CN101657534A - 新的乳酸杆菌菌株及其在保护食品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH(DSMZ)的保藏号为DSM 18775的弯曲乳酸杆菌菌株，以及包括其的组合物、培养物和食品。本发明的菌株用于保存食品，尤其是在冷藏条件下。

Description

新的乳酸杆菌菌株及其在保护食品中的用途
技术领域
本发明涉及在低温下产生蛋白酶敏感性抗菌剂(细菌素)的新的乳酸杆菌。特别地，本发明涉及弯曲乳酸杆菌DSM 18775，已发现其用于冷藏制品诸如即食性(RTE)肉和奶制品的生物保护。
背景技术
食品的细菌污染已知是腐败和传播食源性疾病的原因。此问题在RTE肉和奶制品中尤其重要，这些制品在摄食之前一般不被消费者重新加热，并且在冰箱中在2-10℃下储存较长的时间。一个示例性的例子是单核细胞增多性李斯特菌，由于其耐受低温，相对高浓度的NaCl和缺氧条件，或在制品中诸如新鲜乳酪中，由于缺少热灭活步骤，因此其是食品诸如真空或气调(MA)包装RTE肉制品中特别受关注的病原菌。为此，已经花费了大量的努力来尝试鉴定可安全地添加至食品中以抑制细菌生长的天然产品。
众所周知，使用乳酸杆菌作为发酵剂来诱发肉制品(一般为腌制的生肉制品)的发酵。术语“发酵剂”是指含微生物细胞的制剂，其用于接种至要进行发酵的食物基质中。用于肉发酵的发酵剂通常由一种或多种乳酸杆菌组成。发酵剂旨在为发酵期间食物基质的特性提供所需的改变(例如，所需的酸化，以及某些其他的感官和技术参数)。一般地，在发酵过程期间发酵剂将增殖。在发酵过程期间，乳酸杆菌主要产生乳酸，从而根据培养物和加工条件(温度、糖类型/含量等)使pH降至所需的pH值，并且重要地是，制品的感官特性被明显改变。
加入至食品中以抑制病原体和/或延长储存期限而不改变制品的感官特性的拮抗培养物被称为“保护性培养物”。与发酵剂相反，保护性培养物不改变制品的感官特性。其使用或其代谢产物的使用(有机酸、过氧化氢、酶类和细菌素)常常被称为“生物保存”或“生物保护”(Castellano，P.和Vignolo，G.，″Inhibition ofListeria innocua and Brochothrix thermosphacta in vacuum-packaged meat byaddition of bacteriocinogenic Lactobacillus curvatus CRL705and its bacteriocins″，2006，Letters in Applied Microbiology.Vol.43：194-199)。此研究证明对非致病性李斯特菌属的抑菌作用。报道对李斯特菌没有杀菌作用。此外，进行的“感官”评价限于pH测定。
除了建立了作为确保微生物安全性而不改变制品的感官特性的方法的生物保存以外，也已评价了生物保护性培养物阻止腐败细菌生长的潜力(Vermieren，L.等人，“Evaluation of meat born lactic acid bacteria as protective cultures for thebiopreservation of cooked meat products”，2004，International Journal of FoodMicrobiology，96：149-164)。
使用生物保护性培养物处理的熟肉制品的感官可接受性会限制保存方法的应用，并且当应用生物保护性培养物时，已显示缓冲容量以及葡萄糖含量是避免感官偏差的关键要素(Vermieren等人，见前)。
使用生物保护性培养物时，在抑制的初发期之后，经常观察到单核细胞增多性李斯特菌的再生长。再生长的原因被认为是单核细胞增多性李斯特菌发生了对细菌素的耐药性、再生长期期间产生的内源性蛋白酶降解细菌素分子、细菌素吸附至生产菌株的表面、或与食物基质的特异性相互作用(Dicks，L.M.T.等人，“Use of bacteriocin-producing starter cultures of Lactobacillus plantarum andLactobacillus curvatus in production of ostrich meat salami”， 2004，Meat Science，66：703-708)。
欧洲专利申请EP 1.475.432公开了作为PTA-5150和PTA-5159保藏的两种弯曲乳酸杆菌菌株，以及它们减少微生物在食物或药物组合物中生长的用途。
专利US 4.886.673公开了三种细菌菌株，弯曲乳酸杆菌DSM 4265、变异微球菌DSM4263和汉森德巴利酵母(Debaromyces hansenii)DSM 4260以及它们保存肉制品的用途。实施例1说明了弯曲乳酸杆菌DSM 4265在生产绞馅发酵香肠(cut raw sausage)中的用途。
欧洲专利申请EP 0.640.291公开了弯曲乳酸杆菌DSM8430作为发酵剂在萨拉米香肠生产中的用途。特别要提到的是，最佳的细菌素生产出现在15-20℃的温度下，并且在低温(+4℃)下活性下降。
Vogel，R.F.等人(1993，System.Appl.Microbiol.，16：457-462)公开了弯曲乳酸杆菌LTH 1174株作为发酵剂在萨拉米香肠生产中的用途。特别要提到的是，最佳的细菌素生产出现在15-20℃的温度下，并且在低温(+4℃)下活性下降。
Benkerroum，N.等人(2005，J.Appl.Microbiol.，98：56-63)公开了弯曲乳酸杆菌LBPE株作为发酵剂在干发酵香肠生产中的用途。发酵在30℃下进行，并且干燥在14-16℃下进行。证明在低温下没有生物保护作用。
Mauriello，G.等人(2004，J.Appl.Microbiol.，97：314-322)公开了聚乙烯膜在食品包装中的用途，该聚乙烯膜用部分纯化的弯曲乳酸杆菌32Y株的细菌素处理。为了产生细菌素，此特定菌株在30℃下生长。
发明内容
本发明要解决的问题是提供能抑制食源性致病菌和腐败菌在低温(2-10℃)下的生长而不改变食品的感官特性的细菌菌株。
溶液基于保藏的保藏号为DSM 18775的弯曲乳酸杆菌菌株。
如下面以非限制方式说明的，已经发现本发明的弯曲乳酸杆菌菌株用于食品的生物保护。由于产生了细菌素，本发明的菌株可用于并且已经证实尤其能用于抑制食源性致病菌和腐败菌。
食源性致病菌和腐败菌可以是需氧的、厌氧的或兼性厌氧的，并且因此，单从食物包装或从食物储存环境中去除氧并不能有效地清除所有类型的杂菌。而且，在食物的储存中控制温度无法完全地有效阻止此类细菌的生长，因为几种类型的致病菌和腐败菌能够在各种温度下生长。另一方面，有这样的致病菌，由于耐受冷藏温度、相对高浓度的NaCl和厌氧条件，因而在RTE食品中它们特别受关注。
本发明的发明人已经观察到在冷藏条件下，本发明的弯曲乳酸杆菌菌株产生细菌素，使得食源性致病菌的数量大量减少而不引起不期望的感官变化，并且还防止食品中腐败菌的生长。本发明的弯曲乳酸杆菌能够在冷藏温度下产生细菌素的事实意味着所述菌株可用于冷藏品的生物保护，并且特别是真空或气调包装的冷藏方便食品。
因此，在一个方面，本发明涉及保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmBH(DSMZ)的保藏号为DSM 18775的弯曲乳酸杆菌菌株。
微生物的培养样品于2006年11月9日保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，保藏号为DSM 18775。
在第二个方面，本发明涉及从根据本发明的第一个方面的菌株获得的培养物。
在菌株作为生物保护性培养物使用的评价中的一个重要方面是菌株在其所用于的食品中工作的能力。在此方面，重要的是不仅菌株能够在相应的储存条件下抑制制品中任何不期望的食源性致病菌，而且它不产生任何不期望的感官效应(变味、异味或不希望的颜色变化)。当应用于大范围的实际RTE肉制品时，在整个储存期间在相应的储存条件下，本发明的弯曲乳酸杆菌菌株显著地抑制食源性致病菌。如下面所说明的，本发明人通过感官分析已经证实本发明的培养物在相应的储存条件下，对食品(诸如各种RTE肉制品)的感官质量没有负面的影响。
此外，与用作生物保护性培养物的其他菌株相反，当本发明的培养物用作生物保护性培养物时，没有观察到单核细胞增多性李斯特菌的再生长。
因此，当使用根据本发明的培养物时，由于保质期期间制品的安全性增加，从而与摄取冷藏制品相关的健康风险减小了。因此，食品工业的经济损失可显著减小。
在第三个方面，本发明涉及用于制备抑制至少一种食源性致病菌的生长的组合物的方法，所述方法包括：(a)培养根据本发明的第一个方面的弯曲乳酸杆菌菌株的细胞，该细胞在培养基中培养后产生对包括单核细胞增多性李斯特菌的细菌菌株具有抑制活性的细菌素，从而获得包括细菌素的上清液；以及(b)从培养细胞分离上清液以获得该上清液，由此获得包括细菌素的上清液组合物。
在此方面的一个实施方案中，包括细菌素的上清液组合物进一步进行干燥步骤以获得所需的干燥的培养洗脱产物。干燥步骤可以适宜地是冷冻干燥或喷雾干燥。如实施例8中所述，该方法产生干燥的培养洗脱产物，其抑制以气调或在真空下包装的肉制品上的单核细胞增多性李斯特菌。
在进一步的实施方案中，当提供足够的用量时，生长抑制组合物对至少一种食源性致病菌具有杀菌作用。优选的实施方案是当提供以足够用量时对单核细胞增多性李斯特菌具有杀菌作用的生长抑制组合物。此实施方案在实施例8和图7a中说明。
在第四个方面，本发明涉及由上述方法得到的培养洗脱组合物。
在第五个方面，本发明涉及由本发明的第三个方面的方法的步骤(a)得到的培养基组合物。
在第六个方面，本发明涉及包括由本发明的第三个方面的方法的步骤(b)得到的细菌素的上清液组合物。
在第七个方面，本发明涉及可通过根据本发明的第三个方面的方法获得的对包括单核细胞增多性李斯特菌的细菌菌株具有抑制活性的细菌素，以及包括所述细菌素的无细胞弯曲乳酸杆菌菌株培养物-培养基-上清液组合物和杀菌剂。
在第八个方面，本发明涉及用于保存食品的组合物，其包括根据本发明的第一个方面的弯曲乳酸杆菌菌株或根据本发明的第五个方面的上清液组合物。
在第九个方面，本发明涉及包括根据本发明的第一个方面的弯曲乳酸杆菌菌株的食品。
在第十个方面，本发明涉及根据本发明的第一个方面的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或根据本发明的第五个方面的上清液组合物用于保存食品的用途。
在第十一个方面，本发明涉及根据本发明的第一个方面的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或根据本发明的第五个方面的上清液组合物用于抑制以冷藏状态保存的食品上的食源性致病菌的生长的用途。
在第十二个方面，本发明涉及根据本发明的第一个方面的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或根据本发明的第五个方面的上清液组合物用于阻止以冷藏状态保存的食品中腐败菌的生长的用途。
在第十三个方面，本发明涉及保存食品的方法，其特征在于根据本发明的第一个方面的弯曲乳酸杆菌以有效量加入至所述制品中。
在第十四个方面，本发明涉及控制食品中、食品加工设备上或食品储存容器上李斯特菌污染的方法，该方法包括将保藏号为DSM 18775的乳酸杆菌菌株以足以减少李斯特菌的量或阻止李斯特菌生长的量应用于食品或食品加工设备。
在整个说明书和权利要求中，词“包括”以及该词的变型，并不旨在排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。在阅读说明书后，本发明的其他目的、优势和特征对于本领域技术人员是显而易见的，或可通过实施本发明而认识到。下面的实施例和附图提供作为说明，并不旨在限制本发明。
附图说明
图1代表接种(■)或未接种(◆)DSM 18775(初始水平为107CFU/g)的摩泰台拉香肠(Monadella sausage)的切片中单核细胞增多性李斯特菌的细胞计数。摩泰台拉香肠的切片以气调包装(30％CO2和70％N2)并且在7℃下储存。细胞计数基于对两片不同的肉切片所做的测定值，并且误差棒表示这两个测定值之间的标准差。
图2代表接种(■)或未接种(◆)DSM 18775(初始水平为107CFU/g)的用细肉末制成的摩泰台拉香肠的切片中单核细胞增多性李斯特菌的细胞计数。摩泰台拉香肠的切片以气调包装(30％CO2和70％N2)并且在7℃下储存。细胞计数基于对两片不同的肉切片所做的测定值，并且误差棒表示这两个测定值之间的标准差。
图3代表接种(■)或未接种(◆)DSM 18775(初始水平为107CFU/g)的熟烟熏火腿的切片中单核细胞增多性李斯特菌的细胞计数。火腿切片以气调包装(30％C02和70％N2)并且在7℃下储存。细胞计数基于对两片不同的肉切片所做的测定值，并且误差棒表示这两个测定值之间的标准差。
图4代表接种(■)或未接种(◆)DSM 18775(初始水平为107CFU/g)的维也纳香肠中单核细胞增多性李斯特菌的细胞计数。维也纳香肠在真空下包装并且在7℃下储存。细胞计数基于对两个不同的香肠所做的测定值，并且误差棒表示这两个测定值之间的标准差。
图5代表接种(■)或未接种(◆)DSM 18775(初始水平为107CFU/g)的熟火腿的切片中单核细胞增多性李斯特菌的细胞计数。火腿切片以气调包装(30％CO2和70％N2)并且在5℃下储存。细胞计数基于对两片不同的熟火腿切片所做的测定值，并且误差棒表示这两个测定值之间的标准差。
图6代表接种(■)或未接种(◆)DSM 18775(初始水平为107CFU/g)的奶酪中pH的进展情况。奶酪在真空下包装，并在9℃下储存。在测定pH前奶酪和水(1∶1)搅拌30min，然后测定奶酪和水的悬液的pH(使用PHM 92pH计，Radiometer，Copenhagen，DK)。
图7.如右侧图例中所解释的，在7℃下在气调(MA，30％CO2和70％N2)(7a)或在真空下(7b)中储存的乳化肠切片上，接触不同浓度的DSM18775或MicroGARD 730的培养洗脱液的单核细胞增多性李斯特菌的细胞计数。细胞计数基于对两片不同的肉切片所做的测定值，并且误差棒表示这两个测定值之间的标准差。
具体实施方式
本发明的弯曲乳酸杆菌DMS 18775株是一种乳酸杆菌。其从发酵食物中分离，并且通过蛋白质凝胶电泳，然后用LMG菌种保藏数据库的参考图谱分析和聚类而被鉴定为弯曲乳酸杆菌。此外，通过使用API谱表征，DMS 18775被鉴定为弯曲乳酸杆菌，概率为63.4％。通过在30℃下孵育48h后完全代谢：D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、七叶苷、D-麦芽糖和D-海藻糖以及部分代谢D-蔗糖表征该菌株。根据布达佩斯条约的条款该菌株于2006年11月9日保藏在“′Deutsche Sammlung von Microorganismenund Zellkulturen”GmbH(DSMZ)。其被指定的保藏号为DSM 18775。使用沙克乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)NCFB 2714作为指示生物在琼脂孔扩散测定中已测定了由DSM 18775产生的抗李斯特菌细菌素。
本发明的范围也包括通过弯曲乳酸杆菌DMS 18775株的突变、变异或重组而获得的弯曲乳酸杆菌菌株，只要得到的菌株在2-10℃的温度下具有抑制食源性致病菌的生长而不引起食物感官变化的能力。
在制备根据本发明的细菌素的方法中，产生细菌素的本发明的菌株在适于生长的培养基中以及条件下培养，通过将培养细胞与上清液分开以获得含细菌素的上清液，得到与培养物分离的上清液，并且为了实施分离，将得到的培养物离心，获得含细菌素的上清液提取物。上清液可被浓缩以获得包括细菌素的浓缩液，并且分离和纯化的细菌素可从上清液和浓缩液获得并可被脱水。
在此方法的特别优选的实施方案中，上清液组合物进一步进行干燥步骤以获得干燥的培养洗脱产物。干燥步骤可方便地是冷冻干燥或喷雾干燥，但适于干燥细菌素的任意的干燥方法，也包括真空干燥和风干，都是可考虑的。尽管在低温下由弯曲乳酸杆菌DSM 18775产生的细菌素没有被详细表征，但已知某些弯曲乳酸杆菌可产生Ila类细菌素包括沙克乳酸杆菌细菌素(Sakacin)。IIa类细菌素是小的热稳定蛋白，因此我们预期甚至中等程度加热培养洗脱产物的方法都会产生活性组合物。
借助于说明其特性的多种微生物学、生物化学和遗传学发现，在下面更详细地表征根据本发明的细菌素。百分比以重量计。抗菌活性的单位根据“琼脂孔试验”测定。在本发明的上下文中，抑制活性以任意单位定义。
使用琼脂孔试验来确定含有根据本发明的细菌素的培养上清液是否显示对不同的芽孢和细菌菌株的抑制活性。由此确定上清液的抑菌谱。
如本文所使用的术语“食品”是指因为细菌生长和增殖而易于腐败的任意食物。此类食品包括但不限于肉、奶制品、蔬菜、水果和谷物。
术语“冷藏品”与“以冷藏状态保存”同义，并且指在2-10℃的温度下储存的食品。食品可在真空下包装或以气调包装。
如本文所使用的，术语“肉”是指来自由人或动物食用的动物的任意肉制品或肉副产品(包括加工的肉制品)，包括而不限于，来自牛、羊、猪、家禽、鱼和甲克类海产品的肉。如本申请中所食用的，术语“即食性肉制品”也称为RTE肉制品，旨在包括在食用之前不期望烹饪的任意肉制品。
术语“奶制品”旨在包括使用奶或乳制品制成的任意食品，包括但不限于奶、酸奶、冰淇淋、乳酪、黄油和奶油。
如本文所使用的“保质期”是指食品能够卖给零售用户的期限。在传统的肉加工中，在动物被宰杀后，肉和肉副产品的保质期为大约30-40天。在此期间肉的冷藏预期能极大地阻止和/或延缓致病菌的生长发育以及较小程度地阻止和/或延缓腐败菌的生长发育。然而在大约30-40天后，冷藏不再能够有效地将腐败菌的增殖控制在可接受的水平之下。
如本文所使用的术语“杀菌作用”是指引起细菌死亡(即，减少其数量)的任意类型的处理。这与“抑菌作用”相反，“抑菌作用”是指处理仅抑制细菌的生长或增值的情况。如果一种药剂能够杀死一种或多种类型的细菌，则称该药剂是杀细菌剂或杀菌剂。杀菌剂被认为具有杀菌或杀细菌活性。
“细菌素”是指释放至细胞外的能够通过一种机制杀死某些其他密切相关的细菌的肽类或蛋白质分子，通过该机制生产细胞显示一定程度的特异免疫性。
如本文所使用的术语“腐败菌”是指能使食物变坏的任意类型的细菌。腐败菌可生长和增殖至食品变得不适于或不期望人或动物食用的程度。细菌能够在食物表面诸如肉表面上，通过同化食物表面上的糖类和蛋白质而增殖。通过代谢这些成分，腐败菌生成副产物，包括二氧化碳、甲烷、含氮化合物、丁酸、丙酸、乳酸、甲酸、含硫化合物和其他不期望的气体和酸类。这些副产物的产生改变了肉表面的颜色，经常将肉从红色转变称褐色、灰色或绿色。由腐败菌产生的气态副产物也使腐败的肉产生不良气味。由于腐败菌在肉制品的表面上生长引起的肉的颜色和气味改变经常使这些食品无法出售给用户。
除了控制腐败菌以外，在食品加工工业中关心的另一重要问题是控制食源性致病菌的生长。如本文所使用的，术语“食源性致病菌”是指能够导致动物或人类疾患的任意的导致食物中毒的有机体。要理解的是术语“食源性致病菌”包括感染食品(例如肉)并且从而导致疾患的细菌，以及产生导致疾患的毒素的细菌。优选地，食源性致病菌选自：豚鼠气单胞菌；嗜水气单胞菌；温和气单胞菌；蜡样芽孢杆菌；空肠弯曲杆菌；柠檬酸杆菌属；肉毒梭状芽孢杆菌；产气荚膜梭状芽孢杆菌；肠杆菌属；肠球菌属；大肠杆菌肠侵袭性菌株；大肠杆菌肠致病性菌株；大肠杆菌产肠毒素菌株；大肠杆菌O157:H7；克雷伯杆菌属；单核细胞增多性李斯特菌；类志贺氏邻单胞菌；沙门氏菌属；志贺氏菌属；金黄色葡萄球菌；链球菌属；霍乱弧菌；小肠结肠炎耶尔森氏菌。更优选地，致病菌是单核细胞增多性李斯特菌。
如本文所使用的，“有效量”的表述是指导致细菌生长的抑制或减少来自食品的其他细菌的数目的根据本发明的第一个方面的弯曲乳酸杆菌的量。
以权利要求形式提出的发明
本发明的优选方面和实施方案可以所谓权利要求的形式提出。见下。
1.一种在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH(DSMZ)保藏的保藏号为DSM 18775的弯曲乳酸杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株，或通过根据权利要求1所述的菌株的突变、变异或重组获得的弯曲乳酸杆菌菌株，其特征在于：其具有在2-10℃的温度下抑制食源性致病菌的生长而不引起食物感官变化的能力。
3.从根据权利要求1和2任意一项所述的菌株获得的培养物。
4.一种组合物，其特征在于：其包括根据权利要求1和2任意一项所述的弯曲乳酸杆菌菌株。
5.一种用于保存食品的组合物，其特征在于：其包括根据权利要求1和2任意一项所述的弯曲乳酸杆菌菌株。
6.一种用于保存食品的组合物，其特征在于：其包括根据权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株。
7.根据权利要求5或6任意一项所述的组合物，其用于延缓食源性致病菌的生长发育。
8.根据权利要求5-7任意一项所述的组合物，其用于延缓腐败菌的生长发育。
9.根据权利要求5-8任意一项所述的组合物，其中所述食品在真空下或以气调包装。
10.根据权利要求5-9任意一项所述的组合物，其中所述食品是RTE肉。
11.根据权利要求5-10任意一项所述的组合物，其中所述食品是奶制品。
12.一种制备具有抑制活性的组合物的方法，包括：
(a)培养如权利要求1或2中所述的弯曲乳酸杆菌菌株的细胞，所述细胞在培养基中培养后产生对包括单核细胞增多性李斯特菌的细菌菌株具有抑制活性的细菌素，从而获得包括所述细菌素的上清液；以及
(b)从所述的培养细胞分离上清液以获得所述上清液，由此获得包括所述细菌素的上清液组合物。
13.根据权利要求12所述的方法进一步包括从所述上清液组合物分离细菌素以获得纯化的细菌素产物。
14.根据权利要求12所述的方法，进一步包括浓缩所述上清液组合物以获得包括所述细菌素的浓缩液。
15.由权利要求12所述的方法的步骤(a)得到的培养基组合物。
16.包括由权利要求12所述的方法的步骤(b)得到的细菌素的上清液组合物。
17.可由权利要求12-14所述的方法获得的对包括单核细胞增多性李斯特菌的细菌菌株具有抑制活性的细菌素。
18.包括权利要求17所述的细菌素的无细胞弯曲乳酸杆菌培养物-培养基-上清液组合物。
19.包括如权利要求17所定义的细菌素的杀菌剂。
20.包括根据权利要求1和2任意一项所述的弯曲乳酸杆菌或其变异体或突变体的食品。
21.包括根据权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌的食品。
22.根据权利要求20-21任意一项所述的食品，其中所述食品在真空下或以气调包装。
23.根据权利要求20-22任意一项所述的食品，其以冷藏状态保存，并且在其表面上具有由根据权利要求1和2任意一项所述的弯曲乳酸杆菌组成的生物学屏障。
24.根据权利要求1-3任意一项所述的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或根据权利要求16所述的上清液组合物用于保存食品的用途。
25.根据权利要求1和3任意一项所述的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物用于保存食品的用途。
26.根据权利要求1-3任意一项所述的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或根据权利要求16所述的上清液组合物用于抑制以冷藏状态保存的食品上的食源性致病菌生长的用途。
27.根据权利要求1-3任意一项所述的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或根据权利要求16所述的上清液组合物用于延缓以冷藏状态保存的食品中出现不希望的感官效应(变味、异味或不希望的颜色变化)的用途。
28.根据权利要求1-3任意一项所述的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或根据权利要求16所述的上清液组合物用于阻止以冷藏状态保存的食品中腐败菌生长的用途。
29.根据权利要求24-28任意一项所述的用途，其中所述食品在真空下或以气调包装。
30.根据权利要求24-29任意一项所述的用途，其中所述食品是RTE肉制品。
31.根据权利要求24-29任意一项所述的用途，其中所述食品是奶制品。
32.根据权利要求24-31任意一项所述的用途，其中所述食源性致病菌是单核细胞增多性李斯特菌。
33.一种保存食品的方法，其特征在于根据权利要求1或2任意一项所述的弯曲乳酸杆菌或根据权利要求16所述的上清液组合物以有效量加入至所述食品中。
34.根据权利要求33所述的方法，其中在所述食品的制造过程期间加入所述弯曲乳酸杆菌菌株或所述上清液组合物。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述弯曲乳酸杆菌菌株或所述上清液组合物加入至所述食品中以便在所述食品的表面上形成屏障。
36.根据权利要求33-35任意一项所述的方法，其中所述食品是RTE肉。
37.根据权利要求33-35任意一项所述的方法，其中所述食品是奶制品。
38.一种控制食品中、食品加工设备上或食品储存容器上的李斯特菌污染的方法，包括将保藏号为DSM 18775的乳酸杆菌菌株以足以减少李斯特菌的量应用于食品或食品加工设备。
实施例
实施例1.菌株鉴定和细菌素的产生
DSM 18775在MRS (De Man，Rogosa和Sharpe，Difco，VWR，Herlev，Denmark)肉汤中在25℃下生长22h后，细胞悬液以4,000xg离心15min。上清液用1N NaOH调节至pH 6.0±0.1，并用滤器灭菌(0.45μm)。用无菌离子交换水制备上清液的两倍稀释液，并且每种细菌素稀释液50μl加入至含浓度为106CFU/ml的指示生物沙克乳酸杆菌NCFB 2714的MRS琼脂中的孔中。为了验证抑制性物质的蛋白特性，蛋白水解酶-蛋白酶K的溶液紧靠着琼脂孔扩散测定的一个孔施加。细胞上清液的细菌素活性被定义为在琼脂测定中产生抑制带的最高稀释度的倒数。观察到由蛋白质化合物细菌素产生的抑制带，活性为500单位/ml细胞上清液，清楚地表明DSM 18775产生可观量的抗李斯特菌细菌素。
实施例2.在摩泰台拉类香肠切片(I)上使用弯曲乳酸杆菌DSM 18775的应用试 验
在摩泰台拉香肠切片上评价DSM 18775的抗李斯特菌作用以及培养物的感官影响。5株单核细胞增多性李斯特菌混合物加入至RTE肉制品的表面上(103CFU/g)，然后接种生物保护性培养物(107CFU/g)。制品以气调(30％CO2和70％N2)包装，并在7℃下储存27天。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在MRS-琼脂板上，并在缺氧条件下在30℃下孵育3天来测定生物保护性培养物的细胞计数。DSM18775在制品上增殖并且在储存1周后达到大约108CFU/g，在储存结束时达到大约109CFU/g。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在李斯特菌选择性PALCAM琼脂板(Oxoid A/S，Glostrup，Denmark)上，并在微需氧条件下在37℃下孵育48h来测定李斯特菌细胞计数。在图1中可见到这些细胞计数，显示DSM18775对单核细胞增多性李斯特菌的杀菌作用。
通过一组10个评判员进行的感官分析三点试验法显示在储存11天后，生物保护性培养物的加入对感官没有任何显著的影响。在储存21天(保质期结束)后，感觉加入生物保护性培养物的制品与不加入DSM 18775的制品相比在口味和气味上较为新鲜，而不加入DSM 18775的制品的特征是较为无味。
实施例3.在细肉末摩泰台拉类香肠切片(II)上使用弯曲乳酸杆菌DSM 18775的 应用试验
在由细肉末制成的摩泰台拉香肠切片上评价DSM 18775的抗李斯特菌作用以及培养物对感官的影响。5株单核细胞增多性李斯特菌混合物加入至RTE肉制品的表面上(103CFU/g)，然后接种生物保护性培养物(107CFU/g)。制品以气调(30％CO2和70％N2)包装，并在7℃下储存27天。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在MRS-琼脂板上，并在缺氧条件下在30℃下孵育3天来测定生物保护性培养物的细胞计数。DSM18775在制品上增殖并且在储存1周后达到大约108CFU/g，在储存结束时达到大约109CFU/g。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在李斯特菌选择性PALCAM琼脂板(Oxoid A/S，Glostrup，Denmark)上，并在微需氧条件下在37℃下孵育48h来测定李斯特菌细胞计数。在图2中可见到李斯特菌细胞计数，清晰地说明了在整个27天的储存期间DSM 18775对单核细胞增多性李斯特菌的杀菌作用。
通过一组10个评判员进行的感官分析三点试验法显示在储存11天时或在保质期结束时，即，储存21天后，生物保护性培养物的加入没有任何显著的感官影响。
实施例4.在熟烟熏火腿切片上使用弯曲乳酸杆菌DSM 18775的应用试验
在熟烟熏火腿切片上评价DSM 18775的抗李斯特菌作用以及培养物的感官影响。5株单核细胞增多性李斯特菌混合物加入至RTE肉制品的表面上(103CFU/g)，然后接种生物保护性培养物(107CFU/g)。制品以气调(30％CO2和70％N2)包装，并在7℃下储存27天。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在MRS-琼脂板上，并在缺氧条件下在30℃下孵育3天来测定生物保护性培养物的细胞计数。DSM18775在制品上增殖并且在储存1周后达到大约108CFU/g，在储存结束时达到大约5×108CFU/g。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在李斯特菌选择性PALCAM琼脂板上，并在微需氧条件下在37℃下孵育48h来测定李斯特菌细胞计数。此制品并不支持单核细胞增多性李斯特菌的生长(可能由于烟熏加工步骤)，但存在与不存在DSM 18775相比，在整个27天储存期间单核细胞增多性李斯特菌的细胞计数有较大的减少(图3)。
通过一组10个评判员进行的感官分析三点试验法显示在储存11天时或在保质期结束时，即，储存21天后，生物保护性培养物的加入没有任何显著的感官影响。
实施例5.在维也纳香肠上使用弯曲乳酸杆菌DSM 18775的应用试验
在维也纳香肠上评价DSM 18775的抗李斯特菌作用以及培养物的感官影响。5株单核细胞增多性李斯特菌混合物加入至RTE肉制品的表面上(103CFU/g)，然后接种生物保护性培养物(107CFU/g)。香肠以真空包装，并在7℃下储存27天。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在MRS-琼脂板上，并在缺氧条件下在30℃下孵育3天来测定生物保护性培养物的细胞计数。DSM18775在制品上增殖并且在储存1周后达到大约108CFU/g，在储存结束时达到大约5×108CFU/g。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在李斯特菌选择性PALCAM琼脂板上，并在微需氧条件下在37℃下孵育48h来测定李斯特菌细胞计数。发现DSM 18775对单核细胞增多性李斯特菌有瞬时的杀菌作用，并且与在此RTE肉制品中缺少生物保护性培养物时发现的单核细胞增多性李斯特菌的显著生长相反，在整个储存期间细胞计数一直是较少的(图4)。
使用沙克乳酸杆菌作为指示生物，使用琼脂孔扩散测定来检测在维也纳香肠中由DSM 18775产生的细菌素。通过用0.02M HCl(1∶2，w/v)匀浆，在5℃下以16,000xg离心5min，用1N NaOH将上清液调整至pH 6.0±0.1并用滤器灭菌(0.45μm)，从香肠提取细菌素。为了验证抑制性物质的蛋白特性，蛋白水解酶-蛋白酶K的溶液紧靠着琼脂孔扩散测定中的香肠提取物施加。在储存11、21和48天后，观察到由蛋白质化合物，推测是从来源于维也纳香肠的提取物中的细菌素产生的抑制带。
在通过一组10个评判员进行的感官分析三点试验法中，在储存11天后，加入DSM 18775的维也纳香肠与没有生物保护性培养物的香肠感官稍有不同，且更新鲜，而在储存21天后，即，在保质期结束时，发现DSM 18775对感官质量没有显著的影响。
实施例6.在熟烟熏火腿切片上使用弯曲乳酸杆菌DSM 18775的应用试验
在熟火腿切片上评价DSM 18775的抗李斯特菌作用以及培养物的感官影响。5株单核细胞增多性李斯特菌混合物加入至RTE肉制品的表面上(103CFU/g)，同时，接种或不接种生物保护性培养物(107CFU/g)。制品以气调(30％CO2和70％N2)包装，并在5℃下储存4周。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在MRS-琼脂板上，并在缺氧条件下在30℃下孵育3天来测定生物保护性培养物的细胞计数。DSM18775在制品上增殖并且在储存结束时达到大约108CFU/g。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在李斯特菌选择性PALCAM琼脂板上，并在微需氧条件下在37℃下孵育48h来测定李斯特菌细胞计数。如图6中所见，发现DSM 18775对单核细胞增多性李斯特菌具有明显的杀菌作用，在整个储存期间观察到1-2log10单位的减少(图5)。
在通过一组8个评判员进行的感官分析三点试验法中，发现在整个储存期期间存在与不存在生物保护性培养物相比，制品的感官质量没有明显的差异。
实施例7.在新鲜奶酪上使用弯曲乳酸杆菌DSM 18775的应用试验
向20kg全乳(在72-73℃下巴氏灭菌，匀浆和标准化为3.0％乳脂)加入3.5×1010CFU的生物保护性培养物DSM 18775，相当于大约107CFU/g奶酪。在接种时，乳的温度为35℃。在加入粗制凝乳酶之前，DSM 18775在35℃下在乳中预成熟30min。新鲜奶酪的制造遵循制造新鲜奶酪的标准方案：切开凝乳，将凝乳在43℃下加热30min，排出50％乳清，干腌以获得奶酪的最终盐含量为2％。制造后，奶酪被分成较小的块，单独地真空包装，并在9℃下储存4周。
通过将在胨盐水中制备的适当的10倍稀释液接种在MRS-琼脂板上，并在缺氧条件下在30℃下孵育3天来测定生物保护性培养物的细胞计数。DSM18775的初始细胞计数比期望值小10倍(大约106CFU/g)，但在储存期间，DSM18775在奶酪中增殖并且在4周后达到大约108CFU/g。
在整个储存期间，在奶酪中观察到加入生物保护性培养物，pH迅速下降，但如图6中所见，在储存结束时，有或没有生物保护性培养物的奶酪中观察不到显著的差异。
一组三个专业评定员评价加入生物保护性培养物对新鲜奶酪的影响。对三块奶酪主要以口感和质地进行表征。评价在10℃下进行。评定员们描述与不加入DSM 18775的奶酪相比，加入DSM 18775的奶酪较新鲜、更为致密、质地较好，不加入DSM 18775的奶酪被表征为不新鲜的、无味的和易碎的。
在琼脂孔扩散测定中使用沙克乳酸杆菌NCFB 2714作为指示生物来测定在储存期间在新鲜奶酪中由DSM 18775产生的细菌素。通过用0.02M HCl(1∶5，w/v)匀浆，在5℃下以16,000xg离心5min，用1N NaOH将上清液调整至pH 4.5±0.1并用滤器灭菌(0.45μm)，从奶酪提取细菌素。为了验证抑制性物质的蛋白特性，蛋白水解酶-蛋白酶K的溶液紧靠着琼脂孔扩散测定中的奶酪提取物施加。
在储存期间的新鲜奶酪中产生并检测到细菌素，在头3周期间其量不断增加(表1)，且处于预期抑制奶酪中单核细胞增多性李斯特菌生长的浓度范围内。
表1
  储存期间分析日  加入DSM 18775的奶酪中的细菌素活性(单位/毫克)  不加入DSM 18775的奶酪中的细菌素活性(单位/毫克)
  0  -  -
  7  8  -
  14  16  -
  21  32  -
  28  32  -
实施例8.弯曲乳酸杆菌DSM18775培养洗脱物与市售培养洗脱物的比较
DSM18775的冻干洗脱物对乳化肠切片的抗李斯特菌作用与来自Danisco，MicroGARD 730的相似类型产品的作用进行比较。
5株单核细胞增多性李斯特菌混合物以大约5e03CFU/g(5×103CFU/g)的终浓度加入至乳化肠切片。加入溶解在Milli-Q水中并经滤器灭菌(0.2mm)的DSM18775和MicroGARD 730的培养洗脱物溶液，终浓度为0.01和0.1％(w/w)。作为对照，相同体积的盐水胨代替培养洗脱液加入至乳化肠切片。被接种的乳化肠切片以气调(MA30％CO2和70％N2)或真空包装，并在7℃下储存。
储存1和7天后，通过在盐水胨中制备适当的10倍稀释液并平板涂布在PALCAM琼脂板上，并在30℃下微需氧孵育2天来检测MA包装和真空包装的肉中李斯特菌的含量。在储存1和7天后感官评价没有加入李斯特菌的切片。
细胞计数的结果显示在图7中，显示在两种包装条件下DSM18775洗脱物抑制单核细胞增多性李斯特菌生长的能力较强。MicroGARD 730仅在最高浓度(0.1％)和MA条件下具有轻微的生长抑制作用。相反，DSM18775的培养洗脱物在0.1％的高浓度下在MA包装时能够阻止单核细胞增多性李斯特菌的生长，并且在真空时几乎完全阻止其生长。
感官评价显示DSM18775或MicroGARD对MA包装或真空包装的乳化肠的颜色或口味都没有影响。然而，感官评价小组注意到加入MicroGARD 730的真空包装的乳化肠切片有轻微的酸性气味。
关于保藏的微生物[专家方案，第13条第6款(PCT)]
对于本专利申请中提到的所有保藏的微生物下列的情况均适用。
关于各指定国家的各专利局，申请人请求在本专利被授权之日或本申请已被驳回或撤回或视为撤回之日前，上面声明的保藏的微生物的样品仅提供给请求人所指定的专家。
具体来说，请求针对：
欧洲
就欧洲专利要求的指定而言，在公布授予欧洲专利的通知或本申请已被驳回或撤回或视为撤回之日前，保藏的微生物样品是可获得的，但此样品仅发放给该样品的请求人所指定的专家，并且i)经申请人和/或ii)欧洲专利局两者任一个批准(EPC第32条)。
加拿大
申请人请求，在基于申请授予加拿大专利或该申请被驳回，或被放弃并且不再恢复权利，或被撤回之前，专利局长仅授权将申请中提到的保藏的生物材料样品提供给由专利局长指定的独立专家，申请人必须相应地在公布国际申请的技术准备完成之前通过书面声明通知国际局。
澳大利亚
申请人在此通告，仅在专利授权之前，或在专利的期满终止、驳回或撤回之前可以将微生物样品提供给对本发明没有利害关系的专业技术人员。
新加坡
申请人在此请求，仅将微生物样品提供给专家。

Claims (17)

1.一种弯曲乳酸杆菌菌株，其在Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmBH(DSMZ)保藏，保藏号为DSM 18775，其特征在于：其具有在2-10℃的温度下抑制至少一种食源性致病菌的生长而不引起食物感官变化的能力。
2.根据权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株，或通过根据权利要求1所述的菌株的突变、变异或重组获得的弯曲乳酸杆菌菌株，其特征在于：其具有在2-10℃的温度下抑制至少一种食源性致病菌的生长而不引起食物感官变化的能力。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的弯曲乳酸杆菌菌株，其中所述食源性致病菌是单核细胞增多性李斯特菌。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的弯曲乳酸杆菌菌株，其中所述菌株除了抑制至少一种食源性致病菌的生长，还对至少一种食源性致病菌有杀菌作用。
5.一种用于保存食品的组合物，其特征在于：其包括根据权利要求1-4任意一项所述的弯曲乳酸杆菌菌株。
6.根据权利要求5所述的组合物，用于延缓食源性致病菌或腐败菌的生长发育。
7.根据权利要求5或6任意一项所述的组合物，其中所述食物是RTE肉或奶制品。
8.一种制备能够抑制至少一种食源性致病菌的生长的组合物，所述方法包括：
(a)培养如权利要求1或4任意一项中所述的弯曲乳酸杆菌菌株的细胞，所述细胞在培养基中培养后产生对包括单核细胞增多性李斯特菌的细菌菌株具有抑制活性的细菌素，从而获得包括所述细菌素的上清液；以及
(b)从所述的培养细胞分离上清液以获得所述上清液，由此获得包括所述细菌素的上清液组合物。
9.根据权利要求8所述的方法进一步包括干燥步骤以获得干燥的培养洗脱物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述干燥步骤是冷冻干燥或喷雾干燥。
11.根据权利要求8-10任意一项所述的方法，其中有效量的生长抑制组合物对所述至少一种食源性致病菌具有杀菌作用。
12.根据权利要求8-11任意一项所述的方法，其中所述至少一种食源性致病菌是单核细胞增多性李斯特菌。
13.由权利要求8-12任意一项所述的方法获得的组合物。
14.一种对包括单核细胞增多性李斯特菌的细菌菌株具有抑制活性的细菌素，其可通过包括权利要求8-12任意一项所述方法的方法获得。
15.根据权利要求1-4任意一项所述的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或如权利要求8所述的方法的步骤(b)的上清液组合物或如权利要求13所述的组合物用于保存食品的用途。
16.根据权利要求1-4任意一项所述的弯曲乳酸杆菌的菌株和培养物或如权利要求8所述的方法的步骤(b)的上清液组合物或如权利要求13所述的组合物用于抑制在2-10℃温度下以冷藏状态保存的食品上食源性致病菌或腐败菌生长的用途。
17.一种控制食品中、食品加工设备上或食品储存容器上的李斯特菌污染的方法，包括将保藏号为DSM 18775的乳酸杆菌菌株以足以减少所述李斯特菌的量应用于食品或食品加工设备。
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