Patents

Search tools Text Classification Chemistry Measure Numbers Full documents Title Abstract Claims All Any Exact Not Add AND condition These CPCs and their children These exact CPCs Add AND condition
Exact Exact Batch Similar Substructure Substructure (SMARTS) Full documents Claims only Add AND condition
Add AND condition
Application Numbers Publication Numbers Either Add AND condition

Prostředky na bázi proteinů matrice pro hojení ran

Abstract

Aktivní substance zubní skloviny mohou být použity pro přípravu farmaceutických nebo kosmetických prostředků pro hojení ran, zlepšení hojení ran, reparace a regenerace měkkých tkání nebo pro prevenci nebo léčbu infekce nebo zánětu.

Landscapes

Show more

CZ20002986A3

Czechia

Other languages
English
Inventor
Stina Gestrelius
Lars Hammarström
Petter Lyngstadaas
Christer Andersson
Ivan Slaby
Tomas Hammargren

Worldwide applications
1999 CZ

Application CZ20002986A events

Description

Prostředky na bázi proteinů matrice pro hojení ran
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká použití matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny jako terapeutických nebo profylaktických činidel. Substance jsou aktivní jako činidla zlepšující hojení ran, jako antibakteriální a/nebo protizánětlivá činidla.
Dosavadní stav techniky
Proteiny matrice zubní skloviny jsou dobře známé jako prekursory zubní skloviny. V patentové literatuře bylo popsáno, že proteiny zubní skloviny a deriváty matrice zubní skloviny indukují tvorbu tvrdých tkání (t.j. tvorbu zubní skloviny, U.S. patent č. 4672032 (Slavkin)) nebo vazbu tvrdých tkání (EP-B-0337967 a EP-B-O263086). Předchozí výzkumy v tomto oboru byly tedy zaměřeny pouze na regeneraci tvrdých tkání, zatímco předkládaný vynález se týká dalších výhodných účinků na hojení ran v měkkých tkáních a antibakteriálních a protizánětlivých účinků těchto substancí, které jsou neočekávaným objevem.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález je založen na objevu, že matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny (dále je zde pro matrici zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a proteiny zubní skloviny používán výraz aktivní substance zubní skloviny) jsou výhodnými činidly pro zesílení nebo zlepšení hojení ran v měkkých tkáních (t.j. nemineralizovaných tkáních), jako jsou
například tkáně obsahující kolagen nebo epitel, včetně kůže a sliznic, svalů, krevních a lymfatických cév, nervové tkáně, žláz, šlach, oka a chrupavek. Jak je zde uvedeno v části příkladů, jsou matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny zejména účinné v hojení nebo profylaxi ran v měkkých tkáních.
V souladu s tím se vynález týká použití přípravku aktivní substance zubní skloviny pro přípravu farmaceutických nebo kosmetických prostředků pro: (i) hojení ran; (ii) zlepšení hojení ran; a/nebo (iii) regeneraci a/nebo reparaci měkkých tkání.
V jiném aspektu se vynález týká způsobu pro zlepšení hojení ran nebo pro podpoření regenerace a/nebo reparace měkkých tkání, kde uvedený způsob obsahuje podání terapeuticky nebo profylakticky účinného množství aktivní substance zubní skloviny jedinci, který potřebuje takovou léčbu.
Dále bylo zjištěno, že matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a proteiny matrice zubní skloviny mají antibakteriální a/nebo protizánětlivé vlastnosti, které mohou být využity pro léčbu onemocnění jak měkkých, tak tvrdých (t.j. mineralizovaných) tkání.
V jiném aspektu se vynález týká použití přípravků aktivní substance zubní skloviny pro přípravu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčbu infekčních nebo zánětlivých stavů.
Hojení ran
Rány a/nebo vředy se obvykle nacházejí na kůži nebo na povrchu sliznic nebo vznikají v důsledku infarktu orgánu (ischemie). Rána může být důsledkem defektu v měkkých tkáních nebo léze nebo základního onemocnění. Regenerace experimentálně vyvolaných defektů periodontu byla vynálezci popsána dříve a nespadá do rozsahu předkládaného vynálezu. Termín kůže, jak je zde použit, označuje zevní povrch těla zvířete včetně člověka a zahrnuje intaktní nebo téměř intaktní kůži, stejně jako poraněnou kůži. Termín sliznice označuje nepoškozenou nebo poškozenou sliznici živočicha, jako například člověka, a zahrnuje ústní, bukální, ušní, nosní, plicní, oční, gastrointestinální, vaginální nebo rektální sliznici.
Termín rána, jak je zde použit, označuje poranění s narušením normální integrity tkáňových struktur. Termín také zahrnuje termíny boláky, léze, nekrosy a vředy.
Termín bolák je lidové označení pro téměř jakoukoliv lézi na kůži či na sliznici a termín vřed označuje lokální defekt nebo exkavaci na povrchu orgánu nebo tkáně, který vzniká odlučováním nekrotické tkáně. Léze je obecně jakýkoliv tkáňový defekt. Nekrosa označuje tkáň odumřelou v důsledku infekce, poranění, zánětu nebo infarktu.
Termín rána, jak je zde použit, označuje jakoukoliv ránu (pro klasifikaci ran viz dále) v jakémkoliv stadiu hojení, včetně stavu před zahájením hojení nebo i stavu před vznikem specifické rány, jako je například chirurgická incise (profylaktické terapie).
Příklady ran, které mohou být preventivně a/nebo terapeuticky léčby způsobem podle předkládaného vynálezu, jsou například aseptické rány, zhmožděné rány, řezné rány, tržné · · · 4 rány, nepenetrující rány (t.j. rány, při kterých není porušena kůže, ale je poranění hlouběji uložených struktur), otevřené rány, penetrující rány, perforující rány, bodné rány, septické rány, podkožní rány atd. Příklady boláků jsou proleženiny, herpetická gingivostomatitis, defekty vzniklé působením chrómu, omrzliny, otlaky a podobně. Příklady vředů jsou například peptické vředy, dvanáctníkové vředy, žaludeční vředy, dnavé vředy, diabetické vředy, ischemické vředy, vředy z hypostásy, bércové vředy (venosní vředy), sublinguální vředy, podslizniční vředy, symptomatické vředy, trofické vředy, tropické vředy, vředy při pohlavních nemocích, například při kapavce (včetně urethritis, endocervitis a proctitis) . Mezi stavy související s ránami či boláky, které mohou být úspěšně léčeny způsobem podle předkládaného vynálezu, patří popáleniny, anthrax, tetanus, plynatá gangréna, spála, erysipel, sycosis barbae, foliculitis, impetigo contagiosa nebo impetigo bullosa atd. Často se použití termínů rána a vřed a rána a bolák překrývá a dále jsou tyto termíny často používány náhodně. Jak bylo uvedeno výše, v předkládaném vynálezu zahrnuje termín rána termíny vřed, léze, bolák a infarkt a tyto termíny jsou používány zaměnitelně, pokud není výslovně uvedeno jinak.
Mezi rány, které mohou být léčeny způsobem podle předkládaného vynálezu, patří také (i) obecné rány, jako jsou chirurgické, traumatické, infekční, ischemické, termální, chemické a bulosní rány; (ii) rány specifické pro orální dutinu, jako jsou například rány po extrakci zubu, rány v endodontu, zejména rány související s léčbou cyst a abscesů, vředů a lézí bakteriálního, virového nebo autoimunitního původu, mechanické, chemické, termální, infekční a lichenoidní rány; konkrétními příklady jsou herpetické vředy, stomatitis apthosa, akutní nekrotizující ulcerativní gingivitida a • · · · · · · · · · 9 • · · · · · ······· · • · · · · · · · · ·
9· ··» tt ·· ·· ·· syndrom pálení v ústech; a (iii) rány na kůži, jako jsou například nádory, popáleniny (například chemické, termální), léze (bakteriální, virové, autoimunitní), kousnutí a chirurgické incise. Jiným způsobem dělení ran je dělení na (I) rány s malou ztrátou tkáně, jako jsou rány způsobené chirurgickou incisí, drobnou abrazí či menším kousnutím; a (ií) rány s významnou ztrátou tkáně. Do druhé skupiny patří ischemické vředy, otlaky, fistule, lacerace, těžší pokousání, popáleniny a rány po odběrech orgánových štěpů (v měkkých a tvrdých tkáních) a infarkty.
Vliv aktivní substance zubní skloviny na hojení ran je významný pro rány přítomné v dutině ústní. Takové rány vznikají v důsledku poranění nebo traumatu při chirurgických zákrocích v dutině ústní, včetně operací periodontu, extrakcí zubů, endodontické léčbě, vkládání zubních implantátů, aplikace a používání zubních protéz a podobně. V části příkladů je demonstrován příznivý efekt aktivní substance zubní skloviny na hojení takových ran. Dále byl pozorován vliv na hojení měkkých tkání.
V dutině ústní je hojení ran typu aftů, traumat nebo herpetických defektů také zlepšeno po aplikaci aktivní substance zubní skloviny. Traumatické defekty a herpetické defekty mohou být samozřejmě lokalizovány i jinde na těle.
V jiném aspektu vynálezu je defekt, který je léčen a/nebo kterému má být zabráněno, vybrán ze skupiny skládající se z aseptických ran, infarktů, zhmožděných ran, řezných ran, tržných ran, nepenetrujících ran, otevřených ran, penetrujících ran, perforujících ran, bodných ran, septických ran a podkožních ran.
• ·
Další rány, které jsou významné v souvislosti s předkládaným vynálezem, jsou rány typu ischemických vředů, otlaky, píštěle, těžší kousnutí, popáleniny a rány vznikající po odběru orgánů.
Ischemické vředy a otlaky se obvykle hojí velmi pomalu a zejména v takových případech má zlepšení a zrychlení hojení značný význam pro pacienta. Dále, náklady na léčbu takových pacientů s takovými defekty jsou značně sníženy, pokud je hojení zlepšeno a probíhá rychleji.
Rány po odběru tkáně jsou rány související s odstraněním tvrdé tkáně z jednoho místa těla a přenesením této tkáně na jiné místo těla, jak je tomu například při transplantacích. Rány vznikající při takových operacích jsou velmi bolestivé a zlepšení hojení má proto značný význam.
Termín kůže je použit ve velmi obecném významu a zahrnuje epidermis a - v případech, kdy je povrch kůže více nebo méně poškozen - také dermis. Kromě stratům corneum se zevní (epitelová) vrstva kůže označuje epidermis a hlubší pojivová tkáň kůže se označuje dermis.
Protože je kůže částí těla nejvíce vystavenou zevním vlivům, je často místem různých poranění, jako jsou například ruptury, řezné rány, oděrky, popáleniny a omrzliny nebo defekty vznikající v důsledku různých onemocnění. Dále, při nehodách je často poraněna velká část kůže. Nicméně, protože je kůže významnou barierou a má významné fyziologické funkce, je integrita kůže významná pro dobrý stav jedince a jakékoliv porušení nebo ruptura kůže představuje ohrožení, které musí tělo reparovat pro zachování existence.
• «
Kromě kůže mohou být také poraněny všechny druhy tkání (t.j. měkkých a tvrdých tkání). Poranění měkkých tkání včetně slizničních membrán a/nebo kůže jsou zejména významná v souvislosti s předkládaným vynálezem.
Hojení defektů na kůži nebo na sliznicích probíhá v mnoha stadiích, které vedou k reparaci nebo regeneraci kůže nebo sliznice. V posledních letech byly regenerace a reparace stanoveny jako dva typy hojení, které mohou proběhnout. Regenerace může být definována jako biologický proces, při kterém je zcela obnovena architektura a funkce ztracené tkáně. Reparace je biologický proces, při kterém je kontinuita poraněné tkáně obnovena novou tkání, která nereplikuje strukturu a funkci ztracené tkáně.
Většina tkání se hojí reparací, což znamená, že vytvořená nová tkáň je strukturálně a chemicky odlišná od původní tkáně (jizevnatá tkáň). V časném stadiu reparace tkáně je jedním z procesů, které jsou téměř vždy přítomny, tvorba přechodné pojivové tkáně v oblasti zranění. Tento proces začíná tvorbou nové extracelulární kolagenové matrice fibroblasty. Tato nová extracelulární kolagenová matrice je potom nosičem pro pojivovou tkáň při konečném procesu hojení. Konečným zhojením je, ve většině tkání, tvorba jizvy obsahující pojivovou tkáň.
V tkáních s regenerativními vlastnostmi, jako je například kůže a kost, obsahuje konečné hojení regeneraci původní tkáně. Tato regenerovaná tkáň má často určité charakteristiky jizvy, jako je například zesílení zhojené zlomeniny kosti.
Za normálních okolností má organismus mechanismy pro hojení poraněné kůže nebo sliznice vedoucí k obnovení integrity slizniční nebo kožní bariery. Reparace i malých poranění může trvat hodiny a dny až týdny. Nicméně, u ulcerací může být • « • •4 4 4 44 4 • 444 4 44 4 • 4 44444 44 4 hojení velmi pomalé a defekt může přetrvávat dlouhodobě, t.j.
měsíce a roky.
Stadia hojení ran jsou obvykle zánět (normálně 1-3 dny), migrace (normálně 1-6 dnů), proliferace (normálně 3-24 dnů) a maturace (normálně 1-12 měsíců). Hojení je komplexní a dobře koordinovaný proces, který zahrnuje migraci, proliferaci a diferenciaci různých typů buněk, stejně jako syntézu složek matrice. Hojení může být rozděleno do tří fází:
(i) Hemostáza a zánět
Jakmile se trombocyty dostanou mimo cirkulaci a do kontaktu s trombinem a kolagenem, tak se aktivují a začnou agregovat. Trombocyty tedy iniciují reparační proces agregací a tvorbou přechodné sraženiny zajišťující hemostasu a bránící invazi bakterií. Aktivované trombocyty aktivují koagulační kaskádu a uvolňují růstové faktory jako je destičkový růstový faktor (PDGF) a epidermální růstové faktory (EGF) a transformující růstové faktory (TGF).
Prvními buňkami migrujícími do místa poranění jsou neutrofily, po kterých následují monocyty, které jsou aktivovány makrofágy.
Hlavní úlohou neutrofilů se zdá být obrana proti bakteriím nebo vyčištění rány od kontaminujících bakterií a zlepšení hojení odstraňováním odumřelých buněk a destiček. Migrace neutrofilů ustává během prvních 48 hodin za podmínky, že v ráně již není žádná bakteriální kontaminace. Nadbytek neutrofilů je fagocytován tkáňovými makrofágy vzniklými z cirkulující zásoby krevních monocytů. Makrofágy se považují za zásadní pro účinné hojení v tom, že jsou také odpovědná za • φ
Φ· φ ·· φφ ·· • φφφ φ φφ φ φ φφ φφ φ φφφφ φφφ φ φ φ · φ φ φφφφφ φφ • φ φ φφ φ φ φφ φφ φφφ φφ φφ φφ fagocytosu patogenních organismů a za odstraňování buněčné drti. Dále, makrofágy uvolňují mnoho faktorů, které se účastní dalšího procesu hójení. Makrofágy přitahují fibroblasty, která začínají produkovat kolagen.
(ii) Tvorba granulační tkáně a reepitelizace
Během 48 hodin po poranění začínají fibroblasty proliferovat a migrovat do oblasti poranění z pojivové tkáně na okrajích rány. Fibroblasty produkují kolagen a glykosaminoglykany a dále snižují tlak kyslíku v ráně, čímž stimulují proliferací buněk endotelu. Endotelové buňky způsobují vznik nové kapilární sítě.
Kolagenasy a aktivátory plasminogenu jsou secernovány z keratinocytů. Pokud není rána narušena a tkáň je dobře zásobena kyslíkem a živinami, tak migrují keratinocyty do rány. Předpokládá se, že keratinocyty migrují pouze nad živou tkáň a do oblasti pod odumřelou tkání a pod krustu na ráně.
Plocha rány je dále zmenšena kontrakcí.
(iii) Remodelování kůže
Ihned po dokončení reepitelizace začíná remodelování tkáně. Tato fáze, která trvá několik let, obnovuje pevnost poraněné tkáně.
Všechny výše uvedené procesy hojení trvají značnou dobu. Rychlost hojení je ovlivněna přítomností infekce, celkovým zdravotním stavem jedince, přítomností cizích těles atd. Některé patologické stavy jako je infekce, macerace, dehydratace, špatný celkový zdravotní stav a malnutrice mohou ·· ♦ ·· ·· 44 ·· • · ·« · · · 4 4 4·· • 4 · · · · · « · · · • · 4 · · ······ · · * • 4 9 · 9 9 9 9 9 9
4 9 99 9 9 99 , 9 9 9 9 vést ke vzniku chronických vředů, jako jsou například ischemické vředy.
Dokud neproběhne alespoň povrchové zhojení, přetrvává stále riziko nové infekce. Proto platí, že čím rychlejší je hojení, tím dříve je toto riziko odstraněno.
Proto má značný význam jakýkoliv postup, který ovlivní rychlost hojení rány nebo zlepší hojení rány.
Dále, protože téměř všechny reparační procesy obsahují časnou tvorbu pojivové tkáně, zlepší stimulace této tvorby a následných procesů hojení tkáně.
Termín klinické zhojení, jak je zde použit, označuje stav, kdy není vizuálně patrné žádné narušení tkáně a jsou přítomné pouze mírné známky zánětu, jako je zarudnutí a mírný otok tkáně. Dále, v klidovém stavu nebo uvolněném stavu není přítomná bolest.
Jak bylo uvedeno výše, vynález se týká použití matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů zubní skloviny jako činidel podporujících hojení ran, t.j. činidel, které zrychlují, stimulují nebo podporují hojení kožních nebo slizničních ran.Významné je také použití těchto substancí jako činidel podporujících regeneraci tkáně a/nebo reparaci tkáně. Kromě toho, z důvodů ovlivnění hojení rány mají matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny zubní skloviny také vliv na bolest.
Tradičně byly pro péči o poranění používány suché obvazy nebo vysychající obvazy. Tyto byly postupně nahrazovány neprodyšnými obvazy udržujícími vlhké prostředí. Pro úspěšnou • ·
··
BB • Β ·· • · · · • · · · • · · · • · · · • · ·· reparaci nebo nahrazení poraněné tkáně musí být vyvážené procesy hojení rány, fibrosy a mikrobiální invaze. Mnoho prostředků určených pro prevenci infekce ohrožuje hojení poranění. Dlouhodobé hojení nebo zánět mohou vést ke vzniku fibrosy. Kromě toho, jak bylo uvedeno dříve, jsou růstové faktory, jako je epidermální růstový faktor (EGF), transformující růstový faktor-α (TGF-a), destičkový růstový faktor (PGDF), fibroblastové růstové faktory (FGF) včetně acidického fibroblastového růstového fakotru (α-FGF) a bazického fibroblastového růstového faktoru (β-FGF), transformující růstový faktor-β (TGF-β), a insulinu-podobné růstové faktory (IGF-1 a IGF-2), molekulami zprostředkujícími proces hojení a jsou často uváděny jako činidla navozující hojení ran; nicméně, mohou také způsobovat vznik fibrosy, která může narušit úspěšné hojení. I přesto, že zrychlení hojení snižuje riziko infekce a následný zánět, který může vést ke tvorbě jizvy, měly terapeutické pokusy o zrychlení normálního hojení ran relativně malý úspěch. Toto je způsobeno patrně tím, že reparačních procesů se účastní mnoho faktorů, jak byly uvedeny výše.
Předkladatelé vynálezu pozorovali, že v různých buněčných kulturách fibroblastů (embryonálních, kožních, z periodontálních ligament, rybích nebo ptačích) je produkováno v kultivačním mediu dvakrát tolik ΤΘΓβΙ při simulaci EMDOGAINEM® ve srovnání s nestimulovanými kulturami, při testování pomocí, například ELISA (viz příklad 1) . Zvýšení je patrné po 24 hodinách kultivace, ale nejvýraznější je po několika dnech (den 2 a 3). Po druhém dnu je také zvýšena proliferace buněk v buněčných kulturách stimulovaných EMDOGAINEM®. Podobné, ale méně výrazné zvýšení produkce ΤΰΓβΙ je pozorováno u lidských epitelových buněk. Protože se ·· ·♦ • · · · • * » · • · · · • · · · ·· ·« ·· « · • · ·· ··· předpokládá centrální význam TGFŮl v epitelizaci povrchu rány, podporují tyto pozorování koncept předkládaného vynálezu.
··
V dutině ústní je použití obvazových prostředků běžné. Takové obvazové prostředky jsou obvykle běžných typů, například Surgipads pro zastavení krvácení a Coe-Pack periodontální obvazy (Coe Laboratories, GC Group, USA) na otevřené rány. Gáza navlhčená antibiotickým roztokem je vkládána do dutiny po extrakci zubu a musí být odstraněna po několika dnech, kdy je zahájeno hojení. Vyplachování antiseptiky jako je chlorhexidin je pravidelně používáno po chirurgických zákrocích v dutině ústní. Někdy jsou také předepisována celková nebo lokální antibiotika.
Při léčbě ran musí být brány v úvahu preventivní opatření, jako je zachování sterility, předcházení kontaminaci, správná aplikace obvazů/bandáží atd., které obvykle vyžadují, aby byla léčba prováděna školenými sestrami. Proto je hojení ran obvykle velmi nákladné, pokud má být činidlo podporující hojení aplikováno několikrát za den. Žádoucí redukce nákladů na hojení rány je proto možno dosáhnout tehdy, je-li snížena frekvence aplikací nebo tehdy, je-li proces hojení zlepšen tak, že je snížena doba nutná pro hojení rány.
Předkladatelé vynálezu nyní zjistili, že matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny zubní skloviny mají vlastnosti podporující hojení ran. Dále, existují důkazy, že aplikace matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů zubní skloviny vede ke zlepšenému hojení ran. Konkrétně, vynálezci pozorovali, že po aplikaci proteinů matrice zubní skloviny a/nebo derivátů matrice zubní skloviny je zánětlivé stadium zkráceno a typické příznaky jako je teplejší povrch, zarudnutí, otok a bolest • 9
9 • Μ
9 9 999
999 9 • 9 9 9
9 9 · • 9 9 9
9 9 9
99 jsou méně vyznačeny, a nová tkáň je tvořena rychleji.
Pozorovaná doba hojení ran (například po chirurgickém zákroku) je významně zkrácena ve srovnání s chirurgickým zákrokem bez použití matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny.
Terapeutická a/nebo profylaktická aktivita matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny může být samozřejmě dokázána v in vivo testech na pokusných zvířatech nebo na lidech (viz část příkladů provedení vynálezu). Nicméně, důkazy účinnosti a/nebo aktivity matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny mohou být získány provedením relativně jednoduchých testů in vitro, například testováním na buněčných kulturách.
Dále, existuje několik parametrů, které mohou být použity pro hodnocení efektu na hojení ran. Mezi tyto parametry patří:
- počítačová planimetrie (hodnocení rychlosti hojení otevřené rány);
- laserové dopplerové zobrazení (hodnocení perfuse rány);
- tensiometrie (hodnocení pevnosti rány);
- histopatologie/cytologie (mikroskopické hodnocení tkání a kapalin z rány);
- biochemická vyšetření (HPLC/RIA) (hodnocení různých léků a biochemických složek v hojící se tkáni);
- elektrodiagnostika (hodnocení vztahů mezi hojením rány a inervací);
- scintigrafie (radionuklidové zobrazení tkání v ráně).
Při hojení ran/vředů má značný význam odstraňování tkáňové drti a čištění rány. Předpokládá se, že čištění rány a/nebo odstraňování tkáňové drti z ran/vředů jsou nutnými podmínkami
• · · ··· · · • · · · • · • · • * • 0 pro proces hojení a dále že pokud jsou aplikována činidla podporující hojení, tak musí být aplikována na čerstvou a vitální tkáň a nikoliv na odumřelou tkáň nebo na kontaminovanou tkáň. Odstraňování nekrotické tkáně může být provedeno alespoň čtyřmi různými způsoby: (i) odstraňováním nekrotické tkáně ostrým nástrojem; (ii) mechanickým odstraňování; (iii) enzymatickým odstraňování; a (iv) autolytickým odstraňováním odumřelé tkáně.
Proto se předkládaný vynález týká také použití způsobu pro odstraňování nekrotické tkáně v kombinaci s použitím matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny pro hojení nebo prevenci ran. Taková kombinovaná terapie obsahuje následující dva kroky: (i) způsob odstranění nekrotické tkáně; (ii) aplikaci matrice zubní skloviny, derivátu matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny; a tyto dva kroky mohou být prováděny tolikrát, kolikrát je potřeba a v jakémkoliv pořadí.
Jakmile je nekrotická tkáň odstraněna z rány, mohou být matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny aplikovány buď přímo na nebo do rány, nebo mohou být aplikovány ve formě jakéhokoliv vhodného farmaceutického prostředku, jako je například suchý nebo vlhký obvaz, do kterého byly zapracovány matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny. Matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny mohou být samozřejmě aplikovány při čištění rány.
Jak bude uvedeno dále, matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny
mohou být použity jako takové nebo mohou být použity ve vhodném přípravku nebo ve farmaceutickém prostředku.
Snížení rizika infekce
V dalším aspektu předkládaného vynálezu jsou matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny použity jako terapeutická nebo profylaktické činidla mající antimikrobiální efekt. Matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny vykazují účinek snižující riziko infekce.
V těchto souvislostech označuje termín snížení rizika infekce léčebný nebo preventivní účinek matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny na infekci tkáně u jedince tehdy, když je jedinec nebo tkáň léčen matricí zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny.
Termín infekce označuje invazi a množení mikroorganismů v tělesných tkáních nebo akumulaci mikroorganismů v tkáních, které může být klinicky neznatelné nebo které může vést k lokálnímu poškození buněk v důsledku kompetitivního metabolismu, působení enzymů, toxinů, intracelulární replikace nebo reakce antigen-protilátka.
V předkládaném vynálezu může být infekce, která je léčena nebo které má být zabráněno, způsobena mikroorganismy. Mezi mikroorganismy významné v souvislosti s předkládaným vynálezem patří bakterie, viry, kvasinky, plísně, protozoa a prvoci.
• ·
V této souvislosti znamená výraz anti-bakteriální účinek to, že růst bakterií je potlačen nebo to, že bakterie jsou destruovány. Termín není omezen na určité bakterie, ale týká se bakterií obecně. Nicméně, vynález je zaměřen na: (i) patogenní bakterie, které vyvolávají onemocnění u savců včetně lidí; a/nebo (ii) na bakterie, které jsou normálně přítomny v těle savců a které mohou způsobit onemocnění za určitých podmínek.
V souladu s tím se předkládaný vynález týká použití aktivní substance zubní skloviny pro prevenci nebo léčbu bakteriální infekce na povrchu těla jako je například kůže, sliznice nebo povrch nehtu nebo zubu.
Obecný a konkrétní popis bakteriálních infekcí, které mohou být léčeny
Matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny mohou být použity pro léčbu infekcí způsobených bakteriemi současně s nebo bez antimikrobiálních činidel. Mezi Gram-negativní bakterie, které mohou být léčeny aktivní substancí zubní skloviny, patří koky, jako je Neisseriae (například N. meningitis, N. gonorrhoeae) a Acinetobacter, nebo tyčky, jako jsou Bacteroides (například B.fragilis), Bordetella (například B.pertussis), Bručela (například B.melitentis, B.abortus Bang, B.suis),
Campylobacter (například C.jejuni, C.coli, C.fetus),
Citrobacter, Enterobacter, Escherichia (například E. coli), Haemophilus (například H.influenzae, H .parainfluenzae), Klebsiella (například K.pneumoniae), Leginella (například L.pneumophila), Pasteurella (P.yersinia, P.multocida), Próteus (například P.mirabilis, P.vulgaris), Pseudomonas (například P.aeruginosa, P.mallei, P.pseudomallei) , Salmonella (například
· i7 : :
• ·
S. enteritidis, S.infantis, S.dublin, S.typhi, S.paratyphí,
S.schottmulleri, S.cholerasuis, S.typhimurium nebo jakákoliv z 2500 dalších serotypů), Serratia (například S.marcences,
S.liquifaciens), Shigella (například S.sonnei, S.flexneri,
S.dysenteriae, S.boydii), Vibrio (například V.cholerae, V.el tor) a Yersinia (například Y.enterocolitica,
Y.pseudotuberculosis, Y.pestis). Mezi Gram-pozitivní bakterie, které mohou být léčeny aktivní substancí zubní skloviny, patří koky, jako je Streptococcus (například S.pneumoniae,
S.viridans, S.faecalis, S.pyogenes), Staphylococcus (napříkad S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus, S.albus) a tyčky, jako jsou Actinomyces (například A.israelli), Bacillus (například B.cereus, B.subtilis, B.anthracis), Clostridium (například C.botulinum, C.tetani, C.perfringens, C.difficile), Corynebacterium (například C.diphtheriae), Listeria a Providencia. Mezi další bakterie způsobující infekce patří Propionobacterium acne a Pityosporon ovále.
Matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny mohou být použity pro léčbu infekcí způsobených spirochetami, jak je například Borrelia, Leptospira, Treponema nebo Pseudomonas.
Antimikrobiální činidlo, které může být použito v kombinaci s matricí zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny, může být takové antimikrobiální činidlo, které působí inhibici syntézy buněčné stěny, jako jsou β-laktamová antibiotika a vankomycin, výhodně peniciliny, jako je amdinocillin, ampicillin, amoxicillin, azlocilin, bacampicilin, benzathin-penicillin G, carbencillin, cloxacillin, cyclacillin, dicloxacillin, methicillin, mezlocillin, nafcillin, oxacillin, penicillin G, penicillin V, piperacillin a ticarcillin; cefalosporiny, jako jsou cefalosporiny první generace, kam patří cefadroxil, cefazolin, cefalexin, cefalotin, cefapirin a cefradin; druhé generace, kam patří cefaclor, cefamandol, cefonicid, ceforanidin, cefoxitin a cefuroxim; nebo cefalosporiny třetí generace, jako je cefoperazon, cefotaxim, cefotetan, ceftazidim, ceftizoxim, ceftriaxn a moxalaktam; karbapenemy jako je imipenem; nebo monobaktamy jako je aztreonam.
Dále mohou být použita antimikrobiální činidla, jejichž mechanismus účinku spočívá v inhibici syntézy proteinů, jako je například chloramfenikol; tetracykliny, jako je například demeclocyklin, doxycyklin, methacyklin, minocyklin a oxytetracyklin; aminoglykosidy, jako je například amikacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, netilmicin, paromomycin, spektinomycin, streptomycin a tobramycin; polymyxiny jako je kolistin, kolistimathat a polymyxin B, a erythromyciny a linkomyciny; a dále antimikrobiální činidla inhibující syntézu nukleových kyselin, jako jsou sulfonamidy, například sulfacytin, sulfadiazin, sulfisoxazol, sulfamethoxazol, sulfamethizol a sulfapyridin; trimethoprim, chinolony, novobiocin, pyrimethamin a rifampin.
Ve specifickém provedení vynálezu je infekce přítomná v dutině ústní a může se jednat o bakteriální infekci.
Mezi příklady bakterií v dutině ústní, které mají být zničeny, patří například:
- bakterie způsobující zubní kaz, například Streptococcus mutans, Lactobacillus spp.;
- bakterie způsobující onemocnění periodontu, jako je například Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter (Fusobacteria, Staphylococci), B.forsythus;
- bakterie způsobující alveolitis, jako je například
Staphylococcus, Actinomyces a Bacillus;
- bakterie způsobující periapikální léze, jako jsou například Spirochety a všechny bakterie uvedené výše.
Protizánětlivé účinky
Předkládaný vynález se také týká použití matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny jako terapeutických nebo profylaktických činidel majících protizánětlivé účinky.
Různé léky se používají pro potlačování zánětů, včetně adrenokortikosteroidů, velké skupiny činidel označované jako nesteroidní protizánětlivé léky nebo NSAID, a léků typu imunosupresivních činidel. Adrenokortikosteroidy, zejména glukokortikoidy, mají výrazné protizánětlivé účinky při použití ve farmakologických dávkách. Specificky inhibují časnou vaskulární fázi zánětlivého procesu tím, že snižují cévní permeabilitu a tak snižují migraci granulocytů. Glukokortikoidy také interferují s pozdními zánětlivými a reparativními procesy tím, že inhibují proliferaci mesenchymálních buněk a produkci extracelulárních makromolekul, včetně proteoglykanů a kolagenu. V pokusech bylo prokázáno, že glukokortikoidy inhibují, například, funkce makrofágů, produkci protilátek, buněčnou imunitu a snad uvolňování lysosomálních enzymů.
Závažnost tkáňového poškození může záviset na reakci antigen/protilátka v organismu, stejně jako na stupni zadržování zánětlivých produktů v místě poranění. Lokální akumulace mediátorů zánětu akceleruje tento proces. Ve většině případů je tento děj pomalý, s imunoinfiltrací tkáně a tvorbou granulační tkáně, která obsahuje zánětlivé buňky.
Termín protizánětlivý účinek, jak je zde použit, označuje působení proti zánětu nebo potlačování zánětu.
Obecný a podrobný popis typů zánětlivých stavů, které mohou být léčeny
Zánětlivý stav, který může být léčen způsobem podle předkládaného vynálezu, může být jakýkoliv zánětlivý stav v jakékoliv části těla nebo jakýkoliv zánětlivý stav v měkkých nebo tvrdých tkáních. V jednom provedení předkládaného vynálezu je zánětlivý stav přítomen v dutině ústní. Příklady onemocnění v dutině ústní jsou alveolitis, cheilitis, kostní nekrosa (potraumatická), fraktury.
V jiném provedení předkládaného vynálezu je zánět přítomen v místě odběru kostního štěpu. Ve třetím provedení předkládaného vynálezu je zánět přítomen v místě kloubní dutiny. Příklady takových zánětlivých stavů jsou revmatoidní artritida a příbuzná onemocnění.
Antibakteriální versus protizánětlivá aktivita
Oproti mnoha v současnosti používaným antibiotikům nenarušují proteiny matrice zubní skloviny hojení rány a rychlejší hojení rány neumožňuje vývoj chronických nebo dlouhodobých zánětlivých procesů. Dále, reorganizace správných tkání, jak je popsána po aplikaci derivátů matrice zubní skloviny na periodontální defekty, je zřetelně zlepšena při rychlém hojení rány bez přítomnosti bakterií či zánětlivých reakcí.
Aplikace matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny vede k rychlejšímu hojení ran po chirurgických incisích, pravděpodobně v důsledku vytvoření povrchu, který při kontaktu s bakteriemi inhibuje jejich růst, ale který zároveň zesiluje migraci fibroblastů a syntézu kolagenu. Když je zánětlivá fáze zkrácena, tak jsou typické příznaky jako je zahřátí oblasti, zarudnutí, otok a bolest méně výrazné.
Matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a proteiny matrice zubní skloviny
Matrice zubní skloviny je prekursorem zubní skloviny a může být získána z jakéhokoliv relevantního přírodního zdroje, t.j. od savců, u kterých probíhá vývoj zubů. Vhodným zdrojem jsou vyvíjející se zuby od jatečních zvířat, jako jsou telata, selata nebo jehňata. Jiným zdrojem je například rybí kůže.
Matrice zubní skloviny může být připravena z vyvíjejících se zubů způsobem popsaným dříve (EP-B-0337967 a EP-B-0263086). Matrice zubní skloviny je seškrabána a jsou připraveny deriváty matrice zubní skloviny, například pomocí extrakce s vodným roztokem jako pufrem, ředěnou kyselinou nebo zásadou nebo směsí vody/rozpouštědla, po které následuje rozdělení podle velikosti, odsolení nebo jiný stupeň přečištění a volitelně lyofilizace. Enzymy mohou být inaktivovány tepelným zpracováním nebo rozpouštědly a v tomto případě mohou být deriváty skladovány v kapalině bez lyofilizace.
V předkládaném vynálezu jsou deriváty matrice zubní skloviny takové deriváty matrice zubní skloviny, které obsahují jeden nebo více proteinů matrice zubní skloviny nebo φφ » φ φ <
» Φ Φ 4 φ φ části takových proteinů, které jsou produkovány za přirozených podmínek alternativním sestřihem a nebo zpracováním, nebo enzymatickým nebo chemickým štěpením přirozených proteinů, nebo syntézou polypeptidů in vitro nebo in vivo (rekombinantními DNA metodami nebo kultivací diploidních buněk). Mezi deriváty matrice zubní skloviny patří také polypeptidy nebo proteiny odvozené z matrice zubní skloviny. Polypeptidy nebo proteiny mohou být navázány na vhodný biologicky degradovatelný nosič, jako jsou polyaminokyseliny nebo polysacharidy nebo jejich kombinace. Dále termín deriváty matrice zubní skloviny také zahrnuje syntetické analogické sloučeniny.
Proteiny jsou biologické makromolekuly tvořené aminokyselinovými zbytky vázanými navzájem peptidovými vazbami. Proteiny, jako lineární polymery aminokyselin, jsou také označovány jako polypeptidy. Typicky mají proteiny přibližně 50-800 aminokyselinových zbytků a proto mají molekulovou hmotnost v rozmezí od přibližně 6000 do přibližně několika stovek tisíc daltonů nebo více. Malé proteiny se označují jako peptidy nebo oligopeptidy.
Proteiny zubní skloviny jsou proteiny, které jsou přítomné v matrici zubní skloviny, t.j. v prekursoru zubní skloviny (Ten Cate: Oral Histology, 1994, Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1: 282-91), nebo proteiny, které mohou být získány štěpením takových proteinů. Obyčejně mají takové proteiny molekulovou hmotnost nižší než 120000 daltonů a patří mezi ně amelogeniny, non-amelogeniny, nonamelogeniny bohaté na prolin, ameliny (ameloblastin, sheathlin) a tufteliny.
• · ·♦ • ·
Příklady proteinů pro použití v předkládaném vynálezu zahrnují amelogeniny, non-amelogeniny bohaté na prolin, tuftelin, trsové proteiny, sérové proteiny, proteiny přítomné ve slinách, amelin, ameloblastin, sheatlin a jejich deriváty a směsi. Přípravek obsahující aktivní substanci zubní skloviny podle předkládaného vynálezu může obsahovat alespoň dvě z výše uvedených proteinových substancí. Komerční výrobek obsahující amelogeniny a pravděpodobně jiné proteiny matrice zubní skloviny je prodáván pod názvem EMDOGAIN® (Biora AB).
Obecně, hlavními proteiny matrice zubní skloviny jsou amelogeniny. Tyto proteiny tvoří přibližně 90% hmot./hmot. proteinů matrice. Zbývajících 10% hmot./hmot. tvoří nonamelogeniny bohaté na prolin, tuftelin, trsové proteiny, sérové proteiny a alespoň jeden protein přítomný ve slinách; nicméně mohou být přítomné také jiné proteiny, jako je například amelin (ameloblastin, sheathlin), které byly identifikovány v matrici zubní skloviny. Dále, různé proteiny mohou být syntetizovány a/nebo zpracovány v několika různých velikostech (t.j. s různými molekulovými hmotnostmi). Tak bylo zjištěno, že převládající proteiny matrice zubní skloviny, amelogeniny, mohou existovat v několika různých velikostech, které dohromady tvoří supramolekulové agregáty. Jsou to značně hydrofobní substance, které za fyziologických podmínek tvoří agregáty. Mohou být nosiči pro jiné proteiny nebo peptidy.
Jiné proteinové substance jsou také považovány za vhodné pro použití podle předkládaného vynálezu. Příklady takových proteinů jsou proteiny bohaté na prolin a polyprolin. Jinými příklady substancí vhodných pro použití podle předkládaného vynálezu jsou agregáty takových proteinů, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny, stejně jako metabolity matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní ·
0 ► · 0 · ► 0 · 0 skloviny a proteinů matrice zubní skloviny. Metabolity mohou být proteiny nebo krátké peptidy jakékoliv velikosti.
Jak bylo uvedeno výše, proteiny, polypeptidy nebo peptidy pro použití podle předkládaného vynálezu mají obvykle molekulovou hmotnost nej častěji přibližně do 120 kDa, například 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa nebo 60 kDa, jak je stanoveno SDS-PAGE elektroforesou.
Proteiny pro použití podle předkládaného vynálezu jsou obvykle připraveny ve formě prostředku, ve kterém je obsah proteinů aktivní substance zubní skloviny v rozmezí od přibližně 0,05% hmot./hmot. do 100% hmot./hmot., například přibližně 5-99% hmot./hmot., přibližně 15-90% hmot./hmot., přibližně 20-90% hmot./hmot., přibližně 30-90% hmot./hmot., přibližně 40-85% hmot./hmot., přibližně 50-80% hmot./hmot., přibližně 60-70% hmot./hmot., přibližně 70-90% hmot./hmot. nebo přibližně 80-90% hmot./hmot..
Přípravky aktivní substance zubní skloviny pro použití podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat směs aktivních substancí zubní skloviny různých molekulových hmotností.
Proteiny matrice zubní skloviny mohou být děleny na část s vysokou molekulovou hmotností a na část s nízkou molekulovou hmotností a bylo zjištěno, že význam pro léčbu periodontálních defektů (t.j. periodontálních ran) má dobře definovaná frakce proteinů matrice zubní skloviny. Tato frakce obsahuje proteiny extrahovatelné kyselinou octovou, které jsou souhrnně označovány jako amelogeniny a které tvoří část matrice zubní skloviny s nízkou molekulovou hmotností (viz EP-B-0337967 a EP-B-0263086).
• 9
99 99 99 • · · 9 9 99 9 ••9 9 9 99 9
9 999 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9· 99 99 ·9
Jak bylo uvedeno výše, část matrice zubní skloviny s nízkou molekulovou hmotností má výhodnou aktivitu pro indukci vazby mezi tvrdou tkání v periodontálních defektech. V předkládaném vynálezu nejsou však aktivní proteiny omezeny na Část matrice zubní skloviny s nízkou molekulovou hmotností. Mezi výhodné proteiny podle předkládaného vynálezu patří proteiny jako je amelogenin, amelin, tuftelin atd, s molekulovou hmotností (jak je měřena in vitro SDS-PAGE) nižší než přibližně 60000 daltonů, ale proteiny s molekulovou hmotností vyšší než 60000 daltonů mají také slibné vlastnosti jako činidla pro hojení ran, jako antibakteriální činidla a jako protizánětlivé činidla.
V souladu s tím se předpokládá, že aktivní substance zubní skloviny pro použití v předkládaném vynálezu má molekulovou hmotnost do přibližně 40000, například mezi 5000 a 25000.
Do rozsahu předkládaného vynálezu spadají také peptidy popsané ve WO 97/02730, t.j. peptidy, které obsahují alespoň jeden element sekvence vybraný ze skupiny skládající se z tetrapeptidů DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), VTKG (Val-Thr-Lys-Gly), EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) a DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu) a které dále obsahují aminokyselinovou sekvenci, ve které je 20 sousedících aminokyselin identických alespoň z 80% se sekvencí aminokyselin stejné délky vybrané ze skupiny skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 a sekvence obsahující aminokyseliny 1 až 103 SEQ ID NO: 1 a aminokyseliny 6 až 324 SEQ ID NO: 2.
Termín identita sekvence označuje identitu sekvence aminokyseliny v tom, že aminokyseliny mají v peptidu stejnou • 4
44 «4 4
4 4 4
4* 44
4 4 4
4 444
4 4 identitu a pozici. Mezera je považována za neidentické místo pro jednu nebo více aminokyselin.
Takové peptidy mohou obsahovat od 3 do 300 aminokyselin, například alespoň 20 aminokyselin, alespoň 30 aminokyselin, alespoň 60 aminokyselin, alespoň 90 aminokyselin, alespoň 120 aminokyselin, alespoň 150 aminokyselin nebo alespoň 200 aminokyselin.
Způsob pro izolaci proteinů matrice zubní skloviny obsahuje extrakci proteinů a odstranění vápníkových a fosfátových iontů ze solubilizovaného hydroxyapatitu za použití vhodné metody, jako je například gelová filtrace, dialýza nebo ultrafiltrace (viz například Janson, J-C. and Rydén, L. ((ed.), Protein Purification, VCH Publishers 1989, a Harris, ELV and Angal, S. Protein Purification Methods - A practical approach, IRL Press, Oxford 1990).
Typický lyofilizovaný proteinový prostředek obsahuje hlavně nebo výlučně až 70-90% amelanogeninů s molekulovou hmotností (MW) mezi 40000 a 5000 daltony a 10-30% prostředku tvoří menší peptidy, soli a residuální voda. Hlavní proteinové proužky mají 20 kDa, 12-14 kDa a přibližně 5 kDa.
Pomocí separování proteinů, například srážením, iontoměničovou chromatografií, preparativní elektroforesou, gelovou vylučovací chromatografií, chromatografií s reversní fází nebo afinitní chromatografií, mohou být přečištěny amelogeniny různé molekulové hmotnosti.
Mohou být připraveny různé kombinace amelogeninů různých molekulových hmotností, od převahy 20 kDa sloučenin pro agregování amelogeninů s různými molekulovými hmotnostmi od 40 • * ♦ · · * * · * * • · • · • · • *
do 5 kDa, do převahy 5 kDa sloučenin. Jiné proteiny matrice zubní skloviny, jako je amelin, tuftelín nebo proteolytické enzymy normálně přítomné v matrici zubní skloviny, mohou být přidány do prostředku a mohou být neseny amelogeninovými agregáty.
Alternativně mohou být deriváty nebo proteiny matrice zubní skloviny získány synteticky, za použití dobře v oboru známých technik, nebo za použití kultivovaných buněk nebo bakterií modifikovaných technikami rekombinantní DNA (viz například Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Fyzikálně-chemické vlastnosti matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny
Obecně jsou matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a proteiny matrice zubní skloviny hydrofobní substance, t.j. jsou špatně rozpustné ve vodě, zejména při vyšších teplotách. Obecně jsou tyto proteiny rozpustné při nefyziologických hodnotách pH a při nízkých teplotách, například 4-20 °C, zatímco při tělesné teplotě (35-37 °C) a neutrálním pH agregují a sráží se.
Matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a proteiny matrice zubní skloviny pro použití podle předkládaného vynálezu také zahrnují aktivní substanci zubní skloviny, kde alespoň část aktivní substance zubní skloviny je ve formě agregátů, nebo po aplikaci in vivo vytváří agregáty. Velikost částic v agregátech je od přibližně 20 nm do přibližně 1 μπι.
• ·
Předpokládá se, že rozpustnost matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny má význam pro profylaktickou a terapeutickou aktivitu substancí. Když je prostředek obsahující matrici zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny (které jsou společně označovány jako aktivní substance zubní skloviny) podán například lidem, tak se proteinové substance vysrážejí působením fyziologického pH. Tak se v místě aplikace vytvoří vrstva matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny a tato vrstva (která může být také molekulární vrstvou v těch případech, kdy se vytvoří agregáty) se obtížně odplavuje za fyziologických podmínek. Dále, z důvodu bioadhesivních vlastností substance (viz dále) se vysrážená vrstva pevně naváže na tkáň také v místě hranice mezi vysráženou vrstvou a tkání. Proteinová vrstva tak pokryje tkáň, na kterou byla aplikována matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny a aktivní substance zubní skloviny tak zůstávají v místě aplikace po dlouhou dobu, to znamená, že není nutné opakování aplikace aktivní substance zubní skloviny v krátkých intervalech. Dále, vrstva vytvořená in šitu se prakticky vyrovná neprodyšnému obvazu, to znamená, že chrání tkáň před působením okolních vlivů. V případě poraněné tkáně, infikované tkáně nebo zánětlivé tkáně chrání taková vrstva tkáň před další kontaminací mikroorganismy přítomnými v okolí. Dále, proteinová vrstva může vykazovat svůj účinek přímým kontaktem s tkání nebo s mikroorganismy přítomnými v tkáni nebo na tkáni.
Pro umožnění vzniku proteinové vrstvy v místě aplikace může být výhodné použití vhodných pufrovacích substancí ve farmaceutických nebo kosmetických prostředcích obsahujících
matrici zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny; takové pufrovací substance mohou bránit rozpouštění aktivní substance zubní skloviny v místě aplikace.
Bylo také zjištěno, že matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a proteiny matrice zubní skloviny mají bioadhesivní vlastnosti, t.j. že mají schopnost adherovat na kůži nebo na povrchy sliznic. Tyto vlastnosti jsou významné při terapeutické a/nebo profylaktické léčbě z následujících důvodů:
- profylaktické a/nebo terapeutické substance mohou být udržovány v místě aplikace po delší dobu, to znamená, že (i) může být snížena frekvence aplikací; (ii) lze dosáhnout kontrolovaného uvolňování aktivní substance; a/nebo (iii) zlepšuje se lokální léčba v místě aplikace;
- substance mohou být sami o sobě použitelné jako nosiče pro jiné profylakticky nebo terapeuticky aktivní substance, protože nosič obsahující matrici zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny může být připraven jako bioadhesivní nosič (t.j. nový bioadhesivní systém pro podání léčiv založený na bioadhesivních vlastnostech matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny.
Teorie mechanismu účinku
Matrice zubní skloviny je příkladem extracelulární proteinové matrice, která adheruje na minerální povrchy, stejně jako na proteinové povrchy. Při fyziologickém pH a teplotě tvoří proteiny nerozpustné supra-molekulární agregáty (Fincham et al., J. Struct. Biol., 1994, March-April, 112(2):103-9 a J.Struct. Biol. 1995, July-August, 115(1):5030
9 ·♦ 9 9
9), které jsou postupně degradovány proteolytickými enzymy (což probíhá jak in vivo, tak in vitro, pokud nebyly proteasy inaktivovány).
Nedávná pozorování týkající se toho, že matrice zubní skloviny je tvořena a přechodně přítomna během tvorby kořenů a kořenového cementu mohou vysvětlit to, jak může aplikace matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny podporovat regeneraci periodontální tkáně. Nicméně, zjištění, které je základem předkládaného vynálezu, že matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny mají také pozitivní efekt na hojení defektů měkkých tkání, jak jsou rány, je velmi překvapivé. Totéž platí pro pozorování anti-infekčního a protizánětlivého účinku.
U mnoha druhů jsou zjišťovány zbytky matrice zubní skloviny v nově mineralizovaných korunkách zubů při jejich prořezávání do dutiny ústní. Lze předpokládat, že nový zub je velmi citlivý na bakteriální infekci běžnými bakteriemi v dutině ústní a že proto musí mít během této iniciální fáze přirozenou ochranu.
Aplikace nerozpustné matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny s vhodnými antibakteriálními a/nebo protizánětlivými vlastnostmi na povrch ran zlepší a zrychlí hojení.
Jak bude uvedeno v příkladech, matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny nebo proteinové agregáty inhibují bakteriální růst kontaktní inhibici, zatímco buňky vystavené působení těchto • · · · · ·· · · ·· • · · · · · 0 · · · · ·
0 0 · 0 0 0 · ·· · • · · · 0 · ··· · · · · · substancí reagují na matrici zubní skloviny jako na normální prostředí, které potlačuje zánětlivé reakce.
Podle předkládaného vynálezu mohou být matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny použity pro kurativní účely, stejně jako pro preventivní účely. Dále, matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny mohou být použity spolu s jinými aktivními činidly, jako jsou například antibakteriální, protizánětlivá, antivirová, antimykotická činidla, nebo mohou být použity spolu s růstovými faktory, jako je například TGFp, PDGF, IGF, FGF, keratinocytový růstový faktor nebo jejich peptidové analogy (předpokládá se, že EGF podporuje hojení zvýšením migrace a dělení epitelových buněk; kromě toho zvyšuje EGF počet fibroblastů v ráně, což vede k vyšší produkci kolagenu). Enzymy, hlavně proteasy - buď přirozeně přítomné v matrici zubní skloviny nebo jejím přípravku nebo přidané - mohou být také použity v kombinaci s matricí zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny.
Aktivní substance zubní skloviny je obvykle připravena jako farmaceutický nebo kosmetický prostředek. Takový prostředek se může skládat z proteinového přípravku nebo může dále obsahovat farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelné přísady. Zejména výhodnými přísadami pro použití ve farmaceutických nebo kosmetických přípravcích jsou propylenglykolalginat nebo kyselina hyaluronová nebo jejich deriváty.
Farmaceutické a/nebo kosmetické prostředky
V následujícím textu jsou popsány příklady vhodných prostředků obsahujících aktivní substanci zubní skloviny. V
závislosti na použití aktivní substance zubní skloviny může být prostředek farmaceutický nebo kosmetický prostředek.
Termín farmaceutický prostředek v dalším popisu zahrnuje kosmetické prostředky, stejně jako prostředky náležící do takzvané šedé zóny mezi farmaceutickými prostředky a kosmetickými prostředky.
Pro podání jedincům (zvířatům nebo lidem) jsou matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny (také označované souhrnně jako aktivní substance zubní skloviny) a/nebo jejich přípravky výhodně připraveny jako farmaceutické prostředky obsahující aktivní substanci zubní skloviny a volitelně jednu nebo více farmaceuticky přijatelných přísad.
Prostředky mohou být ve formě pevných, semi-solidních nebo kapalných prostředků, jako jsou například:
- bioabsorbovatelné náplasti, drenáže, obvazy, hydrogelové obvazy, hydrokoloidní obvazy, filmy, pěny, potahy, bandáže, prostředky pro podání léčiv, implantáty;
- prášky, granule, granuláty, kapsle, agarosové nebo chitosanové korálky, tablety, pilulky, mikrokapsle, mikrosféry, nanočástice;
- spreje, aerosoly, inhalační prostředky;
- gely, hydrogely, pasty, masti, krémy, mýdla, čípky, vaginální prostředky, zubní pasty;
- roztoky, disperze, suspenze, emulze, směsi, pleťové vody, ústní vody, šampony, nálevy;
- kity obsahující například dva samostatné zásobníky, kde první zásobník obsahuje aktivní substanci zubní skloviny, volitelně ve směsi s jiným aktivním lékem a/nebo farmaceuticky přijatelnými přísadami a druhý zásobník obsahuje vhodné medium • · určené pro přidání do prvního zásobníku před použitím za zisku prostředku určeného pro okamžité použití;
- jiné vhodné formy, jako jsou implantáty nebo potahy implantátů nebo formy vhodné pro použití při implantacích nebo transplantacích.
V předkládaném vynálezu jsou nejdůležitější prostředky pro aplikaci na kůži nebo na sliznici. Prostředek obsahující aktivní substanci zubní skloviny může být podán jakýmkoliv vhodným způsobem, například lokálně (dermálně), bukálně, orálně, nasálně, intraaurikulárně, rektálně nebo vaginálně, nebo může být podán do tělní dutiny, jako je například kořen zubu nebo kořenový kanálek zubu. Dále může být prostředek připraven pro použití při chirurgických výkonech, například při incisích, kdy usnadní hojení vnitřních ran a poraněných měkkých tkání.
Jak bylo uvedeno výše, prostředky obsahující aktivní substanci zubní skloviny mohou být vhodné pro použití během chirurgických výkonů, například pro lokální aplikaci (například do dutiny ústní, ve formě gelů, filmů nebo suchých pelet, nebo mohou být použity ve formě roztoků pro proplachování nebo mohou být připraveny jako pasty nebo krémy pro aplikaci na tkáně nebo povrchy, kde brání bakteriální infekci. Pro operační výkony nebo implantace v oblasti kořenového kanálku zubu může být pro uzavření dutiny použita pasta.
Prostředky mohou být připraveny běžnými farmaceutickými technikami, viz například Remingtons Pharmaceutical Sciences a Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Swarbrick, J. and J.C.Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988.
* · • · · · · · · · < * · * 9 ♦· ♦ • · · · · · 9 9 • · 9«· · 9 · · 9 • · 9 9 9«· • 9., · · 9 9 «9
Jak bylo uvedeno výše, prostředky obsahující aktivní substanci zubní skloviny jsou určeny pro aplikaci na kůži nebo na sliznici. Další aplikace jsou také možné, například aplikace na umělý chrup, protesy, implantáty a aplikace do tělních dutin, jako je dutina ústní, nosní a poševní. Sliznici je výhodně sliznice duti ústní, nosní, sliznice tváře, ucha, rekta a vagíny. Dále mohou být prostředky aplikovány přímo na rány nebo na poranění měkkých tkání.
Další významnou aplikací je aplikace v dentálních/ odontologických oblastech. Příkladem je aplikace do periodontálních (dentálních) chobotů, na dásně nebo na poranění dásní nebo na jiné rány v dutině ústní, nebo při chirurgických výkonech v dutině ústní.
Dále se předpokládá, že díky antibakteriálním vlastnostem aktivní substance zubní skloviny může být výhodná její aplikace na zuby nebo na zubní kořeny pro prevenci kazu a/nebo plaku. Toto použití podporuje zjištění (Weinmann, J.P. et al., Hereditary disturbences of enarael formation and calcification, J. Amer. Dent. Ass. 32: 397-418, 1945; Sundell, S. Hereditary amelogenesis imperfecta. An epidemiologie, genetic and clinical study in Swedish child population, Swed. Dent. J. Suppl. 1986, 31: 1-38), že nedokonale vyvinuté zuby (amelogenesis imperfecta), které v důsledku toho obsahují značné množství amelogeninů, jsou značně resistentní na zubní kaz.
Farmaceutické prostředky obsahující aktivní substanci zubní skloviny slouží jako systém pro podání léčiv. Termín systém pro podání léčiv, jak je zde použit, označuje farmaceutický prostředek nebo dávkovou formu, který po podání uvolňuje • · β • · aktivní substance do těla člověka nebo zvířete. Termín systém pro podání léčiv proto zahrnuje jednoduché farmaceutické prostředky, jako jsou například krémy, masti, kapalné prostředky, prášky, tablety atd., stejně jako složitější prostředky, jako jsou spreje, náplasti, obvazy, bandáže a jiné prostředky.
Kromě aktivní substance zubní skloviny může farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu obsahovat farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelné přísady.
Farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelná přísada je substance, která je v podstatě neškodná pro jedince, kterému je prostředek podán. Takové přísady obvykle splňují požadavky dané národními zdravotnickými úřady. Oficiální lékopisy, jako je například British Pharmacopoeia, United States of America Pharmacopoeia a The European Pharmacopoeia, uvádějí standardy pro farmaceuticky přijatelné přísady.
To, jaká farmaceuticky přijatelná přísada je vhodná pro použití ve farmaceutickém prostředku, obecně závisí na vybrané dávkové formě pro použití na určitý typ ran. Dále jsou uvedeny příklady vhodných farmaceuticky přijatelných přísad pro různé prostředky podle předkládaného vynálezu.
Dále je uveden přehled farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu. Přehled je založen na způsobu podání prostředku. Nicméně, je třeba si uvědomit, že pokud může být farmaceuticky přijatelná přísada použita v různých dávkových formách nebo prostředcích, tak není použití farmaceuticky přijatelné přísady omezeno na určitou dávkovou formu nebo na určitou funkci přísady.
Volba farmaceuticky přijatelné přísady v prostředcích podle předkládaného vynálezu a její optimální koncentrace nemůže být obvykle stanovena předem a musí být určena podle experimentálního testování konečného prostředku. Nicméně, odborníci v oboru se mohou orientovat například podle Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.vydání, Mack Publishing Company, Easton, 1990.
Prostředky pro lokální podání
Pro aplikaci na kůži nebo na sliznice mohou obsahovat prostředky podle předkládaného vynálezu běžné netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče a přísady, včetně mikrosfér a liposomů.
Prostředky podle předkládaného vynálezu zahrnují všechny typy solidních, semi-solidních a kapalných prostředků. Zejména významnými prostředky jsou například pasty, masti, hydrofilní masti, krémy, gely, hydrogely, roztoky, emulze, suspenze, pleťové vody, masti, šampony, želé, mýdla, tyčinky, spreje, prášky, filmy, pěny, tampony, tampony (například kolagenové tampony), obvazy (například absorpční obvazy), drenáže, bandáže, náplasti a systémy pro transdermální podání.
Farmaceuticky přijatelnými přísadami mohou být rozpouštědla, pufrovací činidla, konzervační činidla, zvlhčovači činidla, chelační činidla, antioxidační činidla, stabilizační činidla, emulgační činidla, suspendační činidla, gelotvorná činidla, masťové základy, činidla zesilující průnik do tkání, parfemovací činidla a činidla chránící pokožku.
Příklady rozpouštědel jsou například voda, alkoholy, rostlinné nebo rybí oleje (například jedlé oleje jako je • 4 44
4 4 4 • 4 4 4
4 4 4
4 4 4
44
444 4
4 4 · * 4
4 4 4 4
4 44 4 4 4 mandlový olej, ricinový olej, kakaové máslo, kokosový olej, kukuřičný olej, bavlníkový olej, lněný olej, olivový olej, palmový olej, podzemnicový olej, makový olej, řepkový olej, sezamový olej, sojový olej, slunečnicový olej, čajovníkový olej), anorganické oleje, mastné oleje, kapalný parafin, polyethylenglykoly, glycerol, kapalné polyalkylsiloxany a jejich směsi.
Příklady pufrovacích činidel jsou kyselina citrónová, kyselina octová, kyselina vinná, kyselina mléčná, kyselina hydrogenfosforečná, diethylamin atd.
Příklady konzervačních činidel pro použití v prostředcích jsou parabeny, jako je methyl-, ethyl-, propyl-phydroxybenzoat, butylparaben, isobutylparaben, isopropylparaben, sorbat draselný, kyselina sorbová, kyselina benzoová, methylbenzoat, fenoxyethanol, bronopol, bronidox, MDM hydantoin, jodopropynylbutylkarbamat, EDTA, benzalkoniumchlorid a benzylalkohol, nebo směsi konzervačních činidel.
Příklady zvlhčovačích činidel jsou glycerin, propylenglykol, sorbitol, kyselina mléčná, močovina a jejich směsi.
Příklady chelačních činidel jsou sodná sůl EDTA a kyselina citrónová.
Příklady antioxidačních činidel jsou butylovaný hydroxyanisol (BHA), kyselina askorbová a její deriváty, tokoferol a jeho deriváty, cystein a jejich směsi.
φφ
» · φ· tt φφ ··
4 Φ · * « φ • Φ Φ Φ Φ Φ Φ
Φ φφφ φ φ φ · · • Φ ΦΦΦΦ
Φ· ΦΦ ΦΦ ΦΦ
Příklady emulgačních činidel jsou přirozené klovatiny, například arabská klovatina nebo tragant; přirozené fosfatidy, například sojový lecitin; deriváty sorbitanmonooleatu; lanolin; alkoholy ze dřeva; sorbitanové estery; monoglyceridy; mastné alkoholy; estery mastných kyselin (například triglyceridy mastných kyselin); a jejich směsi.
Příklady suspendačních činidel jsou například celulosy a deriváty celulosy jako je například karboxymethylcelulosa, hydroxyethylcelulosoa, hydroxypropylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, karagén, arabská klovatina, tragant, a jejich směsi.
Příklady gelových základů, činidel zvyšujících viskozitu nebo složek vychytávajících exsudát z rány jsou: kapalný parafin, polyethylen, mastné oleje, koloidní oxid křemičitý nebo hliník, zinková mýdla, glycerol, propylenglykol, tragant, karboxyvinylpolymery, silikáty hořečnato-hlinité, Carbopol®, hydrofilní polymery jako je například škrob nebo deriváty celulosy, například karboxymethylcelulosa, hydroxyethylcelulosa a jiné deriváty celulosy, hydrokoloidy bobtnající ve vodě, karagény, hyaluronaty (například hyaluronátový gel volitelně obsahující chlorid sodn) a algináty včetně propylenglykol alginátu.
Příklady masťtových základů jsou včelí vosk, parafin, cetanol, cetylpalmitat, rostlinné oleje, sorbitanové estery mastných kyselin (Spán) , polyethylenglykoly a produkty kondenzace mezi sorbitanovými estery mastných kyselin a ethylenoxidem, jako je například polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween).
99 • 9 9 9
9 9 9
9 9 9 9
9 9 9
99 ·· * 9 • 9
9
9
9
9
9
9 9 *9 9 9
Příklady hydrofobních nebo ve vodě emulsifikujících masťových základů jsou parafiny, rostlinné oleje, živočišné tuky, vosky, lanolin a kapalné polyalkylsiloxany.
Příklady hydrofilních masťových baží jsou solidní makrogoly (polyethylenglykoly).
Příklady masťových baží jsou triethanolaminová mýdla, sulfatované mastné alkoholy a polysorbaty.
Příklady práškových složek jsou: alginat, laktosa, prášek, který tvoří gel po aplikaci na ránu (absorbuje kapalinu/exsudát z rány). Prášek určený pro aplikaci na rozsáhlé otevřené rány musí být sterilní a přítomné částice musí být mikronizované.
Příklady dalších složek jsou polymery, jako je karmelosa, karmelosa sodná, hydroxypropylmethylcelulosa, hydroxyethylcelulosa, hydroxypropylcelulosa, pektin, xantanová klovatina, chlebovníková klovatina, arabská klovatina, želatina, karbomer, emulsifikátory jako je vitamín E, glycerylstearaty, cetanylglukosid, kolagen, karagén, hyaluronáty a algináty a kitosany.
Obvazy a/nebo bandáže jsou také významným systémem pro podání aktivní substance zubní skloviny. Pokud jsou obvazy použity jako dávkové formy, tak může být aktivní substance zubní skloviny smísena s jinými materiály/složkami před nebo během výroby obvazu, nebo může být aktivní substance zubní skloviny nějakým způsobem nanesena na obvaz, například ponořením obvazu do roztoku nebo disperze aktivní substance zubní skloviny nebo nastříkáním roztoku aktivní substance zubní skloviny na obvaz. Alternativně může být aktivní • 0 * · # 0 0 0· 0 · • · · · 4 4 9 4 0 0 0 « • 4 4 0000 0000 • 9 4 00 0 000 00 0 « · ··· 0 · 0 0000
0·· 00 00 00 «0 substance zubní skloviny aplikována na obvaz ve formě prášku. Obvazy mohou být absorpční obvazy pro aplikaci na exudující rány. Obvazy mohou být také ve formě hydrogelových obvazů (například ve formě zesítěných polymerů, jako je Intrasite®, který obsahuje karboxymethylcelulosu, propylenglykol nebo polysacharid, disacharid a proteiny) nebo ve formě oklusivního obvazu, jako jsou například alginátové, chitosanové, hydrofilní polyurethanové filmy, kolagenové obvazy, prášky, pěny, porosní obvazy, pěny (například polyurethanové nebo silikonové), hydrokoloidní obvazy (například karboxymethylcelulosové, CMC), obvazy na bázi kolagenu nebo kyseliny hyaluronové, nebo jejich kombinace.
Alginátové, chitosanové a hydrokoloidní obvazy absorbují po umístění na ránu exsudát. Při této absorpci vytvářejí vodný gel na povrchu rány a předpokládá se, že tento gel je výhodný pro hojení rány, protože udržuje vlhké prostředí v oblasti rány.
Také se předpokládá, že aktivní substance zubní skloviny může být obsažena v prostředku adherujícím ke tkáním, který dále obsahuje například fibrinogen a volitelně faktor XIII nebo jiný plasmatický koagulační faktor pro zabránění krvácení. Tkáňový adhesivní prostředek může být připraven buď jako předem připravená směs aktivní substance zubní skloviny, fibrinogenu a volitelně faktoru XIII, a trombin je přidán k této směsi bezprostředně před aplikací tohoto prostředku na ránu. Alternativně může být předem připravená směs aktivní substance zubní skloviny, fibrinogenu a volitelně faktoru XIII aplikována na ránu před aplikací trombinu. In šitu přeměňuje trombin fibrinogen na fibrin, což napodobuje přirozený proces koagulace, který probíhá při hojení rány. Přítomnost aktivní substance zubní skloviny v tkáňovém adhesivním prostředku může
Β ·
ΒΒ ·· ΒΒ ΒΒ
ΒΒΒ Β ΒΒ·« ΒΒΒΒ ΒΒΒΒ Β ΒΒΒΒΒΒ ΒΒ Β • · Β Β ΒΒ Β
Β· ΒΒ ΒΒ ·Β urychlit hojení rány, jak bylo popsáno výše. Komerční výrobek vhodný pro obsažení aktivní substance zubní skloviny je Tisseel®, dvousložkový fibrinový těsnící materiál vyráběný Immuno, AG, Viena, Austria.
V zubní pastě nebo v ústní vodě nebo v jiném prostředku pro aplikaci na chrup nebo na kořeny zubů může být aktivní substance zubní skloviny přítomná buď v rozpuštěném stavu ve vehikulu s mírně kyselým pH, nebo ve formě disperze ve vehikulu s neutrálním pH. Předpokládá se, že použití aktivní substance zubní skloviny může vytvořit ochrannou vrstvu na povrchu zubu, což brání vazbě bakterií způsobujících zubní kaz (viz příklad 4). V takových prostředcích pro péči o chrup může být aktivní substance zubní skloviny přítomná spolu s jednou nebo více sloučeninami, které mají preventivní účinek na zubní kaz, obvykle s fluorem nebo jiný stopovým prvkem jako je vanad nebo molybden. Při neutrálním pH se předpokládá vazba stopového prvku (například iontová vazba) na aktivní substanci zubní skloviny, ze které je tento prvek mající účinnost proti zubnímu kazu uvolňován při rozpouštění aktivní substance zubní skloviny při pH přibližně 5,5 nebo nižším, které je způsobeno například produkcí kyselin bakteriemi způsobujícími zubní kaz.
Prostředky pro lokální podání uvedené výše jsou nejvhodnější pro aplikaci přímo na ránu a jsou také vhodné pro aplikaci nebo zavedení do různých tělních otvorů, například do uretry, rekta, pochvy, ucha, nosu nebo úst. Prostředek může být aplikován přímo na léčenou oblast, například na sliznici, nebo může být aplikován jakýmkoliv vhodným způsobem podání.
Pro lokální podání jsou významné ty prostředky, které mají thixotropní vlastnosti, t.j. jejichž viskozita je ovlivněna například protřepáním nebo promísením tak, že v době podání • 4
4 4 • 4 • 4
4
4 • 4
4
4
4 • 4 4
4 4
4 4
4
4*
4
444 · 4
4
4· může být viskozita snížena a po aplikaci se viskozita zvyšuje, takže prostředek zůstává v místě aplikace.
Prostředky pro orální použití nebo pro aplikaci na sliznici nebo na kůži
Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny také ve formě suspenzí, emulsí nebo disperzí.
Takové prostředky obsahují aktivní substanci zubní skloviny ve směsi s disperzním nebo smáčivým činidlem, suspendačním činidlem a/nebo s jedním nebo více konzervačními činidly a jinými farmaceuticky přijatelnými přísadami. Takové prostředky mohou být vhodné pro dopravení aktivní substance zubní skloviny na například intaktní nebo poraněnou sliznici, jako je orální, bukální, nasální, rektální nebo vaginální sliznice, nebo pro dodání aktivní substance na intaktní nebo poraněnou kůži nebo na rány.
Vhodnými disperzními nebo smáčivými činidly jsou například přirozené fosfatidy, jako je lecitin nebo sojový lecitin; produkty kondenzace mezi ethylenoxidem a například mastnými kyselinami, alifatické alkoholy s dlouhým řetězcem, nebo částečné estery mastných kyselin a anhydrid hexitolu, jako je například polyoxyethylenstearat, polyoxyethylensorbitolmonooleat, polyoxyethylensorbitanmonooleat atd.
Vhodnými suspendačními činidly jsou, například, přirozené klovatiny, jako je například arabská klovatina, xanthanová klovatina, tragant; celulosy, jako je například karboxymethylcelulosa sodná, mikrokrystalická celulosa (například Avicel® RC 591, methylcelulosa); algináty a chitosany, jako je například alginát sodný atd.
Příklady konzervačních činidel vhodných pro použití v prostředcích podle předkládaného vynálezu jsou stejné, jako byly konzervační činidla uvedená výše.
Prostředky pro použití podle předkládaného vynálezu mohou být také podány orálně. Orální prostředky mohou být ve formě částicových prostředků nebo ve formě solidních, semi-solidních nebo kapalných dávkových forem.
Mezi prostředky pro orální podání patří například prášky, granule, granuláty, parfémový prášek, tablety, kapsle, šumivé tablety, žvýkací prostředky, medicínské oplatky, tablety s okamžitým uvolňováním a tablety s modifikovaným uvolňováním, stejně jako kapalné nebo tekuté prostředky jako jsou roztoky, suspenze, emulze, disperze a směsi. Dále mohou být prostředky ve formě prášků, dispergovatelných prášků nebo granulí vhodných pro přípravu vodné suspenze po přidání kapalného media, jako je například vodné medium.
Pevné dávkové formy pro orální (nebo pro lokální) použití podle předkládaného vynálezu obvykle obsahují aktivní substanci zubní skloviny a jakékoliv další aktivní substance, volitelně ve směsi s jednou nebo více farmaceuticky přijatelnými přísadami. Těmito přísadami mohou být, například:
- inertní ředidla nebo plniva, jako je sacharosa, sorbitol, cukr, mannitol, mikrokrystalická celulosa, škroby včetně bramborového škrobu, uhličitan vápenatý, chlorid sodný, laktosa, fosforečnan vápenatý, síran vápenatý nebo fosforečnan sodný;
- činidla usnadňující granulování a činidla podporující rozpadavost, jako jsou například deriváty celulosy, včetně mikrokrystalické celulosy, škroby, včetně bramborového škrobu,
• · · 4 · 4 4 .4·· < » • ·
4
4 kroskarmelosa sodná, algináty nebo kyselina alginová a chitosany;
- pojivá, jako je například sacharosa, glukosa, sorbitol, arabská klovatina, kyselina alginová, alginat sodný, želatina, škrob, předem želatinizovaný škrob, mikrokrystalická celulosasilikat hořečnato-hlinitý, karboxymethylcelulosa sodná, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, ethylcelulosa, polyvinylpyrrolidon, polyvinylacetat nebo polyethylenglykol; a chitosany;
- kluzná činidla, jako jsou kluzná činidla a antiadhesivní činidla, například stearan hořečnatý, stearan zinečnatý, kyselina stearová, křemičitany, hydrogenované rostlinné oleje nebo talek.
Dalšími farmaceuticky přijatelnými přísadami mohou být barviva, chuťová korigens, změkčovací činidla, zvlhčovači činidla, pufrovací činidla atd.
V případech, že je farmaceutický prostředek ve formě pevné dávkové formy v jednotkových dávkách (například tabletách nebo kapslích), tak může být jednotková dávka opatřena potahem, jak jsou například popsány dále.
V případě, že je prostředek ve formě tablety, kapsle nebo prostředku tvořeného více jednotkami, tak mohou být prostředek nebo jednotlivé jednotky nebo tablety nebo kapsle obsahující jednotlivé jednotky potaženy například cukerným potahem, filmem (například na bázi hydroxypropylmethylcelulosy, methylcelulosy, methylhydroxyethylcelulosy, hydroxypropylcelulosy, karboxymethylcelulosy, akrylátových kopolymerů (Eudragit), polyethylenglykolů a/nebo polyvinylpyrrolidonu) nebo enterálním potahem (například na bázi kopolymerů kyseliny methakrylové (Eudragit), ·· 4 • · ·· • 4 4 • * 4 • 4 ' 4
444
44
4 4 · • 4 4 4
4 444
4 44
44
4 4 4
4 4 4
4 4 4
4 4 4
4 44 celulosaacetatftalatu, hydroxypropylmethylcelulosaacetatsukcinatu, polyvinylacetatftalatu, šelaku a/nebo ethylcelulosy). Dále mohou být použity materiály prodlužující uvolňování, jako je například glycerylmonostearat či glyceryldistearat.
Rektální a/nebo vaginální prostředky
Pro aplikaci na rektální nebo vaginální sliznici patří mezi vhodné prostředky podle předkládaného vynálezu čípky (typu emulse nebo suspenze), nálevy a rektální želatinové kapsle (roztoky nebo suspenze). Vhodnými farmaceuticky přijatelnými čípkovými bázemi jsou kakaové máslo, esterifikované mastné kyseliny, glycerinovaná želatina a různé baze rozpustné nebo dispergovatelné ve vodě, jako jsou polyethylenglykoly a polyoxyethylen-sorbitanové estery mastných kyselin. Mohou být použita různá pomocná činidla, jako jsou například činidla zvyšující vstřebávání nebo surfaktanty.
Nasální prostředky
Pro aplikaci na nosní sliznici (stejně jako na sliznici dutiny ústní) jsou vhodnými prostředky podle předkládaného vynálezu spreje a aerosoly pro inhalaci. V typické nasálním prostředku je aktivní substance zubní skloviny přítomna ve formě částic volitelně dispergovaných ve vhodném vehikulu. Farmaceuticky přijatelná vehikula a přísady a volitelně další farmaceuticky přijatelné materiály, jako jsou ředidla, činidla zvyšující absorpci, chuťová korigens, konzervační činidla atd., jsou vybrána podle běžných pravidel přípravy farmaceutických prostředků.
*4 «
4
4
4
4
4 ♦ 4
4 4
4 4
4
4
44
4 4 4
4 4 4
4 4 4 4
4 4 4 .,.44 44
Dávkování matrice zubní skloviny, derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny
Ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu pro aplikaci na kůži nebo na sliznice je aktivní substance zubní skloviny obvykle přítomná v koncentraci v rozmezí od přibližně 0,01% do přibližně 99,9% hmot./hmot.Množství aplikovaného prostředku odpovídá množství celkového proteinu na cm2 poranění/kůže/tkáně, které je v rozmezí od přibližně 0,01 mg/cm do přibližně 20 mg/cm ,
2 například od přibližně 0,1 mg/cm do přibližně 15 mg/cm .
Množství aplikovaného prostředku závisí na koncentraci aktivní substance zubní skloviny v prostředku a na rychlosti uvolňování aktivní substance zubní skloviny z prostředku, ale obvykle je v rozmezí přibližně 15-20 mg/cm .
V případech, kdy je aktivní substance zubní skloviny podána ve formě kapalného prostředku, je koncentrace aktivní substance zubní skloviny v prostředku v rozmezí od přibližně 0,1 do přibližně 50 mg/ml. V některých případech jsou žádoucí vyšší koncentrace a mohou být získány koncentrace až 100 mg/ml.
Při aplikaci prostředku do dutiny ústní jsou použitelné následující dávky:
Experimentální defekty (u opic) v dutině ústní mají velikost obvykle přibližně 4 x 2 x 5-6 mm, což vyžaduje aplikaci 50 μΐ nebo přibližně 0,025 až 0,15 mg celkového proteinu/mm2 nebo přibližně 2,5-15 mg/cm2. Obvykle se aplikuje do 0,5, například 0,4, 0,3, 0,2 nebo 0,1 ml prostředku • ·· majícího koncentraci přibližně 1-40 mg/ml, například 5-30 mg/ml.
Defekty v dutině ústní u lidí způsobené onemocnění periodontu mají obvykle velikost 5-10 x 2-4 x 5-10 mm, což odpovídá přibližně 200 μΐ a obvykle je na jeden zub aplikováno přibližně 0,5-1 ml, například 0,2-0,3 ml, prostředku majícího koncentraci přibližně 1-40 mg celkového proteinu/ml, například 5-30 mg/ml. 0,2-0,3 mg/ml odpovídá přibližně 6 mg proteinu na 25-100 mm2 nebo přibližně 0,1 mg/mm2, pokud se výpočet provádí pouze pro povrch kořenu. Obvykle se aplikuje větší objem, aby se dosáhlo pokrytí všech povrchů. I aplikace ve více vrstvách vyžaduje pouze malou frakci výše uvedených množství.
Obvykle se do defektu v extrakční dutině (otvoru po extrakci zubu) aplikuje přibližně 0,1-0,5 ml, například přibližně 0,15-0,3 ml nebo přibližně 0,25-0,35 ml prostředku obsahujícího aktivní substanci zubní skloviny. Koncentrace aktivní substance zubní skloviny v prostředku je obvykle 1-40 mg celkového proteinu/ml, jako například 5-30 mg/ml. Když se
0,3-0,4 ml takového prostředku aplikuje při extrakci zubu 2 moudrosti, tak tento objem odpovídá přibližně 0,1 mg/cm (dutina se bere jako válec o průměru 5 mm a hloubce 20 mm).
Koncentrace aktivní substance zubní skloviny ve farmaceutickém prostředku závisí na typu substance zubní skloviny, její účinnosti, závažnosti léčeného onemocnění a na věku a celkovém stavu pacienta. Způsoby pro stanovení vhodných koncentrací aktivní substance zubní skloviny ve farmaceutických prostředcích jsou v oboru dobře známé a mohou být provedeny podle pravidel Guidelines for dood clinical practice (GCP) nebo Investigational New Drug Exemption (IND), jak jsou popsány například v International Standard
• ·
ISO/DIS 14155 Clinical Investigation of Medical Devices, 1994, a v ICH (International Comittee for Harmonisation): harmonised tripartitě guideline for good clinical practice, Brookwood Medical Publicatitons, Ltd., Surrey, UK, 1996. Odborník v oboru bude schopen za použití způsobů popsaných ve standardních učebnicích, návodech a pravidlech popsaných výše, a všeobecných znalostí oboru, vybrat přesné dávkování pro jakoukoliv aktivní substanci zubní skloviny a/nebo vybrané další substance a dávkové formy, za provedení pouze běžných pokusných postupů.
V dalších aspektech se předkládaný vynález týká způsobů pro (i) prevenci a/nebo léčbu ran; (ii) snížení infekcí; a (iii) prevenci a/nebo léčbu zánětů, kde uvedený způsob obsahuje podání účinného množství aktivní substance zubní skloviny takovému savci.
Je třeba si uvědomit, že podrobnosti týkající se použití aktivní substance zubní skloviny pro prevenci a/nebo terapii ran jsou stejné nebo analogické jako podrobnosti týkající se jiných aspektů použití (antibakteriálního a protizánětlivého použití), což znamená, že popis týkající se aktivní substance zubní skloviny, přípravků obsahujících aktivní substanci zubní skloviny, farmaceutických prostředků obsahujících aktivní substanci zubní skloviny, přípravy (i) aktivní substance zubní skloviny, (ii) přípravků obsahujících aktivní substanci zubní skloviny a (iii) farmaceutických prostředků obsahujících aktivní substanci zubní skloviny, stejně jako jejich zlepšených vlastností a použití, lze aplikovat na všechny aspekty předkládaného vynálezu.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 je graf ukazující syntézu DNA v lidských PLD buňkách stimulovaných EMD nebo nestimulovaných EMD;
Obr. 2 je graf ukazující produkci TGF-βΙ v lidských PLD buňkách stimulovaných EMD nebo nestimulovaných EMD;
Obr. 3 je schematické znázornění průtokové komůrky a počítačového systému, které byly použity v průtokových pokusech popsaných v příkladech 3 a 4;
Obr. 4, 5 a 6 jsou grafy ukazující výsledky tří samostatných pokusů ukazujících vazbu Actinomyces viscosus na skleněné plotny zpracované EMD a kyselinou octovou, v příslušném pořadí;
Obr. 7, 8 a 9 jsou grafy ukazující výsledky tří samostatných pokusů ukazujících vazbu Streptococcus mutans na skleněné plotny zpracované EMD a kyselinou octovou, v příslušném pořadí;
Obr. 10A je rentgenový snímek ukazující pooperační defekt po odstranění zubu moudrosti; a
Obr. 10B je rentgenový snímek ukazující regeneraci periodontálního ligamenta po léčbě EMD, jak je popsána v příkladu 12.
Příklady provedení vynálezu
Materiály a metody
Derivát matrice zubní skloviny, EMDOGAIN®, od BIORA AB, S205, Malmo, Sweden, obsahuje 30 mg lyofilizovaného proteinu « · matrice zubní skloviny (zkratka EMD) a 1 ml roztoku jako nosiče (propylenglykol-alginat), které jsou smíseny před aplikací, pkud nejsou protein a nosič testovány samostatně. Hmotnostní poměr mezi hlavními proteinovými píky ve 20, 14 a 5 kDa je 85/5/10, v příslušném pořadí. Tepelně zpracovaný EMD je EMD, který byl zahříván po dobu 3 hodin při přibližně 80 °C pro inaktivaci zbytkových proteas.
Amelogeninový protein (20 kDa) a amelogeninový peptid bohatý na tyrosin (TRAP) (5 kDa) byly izolovány z EMD za použití HPLC gelové vylučovací chromatografíe (TSK G-2000 SW uvedená do rovnováhy za použití 30% acetonitrilu v 0,9% NaCl) a byly přečištěny pomocí chromatografíe s reversní fází (ProRPC, HR 5/10, Pharmacia Upjohn, Sweden), za použití gradientu acetonitrilu. Separované proteiny/peptidy byly potom přidávány v různých množstvích do roztoku nosiče (EMDOOGAIN®) , pokud nebyly testovány samostatně.
Kyselina hyaluronová byla HMT-0028 (MW 990000) od Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan.
Bakteria a kvasinky byly všechny primárně izolovány od pacientů a byla klasifikovány podle metabolických a antigenních vlastností za použití standardních postupů. Druhy použitých bakterií a kvasinek jsou uvedeny v tabulce uvedené dále.
Sérový albumin (hovězí) a kolagen 1 typu (hovězí) byly oba získány od Sigma, S.Louis, USA.
Agarové plotny byly všechny Brain Hart Infusion agar od Difco doplněný lidskými erytrocyty (100 ml/litr agaru).
•· 9 44 ·· • · · · · · ..· • · · · · ·' · · · • · · · · · · 44 44 4 44 49
Příklad 1: Proliferace buněk a produkce TGF-βΙ v PDL buňkách ošetřených EMDOGAINEM®
Zásobní roztok EMD byl připraven rozpuštěním zkumavky (obsahující 30 mg EMD) ve 3 ml 0,1% Hac sterilizované filtrací. 60 μΐ EMD zásobního roztoku bylo přidáno k 6000 μΐ Dulbeccova modifikovaného Eaglova media obsahujícího 10% fetální telecí sérum a 1% roztoku penicilinu-streptomycinu.
300 μς směsi bylo přidáno do každé jamky 96-jamkových mikrotitračních ploten (NUNC A/S, Denmark, katal. č. 167008). 1000 buněk z lidského periodontálního ligamenta (PDL) (získaných ze zdravé lidské periodontální tkáně od jedinců po extrakci premolárů z ortodontických důvodů a kultivovaných způsobem popsaným v Somerman et al., J. Dental Res. 67: 66-70, 1988), se přidalo do každé jamky a provedla se inkubace při 37 °C, 5% CO2 po dobu 5 dnů.
PDL buňky použité jako kontroly byly kultivovány v Dulbeccovu modifikovaném Eaglova mediu způsobem popsaným výše, ale za nepřítomnosti EMD.
Po inkubaci byly buňky testovány imunotestem na proliferaci buněk, který měří inkorporací 5-brom-21-deoxyuridinu (BrdU), podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim, katal. č. 1647 229) V tomto testu je BrdU inkorporován místo thymidinu do DNA rostoucích buněk. Inkorporace BrdU je detekována ELISA testem a množství BrdU měřené v testu ukazuje na rychlost syntézy DNA a tím na rychlost proliferace PDL buněk.
Výsledky uvedené na obr. 1 ukazují, že PDL buňky kultivované za přítomnosti EMD mají významně vyšší rychlost proliferace než PDL buňky kultivované za nepřítomnosti EMD.
100 μΐ buněčného supernatantu z mikrotitrační plotny bylo přidáno k 20 μΐ IN HCl a byla provedena 10-minutová inkubace při teplotě okolí. Inkubační směs byla neutralizována 20 μΐ IN NaOH/0,5 M HEPES. 100 μΐ této směsi bylo přidáno ke 400 μΐ ředícího pufru. 200 μΐ tohoto roztoku byla analyzováno ELISA za použití Quantikines™ kitu (katalogové č. DB100) od R&D Systems, UK, podle návodu výrobce.
Výsledky jsou uvedeny na obr. 2 a ukazují výrazné zvýšení produkce TGF-βΐ v PDL buňkách inkubovaných s EMD ve srovnání s PDL buňkami neinkubovanými s EMD.
Příklad 2: Testování růstu mikroorganismů za přítomnosti derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny
Cílem tohoto příkladu je prokázání inhibičních účinků derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na růst mikrobů in vitro.
Proteiny použité v tomto příkladu byly rozpuštěny ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) s pH upraveným na 5,5 pomocí kyseliny octové. Použité bakterie byly suspendovány v PBS, pH 6,8, v konečné koncentraci mající Οϋεοο = 0,4.
μΐ EMDOGAIN® (30 mg EMD v 1 ml PGA) a 50 μΐ EMD, tepelně zpracovaného EMD, EMD frakcí A, B, C a H (všechny obsahující 10 mg proteinu na ml PBS pufru) bylo naneseno na agarovou plotnu a nechalo se uschnout na vrchu plotny (průměr 9 cm, standardní agar pro stanovení resistence s přidanými činidly podle potřeb jednotlivých bakterií). Potom byla přidána • ·
homogenní suspenze bakterií (1 ml, OD280 = 0,5) rozetřením suspenze na horní ploše agarových ploten a plotny byly inkubovány při 35 °C po dobu 3 dnů (aerobní kultury) nebo 14 dnů (anaerobní kultury) v atmosféře obohacené CO2 nebo za aerobních podmínek, podle požadavků jednotlivých mikroorganismů. Všechny kultury byly kontrolovány denně. Kolagen typu 1 a sérový albumin (oba hovězího původu) byly testovány za stejných podmínek jako kontroly. Neředěný propylenglykolalginat (PGA-EMD nosič), PBS pufr a kyselina hyaluronová (HA - alternativní nosič pro EMD) byly aplikovány jako negativní kontroly.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Pouze deriváty matrice zubní skloviny nebo proteiny nebo deriváty matrice zubní skloviny inhibovaly růst některých mikroorganismů. Nebyly přítomné žádné známky difusních zón okolo proteinu, což ukazuje na to, že aplikované EMD proteiny agregovaly na povrchu agaru a že byl inhibován růst pouze těch mikroorganismů, které byly v přímém kontaktu s proteiny. Když byly odebrány vzorky ze zón inhibice a tyto vzorky byly kultivovány v kapalném mediu (LB medium s doplňkovými složkami), tak byly získány monokultury původních mikroorganismů, což ukazuje, že aktivní proteiny nejsou bakteriocidní. Všechny kontroly byly v testu negativní, což ukazuje na to, že žádný nespecifický mechanismus neovlivnil výsledky.
• φ
Tabulka 1: Růst (+/-) na horní ploše testované substance • φφ ' · φ-φ
EMD frakce A: hlavně amelogenin o přibližně 26-20 kDa; EMD frakce B: proteiny o přibližně 17-13 kDa;
EMD frakce C: peptidy o přibližně 10-5 kDa;
EMD frakce H: všechny proteiny v EMD s vyšší molekulovou hmotností než 27 kDa;
+ - normální růst mikroorganismů;
- úplná inhibice růstu mikroorganismů;
+/- - určitá inhibice růstu ve srovnání s negativními kontrolami.
Všechny výsledky uvedené v tabulce byly zaznamenány druhý den (pro aerobní kultury) nebo po pěti dnech (pro anaerobní kultury) inkubace.
• ·
Tyto výsledky ukazují, že EMD obsahuje proteiny nebo peptidy, které mohou po agregaci na povrchu inhibovat růst některých gram-negativních tyček a některých gram-pozitivních koků. Vzhledem k základním charakteristikám EMD proteinů (ref. jpc) a proto, že účinek není mikrobicidní, je možným vysvětlením pozorovaného účinku to, že proteinové agregáty vytváří nerozpustnou barieru, která separuje mikroorganismy od růstových substrátů.
Příklad 3: Vliv EMD na rychlost vazby Actinomyces viscosus in vitro
Úvod
Byl testován vliv EMD na počáteční vazbu Actinomyces viscosus, orálního organismu, který se hojně vyskytuje v zubním plaku, ale který není uváděn do souvislostí se závažnou periodontitidou. Ačkoliv může tento organismus tvořit agregáty s Porphyromonas gingivalis a tak může ovlivňovat kolonizaci povrchu kořenů potenciálními periodontálními patogeny, jsou Actinomyces spp. nacházeny v relativně hojném počtu ve zdravých subgingiválních lokalitách (tato zjištění odpovídají zjištěním uvedeným v Liljemark et al., Microb. Immunol. 8: 1993, str 5-15, kteří zjistili, že po léčbě periodontu se počty Actinomyces spp. značně zvýšili). Haffajee et al., J. Clin. Periodont. 24, 1997,, str. 767-776, zjistili z počtu mikroorganismů v subgingiválních plácích, že u jedinců s dobrou odpovědí na počáteční periodontální léčbu byly relativně hojně přítomné A. viscosus a T. denticola.
Materiály
Actinomyces viscosus byl získán od Dr. A.J. van Winkelhoff (Dept. of Oral Microbiology, ACTA). Emdogain® byl získán od BIORA (Malmo, Sweden). RBS detergenční činidlo bylo získáno od Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland).
Kultivace a odběr bakterií
A. viscosus byl naočkován z ploten s krevním agarem do vsádkové kultury v Schadlerově kapalném mediu a byla provedena kultivace po dobu 24 hodin při 37 °C. Tato kultura byla použita pro naočkování druhé kultury v Schadlerově bujónu, ve kterém byla kultivace umožněna po dobu 16 hodin. Buňky byly získány centrifugováním (5 min. při 6500 x g) a byly promyty dvakrát destilovanou vodou.Potom byly mikroorganismy zpracovány sonikací po dobu 20 sekund při 30 W (Vibra Cell model 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) pro rozrušení bakteriálních řetězců a agregátů. Sonikace byla přerušovaná za ochlazování lázně ledem a vodou. Buňky byly počítány za použití Burker-Turkerova počítače buněk. Nakonec byl A. viscosus suspendován v adhesním pufru (2 mM fosforečnan draselný, 50 mM chlorid draselný a 1 mM chlorid vápenatý, pH 6,8).
Potažení skleněných ploten
Skleněné plotny byly důkladně očištěny sonikací v 5% RBS detergenčním činidlu, byly důkladně vymyty vodou, byly propláchnuty methanolem a nakonec byly propláchnuty destilovanou vodou. Tímto postupem se získal vodní kontaktní úhel nula stupňů. EMD byl rozpuštěn v 0,01 M kyselině octové v koncentraci 7,5 mg/ml. Skleněné plotny byly rozděleny na dvě poloviny pomocí teflonové značky (DAKO A/S, Glostrup,
Denmark). Kyselina octová (0,01 M) byla aplikována na jednu
• · · · • · · · • · · · ·· stranu a 250 gg EMD na druhou stranu. Skleněné plotny byly sušeny vzduchem v komůrce po dobu 4-6 hodin.
Průtokový pokus
Průtoková komůrka a počítačový systém použité v tomto pokusu jsou schematicky znázorněny na obr. 3. Před každým pokusem byly všechny trubice a průtoková komůrka naplněny adhesním pufrem tak, aby systém neobsahoval žádné vzduchové bubliny. Potažené skleněné plotny tvořily dno průtokové komůrky. Průtok byl nastaven na 2,5 ml/min (což je srovnatelné s rychlostí toku slin u člověka). Bakteriální suspenze se nechala cirkulovat systémem po dobu přibližně 3-4 hodin a byl stanoven počet bakterií adherujících k substrátu. Byly provedeny tři nezávislé pokusy. Všechny pokusy byly provedeny s 3xl08 buňkami na 250 ml adhesního pufru. Během pokusu byly každých 10-15 minut prováděny snímky v 6 předem vybraných místech plotně potažené EMD a kontrolou. Výška kanálu paralelní průtokové komůrky byla 0,6 mm.
Analýza dat
Po spočítání adherujících bakterií ve všech snímcích byla data transformována na bakterie na čtvereční centimetr. Pro o
každý pokus byl konečný počet mikroorganismů na cm použit pro statistickou analýzu (Student t-test pro párová měření za použití n jako počtu pokusů).
Výsledky
Pokus 1 (obr. 4) ukázal postupné zvyšování počtu navázaných mikroorganismů, zejména během prvních 150 minut průtoku. Po této době dosáhl počet mikroorganismů navázaných na EMD plató ·· · ·* »· ·· ·· • ··· · ·♦ · « * * * • · · ··«« »«·· • · · ···.·»·»» · · · • · · · ♦ . · · · · · ·· ··· ·· ·.♦ · ··
2,0 x 106 bakterií na cm2, což je přibližně 4-krát více, než na části skleněné plotny zpracované kyselinou octovou.
Také v pokusu 2 (obr. 5) stimuloval EMD výrazně vazbu A.viscosus na substrát. Nicméně, na počátku pokusu byl tento efekt méně výrazný. Pravděpodobně to bylo způsobeno nižší hustotou mikroorganismů v průtokovém systému. Po dobu 90 minut se počet bakterií navázaných na EMD postupně zvyšoval vzhledem ke kontrole a po 3 hodinách dosáhl maxima 1,4 x 106 na cm2, což je 3-násobné zvýšení.
Třetí pokus (obr. 6) ukázal stimulaci adherence A.viscosus na EMD potah již po 5 minutách toku. EMD indukoval rychlé zvýšení počtu navázaných mikroorganismů během prvních 45 minut. Potom pokračovala adherence mikroorganismů progresivně.
Vazba na stranu zpracovanou kyselinou octovou měla podobný charakter, s menším počtem adherujících mikroorganismů. Po 200 minutách byla vazba na EMD potah dvakrát vyšší než na povrch zpracovaný kyselinou octovou.
Ve 3 pokusech dohromady byl rozdíl statisticky významný (p <
0,05).
Z výsledků se zdá, že EMD, použitý jako potah na skleněném povrchu, má významný stimulační efekt in vitro pro vazbu A.viscosus. Ačkoliv dosud není jasné, které mechanismy jsou odpovědná za tuto vyšší iniciální vazbu, předpokládá se, že organismy interagují s prolinovými zbytky, které jsou hojně přítomné v amelogeninové složce komerčně dostupné proteinové směsi. Bakteriální adhese je často určována specifickými interakcemi protein-peptid a lektin-uhlovodan. Je známo, že A.viscosus se může pomocí svých fimbrií 1. typu vázat na
proteiny bohaté na prolin, jako jsou slinné proteiny bohaté na prolin (PRP) a kolagen I. a III. typu.
Specifické interakce mezi EMD a některými mikroorganismy mohou mít významné následky pro složení biologického potahu v dutině ústní, protože mohou měnit ekologii plaků. Když může proběhnout ekologický posun ve prospěch organismů, které nejsou asociovány s onemocnění periodontu, tak může EMD zlepšit onemocnění periodontu pouze tímto mechanismem. Ten je samozřejmě odlišný od jiných výhodných účinků EMD.
Příklad 4: Vliv EMD na rychlost navázání Streptococcus mutans in vitro
Úvod
Existuje mnoho důkazů pro kausální úlohu organismů v plácích pro patogenesi onemocnění dutiny ústní, jako je periodontitis a zubní kaz. Současný model tvorby supragingiválního plaku předpokládá, že Streptococcus spp. jsou převládajícími organismy kolonizujícími povrch zubu. Tak se plaky vyvíjejí v důsledku růstu bakterií a další kolonizace jinými druhy bakterií. Tato kolonizace může probíhat vazbou bakterie-bakterie, nebo může být umožněna molekulami slin.
Růst plaku je také podpořen produkcí extracelulárních makromolekul. S. mutans je nyní považován za jeden z nejdůležitějších kmenů v biologickém potahu, protože je asociován se zubním kazem. Ačkoliv bylo prokázáno, že několik gram-pozitivních bakterií (t.j. S. mutans) způsobují ztrátu alveolární kosti u gnotobiotických zvířat, nejsou tyto mikroorganismy pravděpodobně hlavní příčinou vzniku periodontálních chobotů. Nicméně, potenciálně patogenní mikroorganismy musí být schopné jak překonání obraných • · · · · • · · *·· · · • ♦ · · ·· ··
9 9 9 9
9 9 9 9
mechanismů hostitele a imunitních mechanismů, tak zahájení destrukce tkáně hostitele.
Materiály
Strepotcoccus mutans NS byl získán od Dr. H. van der Mei (Materia Technica, University of Groningen). Emdogain® byl získán od BIORA (Malmo, Sweden). RBS detergenční činidlo bylo získáno od Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland).
Kultivace a odběr bakterií
S. mutans byl naočkován z ploten s krevním agarem do vsádkové kultury v Todd Hewittově bujónu a byla provedena kultivace po dobu 24 hodin při 37 °C. Tato kultura byla použita pro naočkování druhé kultury v Todd Hewittově bujónu, ve kterém byla kultivace umožněna po dobu 16 hodin. Buňky byly získány centrifugováním (5 min. při 6500 x g) a byly promyty dvakrát destilovanou vodou. Potom byly mikroorganismy zpracovány sonikací po dobu 20 sekund při 30 W (Vibra Cell model 375, Sonics and Materials lne., Danbury, CT, USA) pro rozrušení bakteriálních řetězců a agregátů. Sonikace byla přerušovaná za ochlazování lázně ledem a vodou. Buňky byly počítány za použití Burker-Turkerova počítače buněk. Nakonec byl S. mutans suspendován v adhesním pufru (2 mM fosforečnan draselný, 50 mM chlorid draselný a 1 mM chlorid vápenatý, pH 6,8).
Potažení skleněných ploten
Skleněné plotny byly důkladně očištěny sonikací v 5% RBS detergenčním činidlu, byly důkladně vymyty vodou, byly propláchnuty methanolem a nakonec byly propláchnuty
99
9 9 9
9 9 ♦
9 9 9
9 9 9
99 • 9 * 9
9
9 • 99 99 ·· 9999
9 9 9 9 ••99 999
9 9 9
9 9 9 99 destilovanou vodou. Tímto postupem se získal vodní kontaktní úhel nula stupňů. EMD byl rozpuštěn v 0,01 M kyselině octové v koncentraci 7,5 mg/ml. Skleněné plotny byly rozděleny na dvě poloviny pomocí teflonové značky (DAKO A/S, Glostrup,
Denmark). Kyselina octová (0,01 M) byla aplikována na jednu stranu a 250 pg EMD na druhou stranu. Skleněné plotny byly sušeny vzduchem v komůrce po dobu 4-6 hodin.
Průtokový pokus
Průtoková komůrka a počítačový systém použité v tomto pokusu jsou schematicky znázorněny na obr. 3. Před každým pokusem byly všechny trubice a průtoková komůrka naplněny adhesním pufrem tak, aby systém neobsahoval žádné vzduchové bubliny. Potažené skleněné plotny tvořily dno průtokové komůrky. Průtok byl nastaven na 2,5 ml/min (což je srovnatelné s rychlostí toku slin u člověka). Bakteriální suspenze se nechala cirkulovat systémem po dobu přibližně 3-4 hodin a byl stanoven počet bakterií adherujících k substrátu. Byly provedeny tři nezávislé pokusy. Všechny pokusy byly provedeny s 3xl08 buňkami na 250 ml adhesního pufru. Během pokusu byly každých 10-15 minut prováděny snímky v 6 předem vybraných místech plotně potažené EMD a kontrolou. Výška kanálu paralelní průtokové komůrky byla 0,6 mm.
Analýza dat
Po spočítání adherujících bakterií ve všech snímcích byla data transformována na bakterie na čtvereční centimetr. Pro každý pokus byl konečný počet mikroorganismů na cm2 použit pro statistickou analýzu (Student t-test pro párová měření za použití n jako počtu pokusů).
*· »· ·· ·· »··· ···· ···· ···· • · · ··· · · «· · • · · · · · ·
Výsledky
V každém ze tří pokusů vykazoval EDM inhibiční účinek na rychlost vazby S. mutans (obr. 7, 8, 9; p < 0,05). Inhibice měla hodnotu přibližně 40-70% ve srovnání s kontrolami zpracovanými kyselinou octovou.
V prvním pokusu (obr. 7) byla prokázána inhibice počtu
S.mutans navázaných na skleněný povrch potažený EMD již po 10 minutách toku. Po 3 hodinách byla vazba inhibována na asi 60% ve srovnání s kontrolou.
Ve druhém pokusu (obr. 8) začal EMP inhibovat vazbu S.mutans po 1,5 hodině toku. Počet S.mutans adherujících na EMD dosáhl plato 0,5 milionu na cm2 přibližně po 40 minutách toku. Po 3,5 hodinách byly počty na úrovni 25% ve srovnání s kontrolou.
Ve třetím pokusu (obr. 9) byla prokázána inhibice vazby S.mutans EMD již od zahájení toku. Stejně jako v příkladu 1 dosáhla inhibice 60% kontrolních hodnot po 3 hodinách toku.
Tento pokus prokázal, že EMD má významný inhibiční účinek na adherenci S.mutans na skleněné povrchy. Možným vysvětlením této inhibice může být přítomnost hydrofobních sloučenin ve směsi EMD. Jedním z proteinů hojně přítomných ve směsi je amelogenin; protein, který obsahuje kromě kyselé hydrofilní Ckoncové sekvence také hydrofobní jádro obsahující 100-300 zbytků bohatých na prolin, leucin, methionin a glutamin. Saito et al., Arch. Oral Biol. 42, 1997, str. 539-545, zjistili, že adherence různých kmenů S.mutans na imobilizovaná hydrofobní proteiny (OAIS) byla inhibována. Autoři připisují tento účinek negativnímu náboji na povrchu mikroorganismu (jak je tomu v
případě S.mutans). Jiné charakteristiky povrchu mohou také ovlivňovat adherenci na substrát. S.mutans obsahuje povrchový antigen I/II, který má N-koncovou část bohatou na alanin a obsahuje tandemové repetitivní sekvence. Předpokládá se, že tento region má strukturu α-šroubovice, která nabývá konformace závitu a která může odpovídat za hydrofobní charakter buněčného povrchu spojený s expresí antigenu I/II.
Příklad 5: Vliv EMD na růst některých periopatogenů
Prevotella intermedia a Porphyromonas gingivalis byly předem kultivovány po dobu 10-16 hodin při 37 °C v thioglykolatovém mediu doplněném 0,5 mg/1 vitamínu K a 5 mg/1 heminu v aerobní atmosféře vytvářené GasPakPlus zařízením ve vhodných nádobách, jakmile dosáhly kultury OD600 = 0,1-0,2, což odpovídá hustotě buněk 10 -10 cfu (jednotek vytvářejících kolonie) na ml, byly odebrány 100 μΐ alikvoty a bakterie byly vysráženy odstředěním. Bakterie byly resuspendovány ve 100 μΐ čerstvě připravené směsi lidského séra a sterilního salinického roztoku a suspenze obsahující 105-106 buněk byly přeneseny do sterilních 1,5 ml Eppendorfových zkumavek a byly smíseny s (i) 100 μΐ přípravku EMD (3 mg EMD v 0,1 PGA), -(ii) 100 μΐ PGA nosiče nebo (iii) 100 μΐ směsi séra/NaCl jako kontroly růstu. 10 μΐ alikvoty pro testování růstu byly odebírány po 0, 3, 6a 24 hodinách. Alikvoty byly sériově ředěny ve sterilním 0,9% roztoku NaCl a 10 μΐ jednotlivých ředění bylo naočkováno na Schaedlerův agar. Kultivační podmínky byly stejné jako pro předběžnou kultivaci. Agarové plotny byly inkubovány po dobu 3-4 dnů a potom byly vypočítány cfu a buněčné hustoty (cfu/ml). Všechny pokusy byly opakovány 6-krát.
Výsledky (uvedené jako procenta cfu/ml vzhledem ke koncentraci v čase 0)
1) Kontrolní kultury v různých časech
0 3 h 6 h 24 h
P.intermedia 100 160 25 10
P.gingivalis 100 100 125 150
2) Kultury za přítomnosti PGA nosiče v různých časech
0 3 h 6 h 24 h
P.intermedia 100 140 25 10
P.gingivalis 100 75 50 5
3) Kultury za přítomnosti EMD v různých časech
0 3 h 6 h 24 h
P.intermedia 100 40 0 0
P.gingivalis 100 30 0 0
Kultury byly výrazně inhibovány přítomností EMD ve srovnání s kontrolami se samotným nosičem nebo bez přidání EMD.
Příklad 6: Testování vlivu EMDOGAIN® na zlepšené hojení rány v měkkých tkání po chirurgickém zákroku na periodontu
Cílem tohoto příkladu je ukázat vliv derivátů matrice zubní skloviny a/nebo proteinů matrice zubní skloviny na zlepšené hojení rány v měkkých tkání po chirurgickém zákroku na periodontu.
Pokusné defekty v marginálním periodontu více než 50 zubů opic druhu makak byly vytvořeny odstraněním zubního cementu, periodontální membrány a marginální alveolární kosti na
cerviko-apikální vzdálenost přibližně 5 mm pomocí zubního vrtáku. Do těchto pokusných defektů potom nebylo aplikováno buďto nic, nebo byla provedena aplikace derivátu matrice zubní skloviny (získaného z EMDOGAIN® buď ve formě nerekonstituovaného lyofilizovaného prášku, nebo ve formě rekonstituovaného prostředku). Koncentrace proteinu v rekonstituovaném prostředku byla přibližně 5-30 mg/ml a aplikovaný objem byl od přibližně 0,1 do přibližně 0,2 ml na defekt.
Hojení rány bylo hodnoceno vizuálně v průběhu následujících 8 týdnů. V defektech, do kterých byl aplikován EMDOGAIN®, bylo pozorováno dobré hojení (bez zarudnutí či otoku) a zanedbatelná tvorba plaku po 2 týdnech, kdy byly odstraněny stehy, dobré hojení a malá gingivitida po 5 týdnech a zhojení bez komplikací po 8 týdnech, kdy byl pokus ukončen. Naopak, v kontrolních defektech byl po 2 týdnech pozorován zánět s retrakcí a hojná tvorba plaku, a po 5 a 8 týdnech byla pozorována závažná retrakce a gingivitida.
Příklad 7: Testování vlivu derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na hojení rány_po chirurgickém zákroku na periodontu
Cílem tohoto příkladu je ukázat vliv derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na zlepšené hojení rány u pacientů po chirurgickém zákroku na periodontu.
Padesát pět (55) pacientů vyžadujících chirurgický zákrok na periodontu bylo rozděleno do dvou skupin, kde u jedné skupiny byl proveden běžný chirurgický výkon s modifikovanou Widmanovou flap technikou (20 pacientů) a u druhé skupiny
byla provedena stejná operace s aplikací EMDOGAINU® (35 pacientů) (použitá koncentrace byla 30 mg proteinu na ml a bylo aplikováno přibližně 0,3 ml na zub. Žádnému z pacientů nebyly, v době zákroku podány antibiotika, ale všichni byly instruováni k dennímu používání aseptických (chlorhexidinových) roztoků pro vyplachování úst.
Aktivní dotazování pacientů bylo provedeno v době odstraňování stehů (1-3 týdny po chirurgickém zákroku). Zatímco 3 (15%) kontrolních pacientů udávalo komplikace vyžadující antibiotickou léčbu, pouze 1 (3%) pacient ošetřený EMDOGAINEM® vyžadoval takovou terapii.
Přiklad 8: Testovaní vlivu derivátu matrice zubní skloviny a proteinů matrice extrakci zubu
Cílem tohoto příkladu je skloviny a proteinů matrice extrakci 3. moláru.
zubní skloviny na hojení rány po ukázat vliv derivátů matrice zubní zubní skloviny na hojení rány po
Pacientům ve věku 30 let nebo více se symetricky zaraženými nebo částečně zaraženými třetími moláry vyžadujícími odstranění byla provedena extrakce třetí stoličky klasickou metodou obsahující vytvoření vertikální kapsy pro provedení nutné osteotomie a řezu. Zatímco druhá stolička byla extrahována a dutina byla vyplněna EMDOGAINEM před provedením stehů. Všem pacientům byla podána antibiotika (3 g amoxicillinu nebo 1 g erythromycinu) 1-2 hodiny před chirurgickým výkonem a po výkonu jim byl podán Ibuprofen (600 mg x 3). Byly instruováni k vyplachování chlorhexidinem (0-1%, 10 ml x 2) po dobu 4 týdnů.
Stehy byly odstraněny po 2 týdnech. Hojení míst s aplikací EMDOGAINU® a kontrolních míst bylo hodnoceno jak pacientem, tak dentistou. V jednom centru byly u 9 pacientů provedeny kontralaterální extrakce s/bez aplikace EMDOGAINU®. U jednoho pacienta byla pozorována mírná iritace od stehů na obou stranách, zatímco jiný pacient měl významné bolesti pouze na kontrolní straně, ale ne na straně ošetřené EMDOGAINEM. Ve druhém centru udávaly 3 pacienti ze 6 bolesti pouze na kontrolní straně. Ve třetím centru byla u jednoho pacienta diagnostikována závažná komplikace, alveolitis, která probíhala na kontrolní straně. Strana ošetřená EMDOGAINEM® se zhojila bez obtíží. Jiný pacient měl mírnou iritaci od stehů na obou stranách, ale pouze na kontrolní straně bal zánět a bolest, které vyžadovaly opakované výplachy salinickým roztokem a užívání analgetik.
Tyto klinické výsledky ukazují, že aplikace EMDOOGAIN® do dutiny po extrakci zubu moudrosti může zlepšit hojení a snížit jinak častý bolestivý otok.
Příklad 9: Testování vlivu derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na hojení alveolitis sicca
Cílem tohoto příkladu je ukázat vliv derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na hojení alveolitis sicca (suché dutiny).
Po odstranění 35 radix relicta měl pacient mužského pohlaví ve věku 70 let významnou bolest a otok související s extrakční dutinou. Po vyšetření jeho dentistou bylo jasné, že se u něj vyvinula alveolitis sicca, při které se počáteční koagulum • φ φ φ φ φφ φ • · φ φ φφφφ • · Φφφφφφ ·· φ • · φ φ φ φ φ • · φφ φφ φφ rozpadá a kostní stěna dutiny nekrotizuje. Přilehlá kost a měkké tkáně byly zánětlivě změněné.
Pacient měl anamnesu srdečního selhání a byl léčen antikoagulačním lékem Marevanem. V důsledku tohoto onemocnění měl sníženou cirkulaci periferní krve. Také kouřil pravidelně několik cigaret denně.
Alveolitis byla léčena tradičním způsobem spočívajícím v odstranění nekrotické kosti a indukci nového krvácení. Dále byla mobilisována dáseň a dutina byla uzavřena stehem. Pacient byl potom léčen penicilinem (apocillin 660 mg, 2 tablety ráno a večer po dobu 7 dnů) pro léčbu infekce a také si vyplachoval ústa dvakrát denně roztokem chlorhexidinu. Po pěti dnech, po ukončení podávání antibiotik, se pacient dostavil na zubní kliniku s trvající výraznou bolestí. Byla provedena vizuální prohlídka operované oblasti a palpace a vyšetření sondou a bylo prokázáno, že alveolitis přetrvává a že je přítomná nekrotická kost. Rentgenové vyšetření ukázalo destrukci a nekrosu kosti pod apikální oblastí alveolu. operovaná oblast byla znovu vyčištěna a vzniklý defekt v kosti byl vyplněn EMDOGAINEM® (30 mg/ml, maximálně 0,5 ml) a byla provedena nová sutura dásně pro uzavření alveolu. Nebyla zahájena žádná další léčba, ale pacient pokračoval ve vyplachování roztokem chlorhexidinu. O dva dny později udával pacient vymizení bolestí a otoku. Klinické vyšetření a odstranění stehů jeden týden po léčbě EMDOGAINEM ukázalo dobré hojení bez přítomnosti nekrotické tkáně či zánětu a intaktní dáseň bez zarudnutí či otoku překrývající ránu. Při sondování a palpaci nebylo krvácení ani bolest. Nebyl přítomen zápach z úst ani exsudát. Pacient nepopisoval žádnou bolest či jiné příznaky.
• · • · • ♦ · · • · · · • ··· · ·
* 9. ♦ ·
Příklad 10: Testování profylaktického vlivu derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na alveolitis sicca
Cílem tohoto příkladu je ukázat profylaktický vliv derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na alveolitis sicca.
82-letá pacientka ženského pohlaví měla longitudinální frakturu kořenu zubu 44. Tento zub byl nosným zubem v můstku v rozsahu zubů 35 až 46 a byl endodonticky léčen před několika lety. Klinicky byla dáseň obklopující zub zánětlivě změněna a byla přítomna gingivální kapsa v rozsahu celého apexu u zubu na linguální straně. Rentgenový snímek ukázal lokální, periodontitis zubu 44.
Pacientka měla dobrou orální hygienu, ale měla onemocnění srdce léčené marevanem (antikoagulačním činidlem) a krvácení z dásně bylo snadno provokováno sondováním, před 6 měsíci byl pacientce chirurgicky odstraněn zub 35 z důvodů závažné periodontitidy. Po této operaci měla dlouhodobě alveolitis sicca. Velmi se obávala toho, aby odstranění zubu 44 nezpůsobilo stejné postchirurgické komplikace. Byla informována, že kombinace jejího vysokého věku, léčby
Marevanem a infikovaného kořene a gingivální kapsy výrazně zvyšuje riziko pooperačních komplikací jako je alveolitis, ale že není jiná alternativa než chirurgické odstranění kořenových fragmentů.
Pacientka souhlasila s odstraněním zubu 44 a s pokusnou profylaktickou léčbou EMDOGAINEM® pro prevenci vzniku alveolitis sicca. Pacientce byla pod anestesií provedena incise a odstranění bukální kosti pro odstranění kořenového • ·
fragmentu bez ztráty můstku. Po odstranění byl prázdný alveolus mechanicky vyčištěn a vyplněn EMDOGAINEM® (30 mg/ml, max. aplikace 0,5 ml) a lalok byl reponován s jedním stehem. Týž den večer pacientka udávala (telefonicky) dlouhodobé krvácení z operované oblasti (léčba Marevanem nebyla ukončena před operací), ale ne jiné příznaky. Při odstranění stehu pět dnů po výkonu byla operační rána v měkkých tkáních zcela zhojena. Pacientka neudávala žádné příznaky jako bolest či otok po chirurgickém výkonu a byla celkově velmi spokojená s léčbou.
Příklad 11: Testování vlivu derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na hojení posttraumatických komplikací
Cílem tohoto příkladu je ukázat vliv derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na hojení posttraumatických komplikací u pacienta.
Po nehodě měl pacient postižený horní přední zub, který byl ligován na pohotovostní klinice. Dentista zjistil, že zuby 11 a 21 jsou avitální a zuby 12 a 22 mají mesio-incisální fraktury třídy I nebo II. Marginální dáseň byla významně zánětlivé změněná a špatně lnula k povrchu zubů. Pacient udával bolesti a znecitlivění, otok a divnou chuť a zápach. Byly přítomny také příznaky poranění periodontálního ligamenta v apikálních regionech zubů 11 a 21. Oba centrální řezáky býly vyčištěny a kořeny byly vyplněny čerstvě namíchaným Ca(OH)2·
Po 4 týdnech bylo hojení stále neuspokojivé. Stav přešel do chronického zánětu a zuby byly považovány za ztracené. Standardní terapií tohoto stavu by byla extrakce všech čtyřech řezáků a jejich náhrada můstkem nebo implantátem. Nicméně,
0
0 pacient odmítl tuto léčbu a jako poslední pokus o záchranu zubů byl proveden přenos gingiválního laloku na všech čtyřech postižených zubech (11, 12, 21, 22). Byly použity dvě ampule EMDOGAINU® (60 mg ve 3 ml). Maximálně 0,2 ml EMDOGAINU® (30 mg/ml) na zub bylo aplikováno injekční stříkačkou před tím, že byly laloky sešity 7 stehy. 4 stehy byly odstraněny 5 dní po výkonu. Potom došlo k výraznému zlepšení subjektivních a klinických příznaků. Pacient již neudával bolesti a nebyl přítomen zápach nebo pachuť z postižené oblasti. Po 2 týdnech byly odstraněny zbývající stehy. Dáseň nevykazovala žádné známky zánětu a pacient neměl obtíže. Dáseň byla zdravá a bez příznaků zánětu; pevně lnula k zubu a/nebo alveolární kosti, měla růžovou barvu (nebyla zarudlá, jak je tomu při zánětu) a měla normální (ne oteklou) intradentální papilu. Dále, značné zlepšení bylo pozorováno v podobě obnovení periodontálního ligamenta v postižené části zubu a ukládání nové alveolární kosti bylo vizualizováno rentgenovým vyšetřením.
Příklad 12: Hojení traumatických ran na sousedních zubech a nervech
Kasuistika
Pacientka ženského pohlaví ve věku 39 let měla závažnou pericoronitis okolo levého dolního zubu moudrosti. Na veřejné zubní klinice byl zub částečně odstraněn za ponechání apikální poloviny zubu v čelisti po iatrogenní fraktuře kořenu. Den po chirurgickém odstranění kořenového fragmentu byla pacientka s bolestmi konzultována se specialistou na orální chirurgii.
Dva dny po výkonu byla pacientka u svého dentisty na kontrole. Měla otok na levé straně a měla přetrvávající a kompletní blokádu levého mandibulárního nervu. Klinické a * 00 00 00 00 ·· · * 0 0 0000 • 0000 0000 • « 0 0 ··· · · 0 0 · 0 ·· 0 0000
000 00 0· . 00 00 rentgenové vyšetření ukázalo, že během chirurgického výkonu byla při vrtání vážně poškozena kost čelisti, apikální třetina distálního kořene zubu 37 a kanál mandibulárního nervu (viz rentgenový snímek, obr. IA) . Při sondování byla hloubka distální kapsy na zubu 37 25 mm od vrcholku korunky zubu, což byla hloubka zadního vrcholu distálního kořene.
Ve snaze o indukci hojení kosti a nervu a regeneraci ztraceného periodontálního ligamenta na zubu 37 byla operační rána otevřena a pečlivě vyčištěna. Po vypláchnutí obnažené kosti salinickým roztokem byl povrch distálního kořenu 37 a mandibulárního nervu pokryt EMDOGAINEM® (30 mg/ml, aplikováno v nadbytku; přibližně 1 ml) a rána byla uzavřena třemi stehy. Pacientka byla poučena, aby si vyplachovala ústa chlorhexidinovým roztokem (Cordosyl®) dvakrát denně po dobu dalších pěti dnů a byla jí naordinována pěti-denní profylaktické léčba penicilinem (Ampicillin 660 mg x 4).
Po deseti dnech přišla pacientka na kontrolu a k odstranění stehů. V této době otok odezněl a hojení měkkých tkání bylo velmi dobré. Nicméně, kompletní anestesie mandibulárního nervu přetrvávala a pacientka byla informována, že prognosa při_ natrženém nervu je přinejlepším nejistá. V tuto dobu bylo z důvodů anestesie nemožné zjistit vitalitu zubu 37. Obvykle vede takové poranění kořenu zubu k nekrose dřeně a k ankylose zubu. Pro prevenci těchto komplikací je indikována endodontická léčba. Nicméně, pro zjištění toho, zda může pokusná terapie navodit hojení periodontálního ligamenta, pacientka souhlasila s tím, že zub zůstane nějakou dobu bez ošetření. Pacientka byla zvána na kontroly jednou za měsíc.
O dva měsíce později udávala pacientka lokální hyperestesii v levé polovině dolního rtu, což je příznakem hojení nervu.
• 9 99 99 99 *99 9 9 99 9 ••9 9 9 99 9
9· 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9
9 9.9 9 9 9 9
Měkké tkáně v oblasti 37-38 byly dokonale zhojeny bez jizvy.
Rentgenový snímek ukázal tvorbu nové kosti v extrakcním alveolu. Zub 37 a okolní tkáně byly stále necitlivé.
Čtyři měsíce po léčbě anestesie odezněla a zub 37 byl při testování vitální, ale hypersensitivní, jak na teplotu, tak při elektrickém testu. Rentgenový snímek ukázal, že kostní výplň extrakčního alveolu byla významná a byly přítomné známky periodontální regenerace na distálním kořenu zubu 37.
Pět měsíců po zahájení léčby EMDIGAINEM® byla vitalita zubu 37 normální. V této době byla na rentgenovém snímku patrná úplná regenerace funkčního periodontálního ligamenta (obr. 1B) a nově vytvořená alveolární kost normálního vzhledu vyplnila kostní defekty a extrakční alveolus. Nebyly přítomny známky ankylosy.
Hloubky kapsy distálně na zubu 37 byla při sondování nyní pouze 10 mm, což je přibližně 1 mm pod cementoenamelovým spojením. Po této kontrole byla pacientka propuštěna z sledování jako zcela zhojená a byla odeslána na pravidelné 1roční kontroly.
Komentář
Kompletní a rychlé hojení traumatických ran na sousedních zubech a nervech po chirurgickém odstranění zubu moudrosti je vzácné. Obvyklé komplikace, jako byla výše popsaná komplikace, obvykle končí kompletním odstraněním poraněného zubu, nebo minimálně endodontickým odstraněním zubní dřeně a vyplněním kořenových kanálků kostí s ankylosou. Ruptura nervu se obvykle hojí 8-12 měsíců, pokud vůbec, a některé oblasti s parestesiemi přetrvávají několik let. Rychlost a dobrá kvalita • · ♦ ' ♦ 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 99 9 * 9 9 9 9 9 9 9 9
999 99 99 99 99 výše popsaného hojení jsou velmi neobvyklé a měly by být považovány za známku přínosu EMDOGAINU® pro hojení ran.
Rentgenová vyšetření:
A: Pacient dva dny po odstranění zubu 38. Je přítomen velký defekt distálně na zubu 37 a postižení mandibulárního kanálu.
Také alveolární kost disto-bukkálně na zubu 37 byla odstraněna během chirurgického zákroku.
B: Pacient pět měsíců po chirurgickém zákroku. Jsou přítomné známky kompletního funkčního periodontálního ligamenta (lamina důra) v defektu na distální části kořenu zubu 37. Nejsou příznaky ankylosy. Jsou zřetelné hranice mandibulárního kanálu a extrakční alveolus je zcela vyplněn kostí. Také jsou přítomné známky tvorby nové disto-bukkální alveolární kosti okolo zubu 37.
Příklad 13: Testování vlivu derivátů matrice zubní skloviny a proteinů matrice zubní skloviny na hojení ulcus cruris (venosního vředu)
Pacient 1
Pacientem byl muž narozený v roce 1926 a měl anamnésu opakovaných trombos s posttrombotickým syndromem a recidivujícími bércovými vředy. Byl léčen systémově antikoagulačními kumarinovými deriváty a vředy byly léčeny lokálně za použití přípravku Crupodex (monomer dextranu)
BIOGAL a 3% roztoku kyseliny borité.
• ·
4· 99 •4 4 · · · · • · 4 4 · · ·
4444·· 99 9 · * · 4 4 · ·
V době zahájení terapie přípravkem EMDOGAIN® měl ovální bércový vřed velikosti 5 x 4 cm a hloubky 0,5 mm, který byl ve stadiu granulace s velmi špatnou epitelizací.
Defekt byl desinfikován 3% H2O2 a 500 μΐ přípravku EMDOGAIN® bylo aplikováno po kapkách a tyto kapky byly rovnoměrně rozetřeny sterilní tyčkou. EMDOGAIN® byl ponechán po dobu 10 minut na vzduchu a potom byla rána zakryta Inadine (Johnson and Johnson Rayon obvazem impregnovaným 10% jodpovidonovou mastí.
Po 5 dnech proběhla epitelizace proximální části vředu a vřed se zmenšil na 1,8 x 2,2 cm a nebyly známky vedlejších reakcí (zánětu). Nebyl aplikován žádný EMDOGAIN®. Po 12 dnech proběhla další epitelizace v proximální části a nová epitelizace v laterální části v oblasti přibližně 2x2 cm. Téměř polovina vředu byla zhojena. Bylo aplikováno 400 μΐ přípravku EMDOGAIN®.
Po 19 dnech proběhla další epitelizace v proximální a laterální části vředu, ale ne v distální části, kde byl vřed dosti hluboký (přibližně 1 mm) . Více než polovina vředu byla zhojena. Bylo aplikováno 300 μΐ přípravku EMDOGAIN®. Od zahájení léčby přípravkem EMDOGAIN® pacient neudával žádnou bolest ve vředu, na rozdíl od stavu před léčbou. EMDOGAIN® byl potom aplikován jednou týdně do dne 40 (v dávce 200 μΐ) a vřed byl považován za zcela zhojený po 47 dnech.
Pacient 2
99
9 9 9 • · 9 ·
9 9 9
9 9 9
99 • ♦ 9 • · 9
999
Pacientkou byla žena narozená v roce 1949 a měla varixy, chronickou žilní insuficienci a recidivující bércové vředy. Měla polyvalentní alergii na farmaceutická činidla (léky), stejně jako varikosní ekzém. Byla v předchozí době léčena lokálně Otosporinovými kapkami (polymyxin B sulfát + neomycin sulfát + hydrokortison) a hydrokortizonovými obvazy.
V době zahájení léčby přípravkem EMDOGAIN® měla bércový vřed velikosti 1 cm v průměru a hloubky 2 mm. Bylo aplikováno 300 μΐ přípravku EMDOGAIN®.
Po 5 dnech byla patrná epitelizace 2 mm okolo defektu (po obvodu) a nebyly známky vedlejších reakcí (zánětu). Nebyl aplikován přípravek EMDOGAIN®. Po 12 dnech se velikost defektu zmenšila na průměr 2 mm a bylo aplikováno 100 μΐ přípravku EMDOGAIN®.
Po 19 dnech měl vřed stále ještě průměr 2 mm, ale jeho spodina granulovala a vřed již nebyl tak hluboký (přibližně 0,2 mm). Bylo aplikováno 100 μΐ přípravku EMDOGAIN®.
Stejná pacientka měla jiný vřed na druhé noze, který měl velikost přibližně 0,3 x 1 cm. Bylo aplikováno 200 μΐ přípravku EMDOGAIN®.
Po 7 dnech byla přítomná nová epitelizace, na spodině byla granulační tkáň a velikost se zmenšila na přibližně 0,2 x 0,5 cm.
Potom bylo na každý vřed aplikováno 100 μΐ přípravku EMDOGAIN® jednou týdně do dne 40 a vředy byly považovány za * 4 « 4 • 4
4
4» #
4
4
4« <
4 ' zcela zhojené po 47 dnech. Nebyly pozorovány žádné alergické reakce na EMDOGAIN®.
Na stejné noze vznikl nový vřed mající velikost přibližně 0,5 x 0,3 cm a na tento vřed bylo aplikováno 100 μΐ přípravku EMDOGAIN®.
Pacient 3
Pacientkou byla žena narozená v roce 1929 a měla hlubokou žilní trombosu po erysipelu a v době zahájení terapie přípravkem EMDOGAIN® měla velmi rozsáhlý bércový vřed velikosti přibližně 15 x 19 cm ve stadiu progrese, kde tento vřed byl po různé léčbě považován za téměř beznadějný. 700 μΐ přípravku EMDOGAIN® bylo aplikováno na plochu přibližně 3 cm od horního okraje.
Po 7 dnech nebyla přítomna žádná epitelizace, ale léčená plocha byla transparentnější (lépe strukturovaná) s malými rozptýlenými oblastmi granulace a v této oblasti nebyla bolest ani známky progrese. Na stejnou oblast bylo aplikováno 700 μΐ přípravku EMDOGAIN®.
Po 4 týdnech se u pacientky rozvinula infekce, pravděpodobně způsobená Pseudomonas, v distální části vředu neléčené přípravkem EMDOGAIN®. Bylo aplikováno 700 μΐ přípravku EMDOGAIN®. Infekce vymizela po 7 dnech.
Pacient 4 ·· * *· »· »t *· ···· ···♦ ···« • · 4 4 ·· 4 4 ·· · *70 4 4-4 4 4 4 «·· 99 99 9 /O 44 4 4 4 4 4444 ·· ··· 44 44 «· ·»
Pacientkou byla žena narozená v roce 1947 a měla varixy se superficiální tromboflebitidou po erysipelu a v době zahájení terapie přípravkem EMDOGAIN® měla bércový vřed velikosti přibližně 2 x 0,8 cm s čistou, ale negranulující spodinou.
Bylo aplikováno 300 μΐ přípravku EMDOGAIN®.
Po 7 dnech se velikost vředu zmenšila na přibližně 0,7 x 0,3 cm a po obvodu byla přítomná epitelizace a na spodině granulace. Bylo aplikováno 200 μΐ přípravku EMDOGAIN® a potom bylo po dobu 5 týdnů aplikováno 100 μΐ přípravku EMDOGAIN® za týden. Vřed byl považován za zcela zhojený po pěti týdnech.
Příklad 14: EMDOGAIN® jako doplněk při nechirurgické periodontální léčbě v místě povrchu laloků
Cílem výzkumu bylo zhodnocení toho, zda může aplikace přípravku EMDOGAIN® zlepšit výsledky hojení po nechirurgické periodontální léčbě. Specifickým cílem této studie bylo hodnocení účinku v místě povrchu laloků.
Návrh studie
Studie byla provedena jako intra-individuální longitudinální testování s trváním 6 měsíců. Studie byla dvojitě zaslepená, rozštěpená, placebem kontrolovaná a randomizovaná.
Jedinci pacientů léčených na Clinic of Periodontics, Departmen of Periodontology, Goteborg University, pro středně pokročilou nemoc periodontu.
*· * »♦ Μ 99 99
9 99 9 9 9 9 >»·«
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 999 9 9 99 9 • · · ·· 9 9 9 9 9
A·· ·* t«
Zařazovací kriteria
- alespoň 3 místa povrchu laloku v každém ze 2 kontralaterálních kvadrantů s hloubkou kapsy při sondování > 5 mm a s alespoň jedním párem míst s hloubkou při sondování > 6 mm;
- vybraný zub musí mít vitální dřeň, jak je stanoven termální nebo elektrickou stimulací, nebo - pokud byl léčen kořenový kanálek - musí být asymptomatický a bez technických obtíží.
Léčba Při vstupním vyšetření byly všichni pacienti seznámeni se stavem a byly jim podány informace s správných měřeních supragingiválního plaku. Bylo provedeno hodnocení rozsahu a polohy kořene.
Poté, co ustalo krvácení z kapes, byl do kapes aplikován na dobu 2 minut 24% EDTA gel (získaný od Biora AB, Sweden). Potom byly kapsy opatrně vypláchnuty salinickým roztokem a potom byla aplikována buď testovaná (EMDOGAIN®) , nebo kontrolní substance (PGA gel).
Hodnocení
Základní vyšetření, vyšetření v 1-, 2-, 3-, 8- a 24-měsíci obsahovalo následující složky:
1. stav orální hygieny - přítomnost/nepřítomnost plaků
2. stav dásní - (Gingival Index; Loe 1967)
3. Sondování hloubky kapsy
4. sondování adherence
5. krvácení při sondování - přítomnost/nepřítomnost (15 sekund)
6. hypersensitivita zubu - po vzduchovém stimulu (ano/ne)
7. stupeň diskomfortu - zaznamenávaný 1-, 2-a 3-týdny po vyšetření za použití 10 cm « vizuální analogové stupnice (VAS).
Plaky; průměr (sd)
kontrola EMDOGAIN®
Vstupní vyšetření 0,10 (0,30) 0,19 (0,40)
1 týden 0,08 (0,27) 0,05 (0,22)
2 týdny 0,05 (0,22) 0,02 (0,15)
3 týdny 0,05 (0,22) 0,10 (0,30)
6 týdnů 0,14 (0,35) 0,19 (0,40)
26 týdnů 0,12 (0,33) 0,07 (0,34)
Gingivální index; průměr (sd)
kontrola EMDOGAIN®
Vstupní vyšetření 1,40 (0,50) 1,40 (0,50)
1 týden 1,00 (0,32) 0,87 (0,52)
2 týdny 0,83 (0,44) 0,74 (0,45)
3 týdny 0, 69 (0, 60) 0,60 (0,50)
6 týdnů 0,67 (0,53) 0,64 (0,58)
26 týdnů 0,62 (0,54) 0,62 (0,49)
Krvácení při sondování; %
kontrola EMDOGAIN®
Vstupní vyšetření 100 100
1 týden 67 44
2 týdny 43 33
3 týdny 29 26
6 týdnů 33 31
26 týdnů 19 24
• · • · • · • · • ·
• · ·
·' · « · · · • ·
• ·
• · • · · • · • · • · • ·
Subjektivní hodnocení pacienta; VAS skoré Týden 1
kontrola EMDOGAIN®
VAS skóre
0-20 8% 0%
21-40 15% 8%
41-60 31% 30%
61-80 8% 0%
81-100 38% 62%
Týden 3
kontrola EMDOGAIN®
VAS skóre
0-20 14% 7%
21-40 0% 7%
41-60 3% 0%
61-80 21% 22%
81-100 57% 64%
Závěr
Pacienti měli méně pooperačních problémů, menší krvácení a lepší gingivální index. Tyto výsledky podporují příznivý efekt EMDOGAINU® na hojení ran.
Příklad 15: Pilotní studie hojení ran na prasatech
Úvod
Předmět studie
Předmětem studie je hodnocení hojení řezných ran u prasat a hodnocení vlivu EMD na tyto rány.
Důvody pro volbu zvířecího druhu
Prase je vybráno jako testovací model proto, že bylo ověřeno, že tento druh je dobrým modelem pro hodnocení hojení ran u člověka.
Materiály a metody
Zvířata
Pokus byl proveden na 4 samicích SPF prasat (kříženců Danish country, Yorkshire a Duroc). V době zahájení aklimatizačního období měla zvířata tělesnou hmotnost přibližně 35 kg.
Zvířata se nechala aklimatizovat po dobu 1 týdne, během kterého byla zvířata sledována pro vyloučení zvířat ve špatném zdravotním stavu. Všechna pozorování byla zaznamenávána.
Chov
Studie byla provedena ve zvířecím boxu opatřeným filtrací vzduchu při teplotě 21 °C ± 3 °C, relativní vlhkosti 55% ± 15% a výměně vzduchu 10-krát/hodinu. Box byl osvětlován v cyklu 12 hodin světla a 12 hodin šera. Světlo bylo od 06 do 18 h.
Zvířata byla v boxech umístěna samostatně.
Podestýlka • · • · · · · · · · · · · · oo ······· ···· ·· ··· ········· • · · · · · · ·· · • · · · · · · · · · · · ·
Jako podestýlka byly použity piliny LIGNOCEL H 3/4 od Hahn and Co., D-24796, Bredenbek-Kronsburg. Byla prováděna pravidelná analýza na možné kontaminující složky.
Potrava
Byla podávána komerčně dostupná prasečí potrava Altromin 9033 od chr. Petersen A/S, DK-4100 Ringsted (přibližně 800 g dvakrát denně). Pravidelně byla prováděna analýza hlavních nutričních složek a možných kontaminujících složek.
Pití
Dvakrát denně byla zvířatům podávána pitná voda. Byla prováděna pravidelná analýza na možné kontaminující složky.
Poranění
Poranění byla vytvořena v den 1. Zvířata byla uvedena do anestesie přípravky Stresnil® Vet. Janssen, Belgie (40 mg azaperonu/ml, 1 ml/kg) a Atropinem DAK Denmark (1 mg atropinu/ml, 0,5 ml/10 kg), které byly podány jako jedna intramuskulární injekce, po které následovala i.v. injekce přípravku Hypnodil® Janssen, Belgium (50 mg metomidatu/ml, přibližně 2 ml).
V dorsolaterální oblasti na jedné straně byla zvířata vyholena, omyta mýdlem a vodou, desinfikována 70% ethanolem, který byl opláchnut sterilním salinickým roztokem, a nakonec byla osušena sterilní gázou.
poranění (25 x 25 x 0,4 mm) bylo provedeno na připravených plochách, 4 na každé straně zad, za použití ACCUDermatom (GA 630, Aesculap®). Rány byly očíslovány 1 (nejvíce kraniální) až 4 (nejvíce kaudální) na levé straně zad a 5 • ·
(nejvíce kraniální) až 8 (nejvíce kaudální) na pravé straně zad.
Sražená krev byla odstraněna sterilní gázou.
Bezprostředně před chirurgickým zákrokem, přibližně 8 hodin po zákroku a kdykoliv to bylo nutné byla zvířatům podána intramuskulární injekce přípravku Anorfin®, A/S GEA, Denmark (0,3 mg buprenorfinu/ml, 0,04 ml/kg).
Dávkování
Poranění byla léčena následovně:
Zvíře č.
1 2
Lokalizace vlevo vpravo vlevo vpravo
Kraniálně A B
B A
B A
Kaudálně B A
Zvíře č.
3 4
Lokalizace vlevo vpravo vlevo vpravo
Kraniálně A B
B A
B A
Kaudálně B A
A = kontrola
B = EMD
Přibližně 15 minut před podáním byl EMD prostředek připraven podle návodu výrobce. EMD prostředek byl použit • · ·· ♦· ·· · · ·· ♦ . · ·· · ·· 9 · ·· » • · · · · · · · · · · • · · * · · ··· · « · · · během 2 hodin po přípravě. Pro poranění léčená způsobem B byl EMD aplikován ve formě tenké vrstvy na povrch poranění. Jedna ampule EMD byla použita pro 4 rány.
Obvazy
Rány byly obvázány za použití tegaderm®. Obvazy byly překryty gázovou bandáží fixovanou přípravkem Fixomul®. obvazy, gáza a Fixomul® byly fixovány prubanovým obvazem, Bend-a-rete® (Tesval, Italy). Obvazy byly kontrolovány denně.
Obvazy byly měněny v den 2 (všechna zvířata) a 3 (zvířata č. 3 a 4) .
Před každou výměnou obvazu byla zvířata uvedena do anestesie intramuskulární injekcí do krku (1,0 ml/10 kg tělesné hmotnosti) směsi Zoletil 50®Vet., Virbac, France (125 mg tiletaminu a 125 mg zolazepamu v 5 ml rozpouštědla, 5 ml) Rompun®Vet., Bayer, Germany (20 mg xylazinu/ml, 6,5 ml) a Methadonu®DAK, Nycomed DAK, Denmark (10 mg methadonu/ml, 2,5 ml) .
Kontrola ran
Každá rána byla zkontrolována a fotografována v den 2 (všechna zvířata), 3 (všechna zvířata) a 4 (zvířata č. 3 a 4). Byl hodnocen stupeň exsudace a zánětu. Zjištění novotvořené epidermis bylo popsáno podrobně.
Klinické příznaky
Všechny viditelná známky onemocnění a jakékoliv změny chování byly zaznamenávány denně. Jakákoliv odchylka od normálu byla popsána s ohledem na dobu vzniku, trvání a intensitu.
Tělesná hmotnost
Zvířata byla zvážena při dodání, v den vytvoření poranění a při ukončení testu.
Konečné vyšetření
V den 3 (přibližně 56 hodin po poranění) byla zvířata č. 1 a 2 utracena incisí v oblasti véna a arteria subclavia, který byl proveden po omráčení pistolí.
V den 4 (přibližně 72 hodin po poranění) byla zvířata č. 3 a 4 utracena incisí v oblasti véna a arteria subclavia, který byl proveden po omráčení pistolí.
Odběr tkáňových vzorků
Každá rána byla vyříznuta jako blok separovaný od kosterního svalu. Pokud byla přítomná jakákoliv adherence na přítomný kosterní sval, tak byla část svalu obsažena v materiálu pro fixaci. Každý blok byl fixován ve fosfátem pufrovaném neutrálním 4% formaldehydu.
Histologické vzorky
Po fixaci byly 4 reprezentativní vzorky ze všech ran ponořeny do parafinu, nařezány na nominální tloušťku 5 μιη a barveny haematoxylinem a eosinem. Po barvení byly řezy prohlíženy ve světelném mikroskopu za použití mřížky. To umožnilo měření celkové délky rány a délky epitelizovaného povrchu. Tento poměr byl vyjádřen jako procento rány pokryté epitelem na sklíčko. Byly určeny průměrné hodnoty pro každou ránu a potom byly vypočítány průměry pro skupinu.
Statistická analýza
Data byla zpracována pro dosažení průměrných hodnot pro skupinu a standardních odchylek. Také byly identifikovány • 9 ♦ 9
99 99
9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 • 99999 99 9
9 9 9 9 9
99 99 99 hodnoty ležící mimo rozsah. Potom byla každá proměnná testována na homogenitu variance za použití Barlettova testu. Pokud byla variance homogenní, tak byla pro proměnou provedena analýza variance. Pokud byly detekovány statisticky významné odlišnosti, tak mohly být možné rozdíly mezi skupinami testovány Dunnettovým testem. Pokud byla variance heterogenní, tak byla každá proměnná testována Shapiro-Wilkovou metodou.
V případě normální distribuce mohly být možné rozdíly mezi skupinami identifikovány Student-t testem. Jinak byly rozdíly mezi skupinami hodnoceny Kruskal-Wallisovým testem. Pokud byly detekovány jakékoliv statisticky významné rozdíly mezi skupinami, tak byla následná identifikace skupin provedena za použití Wilcoxon Rank-Surn testu.
Statistická analýza byla provedena za použití SAS® procedur (verse 6.12) popsaných v SAS/STAT® User's Guide, verze 6, 4. vydání, svazek 1+2, 1989, SAS Institute lne., Cary, Nort Carolina 27513, USA.
• · · 4 4 • · ·· ···· · · 9 β
9 4 · · 4 4 · · 9 4
4 · · 9 ······ 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
999 99 99 99 99
Seznam sekvencí <110> Biora AB <120> Prostředky na bázi proteinů matrice pro hojení ran <130> 20542PC1 <160> 2 <170> FastSEQ pro Windows Verze 3.0 <210> 1 <211> 407 <212> PRT <213> neznámý
Met 1 Ser Ala Ser Lys 5 Ile Pro Leu Phe Lys 10 Met Lys Gly Leu Leu Leu /15
Phe Leu Ser Leu Val Lys Met Ser Leu Ala Val Pro Ala Phe Pro Gin
20 25 30
.Arg Pro Gly Gly Gin Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu Ser
35 40 45
Leu Glu Thr Met Arg Gin Leu Gly Ser Leu Gin Gly Leu Asn Ala Leu
50 55 60
Ser Gin Tyr Ser Arg Leu Gly Phe Gly Lys Ala Leu Asn Ser Leu Trp
65 70 75 80
Leu His Gly Leu Leu Pro Pro His Asn Ser Phe Pro Trp Ile Gly Pro
85 90 95
Arg Glu His Glu Thr Gin Gin Pro Ser Leu Gin Pro His Gin Pro Gly
100 105 110
Leu Lys Pro Phe Leu Gin Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gin Val Thr
115 120 125
Pro Gin Lys Pro Gly Pro His Pro Pro Met His Pro Gly Gin Leu Pro
130 135 140
Leu Gin Glu Gly Glu Leu Ile Ala Pro Asp Glu Pro Gin Val Ala Pro
145 150 155 160
Ser Glu Asn Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ile Met Asp Phe Gly Asp
165 170 175
Pro Gin Phe Pro Thr Val Phe Gin Ile Ala His Ser Leu Ser Arg Gly
180 185 190
Pro Met Ala His Asn Lys Val Pro Thr Phe Tyr Pro Gly Met Phe Tyr
195 200 205
Met Ser Tyr Gly Ala Asn Gin Leu Asn Ala Pro Gly Arg Ile Gly Phe
210 215 220
Met Ser Ser Glu Glu Met Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Met Gly Tyr
225 230 235 240
Gly Thr Leu Phe Pro Gly Tyr Gly Gly Phe Arg Gin Thr Leu Arg Gly
245 250 255
Leu Asn Gin Asn Ser Pro Lys Gly Gly Asp Phe Thr Val Glu Val Asp
260 265 270
Ser Pro Val Ser Val Thr Lys Gly Pro Glu Lys Gly Glu Gly Pro Glu
275 280 285
Gly Ser Pro Leu Gin Glu Pro Ser Pro Asp Lys Giy Glu Asn Pro Ala
290 295 300
Leu Leu Ser Gin Ile Ala Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Leu Ala Phe
305 310 315 320
Pro Asn Asp His Ile Pro Asn Met Ala Arg Gly Pro Ala Gly Gin Arg
>0 00 ·· ·♦
00 0 0 9 9 «
9 9 9 · 9 9 «
0 0 0 0- 0 0 0 0 ·
0 0 · · · «
00 99 00 325 m Ala Asp pro Leu Ile Thr Pro Glu
Leu Leu Gly Val Thr Pro Ala Ala Al^ P 35θ y Ala Asp Val Thr Thr Pro Leu 365 e Thr Met Ser Pro Asp Thr Gin 380 ,1 His Gin Pro Gin Val His Asr 395 40C
Val Thr Pro Ala Ala
340
Val Tyr Glu Thr Tyr 360
Glu Ala Thr Met 375 Asp
Met Pro Gly 390 Asn Lys
Phe Gin 405 Glu Pro
385 <210> 2 <211> 324 <212> PRT <213> neznámý
Met Lys Pro Asn Ser Met Glu Asn Ser Leu Pro Val His Pro Pro Pro
1 5 10 15
Leu Pro Ser Gin Pro Ser Leu Gin Pro His Gin Pro Gly Leu; .Lys Pro
20 25 30 r
Phe Leu Gin Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gin Val Thr Pro Gin Lys
35 40 45
Pro Gly Pro His Pro Pro Met His Pro Gly Gin Leu Pro Leu Gin Glu
50 55 60
Gly Glu Leu Ile Ala Pro Asp Glu Pro Gin Val Ala Pro Ser Glu Asn
65 70 75 80
Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ile Met Asp Phe Gly Asp Pro Gin Phe
85 90 95
Pro Thr Val Phe Gin Ile Ala His Ser Leu Ser Arg Gly Pro Met Ala
100 105 110
His Asn Lys Val Pro Thr Phe Tyr Pro Gly Met Phe Tyr Met Ser Tyr
115 120 125
Gly Ala Asn Gin Leu Asn Ala Pro Gly Arg Ile Gly Phe Met Ser Ser
130 135 140
Glu Glu Met Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Met Gly Tyr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Phe Pro Gly Tyr Gly Gly Phe Arg Gin Thr Leu Arg Gly Leu Asn Gin
165 170 175
Asn Ser Pro Lys Gly Gly Asp Phe Thr Val Glu Val Asp Ser Pro Val
180 185 190
Ser Val Thr Lys Gly Pro Glu Lys Gly Glu Gly Pro Glu Gly Ser Pro
195 200 205
Leu Gin Glu Pro Ser Pro Asp Lys Gly Glu Asn Pro Ala Leu Leu Ser
- 210 215 220
Gin Ile Ala Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Leu Ala Phe Pro Asn Asp
225 230 235 240
His Ile Pro Asn Met Ala Arg Gly Pro Ala Gly Gin Arg Leu Leu Gly
245 250 255
Val Thr Pro Ala Ala Ala Asp Pro Leu Ile Thr Pro Glu Leu Ala Glu
260 265 270
00
0. * 0
0 0 0
000>
0 '0
00
00
0 0 0
0 0 »
0 0 0
0 0 0
0 0 ·
Val Tyr
Glu Ala 290
Met Pro 305
Phe Gin
Glu Thr 275
Thr Met
Gly Asn
Glu Pro
Tyr Gly
Asp Ile
Lys Val 310
Ala Asp 280
Thr Met 295
His Gin
Val Thr
Ser Pro
Pro Gin
Thr Pro
Asp Thr 300
Val His 315
Leu Gly 285
Gin Gin
Asn Ala
Asp Gly
Pro Pro
Trp Arg

Claims (53)
Hide Dependent

1. Použití přípravku aktivní substance zubní skloviny pro přípravu farmaceutického nebo kosmetického prostředku pro hojení ran na kůži nebo na sliznici.
2. Použití přípravku aktivní substance zubní skloviny pro přípravu farmaceutického nebo kosmetického prostředku pro zlepšení hojení ran na kůži nebo na sliznici.
3. Použití přípravku aktivní substance zubní skloviny pro přípravu farmaceutického nebo kosmetického prostředku pro regeneraci nebo reparaci kůže nebo sliznice.
4. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1-3, ve kterém je rána přítomná na sliznici v dutině ústní.
5. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1-3, ve kterém je rána poranění nebo trauma spojené s orálním chirurgickým výkonem včetně periodontálního chirurgického výkonu, extrakce zubu, endodontické terapie, vkládání zubních implantátů, aplikace a používání zubních protéz.
6. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1-3, ve kterém je rána vybrána ze skupiny zahrnující aseptické rány, zhmožděné rány, řezné rány, tržné rány, nepenetrující rány, otevřené rány, penetrující rány, perforující rány, bodné rány, septické rány, infarkty a podkožní rány.
7. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1-3, ve kterém je rána vybrána ze skupiny zahrnující ischemické vředy, proleženiny,
Původní nároky • · » «« «· ··· · · · · 4 · 9 · * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 999 99 99 99 99 píštěle, těžší pokousání, popáleniny a defekty po odběru orgánu.
8. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1-4, ve kterém je rána vybrána ze skupiny zahrnující aftosní rány, traumatické rány a rány asociované s herpes.
9. Použití přípravku aktivní substance zubní skloviny pro přípravu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčbu infekce.
10. Použití podle nároku 9, kde infekce je způsobena mikroorganismem.
11. Použití podle nároku 9 nebo 10 pro prevenci nebo léčbu růstu bakterií na slizničním povrchu.
12. Použití podle nároku 9 nebo 10 pro prevenci nebo léčbu růstu bakterií na nehtu nebo na povrchu zubu.
13. Použití podle nároku 9 nebo 10, kde infekce je přítomná v dutině ústní.
14. Použití podle nároku 13 pro profylaxi a/nebo léčbu bakteriální infekce v dutině ústní.
15. Použití podle jakéhokoliv z nároků 9-14, ve kterém je infekce způsobena bakterií způsobující zubní kaz, jako je například Streptococcus mutans; bakterií způsobující onemocnění periodontu, jako je například Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter Fusobacterie, Staphylococci), B. forsythus; bakterií
Původní nároky
99 99 • 9 9 9 • 9 9 9 způsobující alveolitis, jako je například Staphylococcus, Actinomyces a Bacillus; a bakterií způsobující periapikální léze, jako jsou například Spirochetes.
16. Použití podle jakéhokoliv z nároků 9-11, kde bakterie je přítomná na kůži.
17. Použití přípravku aktivní substance zubní skloviny pro přípravu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčbu zánětlivého onemocnění.
18. Použití podle nároku 17, ve kterém je zánět přítomen v dutině ústní.
19. Použití podle nároku 17, ve kterém je zánět přítomen v místě odběru kostního štěpu.
20. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém je aktivní substancí zubní skloviny matrice zubní skloviny, deriváty matrice zubní skloviny a/nebo proteiny matrice zubní skloviny.
21. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém je aktivní substancí zubní skloviny vybrána ze skupiny skládající se z enamelinů, amelogeninů, non-amelogeninů, nonamelogeninů bohatých na prolin, amelinů (ameloblastinu, sheatlinu), tuftelinů a jejich derivátů a směsí.
22. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém má aktivní substance zubní skloviny molekulovou hmotnost nejvýše 120 kDa, například nejvíce 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa nebo 60 kDa, jak je určeno SDS PAGE elektroforesou.
Původní nároky
4 4 4 4
44 44
23. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém obsahuje přípravek aktivní substance zubní skloviny směs aktivních substancí zubní skloviny různých molekulových hmotností.
24. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém obsahuje přípravek aktivní substance zubní skloviny alespoň dvě substance vybrané ze skupiny zahrnující amelogeniny, nonamelogeniny bohaté na prolin, tuftelin, trsové proteiny, sérové proteiny, slinné proteiny, amelin, ameloblastin, sheatlin a jejich deriváty.
25. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém má aktivní substance zubní skloviny molekulovou hmotnost nejvýše 40000.
26. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém má aktivní substance zubní skloviny molekulovou hmotnost v rozmezí od přibližně 5000 do přibližně 25000.
27. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém má hlavní část aktivní substance zubní skloviny molekulovou hmotnost přibližně 20 kDa.
28. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém je alespoň část aktivní substance zubní skloviny ve formě agregátů nebo může po aplikaci tvořit agregáty.
29. Použití podle nároku 26, ve kterém mají agregáty velikost částic od přibližně 20 nm do přibližně 1 gm.
30. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém je obsah proteinu v přípravku aktivní substance zubní skloviny
Původní nároky ·» ·· ··. ·· ♦ » * · • · · 9 • · · · • 9 9 9 v rozmezí od přibližně 0,05% hmot./hmot. do 100% hmot./hmot., například od přibližně 5-99% hmot./hmot.; přibližně od 10-95% hmot./hmot.,; přibližně od 15-90% hmot./hmot.,; přibližně od 20-90% hmot./hmot.,; přibližně od 30-90% hmot./hmot.,; přibližně od 40-85% hmot./hmot.,; přibližně od 50-80% hmot./hmot.,; přibližně od 60-70% hmot./hmot.,; přibližně od 70-90% hmot./hmot.,; nebo přibližně od 80-90% hmot./hmot.
31. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, ve kterém farmaceutický prostředek dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou přísadu.
32. Použití podle nároku 31, ve kterém je farmaceuticky přijatelnou přísadou propylenglykolalginat.
33. Použití podle nároku 31, ve kterém je farmaceuticky přijatelnou přísadou kyselina hyaluronová nebo její sůl nebo derivát.
34. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1-33, ve kterém je pro hojení ran na kůži nebo na sliznicích použit EMDOGAIN® nebo jakýkoliv protein nebo peptid obsažený v tomto přípravku.
35. Způsob pro zlepšení hojení ran vyznačující se tím, že obsahuje podání profylakticky nebo terapeuticky účinného množství aktivní substance zubní skloviny savci, který potřebuje takovou léčbu.
36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že ránou je poranění nebo trauma spojené s chirurgickým výkonem v ústech jako je periodontální chirurgický zákrok, extrakce zubu, endodontická léčba, vložení zubních implantátů, aplikace a použití zubních protéz; nebo kde je rána vybrána ze
Původní nároky
ΦΦ ΦΦ φ φ φ Φ φ φ φ Φ
Φ Φ 9 9 4 • Φ Φ Φ ·· 44 rány, rány, ·· · 94 44
9 9 99 · Φ φ φ
Φ Φ Φ ΦΦΦΦ /^ζ Φ φ φ φφ φφφφ
Vu? φφφ φ > φ 7 φφ φφφ φφ φφ skupiny zahrnující aseptické rány, zhmožděné rány, řezné lacerované rány, nepenetrující rány, otevřené rány, penetrující rány, perforující rány, bodné rány, septické infarkty a podkožní rány; nebo kde je rána vybrána ze skupiny zahrnující ischemické vředy, proleženiny, píštěle, těžší pokousání, popáleniny a defekty po odběru orgánu; nebo kde je rána vybrána ze skupiny zahrnující aftosní rány, traumatické rány a rány asociované s herpes.
37. Způsob podle nároku 36 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny je vybrána ze skupiny skládající se z enamelinů, amelogeninů, non-amelogeninů, nonamelogeninů bohatých na prolin, amelinů (ameloblastinu, sheatlinu), tuftelinů a jejich derivátů a směsí.
38. Způsob podle nároku 36 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny má molekulovou hmotnost nejvýše 120 kDa, například nejvíce 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa nebo 60 kDa, jak je určeno SDS PAGE elektroforesou.
39. Způsob podle nároku 36 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny je aplikována na ránu • 2 v množství odpovídajícím v hmotnosti celkového proteinu na cm 2 2 od přibližně 0,01 mg/cm do přibližně 20 mg/cm , například od
2 2 přibližně 0,1 mg/cm do přibližně 15 mg/cm .
40. Způsob pro podpoření regenerace a/nebo reparace měkkých tkání vyznačující se tím, že obsahuje podání profylakticky nebo terapeuticky účinného množství aktivní substance zubní skloviny savci, který potřebuje takovou léčbu.
41. Způsob podle nároku 40vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny je vybrána ze skupiny
Původní nároky
44 44 44 44 • · · 4 4 4 4
4 4 4 4 4 4 *
4 444 4 4 44 4
4 4 4 4 4 4 4
44 44 44 44 skládající se z enamelinů, amelogeninů, non-amelogeninů, nonamelogeninů bohatých na prolin, amelinů (ameloblastinu, sheatlinu), tuftelinů a jejich derivátů a směsí.
42. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny má molekulovou hmotnost nejvýše 120 kDa, například nejvíce 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa nebo 60 kDa, jak je určeno SDS PAGE elektroforesou.
43. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny je aplikována na ránu v množství odpovídajícím v hmotnosti celkového proteinu na cm od přibližně 0,01 mg/cm2 do přibližně 20 mg/cm2, například od přibližně 0,1 mg/cm do přibližně 15 mg/cm .
44. Způsob pro prevenci nebo léčbu infekce vyznačující se tím, že obsahuje podání profylakticky nebo terapeuticky účinného množství aktivní substance zubní skloviny savci, který potřebuje takovou léčbu.
45. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny je vybrána ze skupiny skládající se z enamelinů, amelogeninů, non-amelogeninů, nonamelogeninů bohatých na prolin, amelinů (ameloblastinu, sheatlinu), tuftelinů a jejich derivátů a směsí.
46. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny má molekulovou hmotnost nejvýše 120 kDa, například nejvíce 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa nebo 60 kDa, jak je určeno SDS PAGE elektroforesou.
Původní nároky ► 9 99 99 »9
9 9 9 9 9 9 9 · • •9 9 9 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9.9 99
47. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že infekcí je bakteriální infekce na povrchu kůže nebo sliznice.
48. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že bakteriální infekcí je infekce v dutině ústní.
49. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že infekce je způsobena bakterií způsobující zubní kaz, jako je například Streptococcus mutans; bakterií způsobující onemocnění periodontu, jako je například Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Campylobacter Fusobacterie, Staphylococci), B. forsythus; bakterií způsobující alveolitis, jako je například Staphylococcus, Actinomyces a Bacillus; a bakterií způsobující periapikální léze, jako jsou například Spirochetes.
50. Způsob pro prevenci nebo léčbu zánětlivých onemocnění vyznačující se tím, že obsahuje podání profylakticky nebo terapeuticky účinného množství aktivní substance zubní skloviny savci, který potřebuje takovou léčbu.
51. Způsob podle nároku 50 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny je vybrána ze skupiny skládající se z enamelinů, amelogeninů, non-amelogeninů, nonamelogeninů bohatých na prolin, amelinů (ameloblastinu, sheatlinu), tuftelinů a jejich derivátů a směsí.
52. Způsob podle nároku 50 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny má molekulovou hmotnost nejvýše 120 kDa, například nejvíce 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa nebo 60 kDa, jak je určeno SDS PAGE elektroforesou.
Původní nároky • 9
9 9
9 '9
9 9
9 9
99 99 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 999 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 99 99
53. Způsob podle nároku 50 vyznačující se tím, že aktivní substance zubní skloviny je aplikována na ránu v množství odpovídajícím v hmotnosti celkového proteinu na cm od přibližně 0,01 mg/cm2 do přibližně 20 mg/cm2, například od přibližně 0,1 mg/cm do přibližně 15 mg/cm .