CN113271791A - 针对致病细菌的生物保护培养物的增强的生物活性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于获得具有抑制或杀死各种致病细菌的杀细菌活性的细菌菌株的生物质组合物的方法。

Description

针对致病细菌的生物保护培养物的增强的生物活性
技术领域
本发明涉及用于获得细菌菌株的生物质组合物(包括单个或多个细菌细胞)的新的和改进的方法，该细菌菌株可抑制或杀死各种致病细菌，具有针对各种致病细菌的杀细菌活性。本发明还涉及所获得的组合物以及该组合物在特定食品制造中的用途。
背景技术
涉及各种病原体的食物中毒，以及对加工食品保存的日益关注，使得人们对食品安全的重要性的认识不断提高。近年来，人们对细菌特别是乳酸菌的抗微生物活性越来越感兴趣。细菌的已知抗微生物活性是细菌素。细菌素根据Ingolf F.Nes在“生物活性肽手册(handbook of Biologically Active Peptides)”(第二版)，2013中定义为核糖体合成的抗菌菌肽/蛋白质，可以杀死密切相关的细菌或抑制密切相关的细菌的生长。这些细菌素分为两大类：I类羊毛硫抗生素和II类非修饰细菌素，后者也称为非羊毛硫抗生素。II类细菌素分为：(a)抗李斯特菌属的片球菌素样细菌素，在其N端具有非常相似的氨基酸序列；(b)二肽细菌素，其活性取决于两个不同的肽，(c)环状细菌素，和(d)线性非片球菌素样一肽(LINPLOP)细菌素。另外，有称为无前导细菌素的一个群组，因为它们是在没有N末端前导肽的情况下合成的。
使用细菌素来保存食品是本领域已知的。
WO 99/67287涉及用作食品成分的喷雾干燥的细菌素乳链球菌素粉末的生产。在生产过程中，将pH调节至6.3至6.7。
WO02055672涉及产生细菌素的乳酸乳球菌转移接合子的生产，其可用作发酵剂培养物以加速干酪成熟。
在食品中使用产生细菌素的培养物对食品安全具有相当大的优势，已发现发酵结束后获得的活性细菌素的量可能在下游加工过程中损失。因此，期望增加最终产品中在发酵过程中和发酵后从培养基中获得的活性细菌素的量。
因此，本发明的目的是提供一种方法，与已知方法相比，在发酵结束后存在于生物质中的活性细菌素的量增加。
发明内容
本发明涉及用于获得具有抑制细菌生长和/或杀细菌活性的生物质的方法。所述生物质是用于抑制或避免食品中，特别是生的或烹饪的加工肉制品和乳制品中的细菌生长的手段。
本发明的第一方面涉及用于获得抑制细菌生长和/或具有杀细菌活性的生物质的方法，包括以下步骤：
a)在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)任选地添加絮凝剂，
d)将生物质与所述培养基分离，
e)任选地向所述生物质中添加赋形剂，
f)任选地将所述生物质的pH调节至pH在5.5至8.0的范围内，
g)任选地将所述生物质制粒，
h)任选地在g)之前和/或之后冷冻和/或干燥所述生物质，和
i)任选地将所述干燥的生物质制成粉末。
本发明的第二方面涉及可通过第一方面的方法获得的组合物。
本发明的第三方面涉及可通过第一方面的方法获得的组合物用于处理食品的用途。
本发明的第四方面涉及可通过第一方面的方法获得的组合物用于处理发酵食品的用途。
本发明的第五方面涉及可通过第一方面的方法获得的组合物用于降低发酵食品中的李斯特菌属物种的浓度的用途。
本发明的第六方面涉及可通过第一方面的方法获得的组合物用于降低肉制品中的李斯特菌属物种的浓度的用途。
定义
在本发明的上下文中，术语“微生物”以其正常含义使用。因此，在其最广泛的含义上，术语“微生物”旨在涵盖藻类、原生动物、细菌和真菌。优选的微生物是细菌和真菌，特别是细菌，例如乳酸菌。
如本文所用，术语“乳酸菌”表示革兰氏阳性微需氧细菌或厌氧细菌，其在发酵糖的同时产生酸，包括乳酸作为主要产生的酸。在“乳杆菌目(Lactobacillales)”的目中发现了工业上最有用的乳酸菌，其包括乳球菌属(Lactococcus)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、明串珠菌属(Leuconostoc)物种、伪明串珠菌属(Pseudoleuconostoc)物种、片球菌属(Pediococcus)物种、短杆菌属(Brevibacterium)物种和肠球菌属(Enterococcus)物种。它们通常单独或与其他乳酸菌组合用作食物培养物。
乳酸菌包括乳杆菌属物种和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的细菌，通常以冷冻或冻干培养物的形式提供，用于批量发酵剂扩大培养，或以所谓的“直投式发酵剂”(DVS)培养物的形式提供，旨在直接接种到发酵容器或罐中以生产食品。这样的乳酸菌培养物通常被称为“发酵剂培养物”或“发酵剂”。乳酸菌的合并应用还包括对可食用食品(例如肉制品)的生物保护。此处，将细菌施加到食品上，以通过抑制致病细菌来延长食品的耐久性和质量。
乳酸菌的常用发酵剂培养物菌株通常分为最佳生长温度在约30℃的嗜中温生物和最佳生长温度在约40至约45℃范围内的嗜热生物。属于嗜中温组的典型生物包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactissubsp.cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳亚种丁二酮变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacasei subsp.paracasei)。嗜热乳酸菌物种包括例如嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
属于双歧杆菌属(Bifidobacterium)的厌氧细菌，包括两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，也通常被用作起发酵剂培养物，并且通常包括在乳酸菌的群组中。另外，丙酸菌属(Propionibacterium)物种被用作发酵剂培养物，特别是在奶酪的制造中。另外，属于短杆菌属(Brevibacterium)的生物通常用作食品发酵剂培养物。
术语“生物质”是给定栖息地中生活物质的量，表示为每单位面积的生物重量或每单位栖息地体积的生物量。
在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”以及类似指称的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在充当单独指代落入该范围内的每个单独的值的简写方法，并且每个单独的值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为表示任何未要求保护的要素对于实施本发明是必不可少的。
与不想要的微生物相关的术语“抑制(to inhibit)”和“抑制(to beinhibiting)”例如是指例如在包含抗微生物组合物的食品中和/或在所述食品表面上的不想要的微生物的生长或数量或浓度比在不包含这样的抗微生物组合物的食品中和/或所述食品表面上要更低。
附图说明
图1
图1公开了用于测试生物保护培养物针对致病细菌，例如李斯特菌属的生物活性的方法的示意图。
图2
图2公开了在实施例1和2中描述的新方法生产后测量的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)培养物的细胞计数。
图3
图3公开了无害李斯特菌(Listeria inocua)的对数细胞计数相对于弯曲乳杆菌的对数细胞计数。分别针对三种不同的pH调节(pH 4.5、6.5和8.5)绘制了三条稀释曲线。
图4
图4公开了在使用实施例1和5中描述的新方法生产后测量的弯曲乳杆菌培养物的细胞计数。
图5
图5公开了计算的IC50值。
图6
图6公开了无害李斯特菌的对数细胞计数相对于弯曲乳杆菌的对数细胞计数。分别绘制了两条稀释曲线–参考pH 6.5和未调节回pH 6.5的生物质。
具体实施方式
本发明涉及用于获得细菌菌株的生物质组合物(包括单个或多个细菌细胞)的新的和改进的方法，该细菌菌株可抑制或杀死各种致病细菌，具有针对各种致病细菌的杀细菌活性。本发明还涉及所获得的组合物以及该组合物在特定食品制造中的用途。
用于肉类等食品应用的目前的生物保护产品基于细胞计数销售给消费者。生物保护培养物此时被添加到消费者的产品中，以通过抑制致病细菌(例如李斯特菌属)来保存食品。认为这种抑制作用源自生物保护培养物的细菌素产生。
本发明描述了增加生物保护培养物的抑制作用，同时降低对产品味道的影响的方法。由于培养物的生长是不希望的，因此认为细菌素产生已经在生物保护培养物的生产过程中发生，其中细菌素已被释放到细胞外环境中。通过常规的生产方法，大部分细胞外细菌素会在细胞浓缩(离心、微滤等)过程中丢失在洗出液中。本发明通过在培养结束后降低pH来增加生物质中细菌素的量。不受理论的束缚，认为细菌素会聚集和/或沉淀，因此它可以被捕获在生物质中。在生物质分离后，如果需要保留培养物的效力，可以再次提高pH值。
本发明的培养基是通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株而获得的。
合适的菌株可以是产生细菌素的任何菌株。优选的菌株属于乳酸菌(LAB)，肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)，乳杆菌属物种，例如弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus Salivarius)、植物乳杆菌(LactobacillusPlantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)，和片球菌属(Pediococcus)物种，例如戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。特别是弯曲乳杆菌菌株CHCC26906(DSM 32591)和弯曲乳杆菌菌株CHCC23218(DSM 32590)。然而，预期其他产生细菌素的物种可提供与本文所说明的那些相同的有利特征和效果。
生长介质可以是任何合适的生长介质，即MRS介质。
根据本发明，在最终的培养之后将培养基的pH调节至pH低于5。在具体实施方案中，在最终的培养之后将pH值调节至pH低于4.5，例如低于4，例如低于3.5，例如低于3。通常在发酵/培养结束后进行pH调节。培养结束是指一旦已经达到决定发酵/培养结束的参数，例如当所有可消耗的糖都耗尽时、已经产生了一定浓度的代谢物、时间标准、停止碱/酸添加、光密度标准等。
pH的调节可以用任何合适的酸进行。
可以将絮凝剂添加到获得的生物质中。
将pH调节至低于5后，将生物质与培养基分离。所选择的分离方法可以是本领域已知的任何合适的方法。在本发明的具体实施方案中，分离步骤通过离心或过滤即微滤进行。
分离后，可将生物质的pH调节至pH高于5。在本发明的具体实施方案中，将pH调节至pH高于5，例如调节至pH为5.5至9，例如调节至pH为5.5至8。
所述方法可以在0至50℃范围，例如在5至30℃或15至25℃的范围的温度下进行。在本发明的具体实施方案中，所述方法在环境温度下进行。
本发明涉及一种获得抑制细菌生长和/或具有杀细菌活性的生物质的方法，包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)任选地添加絮凝剂，
d)将生物质与所述培养基分离，
e)任选地向所述生物质中添加赋形剂；和/或任选地将所述生物质的pH调节至pH在5.5至8.0的范围，
f)任选地将所述生物质制粒，和
g)任选地在f)之前和/或之后冷冻和/或干燥所述生物质。
步骤c)中的分离可以通过本领域已知的任何合适的方法进行。在本发明的具体实施方案中，分离步骤通过离心或过滤即微滤进行。
优选地将生物质制粒、造粒或制成粉末。
优选冷冻和/或干燥生物质，即通过本领域已知的常规技术冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明涉及一种用于获得抑制细菌生长和/或具有杀细菌活性的生物质的方法，包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)任选地添加絮凝剂，
d)将生物质与所述培养基分离，
e)任选地向所述生物质中添加赋形剂；和/或任选地将所述生物质的pH调节至pH在5.5至8.0的范围，
f)任选地对所述生物质进行制粒，和
g)任选地在f)之前或之后冷冻和/或干燥所述生物质。
步骤c)中的分离可以通过本领域已知的任何合适的方法进行。在本发明的具体实施方案中，分离步骤通过离心或过滤即微滤进行。
在具体实施方案中，本发明涉及一种获得抑制细菌生长和/或具有杀细菌活性的生物质的方法，包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)将生物质与所述培养基分离，和
d)向所述生物质中添加赋形剂。
可以在该方法中的任何时间添加赋形剂。在本发明的具体实施方案中，赋形剂在分离后加入。赋形剂可以是本领域已知的任何合适的赋形剂，即冷冻保护剂，例如单糖、二糖、寡糖、多糖和抗氧化剂。具体的保护剂可以是淀粉水解物(例如来自玉米淀粉的糊精)、谷氨酸钠、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)。
在具体实施方案中，本发明涉及一种获得抑制细菌生长和/或具有杀细菌活性的生物质的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)将生物质与所述培养基分离，和
d)将所述生物质的pH调节至pH在5.5至8.0的范围。
在具体实施方案中，本发明涉及一种获得抑制细菌生长和/或具有杀细菌活性的生物质的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)将生物质与所述培养基分离，和
d)将所述生物质制粒或将所述生物质造粒或将其制成粉末。
在本发明的具体实施方案中，通过使用液氮进行生物质的制粒。
本发明涉及一种获得抑制细菌和/或具有杀细菌活性的生物质的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)将生物质与所述培养基分离，和
d)冷冻和/或干燥所述生物质。
本发明涉及一种获得抑制细菌和/或具有杀细菌活性的生物质的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)将生物质与所述培养基分离，
d)任选地向所述生物质中添加赋形剂；和/或任选地将所述生物质的pH调节至pH在5.5至8.0的范围，
e)任选地将所述生物质制粒，和
f)任选地冷冻和/或干燥所述生物质。
本发明进一步涉及通过本发明的方法可获得的或通过本发明的方法获得的组合物。
在本发明的具体实施方案中，生物保护培养物针对李斯特菌属的抑制作用提高至少90％，这相当于与目前接种水平相比，生物保护培养物的0.9LOG单位的更低的接种。
本发明的组合物包含生物质，该生物质包含活的产生细菌素的菌株和细菌素。
本发明进一步涉及通过本发明的方法可获得的或获得的组合物用于处理食品的用途。
最常与单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)污染相关的食品是基于乳的产品，例如基于乳的奶酪、冰淇淋和白软干酪、加工蔬菜、熏制食品、肉类和基于肉的产品。由机械处理且在最终包装中未经热处理的食品特别易受攻击。肉类，例如牛肉、猪肉或家禽肉，可能在屠宰过程中或屠宰后受到污染。鱼也可能在加工过程中受到污染。
在本发明的具体实施方案中，本发明涉及通过第一方面的方法可获得的或获得的组合物用于处理发酵食品的用途。
在本发明的具体实施方案中，本发明涉及通过本发明的方法可获得的或获得的组合物用于降低发酵食品中的致病生物例如李斯特菌属物种的浓度的用途。
在本发明的具体实施方案中，本发明涉及通过本发明的方法可获得的或获得的组合物用于降低肉制品中的致病生物例如李斯特菌属物种的浓度的用途。
在本发明的具体实施方案中，本发明涉及通过本发明的方法可获得的或获得的组合物在益生菌产品中的用途。
在本发明的上下文中，术语“降低浓度”涉及致病生物的量的降低。可以通过杀死、灭活或抑制致病生物的活性来提供降低。在本发明的实施方案中，100％的致病生物被杀死、灭活或抑制，例如至少90％，例如至少75％，例如至少50％，例如至少40％，例如至少30％，例如至少25％，例如至少20％，例如至少10％，例如至少5％，例如至少1％。
在某些应用中，对可能存在于食物中的致病生物的抑制足以使食物安全。因此，培养物确保食物中存在的致病生物数量不会增加。
在具体实施方案中，本发明涉及一种方法，包括以下步骤：
a)提供食物原料，
b)将食物原料与本发明的组合物混合。
更详细地，本发明涉及以下方面：
方面1.一种用于获得抑制细菌和/或真菌生长和/或具有杀细菌活性和/或杀真菌活性的生物质的方法，包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于6，
c)任选地添加絮凝剂，
d)将生物质与所述培养基分离，
e)任选地向所述生物质中添加赋形剂，
f)任选地将所述生物质的pH调节至pH在6至9.0的范围，
g)任选地将所述生物质制粒，
h)任选地在g)之前或之后冷冻和/或干燥所述生物质，和
i)任选地将所述干燥的生物质制成粉末。
方面2.方面1所述的方法，其中在最终的培养之后进行b)。
方面3.根据前述方面所述的方法，其中所述pH保持在低于6至少1小时。
方面4.根据方面1所述的方法，其中将b)中的所述培养基的pH调节至低于5.5。
方面5.根据方面1所述的方法，其中将b)中的所述培养基的pH调节至低于5。
方面6.根据前述方面所述的方法，其中将pH保持在低于5至少1小时。
方面7.根据方面1所述的方法，其中将b)中培养基的pH值调节至低于4.8。
方面8.根据方面1所述的方法，其中将b)中培养基的pH值调节至2.0至5.0。
方面9.根据前述方面中任一项所述的方法，其中c)中的分离通过离心和/或过滤进行。
方面10.根据前述方面中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株属于乳杆菌属物种或片球菌属物种。
方面11.根据方面10所述的方法，其中所述细菌菌株选自由以下组成的组：肉色明串珠菌、弯曲乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌。
方面12.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在将所述培养基的pH调节至低于6之后添加絮凝剂。
方面13.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在将所述培养基的pH调节至低于5之后添加絮凝剂。
方面14.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在已经将生物质与培养基分离之后，将赋形剂添加到所述生物质中。
方面15.根据前述方面中任一项所述的方法，其中将所述生物质的pH调节至5.5至8.0。
方面16.根据前述方面中任一项所述的方法，其中将所述生物质的pH调节至6.5至9.0。
方面17.根据前述方面中任一项所述的方法，其中将所述生物质的pH调节至6.5至8.0。
方面18.根据前述方面中任一项所述的方法，其中将所述生物质制粒成丸粒，造粒成颗粒或制成粉末。
方面19.根据前述方面中任一项所述的方法，其中将方面18所述的丸粒、颗粒或粉末冷冻和/或干燥。
方面20.可通过根据前述方面中任一项所述的方法获得的组合物，其包含产生细菌素的菌株和细菌素。
方面21.方面20所述的组合物用于处理食品的用途。
方面22.方面21所述的用途，其中所述食品是乳制品或肉制品。
保藏和专家方案
申请人请求下述保藏的微生物样品只能提供给专家，直到专利被授予之日为止。
弯曲乳杆菌菌株CHCC26906于2017年8月16日保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)，登录号：DSM 32591。
弯曲乳杆菌菌株CHCC23218于2017年8月16日保藏在德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124，登录号：DSM 32590。
实施例
实施例1.获得弯曲乳杆菌的生物质
弯曲乳杆菌培养物在典型生长培养基中生长，该培养基以w/v百分比计包含1.0％酪蛋白胨、1.0％肉提取物、0.4％酵母提取物、2.0％葡萄糖、0.5％三水醋酸钠、0.1％聚山梨醇酯80、0.2％磷酸氢二钾、0.2％柠檬酸三铵、0.02％七水硫酸镁和0.005％四水硫酸锰。在环境温度、300rpm的搅拌速度和6.5的pH下以350L规模进行发酵。
实施例2.在将pH调节至4.5的情况下从乳杆菌属培养物中收获高活性生物质
在发酵结束时，将2L培养基转移到玻璃烧杯中。用磷酸溶液将培养基的pH从pH6.5(实施例1)调节至pH 4.5。将培养物在室温下保持1小时，同时以50rpm缓慢搅拌。在1小时的保持时间后，通过以4200rpm离心20分钟将生物质与培养基分离。离心后，将生物质浓缩物收集在合适尺寸的玻璃烧杯中，并在50rpm的缓慢搅拌期间用氢氧化钠溶液将pH值从4.5调节至6.5。将冷冻保护溶液(由蔗糖(15％)、麦芽糖糊精(10％)和水(75％)组成)加入(420g至1000g细胞浓缩物)到浓缩物中。最后，将生物质浓缩物在液氮中制粒并冷冻干燥。
实施例3.在将PH调节至5.0的情况下从乳杆菌属培养物中收获高活性生物质
在发酵结束时，将2L培养基转移到玻璃烧杯中。用磷酸溶液将培养基的pH从pH6.5(实施例1)调节至pH 5.0。将培养物在室温下保持1小时，同时以50rpm缓慢搅拌。在1小时的保持时间后，通过以4200rpm离心20分钟将生物质与培养基分离。离心后，将生物质浓缩物收集在合适尺寸的玻璃烧杯中，并在50rpm的缓慢搅拌期间用氢氧化钠溶液将pH值从5.0调节至6.5。将冷冻保护溶液(由蔗糖(15％)、麦芽糖糊精(10％)和水(75％)组成)加入(420g至1000g细胞浓缩物)到浓缩物中。最后，将生物质浓缩物在液氮中制粒并冷冻干燥。
实施例4.在将PH调节至3.5的情况下从乳杆菌属培养物中收获高活性生物质
在发酵结束时，将2L培养基转移到玻璃烧杯中。用磷酸溶液将培养基的pH从pH6.5(实施例1)调节至pH 3.5。将培养物在室温下保持1小时，同时以50rpm缓慢搅拌。在1小时的保持时间后，通过以4200rpm离心20分钟将生物质与培养基分离。离心后，将生物质浓缩物收集在合适尺寸的玻璃烧杯中，并在50rpm的缓慢搅拌期间用氢氧化钠溶液将pH值从3.5调节至6.5。将冷冻保护溶液(其由蔗糖(15％)、麦芽糖糊精(10％)和水(75％)组成)加入(420g至1000g细胞浓缩物)到浓缩物中。最后，将生物质浓缩物在液氮中制粒并冷冻干燥。
实施例5.将生物质的PH保持在PH 4.5，从乳杆菌属培养物中收获高活性生物质
在发酵结束时，将2L培养基转移到玻璃烧杯中。用磷酸溶液将培养基的pH从pH6.5(实施例1)调节至pH 4.5。将培养物在室温下保持1小时，同时以50rpm缓慢搅拌。在1小时的保持时间后，通过以4200rpm离心20分钟将生物质与培养基分离。离心后，将生物质浓缩物收集在合适尺寸的玻璃烧杯中。将冷冻保护溶液(其由蔗糖(15％)、麦芽糖糊精(10％)和水(75％)组成)加入(420g至1000g细胞浓缩物)到浓缩物中。最后，将生物质浓缩物在液氮中制粒并冷冻干燥。
实施例6.测试针对无害李斯特菌的活性
在共培养方法中针对李斯特菌属测试了乳杆菌属培养物的活性。李斯特菌属在30℃下在Palcom肉汤中过夜培养，然后转移到肉类模拟介质(肉类pH介质，MPH)中，在30℃下18小时。此后，李斯特菌属培养物和乳杆菌属培养物在7℃在肉类模拟介质中共培养11天。以固定的CFU/g细胞计数接种李斯特菌属和乳杆菌属培养物。最后，分析李斯特菌属的CFU/g细胞计数。该方法总结在图1中。
实施例7.从乳杆菌属培养物中收获高活性生物质
分别根据实施例1和2中描述的程序获得样品。将该样品与发酵结束后未调节pH值(pH6.5)的样品和发酵结束时(用氢氧化钠溶液)调节至pH 8.5、然后如实施例2中所述连续处理的样品组合测试。
分析冷冻干燥样品的CFU/g细胞计数。结果见图2。
用实施例6中描述的方法测试样品。这产生了图3中所示的数据。对于3种样品(pH4.5，pH 6.5，pH 8.5)中的每一种，在这里通过测试针对李斯特菌属的生物活性培养物的7个不同稀释水平制作稀释曲线。此后测量李斯特菌属的CFU。从图3可以看出，在特定浓度下，基于CFU方法没有李斯特菌属的细胞计数。此外，可以看出，对于pH 4.5处理的样品(实施例2)，李斯特菌属细胞在比pH 6.5(实施例)和8.5样品更低的浓度下被抑制。
实施例8.测试将pH从4.5重新调节到6.5的效果
在另一种情况下，根据实施例1(pH 4.5)和实施例5(pH 4.5，没有将pH调节至pH6.5)中描述的程序获得样品。再次将该样品与在发酵结束后没有调节pH的样品(pH 6.5)组合进行测试。
分析冷冻干燥样品的CFU/g细胞计数。结果可以见图4。结果证实处理导致相当的CFU水平。
使用实施例6中描述的方法测试样品。这产生了图5和图6中所示的数据。对于2种样品(pH 4.5，其中生物质没有调节回pH 6.5；和pH 6.5参考)中的每一种，在这里通过测试针对李斯特菌属的生物活性培养物的7个不同稀释水平制作稀释曲线。此后测量李斯特菌属的CFU。从图5和图6明显可以看出，对于未调节pH的样品，李斯特菌属细胞在比参考样品更低的浓度下被抑制，相当于0.6个对数单位的IC50值的降低。
Figure BDA0003126348970000171
由受理局填写
Figure BDA0003126348970000172
Figure BDA0003126348970000181
由国际局填写
Figure BDA0003126348970000182

Claims (16)

1.一种用于获得抑制细菌生长和/或真菌生长和/或具有杀细菌活性和/或杀真菌活性的生物质的方法，包括以下步骤：
a)通过在生长介质中培养产生细菌素的菌株来获得培养基，
b)将所述培养基的pH调节至低于5，
c)任选地添加絮凝剂，
d)将生物质与所述培养基分离，
e)任选地向所述生物质中添加赋形剂，
f)任选地将所述生物质的pH调节至pH在5.5至8.0的范围，
g)任选地将所述生物质制粒或造粒或将其制成粉末，和
h)任选地在f)之前和/或之后冷冻和/或干燥所述生物质，和
i)任选地将所述干燥的生物质制成粉末。
2.权利要求1所述的方法，其中在最终的培养之后进行b)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述pH保持在低于5至少1小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中b)中的所述培养基的pH被调节至低于4.8。
5.根据权利要求1所述的方法，其中b)中的所述培养基的pH被调节至2.0至5.0。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中c)中的分离通过离心和/或过滤进行。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)物种或片球菌属(Pediococcus)物种。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细菌菌株选自由以下组成的组：肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus Salivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在将所述培养基的pH调节至低于5之后添加絮凝剂。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在已经将所述生物质与所述培养基分离之后，将赋形剂添加到所述生物质中。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物质的pH被调节至5.5至8.0，例如pH 6.5。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物质被制粒成丸粒，被造粒成颗粒或被制成粉末。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中权利要求12所述的丸粒、颗粒或粉末被冷冻和/或干燥。
14.通过根据前述权利要求中任一项所述的方法可获得的组合物，其包含产生细菌素的菌株和细菌素。
15.权利要求14所述的组合物用于处理食品的用途。
16.权利要求15所述的用途，其中所述食品是乳制品或肉制品。
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