タンパク質で、これから142、89、56、45、34、32、25kDaの分子量の分解産物が生ずる(非特許文献12,13)。新生幼若エナメル質のアルカリ可溶性画分に主に89kDaエナメリンが存在する。基質形成期の発育が進んだ段階で中性可溶性画分中に存在する32kDaエナメリンに分解される。この32kDaエナメリンはフルオロハイドロキシアパタイト(非特許文献30)とCaイオン(非特許文献29)に親和性がある。
エナメルタンパク以外にエナメル抽出物中に強力なシグナリング分子が存在することが知られてきた。最近、骨誘導因子(BMP)様活性がノギンの作用でST2細胞(マウス骨髄ストローマルセルライン)を使ってブタエナメル抽出物に存在することが推論され(非特許文献31)、また、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)様活性が口腔の上皮細胞と線維芽細胞を使って証明された(非特許文献32)。エナメル質基質タンパク中のTGF-β様活性はHPDL細胞のALP活性を上昇させ、それらの細胞分化を促進し、最終的に石灰化を誘導した(非特許文献33)。エナメル抽出物中のこれらの成長因子の存在と歯根膜再生における骨形成あるいはセメント質形成の誘導との関係は不明である。
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それらは、好ましくは5%かそれ以上の同一性、より好ましくは10%かそれ以上の同一性、より好ましくは15%かそれ以上の同一性、より好ましくは20%かそれ以上の同一性、より好ましくは25%かそれ以上の同一性、より好ましくは30%かそれ以上の同一性、より好ましくは35%かそれ以上の同一性、より好ましくは40%かそれ以上の同一性、より好ましくは50%かそれ以上の同一性、より好ましくは55%かそれ以上の同一性、より好ましくは60%かそれ以上の同一性、より好ましくは65%かそれ以上の同一性、より好ましくは70%かそれ以上の同一性、より好ましくは75%かそれ以上の同一性、より好ましくは80%かそれ以上の同一性、より好ましくは85%かそれ以上の同一性、より好ましくは90%かそれ以上の同一性、より好ましくは95%かそれ以上の同一性、より好ましくは96%かそれ以上の同一性、より好ましくは97%かそれ以上の同一性、より好ましくは98%かそれ以上の同一性、より好ましくは99%かそれ以上の同一性がある。
(1)分離・精製したシースプロテインを含有するタンパク質であって、前記シースプロテインは、構造エナメルタンパクの一つであるシースリン(アメロブラスチンまたはアメリン)からプロテアーゼの働きで精製した由来物の1つであり、かつ前記シースリンのアミノ末端側に由来するものであることを特徴とするタンパク質。
(2)シースプロテインが、哺乳動物から分離・精製したものであることを特徴とする前記(1)に記載のタンパク質。
(3)哺乳動物シースプロテインが、ブタから分離・精製したものであることを特徴とする前記(2)に記載のタンパク質。
(4)哺乳動物シースプロテインが、ヒトから分離・精製したものであることを特徴とする前記(2)に記載のタンパク質。
(5)分離・精製したシースプロテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:11からなる群から選ばれるものであることを特徴とする前記(1)に記載のタンパク質。
(6)前記(5)に記載のタンパク質を哺乳動物に応用することにより効果をあげる方法。
(7)哺乳動物がヒトであることを特徴とする前記(6)に記載の方法。
(8)SEQ ID NO:11のタンパク質をヒトに応用することにより効果を上げる方法。
(9)哺乳動物がヒトであることを特徴とする前記(8)に記載の方法。
(10)SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれる配列中の約3連続アミノ酸と同じ配列を有する少なくとも3つの連続アミノ酸の配列部位を含むもの、または、
SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれるポリペプチド断片を合成する長さが3〜1000個程度のアミノ酸を含むもの、
であることを特徴とするポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(11)断片が、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれる配列中の少なくとも3連続アミノ酸からなる配列を含むことを特徴とする前記(10)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(12)断片が、長さが3〜1000個程度のアミノ酸であり、かつSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれる配列中の連続アミノ酸の配列部位を含む人工的配列のアミノ酸断片を合成することを特徴とする前記(10)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(13)断片が、長さが3〜1000個程度のアミノ酸であり、かつリコンビナントタンパク発現システムによりSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれる配列中の連続アミノ酸の配列部位を含む人工的配列のアミノ酸断片を生合成することを特徴とする前記(10)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(14)前記(10)に記載のタンパク質を哺乳動物に応用することにより効果をあげる方法。
(15)哺乳動物がヒトであることを特徴とする前記(14)に記載の方法。
(16)SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:25からなる群から選ばれる配列中の約3連続アミノ酸と同じ配列を有する少なくとも3つの連続アミノ酸の配列部位を含むもの、または、
SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:25からなる群から選ばれるポリペプチド断片を合成する長さが3〜1000個程度のアミノ酸を含むもの、
であることを特徴とするポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(17)断片が、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:25からなる群から選ばれる配列中の少なくとも3連続アミノ酸からなる配列を含むことを特徴とする前記(16)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(18)断片が、長さが3〜1000個程度のアミノ酸であり、かつSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:25からなる群から選ばれる配列中の連続アミノ酸の配列部位を含む人工的配列のアミノ酸断片を合成することを特徴とする前記(16)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(19)断片が、長さが3〜1000個程度のアミノ酸であり、かつリコンビナントタンパク発現システムによりSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:25からなる群から選ばれる配列中の連続アミノ酸の配列部位を含む人工的配列のアミノ酸断片を生合成することを特徴とする前記(16)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(20)前記(16)に記載のタンパク質を哺乳動物に応用することにより効果をあげる方法。
(21)哺乳動物がヒトであることを特徴とする前記(20)に記載の方法。
(22)SEQ ID NO: 9中の約3連続アミノ酸と同じ配列を有する少なくとも3つの連続アミノ酸の配列部位を含むもの、または、
SEQ ID NO: 9のポリペプチド断片を合成する長さが3〜1000個程度のアミノ酸を含むもの、
であることを特徴とするポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(23)断片が、SEQ ID NO: 9から少なくとも3つの連続するアミノ酸の配列部位を含むことを特徴とする前記(22)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(24)断片が、長さが3〜1000個程度のアミノ酸であり、かつSEQ ID NO: 9から連続アミノ酸の配列部位を含む人工的配列のアミノ酸断片を合成することを特徴とする前記(22)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(25)断片が、長さが3〜1000個程度のアミノ酸であり、かつリコンビナントタンパク発現システムによりSEQ ID NO: 9の連続アミノ酸の配列部位を含む人工的配列のアミノ酸断片を生合成することを特徴とする前記(22)に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(26)前記(22)に記載のタンパク質を哺乳動物に応用することにより効果をあげる方法。
(27)哺乳動物がヒトであることを特徴とする前記(26)に記載の方法。
(28)SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32からなる群から選ばれる配列部位を含むものとして特徴付けられるポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
(29)前記(28)のポリペプチド断片をヒトに応用することにより効果をあげる方法。
(30)哺乳動物がヒトであることを特徴とする前記(28)に記載の方法。
(32)分離した会合体が、アルカリ溶液中のシースプロテインとアメロゲニンとで形成されることを特徴とする前記(31)に記載の成分。
(33)分離した会合体が、哺乳動物の基質形成期エナメル質の表面から約30μmに相当する表層のエナメル質である新生エナメル質に存在することを特徴とする前記(31)に記載の成分。
(34)分離した会合体は、表層のエナメル質である新生エナメル質から調整したものであることを特徴とする前記(31)に記載の成分。
(35)分離した会合体は、アルカリ溶液中でのゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、硫安分画からなる群から選ばれる1つの方法で分離されることを特徴とする前記(31)に記載の成分。
(36)前記(31)に記載のタンパク質を哺乳動物に応用することにより効果をあげる方法。
(37)哺乳動物がヒトであることを特徴とする前記(36)に記載の方法。
(38)シースプロテインを含む分離したエナメルタンパク質を含む成分。
(39)分離したエナメルタンパク質が、哺乳動物の基質形成期エナメル質の表面から約30μmに相当する表層のエナメル質である新生エナメル質から調整したものであることを特徴とする前記(38)に記載の成分。
(40)分離したエナメルタンパク質が、表層のエナメル質である新生エナメル質から中性可溶性画分を抽出した後にアルカリ溶液で抽出されるものであることを特徴とする前記(38)に記載の成分。
(41)前記(38)に記載の成分を哺乳動物に応用することにより効果をあげる方法。
(42)哺乳動物がヒトであることを特徴とする前記(41)に記載の方法。
また、図面については、本願明細書の一部であり、本発明の特定の態様をより証明するために含まれている。本発明は、これらの図面を一つ以上参照することにより、ここで提示される具体的な実施態様の詳細な説明と組合せることで、よりよく理解されるであろう。
〔ブタエナメルタンパク中のセメント質再生(CR)促進因子の同定〕
セメント質形成に特異的なマーカーがないので、CR促進因子の同定のために、犬に施した頬側裂開型骨欠損に種々の精製段階のエナメルタンパクを適用して、組織学的な方法で分析した。CR促進活性はビーグル犬に施した一壁性の骨欠損における8週後の組織学的分析で評価した。CR促進活性を持つタンパクが決定された後には、細胞培養法で精製したエナメルタンパクあるいはそれらのペプチドを適用することで、HPDL細胞のALP活性を検出して、タンパクの生理活性をもつ配列を調べた。なぜなら、ALP活性はHPDL細胞の細胞分化活性をあらわし、無細胞セメント質の形成に重要な働きをしている。それはALP欠損マウスの光学顕微鏡による形態的な評価から推論されている(非特許文献47)。細胞培養システムはエナメルタンパクの細胞分化活性の決定につながる便利な方法である。しかしながら、HPDL細胞の細胞分化がセメント質形成かあるいは骨形成に関わるかどうかは今のところ不明である。だから、CR促進因子が最初に決定されれば、HPDL細胞の細胞分化活性の検出がCR促進活性を示すタンパク質中の生理活性配列を決定するのに有用である。
幾つかのエナメルタンパク試料を適用してCR活性を検出するために約2歳のオスのビーグル犬 (体重約15kg)が使われた。それらは正常な歯列を持ち、歯周組織は健全であった。頬側石灰型骨欠損の外科的手術は、ケタミン塩酸(9.8mg/kg:Sankyo Co. LTD, Tokyo, Japan)とXylazine HCl(0.7mg・kg:Bayer Co. LTD, Tokyo, Japan)の混合物を筋肉内に注射して前麻酔した後、100%の酸素に1.5-2.0%ハロタン(Takeda Yakuhin Co. LTD, Osaka, Japan)を加えて気管内チューブ(endotracheal tube)により送管した麻酔下でHammerstrom(1997)の変法を用いて行った。
分画したあるいは精製したエナメルタンパクとEMDを適用して得られた再生セメント質の長さと厚さを組織学的な結果のコンピューター処理により計測した。再生セメント質の長さは、新生歯槽骨の先端までと同じように、欠損の先端から新生セメント質までの直線距離である。セメント質の厚さは辺縁と先端とその間を側定した。これらのデータは統計処理を行った。
全てのステップは何も記載がなければ氷水中か4度で行った。屠殺場から氷中で運んできた生後6ヶ月くらいの新鮮下顎骨から、切歯永久歯歯胚が取り出された。
分画したエナメルタンパクを、1%SDSを含む15%ポリアクリルアミド平板ゲルを使ったLaemmliの方法によるアクリルアミドゲル電気泳動し、クーマーシーブリリアントブルーR250 染色して調べた。エナメルタンパクの同定はアメロゲニン、エナメリン、シースプロテインのポリクロナール抗体(非特許文献24)でウェスタンブロット法で行った。泳動後、ゲルはGVHP膜にトランスブロットした。膜は非特許文献50に記載の方法に従ってアビジン−ビオチン複合体を使ったABCキットを使いプロトコル(Vector Laboratoreis, USA)に従って免疫染色した。
<中性とアルカリ可溶性画分の抽出>
集めた試料は一緒にして氷水中で湿重量の20倍容量の緩衝液を加えた。資料中のタンパク質はポリトロンホモジナイザーを用いて約6000回転のスピードでトータルとして60秒間ホモジナイズして抽出した。ホノジナイズ中、試料が加熱しないように3から4回のインターバルで行った。同じ緩衝液での抽出は3回繰り返された。中性可溶性画分とアルカリ可溶性画分はそれぞれ0.05M Sorensen 緩衝液(pH7.4)と0.05M 炭酸‐重炭酸緩衝液(pH10.8)中でホモジナイズして連続的に抽出した(非特許文献3)。総タンパク質量の95%以上がこれらの連続抽出で基質形成期エナメル質から抽出された。総タンパク質の約16%が中性緩衝液で可溶化され、80%がアルカリ緩衝液で可溶化された。
新生幼若エナメル質のアルカリ可溶性画分は0.05M炭酸ー重炭酸緩衝液(pH10.8)で平衡化してあるセファデックスG-100(Pharmacia Biotech, Uppasala, Sweden) のカラム(2.6x100cm)で4つ(1-4)のフラクションにゲルろ過された。炭酸緩衝液の採用はアルカリ性の条件がアメロゲニンの会合が抑制するためである。最初に溶出するピーク(フラクション1)には、主に70-89kDaエナメリン, 13-17kDaシースプロテインと少量の20-15kDa アメロゲニンが含まれていた。主たる二番目のピークには20-25kDaアメロゲニンが含まれていた。他のピークにはアメロゲニン由来物が含まれていた。
表層の試料から抽出したアルカリ可溶性画分のセファデックスG-100ゲルろ過で最初に溶出するピーク(フラクション1)は70-89kDaエナメリンと少量の20-25kDaアメロゲニンを含む13-17kDaシースプロテインからなる会合体を含む。一般に分子量の大きなタンパク質はゲルろ過で早い位置に溶出してくる。だから、フラクション1に含まれる13-17kDa シースプロテインは少量の20-25kDaアメロゲニンと共に会合体を形成しているといえる。なぜなら、4本のTSKgel G-3000PWカラムを使って室温で炭酸緩衝液中でさらに精製したところ、ほとんどの13、15、17kDaシースプロテインははじめに溶出し次に70-89kDaエナメリン、最後にアメロゲニンが溶出してきたからである。これらの小さい分子量のシースプロテインはアルカリ条件でも少量のアメロゲニンと会合体を形成して、ゲルろ過カラムを通り抜けていると思われる。
シースプロテインを含む画分は4Mグアニジン塩酸(pH7.4)を含む0.05Mトリス緩衝液(pH7.4)で平衡化したCellulofine GCL-2000(Chisso Ltd, Makuhari, Japan)のカラム(2.5x95cm)か4本のTSKgel G3000PW(TOSOH, Tokyo, Japan)のカラム(7.5mm I.D. x 60cm)を使ったリサイクルゲルろ過で分離した。
精製した各々のシースプロテインのアミノ酸配列分析は、これらシースプロテインが親タンパクであるシースリン(非特許文献1)から由来することを示した。アミノ酸配列分析はSHIMAZDU プロテインシーケンサーPPSQ-23A(Shimadzu Co., Kyoto, Japan)で行った。
分離した17、15、13kDaシースプロテインのキャラクタリゼーションから17と15kDaシースプロテインは各々170残基と130残基のアミノ酸を含むシースリンのN末端側分解産物であった。13kDaシースプロテインはM32からQ130までの99残基のアミノ酸からなっている。
精製した17kDaと15kDaシースプロテインを8週でのセメント質再生の組織学的分析(非特許文献40)で試験すると、再生されたセメント質の厚さは17kDaと15kDaを適用した時、それぞれ31.77±3.78μm、8.13±2.06μmであった。したがって、17kDaシースプロテインは厚い無細胞セメント質を誘導したが、15kDaシースプロテインはほとんどCR活性がなかった。
<HPDL細胞の細胞培養とALP活性の検出>
ヒト歯根膜(HPDL)細胞は、矯正治療の目的で抜去された健康な小臼歯から非特許文献51に記載の方法で得られた。細胞は4〜6代、α-MEM 培地で継代培養してprimary cell line を確立した。細胞はイーグル培地をαモディフィケーションした10%の子牛血清(FBS, Ashi Technoglass, Chiba, Japan)と1% antibiotics(100U/ml of Penicillin-G and 100μg/ml Streptomycin sulfate; Gibco BRL, Grand Island, N.Y., USA)を含む培地(α-MEM; Life Technologies, Grand Island, N.Y., USA)中で、5%炭酸ガスを含み湿潤にした条件で37℃で培養した。マウス骨髄細胞由来骨芽細胞様細胞であるST2細胞(Riken Cell Bank, Tsukuba, Japan)は同じ条件で培養した。
HPDL細胞を24穴プレートに1x105 /wellの細胞数でまいた。24時間インキュベート後、50μMアスコルビン酸、10mMβ-グリセロリン酸、10nM 1α-25-dihydroxy-Vitamin D3(differentiation medium)と1μg/mlの試料を含む成長培地に置換した。培地は72時間ごとに交換した。細胞は30日間培養した後、培地は捨てた。
HPDL細胞は96穴プレートに1つのウエルに約5x105の細胞になるようにまき、24時間培養した。その後、10nM 1α-25-dihydroxy-Vitamin D3と50μg/ml(終濃度)の精製したシースプロテインか又は合成ペプチドの試料を含む成長培地に置換した。96時間培養後、ALP活性はp-nitorophenylphosphateを基質として測定した。ポジティブコントロールとしてリコンビナントBMP-2あるいはTGF-β1のそれぞれ500ng/ml、50ng/mlを使用した。
ブタ17kDaシースプロテインのC末端側配列を元に6つのペプチドが合成された。
ヒトのエクストラC末端ペプチドは、ブタのエクストラC末端ペプチドが40残基のアミノ酸からなるのと異なり、66残基のアミノ酸を持っている。それで、66個のアミノ酸からなる配列から5つのペプチドを合成した。
20匹のブタ下顎骨から調整した歯冠形成期の永久歯切歯の唇側面から、基質形成期エナメル質の表層、表層‐深層、深層の試料を得た。一回の試料調整で得られた平均湿重量を下記に示す。試料の調整はお互いの混入がないように注意しながら切歯の幼若エナメル質から連続的に行った。だから、調整時の試料のロスは考慮すべきである。
湿重量 タンパク質量
表層エナメル質試料 0.064 g 0.022 g
(0.044g-0.085g)
表層‐深層エナメル質試料 0.153 g 0.041 g
(0.145g-0.159 g)
深層エナメル質試料 2.290g 0.498 g
(2.209g-2.449 g)
総基質形成期エナメル質 2.507g 0.561 g
・基質形成期エナメル質の総湿重量あたりの「表層エナメル質試料」+「表層‐深層エナメル質試料」の湿重量は、8.65% (7.0%-10.2%)である。
・各々の試料の「タンパク質量」は、後述の表2の値から計算した。
・基質形成期エナメル質の総タンパク質量あたりの「表層エナメル質試料」+「表層‐深層エナメル質試料」のタンパク質量は、11.2% (9.1%-13.2%)である。
ブタの基質形成期のエナメル質表層のアルカリ可溶性抽出物からセファデックスG-100ゲルろ過で分離されたフラクション1を頬側裂開型骨欠損における歯周組織欠損モデルに適用した時、完全な再生が象牙質表面に誘導された。フラクション1はノッチから辺縁までの象牙質によく結合した厚い無細胞性セメント質の形成を誘導した。正常な歯根膜にみられるように配列した豊富なコラーゲン線維束が、再生したセメント質から生じていた。これらの結果は再生されたセメント質の長さや厚さを、組織学的結果からコンピューターモニターで計測し、統計学的に分析した事実に基づいている。
基質形成期エナメル質表層、表層‐深層、深層の試料の化学組成 (湿重量 %)
水 ミネラル 総タン 中性可溶性 アルカリ可溶性
パク量 画分 画分
表層 42 24 34 5.4 29
(0-30μm)
表層‐深層 35 38 27 5.1 21
(30-60μm)
深層 34 47 19 5.1 13
(60-300μm)
基質形成期エナメル質表層、表層‐深層、深層 の中性、アルカリ性、酸性可溶性画分のタンパク量 (乾燥重量 %)
総 中性可溶性 アルカリ可溶 酸性可溶性
タンパク量 画分 性画分 画分
表層 59.3 9.5(16) 47(80) 3.6(4)
表層‐深層 40.8 7.8(19) 31(77) 4.0(4)
深層 28.8 7.8(27) 20(68) 4.5(5)
ブタ 17kDaシースプロテインアミノ酸配列
≪SEQ ID NO: 10≫
Sequence Size 170
Sequence Position 1-170
疎水性 94(55.29)
中性 46(27.06)
親水性 30(17.65)
その他 0(0.00)
[疎水性残基]
Gly(G) 12 (7.06%)
Ala(A) 6 (3.53%)
Val(V) 10 (5.88%)
Lcu(L) 16 (9.41%)
Ile(I) 3 (1.76%)
Met(M) 6 (3.53%)
Phe(F) 8 (4.71%)
Trp(W) 2 (1.18%)
Pro(P) 31 (18.24%)
[中性残基]
Ser(S) 15 (8.82%)
Thr(T) 5 (2.94%)
Asn(N) 3 (1.76%)
Gln(Q) 23 (13.53%)
Cys(C) 0 (0.00%)
[親水性残基]
Asp(D) 3 (1.76%)
Glu(E) 8 (4.71%)
Lys(K) 4 (2.35%)
His(H) 5 (2.94%)
Arg(R) 6 (3.53%)
Tyr(Y) 4 (2.35%)
[その他の残基]
Asx(B) 0 (0.00%)
Glx(Z) 0 (0.00%)
Xaa(X) 0 (0.00%)
平均分子量 = 18885.15
モノアイソトピック分子量 = 18873.5067
ヒトシースリン(アメロブラスチン)配列から推定されるヒトシースプロテインのアミノ酸配列
≪SEQ ID NO: 11≫
Sequence Size 196
Sequence Position 1-196
疎水性 109(55.61)
中性 50(25.51)
親水性 37(18.88)
その他 0(0.00)
[疎水性残基]
Gly(G) 15 (7.65%)
Ala(A) 11 (5.61%)
Val(V) 5 (2.55%)
Lcu(L) 26 (13.27%)
Ile(I) 3 (1.53%)
Met(M) 5 (2.55%)
Phe(F) 9 (4.59%)
Trp(W) 2 (1.02%)
Pro(P) 33 (16.84%)
[中性残基]
Ser(S) 18 (9.18%)
Thr(T) 8 (4.08%)
Asn(N) 3 (1.53%)
Gln(Q) 21 (10.71%)
Cys(C) 0 (0.00%)
[親水性残基]
Asp(D) 7 (3.57%)
Glu(E) 8 (4.08%)
Lys(K) 6 (3.06%)
His(H) 6 (3.06%)
Arg(R) 6 (3.06%)
Tyr(Y) 4 (2.04%)
[その他]
Asx(B) 0 (0.00%)
Glx(Z) 0 (0.00%)
Xaa(X) 0 (0.00%)
平均分子量 = 21419.96
モノアイソトピック分子量 = 21406.8663
CR促進活性を示すブタ生理活性アミノ酸配列
≪SEQ ID NO: 12≫
Sequence Size 40
Sequence Position 1-40
疎水性 24(60.00)
中性 7(17.50)
親水性 9(22.50)
その他 0(0.00)
平均分子量 = 4347.81
モノアイソトピック分子量 = 4345.1035
CR促進活性を示すヒト生理活性アミノ酸配列
≪SEQ ID NO: 13≫
Sequence Size 66
Sequence Position 1-66
疎水性 41(62.12)
中性 12(18.18)
親水性 13(19.70)
その他 0(0.00)
平均分子量 = 6935.60
モノアイソトピック分子量 = 6931.4326
CR促進活性の可能性のあるブタ17kDaシースプロテインのN末端側のアミノ酸配列
≪SEQ ID NO: 24≫
Sequence Size 31
Sequence Position 1-31
疎水性 19(61.29)
中性 9(29.03)
親水性 3(9.68)
その他 0(0.00)
平均分子量 = 3222.67
モノアイソトピック分子量 = 3220.7022
CR促進活性の可能性のあるヒト17kDaシースプロテインのN末端側のアミノ酸配列
≪SEQ ID NO: 25≫
Sequence Size 31
Sequence Position 1-31
疎水性 17(54.84)
中性 11(35.48)
親水性 3(9.68)
その他 0(0.00)
平均分子量 = 3391.88
モノアイソトピック分子量 = 3389.7220
N-1: SEQ ID NO: 18
N-2: SEQ ID NO: 19
N-3: SEQ ID NO: 20
C-1: SEQ ID NO: 21
C-2: SEQ ID NO: 22
C-3: SEQ ID NO: 23
〔表10〕
≪N-1: SEQ ID NO:18≫
Sequence Size 13
Sequence Position 1-13
疎水性 10(76.92)
中性 2(15.38)
親水性 1(7.69)
その他 0(0.00)
平均分子量 = 1322.49
モノアイソトピック分子量 = 1321.7143
〔表11〕
≪N-2: SEQ ID NO:19≫
Sequence Size 13
Sequence Position 1-13
疎水性 7(53.85)
中性 4(30.77)
親水性 2(15.38)
その他 0(0.00)
平均分子量 = 1361.57
モノアイソトピック分子量 = 1360.7019
〔表12〕
≪N-3: SEQ ID NO:20≫
Sequence Size 13
Sequence Position 1-13
疎水性 6(46.15)
中性 5(38.46)
親水性 2(15.38)
その他 0(0.00)
平均分子量 = 1446.64
モノアイソトピック分子量 = 1445.7294
〔表13〕
≪C-1: SEQ ID NO:21≫
Sequence Size 170
Sequence Position 132-146
平均分子量 = 1626.82
モノアイソトピック分子量 = 1625.8084
〔表14〕
≪C-2: SEQ ID NO:22≫
Sequence Size 170
Sequence Position 144-158
平均分子量 = 1599.72
モノアイソトピック分子量 = 1598.7827
〔表15〕
≪C-3: SEQ ID NO:23≫
Sequence Size 170
Sequence Position 156-170
平均分子量 = 1706.88
モノアイソトピック分子量 = 1705.7770
したペプチド
H-1: SEQ ID NO:3
H-2: SEQ ID NO: 1
H-3: SEQ ID NO:2
H-4: SEQ ID NO:4
H-5: SEQ ID NO:5
〔表16〕
≪H-1: SEQ ID NO:3≫
Sequence Size 196
Sequence Position 131-144
平均分子量 = 1494.64
モノアイソトピック分子量 = 1493.7725
〔表17〕
≪H-2: SEQ ID NO:1≫
Sequence Size 196
Sequence Position 144-157
平均分子量 = 1525.68
モノアイソトピック分子量 = 1524.7824
〔表18〕
≪H-3: SEQ ID NO:2≫
Sequence Size 196
Sequence Position 157-170
平均分子量 = 1478.62
モノアイソトピック分子量 = 1477.6546
〔表19〕
≪H-4: SEQ ID NO:4≫
Sequence Size 196
Sequence Position 170-183
平均分子量 = 1486.61
モノアイソトピック分子量 = 1485.7138
〔表20〕
≪H-5: SEQ ID NO:5≫
Sequence Size 196
Sequence Position 183-196
平均分子量 = 1550.72
モノアイソトピック分子量 = 1549.7889
〔材料と方法〕
全ての動物実験は鶴見大学動物取り扱いプログラムの承認のもとに行われた。
エナメルタンパクのCR促進活性はイヌの下顎骨の歯根部位に施された頬側裂開型骨欠損を使用した8週後の組織学的な研究で、抽出や精製の各段階で調べた(図1)。
ブタ基質形成期のエナメル質から表層の試料(新生エナメル質)と深層の試料を調整した。これらの試料から、中性可溶性、アルカリ可溶性画分を別々に緩衝液中で短時間でホモジナイズしながら抽出した。CR促進活性は基質形成期表層のアルカリ可溶性画分に存在した。そこでCR促進活性セファデックスG-100カラムによるゲルろ過とDEAEイオン交換クロマトグラフィで分離し、最終的には4Mグアニジン溶液中でのセルロファインGCL-2000のカラムによるゲルろ過のリサイクル方法で部分精製物を得た。
表層のエナメル質試料は基質形成期エナメル質の表面から約30μmの厚さに相当する(図2)。この試料の水、ミネラル、タンパク質の化学組成はそれぞれ42%、24%、34%であった(表21)。表層のエナメル質試料の中性可溶性とアルカリ可溶性の全タンパク質の割合はそれぞれ16%、80%であった(表22)。
水 ミネラル 総タン 中性可溶性 アルカリ可溶性
パク量 画分 画分
表層 42 24 34 5.4 29
(0-30μm)
表層‐深層 35 38 27 5.1 21
(30-60μm)
深層 34 47 19 5.1 13
(60-300μm)
エナメル質試料中の中性、アルカリ性、酸性可溶性画分のタンパク質の回収率(Dry weight %)
試料 総タンパク 中性 アルカリ 酸性
画分 画分 画分
表層 59.3 9.5(16) 47(80) 3.6(4)
表層‐深層 40.8 7.8(19) 31(77) 4.0(4)
深層 28.8 7.8(27) 20(68) 4.5(5)
カッコ内は総タンパクあたりのタンパク量
以前に発表された明らかなCR活性を示すEMDの適用に比べて、新生基質形成期エナメル質のアルカリ可溶性画分からセファデックスG-100 のゲルろ過分画で得られたフラクション1中に再現性よく、より強いCR活性があることが判明した。フラクション1はエナメリンと少量のアメロゲニンを含んで会合体を形成しているシースプロテインからなっている。CR活性は組織学的検討で17kDaシースプロテインに存在し、アメロゲニンやエナメリンにはその活性はなかった。
〔材料と方法〕
人の細胞の使用について鶴見大学倫理委員会で示されているプロトコール(NO.103)に従って全ての患者からインフォームドコンセントを得ている。
新生基質形成期エナメル質に存在するシースプロテインにCR促進活性があったので、これらを単一になるまで精製した。シースプロテインの会合体は表層のエナメル質試料のアルカリ可溶性画分からセファデックスG-100スーパーファインのカラムによるゲルろ過で分離した。さらに炭酸緩衝液(pH10.8)で4本のTSKgel G-3000PW (TOSOH, Tokyo, Japan; 7.5mmI.D.x 60cm)のカラムをつかってHPLCで分離した。最初に溶出するピークの会合体にあるシースプロテインは
同じカラムシステムを使って4M グアニジン溶液(pH7.4)中でリサイクルすることによって単一になるまで精製した。
<シースプロテインの精製とキャラクタリゼイション>
シースプロテインは 4M グアニジン緩衝液中で4本のTSKgel G-3000PW のカラムをつかったゲルろ過のリサイクルシステムで精製した(図10)。分離した17、15、13kDa シースプロテインを調べてみると、17と15kDaはシースリンのN末端側で切断された生成物で、それぞれ170と130のアミノ酸を含んでいた。13kDaシースプロテインはシースリンのM32からQ130までの99個のアミノ酸を含んでいた(図11)。
ブタエナメルタンパク中のCR促進タンパクは犬に施された実験的骨欠損の系で17kDaシースプロテインあることがわかった。17kDaシースプロテインに存在するCR活性は15kDaシースプロテインには存在しないC末端側ペプチドにあることがわかった。
〔材料と方法〕
人のシースプロテインのC末端側ペプチドはブタの40残基の余分なC末端側ペプチドと異なって66個のアミノ酸を持っているが、それの配列を元にしてペプチドを合成した。
HPDL細胞は24穴プレートに1x105個の濃度で細胞をまいた。24時間インキュベートした後、培地を、50μMアスコルビン酸、10mMβ-グリセロリン酸、10nM 1α,25-ジヒドロキシビタミンD(細胞分化培地(differentiation medium))、及び1μg/mlの試料を含む成長メディウムに交換した。メディウムは72時間ごとに交換し、細胞は30日間培養した。石灰化活性はカルシウム量とアリザリンレッド染色で検出した。
H-2とH-3ペプチドの約1ng/mlの適用は用量に依存してHPDL細胞のALP活性を増強させた(図13)。これらのペプチドの適用はHPDL細胞の30日間のin vitroの細胞培養においてTGF-β1の場合に比べてその程度は低かったけれども、石灰化の誘導を促進した。他のペプチドもHPDL細胞のALP活性を促進したが、それらはH-2とH-3に比べてその作用が弱かった。ST2細胞についてはどのペプチドもALP活性を増強させなかった。H-2とH-3の配列を元にして合成した全てのペプチドはHPDL細胞のALP活性を増強させた。LPG配列がHPDL細胞のALP活性を増強させる最も短い生理的なペプチドであることが確認された。
TGF-β1の細胞培養におけるHPDL細胞のALP活性を増加させる適正な濃度は約10ng/mlである。TGF-β1の分子量は約25kDaであるのでその濃度は0.4nM/literである。合成ペプチドの分子量は1.5kDaであるので、HPDL細胞のALP活性を増加させるのに適切な濃度は0.6nM/literであった。細胞培養におけるこれらの濃度から、これらのペプチドの活性がTGF-β1成長因子と同じようなレベルの濃度にあることになる。
Claims (14)
- 分離・精製したシースプロテインを含有するタンパク質であって、前記シースプロテインは、構造エナメルタンパクの一つであるシースリンからプロテアーゼの働きで精製した由来物の1つであり、かつ前記シースリンのアミノ末端側に由来するものであることを特徴とするタンパク質。
- シースプロテインが、哺乳動物から分離・精製したものであることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質。
- 哺乳動物シースプロテインが、ブタから分離・精製したものであることを特徴とする請求項2に記載のタンパク質。
- 哺乳動物シースプロテインが、ヒトから分離・精製したものであることを特徴とする請求項2に記載のタンパク質。
- 分離・精製したシースプロテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:11からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質。
- SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれる配列中の約3連続アミノ酸と同じ配列を有する少なくとも3つの連続アミノ酸の配列部位を含むもの、または、
SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれるポリペプチド断片を合成する長さが3〜1000個程度のアミノ酸を含むもの、
であることを特徴とするポリペプチド断片あるいはペプチド断片。 - 断片が、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれる配列中の少なくとも3連続アミノ酸からなる配列を含むことを特徴とする請求項6に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
- 断片が、長さが3〜1000個程度のアミノ酸であり、かつSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれる配列中の連続アミノ酸の配列部位を含む人工的配列のアミノ酸断片を合成することを特徴とする請求項6に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
- 断片が、長さが3〜1000個程度のアミノ酸であり、かつリコンビナントタンパク発現システムによりSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13からなる群から選ばれる配列中の連続アミノ酸の配列部位を含む人工的配列のアミノ酸断片を生合成することを特徴とする請求項6に記載のポリペプチド断片あるいはペプチド断片。
- シースプロテインを含む分離した会合体を含む成分。
- 分離した会合体が、アルカリ溶液中のシースプロテインとアメロゲニンとで形成されることを特徴とする請求項10に記載の成分。
- 分離した会合体が、哺乳動物の基質形成期エナメル質の表面から約30μmに相当する表層のエナメル質である新生エナメル質に存在することを特徴とする請求項10に記載の成分。
- 分離した会合体は、表層のエナメル質である新生エナメル質から調整したものであることを特徴とする請求項10に記載の成分。
- 分離した会合体は、アルカリ溶液中でのゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、硫安分画からなる群から選ばれる1つの方法で分離されることを特徴とする請求項10に記載の成分。
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