DE69938133T2

DE69938133T2 - Ein sprühgetrocknetes bacteriocinpulver mit antimikrobieller aktivität

Info

Publication number: DE69938133T2
Application number: DE69938133T
Authority: DE
Inventors: Reynolds Paul Ross; Colin Hill
Original assignee: University College Cork; Teagasc Agriculture and Food Development Authority
Current assignee: University College Cork; Teagasc Agriculture and Food Development Authority
Priority date: 1998-06-22
Filing date: 1999-06-22
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2019-06-23
Also published as: ES2303379T3; NZ509267A; EP1090035A1; ATE386052T1; DE69938133D1; WO1999067287A1; EP1090035B1; PT1090035E; DK1090035T3; AU4529799A; AU767838B2; US6833150B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines sprühgetrockneten Bakteriocin-Pulvers mit antimikrobieller Aktivität. Die Erfindung betrifft ein Lacticin 3147 sprühgetrocknetes Pulver.
Stand der Technik
Die Eliminierung von Lebensmittelverderben und pathogenen Organismen wurde zum Fokus ausgedehnter Forschungen, da durch Lebensmittel übertragene Krankheiten im Hinblick auf die betroffenen Individuen und Kosten der Behandlung unglaubliche Auswirkungen haben. Es wurde geschätzt, daß mikrobielle Pathogene in Nahrungsmitteln 6,5 bis 33 Millionen Fälle menschlicher Erkrankungen in den USA jährlich auslösen, mit Kosten zwischen $ 2,9 bis $ 6,7 Billionen Dollars (2), wobei Gram-positive Lebensmittelgetragene Pathogene zwischen 25 und 55% der Kosten verursachen. In den letzten Jahren hat die Nachfrage bei den Verbrauchern nach frischem, möglichst wenig verarbeiteten sicheren Lebensmitteln, zusätzlich zu Bedenken gegenüber der Verwendung chemischer Konservierungsmittel in Nahrungsmitteln ein substantielles Interesse an der Anwendung von Biokonvervierungsmitteln ausgelöst. Bacteriocine, die von Milchsäurebakterien erzeugt werden, werden als Alternativen zu traditionellen Konservierungsmitteln zur Sicherstellung der Lebensmittelsicherheit angesehen und potentielle Anwendungen in Lebensmitteln wurden bereits einfach identifiziert (21).
Nisin, ein Bacteriocin, das von bestimmten Stämmen von Lactococcus lactis erzeugt wird, wurde erfolgreich zur Kontrolle des Verderbens von Lebensmitteln verwendet, und zwar bei einer Anzahl unterschiedlicher Lebensmittel, einschließlich Käsen, Konserven und Milchdesserts (10), siehe beispielsweise DE 2616390 und eine Studie hinsichtlich der Herstellung getrockneter Milch mit hohem Nisin-Gehalt (Datenbank FSTA [online] Datenbank-Zugangsur. 75-2-06-p1345). Seine Verwendung unterliegt jedoch bestimmten Restriktionen. Es ist besonders in denjenigen Lebensmitteln effektiv, die einen sauren pH (unterhalb eines pHs von 6,0) und einen niedrigen Protein- und Fettgehalt aufweisen. Es ist oberhalb von pH 6,0 schlecht löslich und hat als solches eine begrenzte Wirksamkeit in vielen Lebensmitteln. Ein pulverförmige Form von Nisin, Nisaplin (Aplin und Barrett, Towbridge, Wiltshire, U. K.) wurde entwickelt und wird für die Konservierung von Lebensmitteln verwendet.
Zusätzlich zu der Entwicklung von Nisaplin wurden andere pulverförmige Bacteriocin-haltige Mittel für die Konservierung von Nahrungsmitteln entwickelt. Propionibacterium freundreichii subsp. shermanni wird verwendet um Microgard (Wesmen Food, Inc., Beaverton, OR) durch Pasteurisierung und Trocknen von Propionibakterien fermentierter entfetteter Milch zu erzeugen. Es wird geschätzt, daß es in ungefähr einem Drittel aller Hüttenkäse verwendet wird, die in den USA hergestellt werden und es soll gegenüber den meisten Gram-negativen Bakterien und einigen Pilzen inhibitorisch wirken (4). Die Wirkstoffe in Microgard beinhalten Propionsäure, Essigsäure, Diacetyl, Milchsäure und ein wärmestabiles Peptid mit ungefähr 700 Daltons, das als besonders aktive Komponente betrachtet wird.
Lacticin 3147 ist ein Bacteriocin, das von L. lactis DPC3147 erzeugt wird, und das einen ähnlichen Wirtsbereich wie Nisin aufweist, nämlich darin, daß es gegenüber einem breiten Bereich Gram-positiver Organismen, einschließlich Listeria, Clostridium spp., Enterococcus, Staphylococcus und Streptococcus inhibitorisch ist (17). Angesichts der Tatsache, daß viele dieser Organismen als Mittel für ein Verderben von Lebensmitteln und eine Pathogenese infiziert wurden, hat die Entwicklung von einem auf Lacticin 3147 basierenden System zur Kontrolle dieser Organismen attraktive Gesichtspunkte. Dies kann auf zwei Weisen erreicht werden. Der erste involviert die Verwendung von Starterkulturen (einschließlich Transkonjuganten), die Lacticin 3147 erzeugen und kann in Lebensmittelfermentationen verwendet werden, wo diese Stämme die ursprünglichen Starterkulturen ersetzen können. Die genetischen Determinanten für Lacticin 3147 werden durch ein 60,2 kb-Plasmid, pMRC01 codiert, das vollständig sequenziert wurde (6) und das in einer Anzahl von Käsestarterkulturen mobilisiert wurde (3). Lacticin 3147 ist Gegenstand der PCT-Anmeldung Nr. PCT/IE96/00022, veröffentlicht als WO 96/32482 .
Kürzlich wurde gezeigt, daß eine Lacticin 3147-erzeugende Transkonjugante Listeria monocytogenes in Hüttenkäse inhibieren kann (13). Dieser Starter wurde auch zur Kontrolle der Proliferation von Nicht-Starter-Milchsäurebakterien in Cheddarkäse verwendet. Der zweite Ansatz zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit durch Verwendung von Lacticin 3147 involvliert die Entwicklung einer sprühgetrockneten Form des Bacteriocins.
Der Vorteil eines solchen bioaktiven Pulvers ist derjenige, daß es als Lebensmittelbestandteil bei einer Vielzahl von Lebensmitteln angewandt werden könnte. Es ist jedoch in keiner Weise eindeutig, daß das Bacteriocin robust genug ist, um einem Sprühtrocknen zu widerstehen und es gab die Möglichkeit, daß das Sprühtrocknen zu einem signifikanten Verlust der Bacteriocin-Aktivität führen würde.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Lacticin 3147-angereicherten Lebensmittelbestandteils zur Inkorporation in Lebensmittel. Insbesondere ist es wünschenswert, ein sprühgetrocknetes Lacticin 3147-Pulver bereitzustellen. Es konnte nicht vorhergesagt werden, daß ein solches sprühgetrocknetes Pulver erzeugt werden könnte, da das Sprühtrocknen zu einer Hitzedenaturierung des Bacteriocins geführt haben könnte, wobei man bedenken sollte, daß Lacticin 3147 aus zwei Peptiden besteht, die beide für die Aktivität benötigt werden. Außerdem könnte eine Dehydratisierung das Bacteriocin irreversibel inaktivieren.
Hier beschrieben wird ein auf Molke basierendes bioaktives Pulver mit einer Effektivität zur Kontrolle von zwei repräsentativen Pathogenen: L. monocytogenes und Staphylococcus aureus, in Puffer bei sowohl neutralem als auch saurem pH. Ebenfalls wird seine Wirksamkeit bei der Kontrolle von L. monocytogenes in einer Kleinkinder-Milchformulierung und anderen Nahrungsmitteln beschrieben. Es wird jedoch für den Fachmann auf dem Gebiet deutlich sein, daß das beschriebene Bacteriocinpulver nicht unbedingt auf einer Milchbasis vorliegen muß und daß es auch möglich wäre, ein sprühgetrocknetes Bacteriocin zu erzeugen, das beispielsweise auf anderen Pulvern, synthetischen Materialien oder ähnlichem basiert.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines sprühgetrockneten Lacticin-3147-Pulvers bereitgestellt, umfassend:

(a) Inokulieren eines Mediums mit einem Lacticin-3147-erzeugenden Stamm von Bakterien,
(b) Fermentation des inokulierten Mediums,
(c) Einstellung des pHs der Fermentation auf einen pH von 6,3 bis 6,7,
(d) Inaktivieren des bakteriellen Fermentats,
(e) Verdampfen des Fermentats von Schritt (d)
(f) Sprühtrocknen des in Schritt (e) erzeugten Pulvers.

Das Medium, das mit den Bakterien inokuliert werden kann, kann aus Milch oder aus Milchprodukten-Basispulvern gewählt werden, einschließlich entmineralisiertem Molkepulver, rekonstituiertem entfettetem Milchpulver, Molkeprotein-Konzentratpulver, pasteurisierter Milch, Cheddarkäsemolke oder synthetischen Labormedien wie LM17 oder TY broth oder ähnlichem Vorzugsweise wird das inokulierte Medium bei ungefähr 30°C für ungefähr 6 bis 24 Stunden fermentiert.
Vorzugsweise wird der pH der Fermentation auf ungefähr 6,5 eingestellt.
In geeigneter Weise wird das bakterielle Fermentat durch Pasteurisierung oder durch Behandlung bei Ultrahochtemperatur inaktiviert.
Geeigneterweise wird das Fermentat, wenn es pasteurisiert wird, bei ungefähr 72°C für ungefähr 15 Sekunden pasteurisiert.
Vorzugsweise wird das inaktivierte Fermentat bei ungefähr 6°C auf ungefähr 40% Gesamtfeststoffe verdampft.
Das Konzentrat von Schritt (e) kann dann ungefähr bei 32°C abgekühlt werden, mit Lactose bei ungefähr 0,1% G/G versetzt werden und man kann es bei einer Kühlrate von ungefähr 1°C pro Stunde kristallisieren lassen.
Das kristallisierte Konzentrat wird dann durch die Verfahren, die auf dem Gebiet im Stand der Technik bekannt sind, gemäß Schritt (f) sprühgetrocknet.
Ein sprühgetrocknetes Lacticin 3147-Pulver, das eine Fähigkeit zur Inhibition von Organismen aufweist, die nicht gegenüber Lacticin 3147 resistent sind und das in geeigneter Weise eine Aktivität von ungefähr 40.240 au (willkürliche Einheit)/pro ml aufweist, wird beschrieben.
Ein Lebensmittelprodukt, umfassend ein sprühgetrocknetes Lacticin 3147-Pulver, wie oben definiert, wird ebenfalls beschrieben. Das Lebensmittelprodukt kann eine Kleinkind-Milchformulierung, eine Soße, Mayonnaise, ein Dessert, ein Yoghurt, ein Senf, eine Konserve wie ein konserviertes pflanzliches oder fleischliches Produkt, eine Suppe, ein Backprodukt oder ähnliche Produkte sein.
Das Lebensmittelprodukt kann weiter einem erhöhten hydrostatischen Druck während der Verarbeitung unterworfen werden, geeigneterweise bei einem Druck von ungefähr 150 bis 800 MPa.
Figuren-Legenden
Die vorliegende Erfindung wird nun im größeren Detail unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, worin:
1: (A) Wachstum vom L. lactis DPC3147 und Lacticin 3147-Produktion in 10% rekonstituierten entmineralisierten Molkepulver bei 30°C, unter pH-kontrollierten und nicht kontrollierten Bedingung. (♦) KBE/ml ohne pH-Kontrolle,
KBE/ml bei konstantem pH von 6,0,
KBE/ml bei konstantem pH von 6,5 und (O) KBE/ml bei konstantem pH von 7,0.
AU/ml ohne pH-Kontrolle, (☐) AU/ml bei konstantem pH von 6,0,
AU/ml bei konstantem pH von 6,5 und
AU/ml bei konstantem pH von 7,0.

(B) Inhibitorische Aktivität von Lacticin 3147 gegen L. lactis HP, wenn (a) ohne pH-Kontrolle und wenn (b) bei einem konstanten pH von 6,5 gezüchtet wird.

2: Schematisches Diagramm des Temperaturprofils und der Lacticin 3147-Aktivität während der Herstellung von Lacticin 3147-Pulver.
3: Wirkung von Lacticin 3147-Pulver auf die Lebensfähigkeit von Listeria monocytogenes Scott A in einem Puffer bei 30°C (A) bei pH 5 und (B) bei pH 7. (♦) ohne Zugabe,
Zugabe von 10% Lacticin 3147-Pulver.
4: Wirkung von Lacticin 3147-Pulver auf die Lebensfähigkeit von Staphylococcus aureus 10 in Puffer bei 30°C (A) bei pH 5 und (B) bei pH 7. (♦) ohne Zugabe,
Zugabe von 15% Lacticin 3147-Pulver.
5: Wirkung von Lacticin 3147-Pulver auf die Lebensfähigkeit von L. monocytogenes Scott A, wenn verwendet als Komponente einer Kleinkind-Milchformel.
15% Lacticin-Pulver,
10% Lacticin-Pulver, 5% Kleinkindmilchpulver,
5% Lacticin-Pulver, 10% Kleinkindmilchpulver, (♦) 15% Kleinkindmilchpulver.
6: Wirkung von Lacticin 3147-Pulver (10%) auf die Lebensfähigkeit von Listeria monocytogenes Scott A in Yoghurt. (♦) Kein Lacticin 3147 zugefügt,
10% Lacticin 3147 zugefügt. 10% bezieht sich hier auf 10 g Lacticin 3147-Pulver zugefügt zu 90 g Yoghurt.
7: Wirkung von Lacticin 3147-Pulver (10%) auf die Lebensfähigkeit von Listeria monocytogenes Scott A in Hüttenkäse. (♦) Kein Lacticin 3147 zugefügt,
10% Lacticin 3147 zugefügt. 10% bezieht sich hier auf 10 g Lacticin 3147-Pulver zugefügt zu 90 g Hüttenkäse.
8: Wirkung von Lacticin 3147-Pulver (10%) auf die Lebensfähigkeit von Bacillus cereus in (Paket) suppe.

(♦) kein Lacticin 3147 zugefügt,
1% Lacticin 3147 zugefügt,
5% Lacticin 3147 zugefügt,
10% Lacticin 3147 zugefügt.

1, 5 und 10% bezieht sich hier jeweils auf 1, 5 oder 10 g Lacticin 3147-Pulver, zugefügt zu 99, 95 bzw. 90 g Paket-Suppenpulver, rekonstituiert gemäß den Anweisungen des Herstellers.
9: Wirkung von Lacticin 3147-Pulver (10%) auf die Lebensfähigkeit von Listeria monocytogenes Scott A in (Paket) suppe.

1, 5 und 10% bezieht sich hier jeweils auf 1, 5 oder 10 g Lacticin 3147-Pulver, zugefügt zu 99, 95 bzw. 90 g Paket-Suppenpulver, rekonstituiert gemäß den Anweisungen des Herstellers.
10: Wirkung von ansteigendem Druck auf die Aktivität von Lacticin 3147, (a) atmosphärischer Druck, (b) 200 MPa, (c) 400 MPa, (d) 600 MPa und (e) 800 MPa.
11: Wirkung von Hochdruck und Lacticin 3147 auf die Lebensfähigkeit von L. innocua DPC1770-Lebensfähigkeit.
Beispiel
Material und Methoden
Bakterielle Stämme und Kulturbedingungen
Der Bacteriocin-Erzeuger L. lactis subsp lactis DPC3147 und der empfindliche Indikatorstamm L. lactis subsp lactis HP wurden routinemäßig bei 30°C in M17 (20; Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England), supplementiert mit 0,5% (G/V) Lactose gezüchtet. Andere Indikatorstämme, die verwendet wurden, beinhalteten L. monocytogenes Scott A, gezüchtet in Trypicase Soy Broth (TSB, Becton Dickinson und Co., Cockeysville, MD21030, USA), supplementiert mit 0,6% (G/V) Hefeextrakte (Oxoid) und Staphylococcus aureus 10 (DPC culture collection, Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irland), gezüchtet in Brain Heart Infusion broth (BHI, Oxoid), bei 37°C. Feste Medien wurden durch Zugabe von 1% bakteriologischem Agar (Oxoid) hergestellt.
Eine Anzahl unterschiedlicher Medien wurde im Hinblick auf die Produktion von Lacticin 3147 untersucht. Diese wurden als 10% (G/V)-Lösungen hergestellt, außer aus pasteurisierter Vollmilch- und Ceddarkäsemolke. Die 10%igen Lösungen wurden aus entmineralisiertem Molkepulver (95% entmineralisiert) hergestellt, aus rekonstituiertem entfettetem Milchpulver (Dairygold, Mitchelstown, Co., Cork. Irland) und Molkeprotein-Konzentratpulver (WPC35, 35% Protein in der Trockenmasse, Moorepark Technology Ltd., Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irland). Die auf Molke basierenden Lösungen wurden durch Erhitzung auf 95°C für 30 Minuten sterilisiert. Die entfettete Milchpulverlösung wurde durch Autoklavieren bei 121°C für 5 Minuten sterilisiert.
Bacteriocin-Assay und Aktivitätsbestimmung
Die Bacteriocin-Aktivität wurde durch den Agar-Vertiefungsdiffusionsassay, wie beschrieben von Parente und Hill (15), bestimmt. Geschmolzener Agar wurde mit einem Indikatorstamm versetzt und in Petrischalen verteilt. Vertiefungen mit einem Durchmesser von ungefähr 4,6 mm wurden in den Agar gebohrt und ein 50 μl-Volumen einer zweifachen Serienverdünnung einer Bacteriocin-Präparation wurden in jede Vertiefung ausgegeben. Die Bacteriocin-Lösung wurde Zentrifugation der Kultur und Wärmebehandlung des Überstands bei 70°C für 10 Minuten vor der Durchführung der Verdünnungsreihe hergestellt. Die Platten wurden dann bei entweder 30 oder 37°C inkubiert, abhängig von dem verwendeten Indikatorstamm. Die Bacteriocin-Aktivität wurde als inverse Zahl der letzten Verdünnung berechnet, die eine definitive Clearance-Zone nach Inkubation über Nacht ergab. Aktivitätseinheiten (AU) wurden pro Milliliter ausgedrückt (1/Verdünnung × 20).
Kontrollierte pH-Fermentationen
Kontrollierte pH-Fermentationen wurden über eine 24-stündige Zeitspanne durchgeführt, wobei leicht bewegt wurde (ungefähr 20 Upm), bei 30°C. Ein 1%iges Inokulum von DPC3147 wurde zum Inokulieren von 100 ml Wachstumsmedium verwendet. Der pH der Wachstumsmedien wurde durch Zugabe von 1,0 M NaOH nach Bedarf über ein 718 STAT Titrino (Metrohm, Irland) konstant gehalten. Zellzahlen und Bacteriocin-Aktivitätsbestimmungen wurden in stündlichen Intervallen für die ersten 10 Stunden durchgeführt und eine letzte Probe wurde nach 24 Stunden genommen.
Produktion eines sprühgetrockneten Lacticin 3147-Pulvers
170 l-Volumen von entmineralisiertem Molkepulver (10% Gesamtfeststoffe) wurden mit 1% DPC3147 inokuliert und der pH der 24-stündigen Fermentation wurde durch Zugabe von 2,5 M NaOH nach Bedarf kontrolliert (pH 6,5). Das Fermentat wurde dann bei 72°C für 15 s unter Verwendung eines APV SSP-Pasteurisators (APV, Silkborg, Dänemark) pasteurisiert. Das pasteurisierte Fermentat wurde dann bei 60°C auf 40% Gesamtfeststoffe unter Verwendung eines "single effect" Fallstromverdampfer (Anhydro Modell F1 Lab.) verdampft. Das resultierende Konzentrat wurde auf 32°C abgekühlt, mit Lactose (0,1% G/G) versetzt und man ließ es über Nacht bei einer Abkühlrate von 1°C pro Stunde präkristallisieren. Das präkristallisierte Konzentrat wurde dann unter Verwendung einer Düsenatomisiervorrichtung in einem Anhydro-Spray-Trockner (Anhydro Modell Lab 3) bei einer Lufteinlaßtemperatur von 190°C und einer Auslaßtemperatur von 90°C sprühgetrocknet. Das Pulver wurde auf Aliquots verteilt, in Folien ausgekleidete Probentaschen als Täschchen verpackt und bei 4°C gelagert. Die Bacteriocin-Aktivität wurde bei jedem Schritt während des Prozesses bewertet.
Wirkung des Lacticin 3147-Pulvers gegen Pathogene in Puffer
Empfindliche Zellen wurden bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet, gewaschen und mit ungefähr 10⁷ bis 10⁸ KBE/ml in 2,5 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0 oder pH 5,0 und 2,5 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0 oder pH 5,0, supplementiert mit 10 mM Glucose resuspendiert. Lacticin 3147-Pulver wurde zugefügt (in unterschiedlichen Konzentrationen, abhängig von dem untersuchten empfindlichen Stamm) und Proben wurden in geeigneten Zeitintervallen über eine 3-stündige Periode zur Bestimmung der Zahl der lebensfähigen Zellen genommen.
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver gegen L. monocytogenes in einer Kleinkind-Milchformulierung
Lacticin 3147-Pulver wurde zu einer kommerziell erhältlichen Kleinkind-Milchformel zugefügt [Bestandteile aufgeführt wie folgt: entmineralisiertes Molkepulver, pflanzliche Öle, Lactose, entfettete Milch, Calciumcarbonat, Kaliumcitrat, Calciumchlorid, Natriumcitrat, Magnesiumchlorid, Vitamin C, Emulgator (Sojalecithin), Taurin, Kaliumhydroxid, Eisensulfat, Zinksulfat, Vitamin E, Nicotinamid, Pantothensäure, Vitamin A, Kupfersulfat, Zitronensäure, Thiamin, Vitamin B₆ (Karotin, Mangansulfat, Kaliumiodid, Folsäure, Vitamin K, Natriumselenit, Vitamin D, Biotin). Die Angaben des Herstellers geben an, daß die endgültige Flüssigkeit für den Kleinkindverbrauch eine 15%ige Lösung ist (G/V). In Experimenten wurde das 15%ige (G/V) Kleinkindmilchpulver durch entweder 5% (G/V) Lacticin-Pulver und 10% (G/V) Kleinkindmilchpulver oder durch 10% (G/V) Lacticin-Pulver und 5% (G/V) Kleinkindmilchpulver ersetzt. L. monocytogenes-Zellen wurden zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet, gewaschen und bei ungefähr 10⁴ KBE/ml in verschiedenen Kleinkindmilch-Formulierungen bei 30°C resuspendiert und Proben wurden nach geeigneten Zeitintervallen über eine dreistündige Periode zur Bestimmung der Zahl der lebensfähigen Zellen genommen.
Präparation von Lacticin 3147 zur Verwendung in Hochdruckinaktivierungsstudien
Für die Inaktivierung von Staph. aureus ATCC6538 wurde eine flüssige Präparation von Lacticin 3147 unter Verwendung einer hydrophoben Adsorptionschromatographie hergestellt. Für Studien hinsichtlich der Inaktivierung von L. innocua DPC1770 wurde eine food grade-Pulver-Präparation von Lacticin 3147 wie oben beschrieben hergestellt, wobei sie die folgende Modifikation aufwies: eine 1%ige entmineralisierte Molkepulverlösung wurde mit L. lactis susp. lactis DPC3147 unter Bedingungen einer pH-Kontrolle mit einem pH von 6,0 für 18 Stunden fermentiert.
Die Aktivität von beiden Lacticin 3147-Präparationen wurde durch den Agar-Vertiefungsdiffusionsassay, wie beschrieben von Parente und Hill (15), bestimmt. Geschmolzener Agar wurde mit dem Indikatorstamm L. lactis subsp. lactis HP ausgesät und auf Petrischalen verteilt. Vertiefungen mit einem Durchmesser von ungefähr 6,0 mm wurden in den Agar gebohrt und ein 50 μl-Volumen einer zweifachen seriellen Verdünnung einer Bacteriocin-Präparation wurde in jede Vertiefung ausgegeben. Dann wurden die Platten bei 30°C inkubiert. Die Bacteriocin-Aktivität wurde als inverse Zahl der letzten Verdünnung, die eine definitive Clearance-Zone nach Inkubation über Nacht ergab, berechnet. Aktivitätseinheiten (AU) wurden pro Milliliter ausgedrückt (1/Verdünnung × 20). Die Aktivität kann auch als Zonendurchmesser (mm) ausgedrückt werden, wobei der Durchmesser der ersten Zone (rein, unverdünnte Probe) der Verdünnungsreihe aufgezeichnet wird.
Wirkung von Hochdruck auf die Staph. aureus ATCC6538 und L. innocua DPC1770 Lebensfähigkeit
Staph. aureus ATCC6538-Zellen wurden in 10% RSM resuspendiert und in sterile 700 μl PCR-Eppendorfs als Aliquots verteilt, bevor sie in sterile Stomacher-bags plaziert wurden (Seward Ltd., London, UK). 10 ml Volumina von L. innocua DPC1770-Zellen wurden in 20% rekonstituiertem entmineralisiertem Molkepulver resuspendiert, aliquotiert in sterile Stomacher-bags. Die Proben wurden individuell vor ihrem Plazieren in einem Druckgefäß vakuumversiegelt (Stansted Fluid Power Ltd., Stanstet, England). Das Gefäß bestand aus einem Zylinder aus rostfreiem Stahl (37 mm Durchmesser × 300 mm Höhe), gefüllt mit einem 15% (V/V) Castoröl in Ethanol-Lösung, das als hydrostatisches Druckbildungsmedium wirkte. Die Proben wurden bei 25°C für 30 min in einem DrucKBEreich von 150 bis 600 MPa behandelt, zusätzlich zu einer Kontrollprobe, die bei atmosphärischen Druck (0,1 MPa) gehalten wurde. Alle Experimente wurden im Duplikat durchgeführt. Die Kammer temperatur wurde durch ein Thermoregulierungssystem bestimmt, das zirkulierte, um die Kammertemperatur zu erhalten.
Wirkung von Hochdruck auf die Lacticin 3147-Aktivität
Um die Wirkung von Hochdruck auf die Lacticin 3147-Aktivität zu bestimmen, wurden rekonstituiertes Lacticin 3147-Pulver und Aliquots von flüssigem Lacticin 3147 vakuumversiegelt und Druck in einem Bereich von 100 bis 800 MPa wie oben beschrieben ausgesetzt. Unter Druck gesetzte und nicht unter Druck gesetzte Lösungen von Lacticin 3147 wurden bei 80°C 10 Minuten vor einer Durchführung einer Aktivitätsbestimmung durch den Vertiefungsdiffusionsassay unter Verwendung von L. lactis HP als Indikatorstamm wärmebehandelt.
Ergebnisse
Das Ziel dieser Forschung war die Entwicklung eines Verfahrens zur Erzeugung einer pulverförmigen Form von Lacticin 3147, das zur Verwendung als Bestandteil geeignet ist, der die Kontrolle von unerwünschten Mikroorganismen in Nahrungsmitteln unterstützen kann. Folgend auf die Optimierung der Lacticin 3147-Produktion wurde eine Scale-Up-Fermentation durchgeführt und das Fermentat wurde sprühgetrocknet, um ein Bacteriocinreiches Pulver zu bilden. Dieses Pulver wurde sowohl in einem Puffer als auch in einem Kleinkind-Milchnahrungsmittelsystem im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Inhibition von Pathogenen bewertet.
Lacticin 3147-Produktion in verschiedenen Medien
Folgend auf eine Inokulation von DPC3147 (1%) und Übernacht-Inkubation bei 30°C wurde die Lacticin 3147-Aktivität in einer Anzahl unterschiedlicher Wachstumsmedien bewertet. Die meisten Medien basierten auf Milchprodukten jedoch waren auch zwei synthetische Medien beinhaltet (LM17 und TV). Die Ergebnisse der Produktion von Lacticin 3147 (siehe Tabelle 1) demonstrierten, daß die Aktivität in allen auf Milch basierenden Medien (1280 bis 2560 AU/ml) hoch war, außer bei WPC35 (320 AU/ml). Die höchsten Lacticin 3147-Aktivitätsniveaus wurden in Cheddarkäse-Molke angetroffen, außerdem in Vollmilch und LM17 (2560 AU/ml). Sowohl 10%iges rekonstituiertes entmineralisiertes Molkepulver als auch 10%iges rekonstituiertes entfettetes Milchpulver ergab eine Aktivität von 1280 AU/ml. Niedrigere Lacticin 3147-Aktivitätsniveaus wurden bei TY-broth beobachtet (640 AU/ml).
Da entmineralisiertes Molkepulver kommerziell und einfach erhältlich ist und eine gute Lacticin 3147-Aktivität in diesen Medien beobachtet wurde, wurden weitere Untersuchungen hinsichtlich der Optimierung der Lacticin 3147-Produktion in entmineralisiertem Molkepulver durchgeführt.
Optimierung der Lacticin 3147-Produktion in 10%igen rekonstituiertem entmineralisiertem Molkepulver
Die Bacteriocin-Produktion und die Zahl lebensfähiger Zellen in pH-kontrollierten und pH-nicht-kontrollierten Fermentationen ergaben, daß erhöhte Niveaus von Lacticin 3147 durch Erhalt des pHs bei einem konstanten Wert, nämlich pH 6,5 in den Wachstumsmedien erzeugt werden konnten (1). Die Niveaus der Bacteriocin-Aktivität erreichten 10 240 AU/ml in 10%igem rekonstituiertem entmineralisierten Molkepulver, wenn der pH des Wachstumsmediums bei einem pH von 6,5 konstant gehalten wurde (1B(a)), im Vergleich mit 640 AU/ml, wenn keine pH-Kontrolle ausgeübt wurde (1B(b)). Sowohl bei pH 6,0 als auch pH 7,0 erreichte die Lacticin-Aktivität 5120 AU/ml. Die Ergebnisse der Zählungen der lebensfähigen Zellen über eine 24-stündige Zeitspanne zeigten an, daß eine erhöhte Bacteriocin-Aktivität zu höheren Zelldichten korrespondierte. Ohne pH-Kontrolle erreichte die Zahl lebensfähiger Zellen 1 × 10⁹ KBE/ml, während bei Erhalt des pHs in den Wachstumsmedien bei einem konstanten pH von 6,5 die Zahl lebensfähiger Zellen 3,8 × 10⁹ KBE/ml erreichte (1A). Mit einer pH-Kontrolle bei 6,0 und 7,0 erreichten die Zahlen lebensfähiger Zellen 2,5 × 10⁹ KBE/ml.
Produktion von Lacticin 3147-Pulver
Eine sprühgetrocknete Lacticin 3147-Präparation wurde wie in Material und Methoden beschrieben hergestellt. während des Herstellungsverfahrens wurde die Bacteriocin-Aktivität bei jedem Schritt bewertet, wobei L. lactis HP als Indikatorstamm verwendet wurde (2). Folgend auf die pH-kontrollierte Fermentation (in 10% rekonstituiertem entmineralisiertem Molkepulver) betrug die Bacteriocin-Aktivität 10 240 AU/ml. Das Fermentat wurde einer Pasteurisierung unterworfen, um die Bacteriocin-produzierende Kultur DPC3147 zu inaktivieren. Die Pasteurisierung hatte keine Wirkung auf die Bacteriocin-Aktivität (2). Eine Verdampfung (von 10% Feststoffen zu 40% Gesamtfeststoffen) führte zu einer Konzentration des Fermentats und führte zu einem Anstieg der Bacteriocin-Aktivität auf 40 960 AU/ml. Folgend auf eine Über-Nacht-Kristallisierung blieb die Aktivität des Konzentrats stabil. Ein Sprühtrocknen des Konzentrats führte zu einer Produktion eines aktiven Pulvers. Wenn das sprühgetrocknete Pulver bei einer Konzentration von 50 mg/ml (5% Feststoffe) resuspendiert wurde, enthielt es 5120 AU, was anzeigte, daß die Aktivität des Lacticin-Pulvers 102 400 AU/g (100% Feststoffe) betrug. Die als AU/g von Trockenmasse ausgedrückte Lacticin 3147-Aktivität blieb während der Herstellung konstant bei 102 400 AU/g, was anzeigte, daß während der Verarbeitung kein Verlust der Bacteriocin-Aktivität auftrat.
Die inhibitorische Aktivität des mit Bacteriocin angereicherten Pulvers wurde der Wirkung von Lacticin 3147 und nicht derjenigen anderer Fermentationsmetaboliten wie Milchsäure zugeschrieben, da es einen empfindlichen L. lactis MG1614 inhibierte, jedoch keine inhibitorische Wirkung gegen eine Transkonjugante zeigte, die das pMRC01-Plasmid enthielt.
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver auf Pathogene
Das mit Lacticin 3147 angereicherte entmineralisierte Molkepulver (Lacticin 3147-Pulver) wurde im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Inhibition zweier Lebensmittel-getragener Pathogene untersucht. Die inhibitorische Wirkung des Pulvers wurde bei einem pH von 5 und einem pH von 7 untersucht, in Gegenwart und Abwesenheit von 10 mM Glucose. Die Wirksamkeit einer 10%igen (G/V)-Lösung von Lacticin 3147-Pulver gegen Zellen in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase von L. monocytogenes Scott A demonstrierte, daß ungefähr eine 3,3 log-Tötung (99,95%ige Tötung) bei einem pH von 5 innerhalb von 3 Stunden bei 30°C erreicht werden konnte (3A). Ein Abtöten von L. monocytogenes Scott A mit einer 10%igen (G/V)-Lösung von Lacticin-Pulver war etwas effektiver bei pH 7 (3B). Eine 3,8 log-Tötung (99,98%ige Tötung) wurde innerhalb von 3 Stunden bei 30°C beobachtet.
Es erwies sich, daß S. aureus 10 gegenüber der Wirkung des an Lacticin angereicherten Pulvers etwas resistenter war als L. monocytogenes Scott A; aus diesem Grund wurde eine 15%ige Lösung des Pulvers verwendet. Die Wirksamkeit einer 15%igen (G/V)-Lösung von Lacticin 3147-Pulver gegen Zellen von S. aureus 10 in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase führte zu einer ungefähr 1,1 log-Tötung (90,4%igen Tötung) bei pH 5 innerhalb von 3 Stunden bei 30°C (4A). Die Abtötungswirkung einer 15%igen Lösung (G/V) eines Lacticin-Pulvers erhöhte sich dramatisch bei pH 7, wo ungefähr eine 4 log-Abtötung (99,98%ige Tötung) von S. aureus 10 innerhalb von 3 Stunden bei 30°C beobachtet wurde (4B). Der Einschluß von 10 mM Glucose führte nur zu geringen Anstiegen im Niveau des Zelltods für sowohl L. monocytogenes Scott A als auch S. aureus 10 (Ergebnisse nicht dargestellt).
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver gegen L. monocytogenes Scott A in einer Kleinkind-Milchformulierung
Um die Wirksamkeit des Lacticin 3147-Pulvers in einem Nahrungsmittelsystem zu bewerten, wurden Experimente an einer Kleinkind-Milchformel durchgeführt, da diese ein Beispiel für ein Nahrungsmittel ist, das für Verbraucher mit hohem Risiko bestimmt ist und das entmineralisiertes Molkepulver als Hauptbestandteil enthält. Die Ergebnisse zeigten eine mehr als 99%ige Abtötung von L. monocytogenes Scott A, die sich ergaben, wenn ein Teil der Kleinkind-Milchformulierung durch entweder zwei Drittel (10% Lacticin-Pulver und 5% Kleinkind-Milchpulver) oder ein Drittel Lacticin 3147-Pulver (5% Lacticin-Pulver und 10% Kleinkind-Milchpulver) ersetzt wurden (5). Die Zahlen reduzierten sich hier von ungefähr 7 × 10⁴ KBE/ml auf 3 × 10¹ KBE/ml innerhalb von 3 Stunden bei 30°C. In der Kontrollkultur ohne vorhandenes Lacticin 3147-Pulver erhöhten sich die Zahlen von ungefähr 10⁴ KBE/ml auf ungefähr 10⁵ KBE/ml in derselben Zeitspanne.
Anwendung des Lacticin 3147-Pulvers auf einen Bereich von Nahrungsmitteln
Pulverförmiges Lacticin 3147 wurde im Hinblick auf seine Inhibition eines Verderbens von Nahrungsmitteln bewertet sowie von pathogenen Mikroorganismen in einer Anzahl von Nahrungsmittelsystemen, einschließlich Kleinkind-Nahrungsmittelformeln, pulverförmigen Suppen, Hüttenkäse und natürlichem Yoghurt. Das folgende sind spezifische Beispiele der Verwendung von Lacticin 3147 zur Inhibition von Pathogenen in Nahrungsmittelsystemen.
Die Fähigkeit des Lacticin 3147-Pulvers zur Inhibition von Listeria monocytogenes Scott A wurde anfänglich in einer Kleinkind-Milchformulierung wie oben beschrieben untersucht. Um die inhibitorische Wirkung des Lacticin 3147-Pulvers weiter zu untersuchen, wurden Inaktivierungsversuche gegen eine Anzahl unterschiedlicher Mikroorganismen in natürlichem Yoghurt, Hüttenkäse und rekonstituierter pulverförmiger Suppe durchgeführt, mit pHs von 4,5, 4,4 bzw. 6,6.
Die Wirkung des 10%igen Lacticin 3147-Pulvers auf die Inhibition von Listeria monocytogenes Scott A (10⁴ KBE/ml) in natürlichem Yoghurt demonstrierte, daß mehr als 98,3% der Kultur innerhalb von 5 Minuten bei 30°C abgetötet wurde. Innerhalb von 60 Minuten verblieben keine lebensfähigen Zellen (6).
Im Falle des Hüttenkäses, der mit 10⁴ KBE/ml Listeria monocytogenes inokuliert worden war, wurde 40% der Population innerhalb von 5 Minuten bei 30°C in Gegenwart von 10% Lacticin 3147-Pulver abgetötet. Nach 160 Minuten blieb nur 14% der Population lebensfähig (7).
Die Wirkung von 1, 5 und 10%igen Konzentrationen von Lacticin 3147 in pulverförmiger Suppe gegen Bacillus cereus bei 30°C demonstrierte, daß folgend auf eine 24-stündige Inkubation eine mehr als 99,9%ige Abtötung in Gegenwart der 5 und 10%igen Lacticin 3147-Pulverkonzentrationen beobachtet wurde. Im Fall der 1%igen Lacticin 3147-Konzentration überlebten 17% der Populationen (8).
Eine ähnliche Studie wurde durchgeführt um die Wirkung von 1, 5 und 10%igen Konzentrationen des Lacticin 3147-Pulvers auf das Überleben von Listeria monocytogenes Scott A in pulverförmiger Suppe zu bestimmen. Eine 1%ige Konzentration von Lacticin war bei der Inhibition von Scott A innerhalb von 24 Stunden ineffektiv, während eine 5%ige Konzentration mehr als 10% der Population inhibiert war. Bei einer Konzentration von 10% wurden mehr als 40% der Kultur inhibiert (9).
Aus diesen Ergebnissen kann man sehen, daß eine pulverförmige Form von Lacticin 3147 tatsächlich viele Anwendungen bei der Nahrungsmittelsicherheit zur Kontrolle von Nahrungsmittelpathogenen und Organismen, die zu einem Verderben derselben führen, aufweist.
Wirkung von hydrostatischen Druck
Die Verwendung von hydrostatischem Druck und Lacticin 3147-Behandlungen wurde in Milch und Molke im Hinblick auf eine Kombination beider Behandlungen zur Verbesserung der Qualität von nur minimal verarbeiteten Milchnahrungsmitteln bewertet. Das System wurde unter Verwendung von zwei Nahrungsmittel-getragenen Pathogenen, Staphylococcus aureus ATCC6538 und Listeria innocua DPC1770 bewertet. Versuche gegen Staph. aureus ATCC6538 wurden unter Verwendung von konzentriertem Lacticin 3147, hergestellt aus Kulturüberstand, durchgeführt. Die Ergebnisse demonstrierten eine mehr als additive Wirkung, wenn beide Behandlungen in Kombination verwendet wurden, beispielsweise führte die Kombination von 250 MPa (2,2 log Reduktion) und Lacticin 3147 (1 log Reduktion) zur mehr als 6 logs Abtötung (10). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn eine pulverförmige Form vom Nahrungsmittelgrad von Lacticin 3147 (entwickelt aus einer sprühgetrockneten Fermentation von rekonstituiertem entmineralisiertem Molkepulver) im Hinblick auf die Inaktivierung von L. innocua DPC1770 bewertet (11). Weiterhin wurde beobachtet, daß die Behandlung von Lacticin 3147-Präparationen mit Druck von mehr als 400 MPa zu einem Anstieg der Bacteriocin-Aktivität führte (äquivalent zu einer Verdopplung der Aktivität). Diese Ergebnisse zeigen an, daß eine Kombination von Hochdruck und Lacticin 3147 zur Verbesserung der Qualität von nur minimal prozessierten Nahrungsmitteln bei niedrigeren hydrostatischen Druckniveaus geeignet sein kann.
Diskussion
Die Entwicklung eines auf Molke basierenden bioaktiven Nahrungsmittelbestandteils wurde folgend auf Untersuchungen zur Lacticin 3147-Produktion in unterschiedlichen Medien erreicht. Die Lacticin 3147-Aktivität war bei allen untersuchten auf Milch basierenden Medien hoch, außer bei dem Molkeprotein-Konzentrat (WPC35). Eine mögliche Erklärung für das niedrige Aktivitätsniveau im Molkeprotein-Konzentrat könnte sein, daß die Bacteriocin-Aktivität vor dem Assay auf die Aktivität in das Pellet bei Zentrifugation fraktionierte. Zwei synthetische Medien wurden im Hinblick auf die Lacticin 3147-Produktion untersucht, die LM17 broth (20) und TY broth (15). Die Niveaus der Lacticin 3147-Aktivität in LM17 waren vergleichbar zur denjenigen bei auf Milch basierenden Medien, jedoch war dies nicht unerwartet, da diese Medien für die Kultivierung von Lactococcen entwickelt wurden. Die TY-broth, worin niedrige Niveaus einer Lacticin 3147-Aktivität beobachtet wurden, wurde entwickelt, um optimale Bacteriocin (Enterocin 116)-Produktion zu ergeben, während die Peptidniveaus im Medium minimiert wurden (um Peptide zu eliminieren, die mit der Reinigung interferieren könnten). Für die Entwicklung eines Pulvers ist die Verwendung des besonders kosteneffektiven Wachstumsmediums natürlich vorteilhaft. Entmineralisierte Molkepulver, ein leicht erhältliches und kosteneffektives Medium (20 $ pro 25 kg) wurde im Hinblick auf eine. Optimierung der Lacticin 3147-Produktion untersucht. Andere geeignete Wachstumsmedien können jedoch wie oben beschrieben verwendet werden.
Die Wirkung des pHs auf die Bacteriocin-Produktion wurde gut dokumentiert und für eine Anzahl von Bacteriocin-erzeugenden Stämmen führt die Kontrolle des pHs während des Wachstums zur höheren Bacteriocin-Titern (11, 14, 18). Die Lacticin 3147-Aktivität stieg dramatisch, wenn der pH der Wachstumsmedien bei einem pH von 6,5 konstant gehalten wurde. Die fünf höchsten Bacteriocin-Titer und höchsten Zellzahlen wurden bei diesem pH beobachtet. Die niedrigsten Bacteriocin-Titer und niedrigsten Zellzahlen wurden beobachtet, wenn keine pH-Kontrolle ausgeübt wurde. Eine erhöhte Bacteriocin-Aktivität korrespondierte zu erhöhten Zellzahlen.
Sobald die Lacticin 3147-Produktion in 10%igem rekonstituiertem entmineralisiertem Molkepulver optimiert worden war, wurde ein Fermentation in großem Umfang aufgestellt, um ausreichend Fermentat für ein Sprühtrocknen zu erzeugen. Die Produktion eines aktiven sprühgetrockneten Pulvers demonstrierte die Flexibilität des Bacteriocins, in den Extremen der Verarbeitungsbedingungen. Die Aktivität wurde während des Verfahrens nachgewiesen und das endgültige Pulver hatte eine Aktivität von 102 400 AU/g Trockenstoff, äquivalent zu der zu Beginn des Prozesses vorliegenden Aktivität. Dieses unerwartete Ergebnis ist signifikant darin, daß es nahelegt, daß während der Produktion keinerlei Aktivität verlorengeht.
Die Bewertung der inhibitorischen Aktivität des bioaktiven Pulvers demonstrierte, daß es dazu in der Lage ist, sowohl L. monocytogenes als auch S. aureus bei einem pH von 5 und einem pH von 7 zu inhibieren. In beiden Fällen zeigte das bioaktive Pulver eine erhöhte Abtötungsfähigkeit bei neutralem pH. Dies ist eine signifikante Feststellung, da Nisaplin, ein fermentierter Nahrungsbestandteil zur Verlängerung der Lagerfähigkeit eines Produkts und zur Verhinderung von Verderben bekanntlich besonders bei saurem pH effektiv ist (unterhalb eines pHs von 6,0). Die Entwicklung eines Nahrungsmittelbestandteils, der Gram-positive Bakterien bei neutralem pH abtöten kann, zeigt an, daß das Lacticin 3147-Pulver zum Einbau in einen breiteren Bereich von Nahrungsmittel geeignet sein kann, wo es bis jetzt keine Gelegenheit für eine Verhinderung eines Verderbens der Nahrungsmittel/Pathogenese, außer einem Einschluß chemikalischer Konservierungsmittel, gab.
Der Wirkungsmechanismus von Lacticin 3147 wurde erhellt (12). Es induziert einen Zelltod durch Permeabilisieren der Membranen empfindlicher Zellen durch Porenbildung, was einen Ausfluß von K⁺-Ionen und Phosphat ermöglicht. Diese Wirkung resultiert in der Verteilung der Protonen-Antriebskraft, einer Hydrolyse von intrazellulärem ATP und schließlich Zelltod. Energetisch aufgeladene Zellen sind gegenüber der Wirkung von Lacticin 3147 stärker empfänglich. Die Zellen, die in Gegenwart von Lacticin-Pulver inkubiert wurden, kombiniert mit 10 mM Glucose, zeigten einen leichten Anstieg der Abtötungseffizienz (außer bei S. aureus 10 bei pH 7, Ergebnisse nicht dargestellt). Dies stimmt mit den von McAuliffe et al. (12) berichteten Ergebnissen überein, wobei beobachtet wurde, daß energetisch geladenen Zellen gegenüber Lacticin 3147 empfindlicher waren. Energetisch geladene Zellen haben eine Protonen-Antriebskraft, die die Insertion des Lacticin 3147-Moleküls in die Membran begünstigen könnte, wie beispielsweise im Fall von Nisin, einem lantibiotischen Porenbilder (7, 8).
Die Entwicklung einer pulverförmigen Form von Lacticin 3147 würde es ermöglichen, daß es in einer Anzahl von Nahrungsmittelsystemen verwendet wird. Da das existierende Lacticin 3147-Pulver aus entmineralisiertem Molkepulver entwickelt wurde, hat dieses Pulver Anwendungen bei allen Nahrungsmitteln, bei denen entmineralisiertes Molkepulver ein existierender Bestandteil ist. Beispielsweise wird entmineralisiertes Molkepulver in eine Anzahl von Nahrungsmitteln, einschließlich Kleinkind-Milchformulierungen eingebaut. Die in diesem Artikel demonstrierten Ergebnisse demonstrieren die Fähigkeit dieses Pulvers effektiv 99% von L. monocytogenes Scott A, zugegeben zu einer Kleinkind-Formel zu inaktivieren, wobei ein Teil des Kleinkind-Milchpulvers durch das Lacticin 3147-Pulver ersetzt wurde. Kleinkind-Milchformulierungen werden mit dem höchstmöglichen Standard hergestellt und das Auftreten von durch Nahrungsmittel übertragene Krankheiten, die mit solchen Nahrungsmitteln assoziiert sind, ist selten. Mehr als viele andere Nahrungsmittel sind jedoch Kleinkind-Milchformeln gegenüber einer Kontamination durch Haushaltskontaminationen empfänglich, was die Gesundheit von Kleinkindern einem Risiko aussetzt. Aus diesem Grund kann der Einschluß eines an Lacticin 3147 angereicherten Pulvers in solche Formulierungen einen erhöhten Schutz im Fall einer Kontamination bieten, was sowohl für die Erzeuger als auch die Verbraucher günstig wäre.
Da die Hersteller bereits entmineralisiertes Molkepulver als Nahrungsmittelbestandteil verwenden, sollte es möglich sein, dieses Pulver (entweder teilweise oder vollständig) mit einem bioaktiven entmineralisierten Molkepulver zu ersetzen, um Nahrungsmittelprodukte weiter vor einem Verderben und pathogenen Gram-positiven Organismen zu schützen. Und tatsächlich, für Hersteller, die entmineralisierte Molkepulver nicht als Nahrungsmittelbestandteil verwenden, könnte der Einschluß von niedrigen Niveaus des bioaktiven Pulvers ausreichen um einen verstärkten Schutz zu verleihen, ohne die sensorischen oder funktionellen Eigenschaften dieser Nahrungsmittel zu beeinflussen. Es wird jedoch auch deutlich, daß ein sprühgetrocknetes Lacticin 3147-Pulver, basierend auf einem anderen Medium als Molkepulver, durch diese Erfindung erhältlich wäre. Ein solches Pulver hat ein Potential zur Anwendung als Ersatz in Bereichen, in denen Molkepulver nicht verwendet wird, mit denselben günstigen Wirkungen.
Zusammenfassung
Das von Lactococcus lactis DPC3147 erzeugte Breitspektrumbacteriocin Lacticin 3147 ist gegenüber einem breiten Bereich von Nahrungsmittelverderben durch Gram-positive und pathogene Organismen inhibitorisch. Eine 10%ige Lösung von entmineralisiertem Molkepulver wurde mit DPC3147 bei einem konstanten pH von 6,5 fermentiert. Das Fermentat wurde sprühgetrocknet und das resultierende Pulver zeigte eine inhibitorische Aktivität.
Die Fähigkeit des Lacticin 3147 angereicherten Pulvers zu Inhibition von Listeria monocytogenes Scott A und Staphylococcus aureus 10 wurde in Puffer bei sowohl saurem (pH 5) als auch neutralem pH (pH 7) bewertet. Zusätzlich wurde die Fähigkeit des Pulvers zur Inhibition von L. monocytogenes Scott A in einer Kleinkind-Milchformulierung bewertet. Die Resuspension von 8,3 log sich in der mittleren exponentionellen Wachstumsphase befindlichen L. monocytogenes Scott A-Zellen in einer 10%igen Lösung des Lacticin 3147-angereicherten Pulvers führte zu einer 1000-fachen Reduktion lebensfähiger Zellen bei einem pH von 5 und 7 nach 3 Stunden bei 30°C. Im Fall von S. aureus 10 führte die Resuspension von 2,5 × 10⁷ sich in einer mittleren exponentiellen Wachstumsphase befindlichen Zellen in einer 15%igen Lösung des Lacticin 3147-angereicherten Pulvers bei einem pH von 5 zu nur einer 10-fachen Reduktion der Zellzahlen lebensfähiger Zellen im Vergleich zu einer 1000-fachen Reduktion bei pH 7, folgend auf eine Inkubation für 3 Stunden bei 30°C. In einer Kleinkind-Milchformulierung führte die Verwendung des Lacticin 3147-Pulvers zu mehr als einer 99%igen Abtötung von L. monocytogenes innerhalb von 3 Stunden bei 30°C. Ähnlich konnte gezeigt werden, daß das Lacticin 3147-Pulver bei der Inhibition des Verderbens von Nahrungsmitteln in pulverförmiger Suppe, Yoghurt und Hüttenkäse effektiv war. Weiterhin führt die Kombination von hydrostatischem Druck und Lacticin 3147 zu einer erhöhten Abtötung, was dies zu einem attraktiven Verfahren zur Verhinderung eines Verderbens von minimal prozessierten Nahrungsmitteln macht. So wird dieser bioaktive Lacticin 3147-Nahrungsmittelbestandteil Anwendungen in vielen unterschiedlichen Nahrungsmitteln finden, einschließlich denjenigen mit einem pH nahe am neutralen pH.
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Die Bezeichnungen "umfaßt/umfassend" und die Bezeichnungen "hat/beinhaltend", wie hier in der gegenwärtigen Erfindung verwendet, werden verwendet um die Gegenwart der angegebenen Merkmale, Zahlen, Schritte und Komponenten anzuzeigen, schließen jedoch die Gegenwart oder Addition von ein oder mehr anderen Merkmalen, Zahlen Schritten, Komponenten oder Gruppen davon nicht aus. Tabelle 1: Lacticin 3147-Aktivität in verschiedenen Medien nach einer Inkubation über Nacht bei 30°C

Wachstumsmedium	Lacticin 3147-Aktivität (AU/ml)
Cheddarkäse-Molke	2560
Vollmilch	2560
Rekonstituiertes entfettetes Milchpulver	1280
Rekonstituiertes demineralisierte Molkepulver	1280
Molkeprotein-Konzentrat (WPC35)	320
LM17	2560
TY broth	640

Claims

Verfahren zur Herstellung eines sprühgetrockneten Lacticin-3147-Pulvers zur Verwendung als Nahrungsmittelbestandteil, umfassend: (a) Inokulieren eines Mediums mit einem Lacticin-3147-erzeugenden Stamm von Bakterien, (b) Fermentation des inokulierten Mediums, (c) Einstellung des pHs der Fermentation auf einen pH von 6,3 bis 6,7, (d) Inaktivieren des bakteriellen Fermentats, (e) Verdampfen des Fermentats von Schritt (d) (f) Sprühtrocknen des in Schritt (e) erzeugten Pulvers.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Medium ausgewählt ist aus Milch oder auf Milchprodukten basierenden Pulvern, einschließlich demineralisiertem Molkepulver, rekonstituiertem entfetteten Milchpulver, Molkeprotein-Konzentratpulver, pasteurisierter Vollmilch, Cheddarkäsemolke, Hefepulvern oder synthetischen Labortyp-Medien oder Brühen.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Labortyp-Medien LM17 oder TY-Broth sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Konzentrat von Schritt (e) abgekühlt, mit Lactose mit ungefähr 0,1% G/G eingesät wird und man es ihm ermöglicht, bei einer Abkühlrate von ungefähr 1°C pro Stunde zu kristallisieren.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das inokulierte Medium bei ungefähr 30°C für ungefähr 6 bis 24 Stunden fermentiert wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der pH der Fermentation auf ungefähr pH 6,5 eingestellt wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Fermentat durch Pasteurisieren oder Ultrahoch-Temperaturbehandlung inaktiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Fermentat bei ungefähr 72°C für ungefähr 15 Minuten pasteurisiert wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Fermentat von Schritt (d) bei ungefähr 60°C auf ungefähr 40% Gesamtfeststoffe verdampft wird.