CN1875110A - 含细菌素乳酸菌培养物的生产方法及使用它保存食品的方法 - Google Patents

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Abstract

通过培养诸如Weissella属等的乳酸菌来生产含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物，在食品中使用所述培养物可以改进食品的耐存储性。

Description

含细菌素乳酸菌培养物的生产方法及使用它保存食品的方法
                              技术领域
本发明涉及1)一种含细菌素的乳酸菌培养物的生产方法，2)用含细菌素的乳酸菌培养物保存食品的方法，3)能够产生细菌素的乳酸菌的筛选方法。
                              背景技术
为了防止食品的腐败和品质退化，在各种食品中加入食品防腐剂。这样的食品防腐剂，迄今为止主要是使用化学合成的食品防腐剂。然而，化学合成食品防腐剂有时会涉及对光的安全性问题，例如持久性或毒性。为了解决这个问题，人们期望开发出来源于传统食品的安全的抗菌物质。
同时，乳酸菌是传统上已经用于生产各种发酵食品(包括发酵饮料)，例如酱油、豆瓣酱(日本豆酱)、泡菜和日本清酒等的有用的微生物。另外，乳酸菌已被用于生产发酵食品的加工。这归因于，由于通过乳酸发酵而产生乳酸从而体系的pH降低，因此抑制了存在于生产过程和最终产品中的污染菌的生长，从而能防止这些食品腐败和品质退化。另外，已经证明，由乳酸菌产生的抗菌物质对于防止食品的腐败和品质退化也有用。
抗菌物质中，由各种细菌产生的蛋白质抗菌物质被称为细菌素。由乳酸菌产生的各种细菌素中，乳链菌肽是被美国食品药品管理局(FDA)批准的公认安全(GRAS)物质，同时也被世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)批准的具有抗菌活性的安全物质。此外，乳链菌肽在全世界50多个国家被用作为食品防腐剂。
然而，不利的是，包括乳链菌肽在内的已知的各种细菌素与蛋白酶在一起很容易分解。换句话说，在生产像清酒、酱油和豆瓣酱(日本豆酱)等发酵食品的过程中，细菌素很容易被由米曲霉等产生的蛋白酶分解。所以细菌素不能维持满意的抗微生物活性。例如，据报导，在清酒的巴斯德氏灭菌法之前加入乳链菌肽的情况下(公开No.JP06-319516)和加入acidocin8912作为另一个细菌素种的情况下(公开No.JP06-319516)，不能获得抗微生物效果，这是因为在未加工的清酒中，这些种的细菌素被诸如蛋白酶的酶分解。目前，还没有报道表明乳酸菌产生抗蛋白酶的细菌素。
另外，经过处理的肉类产品，例如火腿和香肠，是由于存在于其原材料自身的微生物或在生产过程中污染微生物而自然发酵，因此可以赋予更好的风味和可保存性。为了稳定产品质量、缩短生产周期和防止有害微生物的生长，目前，已经开发了起子培养物方法(乳酸菌科学技术，联合出版中心，1996年，239页)。
例如，Chung等人披露了在乳链菌肽溶液中浸渍未煮过的肉的效果或在预先注射特定菌种的新鲜的可食用肉上放置乳链菌肽的效果。根据报告，用于新鲜的食用肉的乳链菌肽很快就失去了活性(Env.Microbiol.55：(6)1329-1333页(1989))。这是由于乳链菌肽在食用肉内被诸如组织蛋白酶的蛋白酶分解而很快失去抗菌活性。
为了防止类似上述乳链菌肽的酶分解，一项包括热处理食用肉、随后将诸如乳链菌肽的羊毛硫氨酸基细菌素施于热处理食用肉的表面上的发明被报道(公开号JP06-22685)。然而，食用肉在加入乳链菌肽之前应该加热处理。因此，该发明的使用范围多少受到限制。
目前在食品工业上，迫切要求提供适用于各种食品包括发酵食品和经加工的肉类制品的抗蛋白酶细菌素。
                                  发明内容
如上所述，乳酸菌传统上已经用于处理各种食品包括发酵食品，而且从来没有引起任何安全问题。另外，由乳酸菌产生的抗菌物质被认为比化学合成物质安全。因此，本发明的目的是提供1)一种含细菌素的乳酸菌培养物的生产方法；2)用含所述细菌素的乳酸菌培养物保存食品的方法；和3)能够产生抗蛋白酶细菌素的乳酸菌的筛选方法。
为了解决这个课题，发明人对存在于诸如发酵牛奶等发酵食品中的乳酸菌进行了分离，并筛选了产生新的抗蛋白酶细菌素的菌株。因此，发明人成功地分离了产生那种物质的乳酸菌。发明人证实，由所述菌株产生的细菌素是新物质。以下详细描述本发明。
(1)一种含抗蛋白酶的细菌素的乳酸菌培养物的生产方法。
(2)如(1)所述的方法，其中，乳酸菌属于Weissella、小球菌属、乳杆菌属或白联珠菌属中的任何一个属。
(3)在(2)中所述的方法，其中，属于Weissella属的乳酸菌是Weissella属FERM P-19577、Weissella cibaria JCM12495，Wissella confusa JCM1093、Weissella hellenica JCM10103、Weissella kandleri JCM5817、Weissella minor JCM1168、Weissella paramesenteroides JCM9890或Weissella thailandensis JCM10694中的任何一个。
(4)在(2)中所述的方法，其中，属于小球菌属的乳酸菌是戊糖片球菌。
(5)在(2)中所描述的方法，其中，属于乳杆菌属的乳酸菌是植物乳杆菌、Lactobacillussalivarius或Lactobacillus pentosus中的任何一个。
(6)在(2)中所描述的方法，其中，属于白联珠菌属的乳酸菌是Leuconostoe citreum、Leuconostoc pseudomesenteroides、Leuconostoc argentinum、Leuconostoccamosum或Leuconostoc mesenteroides中的任何一个。
(7)一种保存食物产品的方法，其中，(1)至(6)中任何一个所述的乳酸菌培养物被用于食品的生产过程。
(8)如(7)中所述的方法，其中，食品为发酵食品或加工过的肉类制品。
(9)一种筛选产生细菌素的乳酸菌的方法，其包括筛选所述细菌素即使在蛋白酶存在的情况下也具有抗菌活性的乳酸菌培养物的步骤。
以下详细描述本发明。
在亚美尼亚，通常也作为一个长寿国家为人所知，现在已经知道了大量传统上配制给病人的健康食品。例如，食品包括诸如Matsoon和Narine、干杏、红葡萄酒、jyesiin和tiinaff的乳酸食品。发明人将注意力主要集中在亚美尼亚人们食用的发酵牛奶Matsoon和作为发酵食品原料的清酒曲(koji)上，展开研究工作。
在本发明中，“具有蛋白酶耐性的细菌素”或“耐蛋白酶细菌素”是指即使在有来源于米曲霉的蛋白酶存在的情况下仍然具有抗菌活性的细菌素。也包括其抗菌活性会被淀粉酶降低的细菌素。
乳酸菌培养物，包含“具有蛋白酶耐性的细菌素”或“耐蛋白酶细菌素”，是指形成指示菌株抑制区的培养物，在下述方法中将作具体说明：
(1)根据普通的培养法(或用于分离微生物的培养法)配制乳酸菌培养物。用氢氧化钠溶液调节乳酸菌培养物的pH至pH5.5-6.0。随后，在12,000rpm转速下将培养物离心10分钟，用一次性注射器过滤装置“Dismic-25cs”，0.45μm的醋酸纤维素(ADVANTEC公司)过滤，滤液作为样品。如果样品的抗菌活性低，需要将样品在室温下减压浓缩至4倍。必要时，浓缩至10倍。
(2)使用Listeria innocua ATCC33090T、Bacillus circulans JCM2504T、Bacillus coagulansJCM2257、Micrococcus luteus IFO12708、Bacillus subtilis JCM1465T、Bacillus subtilisIAM1381、Lactococcus lactis sub sp.Lactis ATCC19435、Enterococcus faecium JCM5804T、Enterococcus faecium JCM5803T、Lactobacillus plantarum ATCC14917T和Lactobacillus sakeiJCM1157T作为指示菌株，通过后述菌苔上点样法(SPOT-ON-LAWN)或菌落形成单位数的测定来选择具有最强抗菌活性的指示菌。
(3)酶，使用来源于曲霉(UMAMIZYME G，Amano Enzyme Co)的蛋白酶。
(4)在如(1)所述的样品中添加10至100unit/ml的(3)所述的蛋白酶，在30℃下反应1小时以上。
(5)将表现出(2)中所述的最强抗菌活性的指示菌株涂在中厚板上，例如指示菌可以生长的MRS中厚板，在中厚板的中心处滴下0.01毫升如(4)所述的蛋白酶处理过的样品，在适合指示菌生长的最适温度下(对于Listeria innocua，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，Enterococcus faecium或Pediococcus pentosaceus是37℃，对于其他菌是30℃)培养20至24小时。然后，可以观察到指示菌的抑制区。
本发明的能够产生耐蛋白酶的细菌素的乳酸菌是从发酵食品等中分离出来的。当然，也可以使用通过下述筛选方法获得的具有抗菌活性的乳酸菌。换言之，任何产生耐蛋白酶的细菌素的乳酸菌都适宜使用，而对于从哪种菌中分离出来的没有特殊的限制。根据发明人研究的结果，发现乳酸菌当中，Weissella属、小球菌属(Pediococcus)、Lactobacillus属、Leuconostoc属等产生所期望的耐蛋白酶细菌素。不言而喻，除上述以外，只要是能够产生耐蛋白酶细菌素的乳酸菌，都可以使用。
通过在生产酱油、味噌和鱼酱等各种发酵食品以及火腿、香肠等各种加工过的肉制品的工艺中使用含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物，所述含耐蛋白酶细菌素的培养物是通过培养能够产生耐蛋白酶细菌素的乳酸菌而得到的，这样就可以防止目标食物的腐败和品质退化。细菌素可以分离后使用。或者，也可以不需分离直接将包含细菌素的培养物用作细菌素。由于分离等纯化过程通常很麻烦，所以优选将乳酸菌培养物本身添加到生产各种发酵食品的工艺中。此外，含有耐蛋白酶细菌素的培养物在生产发酵食品、加工过的肉制品等的工艺中可以添加一次或多次。细菌素或液体培养基被分成多少份添加可以自由决定。
为获得预期的包含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物，乳酸菌应该被培养。培养条件，例如培养温度、培养次数、培养方法和培养基可以选择通常用来培养乳酸菌的培养条件。另外，凝胶过滤等常规的分离和纯化方法也可以用来分离。本发明的乳酸菌培养物是指含有被培养的乳酸菌的培养基或通过离心等除去所培养的乳酸菌的培养基。培养基可以是液体、固体或凝胶状物。当使用液体培养基时，有时也写成乳酸菌培养液。当然，乳酸菌培养物包括乳酸菌培养液。另外，本发明的乳酸菌培养物包括，通过喷雾干燥、冷冻干燥等得到的液体乳酸菌培养物的干粉，通过过滤、蒸发等得到液体乳酸菌培养物的浓缩液或糊状物，通过凝胶过滤、层析法等得到的具有抗菌活性的液体乳酸菌培养物的一部分。
含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物可以被添加到任何食品中，对比并没有特殊的限制。最好为，将培养物添加到在生产过程中引入微生物的发酵食品和加工过的肉制品中。
发酵食品包括酱油、鱼酱、清酒、豆瓣酱、味噌、泡菜、乳酪等。这些只是一部分例子，含有耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物可以用于除上述例子之外的食品中。
发酵食品中，一直以来使用氯化钠作为抑菌剂。由于近年来对低盐饮食需求的增加以及通过在发酵作用中降低盐或除去盐可以加快蛋白质分解速率的优势，已经开展了在发酵食品中使用诸如乳链菌肽的细菌素的研究工作。然而，由于乳链菌肽和各种细菌素被存在于生产过程中的蛋白酶分解，所以目前还没有观察到抑菌力。在这样的生产发酵食品的工艺中，也可以使用含有耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物。
另外，加工过的肉制品包括，例如火腿和香肠。当然，这只是举一些例子。含有耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物可以用于除上述例子之外的食品中。
添加了包含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物的食品，例如发酵食品和加工过的肉制品等，具有非常高的耐存储性。
在以下的实施例中，描述作为本发明的一个重要方面的产生耐蛋白酶细菌素的乳酸菌的筛选方法，在这些实施例中，乳酸菌是从发酵食品Matsoon中分离出来的。
将从发酵食品之一的发酵牛奶Matsoon中收集的样品在乳酸菌能够生长的培养基中培养，所述培养基有例如MRS培养基(表1)或M17培养基(表2)，培养温度为30℃至37℃，放入培养基的样品量是0.5％。培养天数为1天、5天或10天。培养结束后，将培养液涂布在包含0.5％碳酸钙的琼脂培养基(琼脂1.2％)上并培养。从产生的菌落中收集乳酸菌。
    表1.MRS培养基的组成
  MRS培养基的组成(默克公司)
  蛋白胨   10.0g/l
  Lab-Lemco′s粉末   8.0g/l
  酵母提取物   4.0g/l
  葡萄糖   20.0g/l
  吐温80   1.0g/l
  磷酸氢二钾   2.0g/l
  醋酸钠   5.0g/l
  柠檬酸铵   2.0g/l
  七水合硫酸镁   0.20g/l
       表2.M17培养基的组成
  M17培养基的组成(默克公司)
  来源于大豆粉的蛋白胨   5.0g/l
  来源于肉类的蛋白胨   2.5g/l
  来源于酪蛋白的蛋白胨   2.5g/l
  酵母提取物   2.5g/l
  肉类抽提物   5.0g/l
  D(+)-乳糖   5.0g/l
  抗坏血酸   0.5g/l
  b-甘油磷酸钠   19.0g/l
  硫酸镁   0.25g/l
将收集的乳酸菌按前述方法培养。接着，将来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)蛋白酶的Umamizyme G(Amano酶公司)经过滤后添加到MRS琼脂培养基，在上述MRS琼脂培养基的平皿内接种并培养这些乳酸菌24小时。随后，将预先混合了指示菌株的LactobacilliAOAC培养基(表3)叠加在平皿上，培养24小时，形成指示菌株的抑制区。
表3.Lactobacilli AOAC培养基的组成
  Lactobacilli AOAC培养基的组成(Difco)
  蛋白胨乳   15.0g/l
  酵母提取物   5.0g/l
  葡萄糖   10.0g/l
  番茄汁   5.00g/l
  磷酸二氢钾   2.0g/l
  聚山梨醇酯80   1.0g/l
关于添加蛋白酶的方法，除了将蛋白酶混合在琼脂培养基内的方法外，还可以使用例如以下方法。
1)将蛋白酶和指示菌株一起混合至培养基内的方法。
2)在琼脂培养基上涂布蛋白酶的方法。
3)在培养乳酸菌菌落时添加蛋白酶的方法，在这种情况下，蛋白酶可以在开始培养时、在培养期间内、或培养结束后添加。
4)将样品适量滴在混合了指示菌株的培养皿上，观察抑制区形成的方法，其中，所述样品是在培养乳酸菌菌落、然后将培养液中的菌体灭菌或杀死之后，添加了蛋白酶的样品。再次说明，方法不局限于1)至4)所述的方法。另外，蛋白酶不局限于Umamizyme G。
然后，通过分析抗菌谱进行评价。采用菌苔上点样法(spot-on-lawn)在培养皿上点样具有抗菌活性的乳酸菌培养物的上清液，考察如下所述的抗菌活性，考查抗菌谱。
首先配制具有抗菌活性的样品。将由上述方法获得的具有抗菌活性的菌株培养液在10,000rpm下离心10分钟，从而获得培养物上清液。然后通过过滤器过滤上清液来获得无菌样品。将样品每次稀释2倍，直至配制成稀释级数为211的稀释系列。当活性比较低的情况下，在室温下每次将样品减压浓缩2倍，逐渐配制浓度级数至2-3。
然后，培养欲混合在培养皿上来考查抗菌活性的指示菌株。在TSBYE培养基(表5和6)或MRS培养基上培养表4所示的指示菌株。杆菌属和小球菌属是用振荡器培养而其他菌是静置培养。另外，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、李斯特菌属(Listeria)、小球菌属(Pediococcus)和肠球菌(Enterococcus)在37℃培养而其他菌则在30℃培养。
       表4.评价抗菌活性指示菌株
  菌株名称   培养基/温度(℃)   培养方法
  凝结芽孢杆菌JCM2257   TSBYE/37   振荡培养
  枯草杆菌JCM1465T   TSBYE/30   振荡培养
  Bacillus subtilis IAM1381   TSBYE/30   振荡培养
  环状杆菌JCM2504T   TSBYE/30   振荡培养
  Micrococcus luteus IFO12708   TSBYE/30   振荡培养
  Listeria innocua ATCC33090T   TSBYE/37   静置培养
  戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885   TSBYE/37   静置培养
  Enterococcus faecalis JCM5803T   TSBYE/37   静置培养
  Enterococcus faecium JCM5804T   TSBYE/37   静置培养
  Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC19435   MRS/30   静置培养
  植物乳杆菌(Laetobacillus plantarum)ATCC14917T   MRS/30   静置培养
  Lactobacillus sakei subsp.sakei JCM1157T   MRS/30   静置培养
  Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides JCM6124T   MRS/30   静置培养
  Lactobacillus kimchii JCM10707T   MRS/30   静置培养
    表5.TSBYE培养基的成分
  表5.TSBYE培养基的成分
 TSB培养基   30.0g/l
 酵母提取物(Difco)   6.0g/l
              表6.TSB培养基的成分
 Bacto胰蛋白酶的大豆培养液(TSB)培养基(Difco)的成分
  酪蛋白胰腺消化液   17.0g/l
  大豆饼粉的酶消化液   3.0g/l
  葡萄糖   2.5g/l
  氯化钠   5.0g/l
  磷酸氢二钾   2.5g/l
此外，配制考查抗菌活性的平皿在121℃对10毫升MRS琼脂培养基(琼脂1.2％)和5毫升Lactobacilli AOAC琼脂培养基(琼脂1.2％)分别灭菌15分钟，然后，保持温度55℃。将灭菌后的MRS琼脂培养基倾注在无菌的陪氏培养皿，然后放置在净化操作台上1小时。随后，将50ml的指示菌株培养液混合在Lactobacilli AOAC琼脂培养基，保持温度为55℃。将培养液倾注在MRS平皿上。在净化操作台上打开平皿的盖子(大约15分钟)，干燥表面。
将如上所配制的10μl每一种具有抗菌活性的样品滴加到平皿上。然后，盖上盖子，按照原样放置大约一小时，干燥平皿。在适宜于各个指示菌株的温度下培养平皿20小时，来考查抑制区的形成。这里，抗菌活性(AU/ml)定义如下：
抗菌活性(AU/ml)＝(形成抑菌圈的最大稀释比)×1000/10
按这种方式进行了抗菌谱分析的样品具有蛋白酶耐性，表现出广泛的抗菌谱。
考查按上述方法筛选的乳酸菌菌株AJ110263的细菌学性质。根据16S核糖体DNA(rDNA)核苷酸序列的同源性分析(Altschul，S.F.Madden T.F.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.Miller，W.，Lipman，D.J.(1997)Gapped BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库查找程序(a new generation of protein database search programs)。核酸研究(Nucleic Acids Res.)。25：3389-3402.)。菌株具有与Weissella confusa菌株ATCC 1088198.22％的同源性(表7)。同源性评价使用保藏在美国标准菌库(ATCC)的标准培养物(type culture)。
                表7.菌株AJ110263的16S rDNA同源性
16S rDNA的同源性   Weissella confusa   98.22％
  Weissella viridescens   95.20％
  Weissella minor   92.54％
  Weissella kandleri   92.01％
  Weissella halotolerans   87.39％
  Weissella paramesenteroide   86.25％
  Lactobacillus mali   78.17％
  小片球菌(Pediococcus parvulus)   77.58％
一般认为，菌株的基本特性(表8)与乳酸菌的一般性状一致，且糖发酵模式(表9)与Weissella confusa的发酵模式相似。然而，根据菌株L-阿拉伯糖的发酵模式不同以及菌株在16S rDNA上不具有100％的同源性，可以认为菌株是不同于任何已知的菌的新菌株。因此，将菌株命名为Weissella sp.AJ110263。菌株保藏在国际专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)(IPOD)，高级工业科学技术国家研究院(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(AIST))，保藏号是FERM P-19577。
   表8.乳酸菌菌株AJ110263的基本特性
  细胞形态   短的杆菌(0.8-1.0×1.0-1.5μm)
  革兰氏染色   (+)
  孢子   (-)
  运动性   (-)
  菌落形态(培养基：MRS培养基)(培养温度：30℃)(培养时间：24hr)   圆形全部外缘光滑低凸出状有光泽不透明
  培养温度(37℃/45℃)   (+/-)
  催化酶   (-)
  产酸/产气(葡萄糖)   (+/-)
  O/F测试(葡萄糖)   (+/+)
  在pH 9.6下的生长   (+)
  在NaOH(6.5％)条件下的生长   (+)
    表9.乳酸菌菌株AJ110263的糖发酵特性
  糖发酵特性
发酵性(+)   L-阿拉伯糖   熊果苷
  D-木糖   七叶苷
  半乳糖   水杨苷
  葡萄糖   纤维二糖
  果糖   麦芽糖
  甘露糖   精制糖
  N-乙酰葡糖胺   龙胆二糖
  苦杏仁苷   葡糖酸
  发酵性(-)   甘油   海藻糖
  赤藓糖醇   菊粉
  D-阿拉伯糖   松三糖
  核糖   棉籽糖
  L-木糖   淀粉
  阿东糖醇   糖原
  β-甲基-D-木糖   木糖醇
  山梨糖   D-tulanose
  鼠李糖   D-来苏糖
  半乳糖醇   D-塔格糖
  肌醇   D-岩藻糖
  甘露醇   L-岩藻糖
  山梨糖醇   D-阿糖醇
  α-甲基-D-甘露糖   L-阿糖醇
  α-甲基-D-葡萄糖   2-酮葡糖酸
  乳糖   5-酮葡糖酸
  蜜二糖
                        具体实施方式
现在结合以下实施例说明本发明。然而，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
预先培养从发酵牛奶Matsoon中分离的Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)和来自典型培养物的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5890、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JCM1149、Lactobacillus salivariusJCM1231，然后在MRS培养基(表1)中培养。Weissella sp.在30℃培养而其他菌株则在37℃培养。在分别添加了表3所示的0U/ml(未添加)、200U/ml和400U/ml的Umamizyme G的MRS培养基上接种乳酸菌，培养24小时。
培养是这样实施的：在500毫升Sakaguchi烧瓶内装入100毫升MRS培养基，然后接种100ml每一种前培养液，在100次/分的振荡下振荡培养。
接着，覆盖混合了Lactobacillus sakei菌株JCM1157作为指示菌株的Lactobacilli AOAC培养基。将这些平皿培养24小时。从而，形成指示菌的抑制区(表10)。结果表明每个菌株都产生耐蛋白酶细菌素。
               表10.产生PRB菌株的抑制区直径(毫米)
  菌株   蛋白酶(U/ml)
  0   200   400
  Weissella sp.AJ110263   7   10   10
  戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885   15   15   15
  戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5890   10   12   12
  植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JCM1149   15   17   23
  Lactobacillus salivarius JCM1231   13   18   18
Lactobacillus sakei strain JCM1157被用作指示菌株。表中的数值表示生长抑制区的直径。
实施例2
30℃下在MRS培养基上培养Lactococcus lactis NCDO497(乳链菌肽A产生菌)和Lactococcus lactis NCIMB702054(乳链菌肽Z产生菌)。与实施例1同样的方法，用Lactobacillus sakei菌株JCM1157作为指示菌株评价抗菌活性。
另外，用1000IU/ml的乳链菌肽A溶液(ICN Biomedical Inc.(ICN生物医学公司))代替使用乳链菌肽产生菌，在MRS琼脂培养基平皿上点样10μl，评价抗菌活性。
在没有蛋白酶的情况下，形成指示菌株的抑制区。在有蛋白酶存在的情况下，当蛋白酶浓度较高时(表11)活性降低。
      表11.不产生PRB菌株的抑制区直径(毫米)
  菌株   蛋白酶(U/ml)
  0   200   400
  添加乳链菌肽A(未使用菌株)   30   ND   ND
  Lactococcus lactis NCDO497(乳链菌肽A产生菌)   30   13   ND
  Lactococcus lactis NCIMB702054(乳链菌肽Z产生菌)   30   13   ND
Lactobacillus sakei strain JCM1157被用作指示菌株。表中的数值表示生长抑制区的直径。
ND＝未检出
实施例3
培养Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、Lactococcus lactis NCDO497(乳链菌肽A产生菌)和Lactobacillus sakei JCM 1157菌株。在10,000rpm下离心培养液10分钟，来获得培养物上清液。向上清液添加2000U/mlUmamizyme、用酶处理24小时后，用过滤器(DISMIC25CS，ADVANTEC；0.45μm)过滤上清液，配制无菌样品。使用菌苔上点样法(spot-on-lawn)考查抗菌谱。结果，与乳酸菌肽产生菌的培养液和不产生细菌素的Lactobacillus sakei JCM1157的培养液相比，Weissella sp.AJ110263(FERM P 19577)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885即使在经过蛋白酶处理后仍然保持抗菌活性(表12)。这表明Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus JCM5885)产生耐蛋白酶细菌素。
表12
  Micrococcus luteusIFO12708   100   100   ND   ND
  枯草杆菌JCM1465T   100   100   ND   50
  Lactococcus   lactissubsp         lactisATCC19435   50   50   ND   ND
  Enterococcus faeciumJCM5804T   50   100   ND   ND
  Enterococcus faecalisJCM5803T   100   100   ND   50
  植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ATCC14917T   100   100   ND   50
  Lactobacillus  sakeiJCM1157T   50   50   ND   ND
培养液用蛋白酶处理后，用菌苔上点样法评价上清液。数值表示抗菌活性。抗菌活性(AU/ml)＝(形成抑菌圈的最大稀释比)×1000/10，ND＝未检出
实施例4
按照实施例3所述的方法，用酶处理Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JCM1149、Lactobacillus salivarius JCM1231、Leuconostoc citreum JCM9698、Leuconostocpseudomesenteroides JCM9696、JCM11045和Lactococcus lactis NCIMB702054(乳链菌肽Z产生菌)菌株的培养物上清液。枯草杆菌(Bacillus subtilis)IAM1381被用作指示菌株。使用与实施例3同样的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的Umamizyme G作为酶。另外，将来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的α-淀粉酶(Wako Pure化学药品有限公司)以100U/ml的量添加至乳酸菌培养液中，在30℃使其反应一小时以上。然后，按同样的方法以枯草杆菌(Bacillus subtilis)IAM1381作为指示菌株，采用菌苔上点样法评价抗菌活性，研究α-淀粉酶对抗菌活性的影响。如表13所示，Weisella sp.AJ110263(FERM P-19577)、Weissella cibariaJCM12495、Weissella confusa JCM1093、Weissella hellenica JCM10103、Weissella kandleriJCM5817、Weissella minor JCM1168、Weissella paramesenteroides JCM9890、Weissellathailandensis JCM10694、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149、Lactobacillus salivarius JCM1231、Lactobacillus pentosusJCM1558、Leuconostoc citreum JCM9698、Leuconostoc pseudomesenteroides JCM9696、JCM 11045、Leuconostoc argentinum JCM11052、Leuconostoc carnosum JCM9695、和Leuconostoc mesenteroides JCM6124即使经过蛋白酶处理后仍然保持抗菌的活性。因此，发现这些菌株产生耐蛋白酶的细菌素。
                            表13.酶处理后的残存抗菌活性
  残留抗菌活性
  空白   umanizyme  α-淀粉酶
  乳链菌肽产生菌
  Lactococcuslactis NCIMB702054   100   nd   100
  耐蛋白酶细菌素(PRB)产生菌
  Weissella sp.AJ110263   100   100   30
  Weissella cibaria JCM12495   100   100   30
  Weissella confusa JCM1093   100   70   50
  Weissella hellenica JCM10103   100   100   40
  Weissella kandleri JCM5817   100   100   40
  Weissella minor JCM1168   100   100   40
  Weissella paramesenteroides JCM9890   100   100   70
  Weissella thailandensis JCM10694   100   100   40
  戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885   100   90   30
  植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JCM1149   100   80   30
  Lactobacillus salivarius JCM1231   100   80   30
  Lactobacillus pentosus JCM1558   100   100   30
  Leuconostoc citreum JCM9698   100   80   40
  Leuconostoc pseudomesenteroides JCM9696   100   100   50
  Leuconostoc pseudomesenteroidesJCM11045   100   100   50
  Leuconostoc argentinum JCM11052   100   100   Nd
  Leuconostoc camosum JCM9695   100   100   30
  Leuconostoc mesenteroides JCM6124   100   100   40
实施例5
分别将大豆(10g)和纯水(10毫升)放进六个锥形瓶(体积200ml)，在高压锅内120℃下灭菌30分钟。冷却后，添加0.04g曲霉(koji mold)(酱油用紫色1 NO.1菌)，30℃下静置培养2天。将40毫升无菌纯水添加到培养样品(样品No.1)中，40毫升盐水添加至SampleNo.2中调整样品含盐量至18％，40毫升Lactococcus lactis NCIMB702054(乳链菌肽Z产生菌)培养物上清液添加至样品No.3，以及40毫升Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)的培养物上清液添加至样品No.4，40毫升Pediococcus pentosaseceus JCM5885的培养物上清液添加至样品5，40毫升Lactobacillus salivarius JCM1231的培养物上清液添加至样品6。用过滤器过滤过的6N盐酸和6N NaOH调节产物混合物至pH6.5-7.0。
200μl在TSBYE培养基内30℃下用振荡器振荡培养20小时的枯草杆菌IAM1381另外地接种、充分混合、30℃下培养。在培养的第1、2、7天，收集培养液在GAM琼脂培养基(GAM肉汤“NISSUI”，Nissui药物有限公司)上计算枯草杆菌IAM1381的活细胞数。在纯水样品中存在的污染菌枯草杆菌IAM1381为每克108细胞以上。在18％的含盐样品中没有发生污染。同时，在加入不含盐的乳链菌肽上清液的情况下，在第1天及以后乳链菌肽被来源于曲霉的蛋白酶分解。因此，产生每克108细胞以上的污染，没有观察到抗菌效果。
然而，在使用Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)、Pediococcus pentosaseceusJCM5885和Lactobacillus salivarius JCM1231的上清液的情况下，从发酵的第1天到第7天都没有观察到污染菌枯草杆菌IAM1381(表14)。
                               表14.在酱油的生产工艺中使用细菌素代替盐的测试
  在发酵的第1天   第7天
  No.   盐   乳酸菌液体   细菌素   谷氨酸(mg/dl)   活细胞数BS  谷氨酸(mg/dl)   活细胞数BS
  1   未添加   没有   未添加   400   3×10^8   980   3×10^7
  2   18％   没有   未添加   90   ND   490   ND
  3   未添加   Lactococcus lactis NCIMB702054   乳链菌肽*2   430   3×10^7   920   3×10^7
  4   未添加   Weissella sp.AJ110263   PRB   580   ND   1,140   ND
  5   未添加   戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885   PRB   450   ND   1,064   ND
  6   未添加   Lactobacillus salivarius JCM1231   PRB   460   ND   1,176   ND
PRB：耐蛋白细菌素
实施例6
将在MRS培养基上培养Lactococcus lactis NCIMB702054(乳链菌肽Z产生菌株)和Weissella sp.AJ11026(FERM P-19577)获得的培养液用氢氧化钠调节至pH5.5。接着，通过离心从调整过pH的培养物液体中除去菌以制备上清液。上清液和包含乳酸菌的培养液被用于下述实验。
分别将5g日本牛肉青丝的肉馅放进六个无菌Falcon管(Becton Dickinson公司，体积50ml)、向肉中添加5毫升盐水(样品No.1)，向样品No.2中添加5毫升18％盐水，向样品No.3中添加5毫升Lactococcus lactis NCIMB702054的上清液，向样品No.4中添加5毫升Lactococcus lactis NCIMB702054培养液，向样品No.5中添加5毫升Weissella sp.AJ11026的上清夜，向样品No.6中添加5毫升Weissella sp.AJ11026的培养液。进而，将在TSBYE培养基内37℃静置培养24小时的Listeria irmocua ATCC33090添加至样品中，添加量为108cfu/ml，让样品在室温下熟化。收集熟化一天和七天的样品，在李斯特菌属(Listeria)选择培养基(Oxoid公司)上计算Listeria innocua ATCC33090的活细胞数。如表15所示，在盐水样品中，存在污染菌Listeia innocua ATCC33090数目为106cfu/ml以上，在18％盐水样品中，存在污染菌Listeia innocua ATCC33090数目为105cfu/ml以上。在加入培养物肉汤或产生乳链菌肽的乳酸菌的上清液的情况下，由于乳链菌肽被来源于肉类(组织蛋白酶)的蛋白酶分解，所以存在污染菌Listeia innocua ATCC33090的数目为106cfu/ml以上。然而，在使用培养肉汤或Weissella sp.AJ11026(FERM P-19577)的上清液的情况下，在熟化的第一天直到第七天污染菌Listeia innocua ATCC33090能够被减少到103cfu/ml。
表15
No. 盐 乳酸菌   (细菌素) 熟化天数0 熟化天数1 熟化天数7
  FAA   cfu/ml   FFA   cfu/ml   FFA   cfu/ml
  (μmol/g)   (μmol/g)   (μmol/g)
1   未添加 未添加 72 2*10^6 70 5*10^7 100 2*10^6
  2   18％   未添加   66   4*10^6   73   6*10^5   70   2*10^5
3   未添加   LactococcusLactis#120 上清液   乳链菌肽Z 72 4*10^6 75 2*10^7 88 4*10^6
4   未添加   LactococcusLactis#120 肉汤   乳链菌肽Z 83 4*10^6 81 1*10^6 84 4*10^6
5   未添加 Weissella spAJ10155 上清液 PRB 82 4*10^6 93 4*10^3 111 1*10^3
6   未添加 Weissella spAJ10156 肉汤 PRB 84 4*10^687   nd 104 2*10^2
PRB：耐蛋白细菌素
FFA：游离氨基酸
另外，考查了抗菌谱，结果表明，除Enterococcus faecium之外，细菌素对引起食物中毒的李斯特菌属和生产酱油和味噌糊过程中有害的枯草杆菌具有生长抑制作用。
也考查对pH和温度的稳定性，新的细菌素甚至在pH2至4的条件下也能保持大约50％的活性在pH2至pH11的很宽的范围内，抗菌活性稳定。尤其，在pH4至pH6左右细菌素具有很强的抗菌活性。另外，甚至在100℃加热10分钟后，细菌素仍然保持大约50％的活性。因此，细菌素具有很好的热稳定性。
工业实用性
通过在发酵食品的生产过程中添加由例如Weissella sp.、戊糖片球菌、植物乳杆菌和Lactobacillus salivarius等产生的含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物，可以提供良好的保存食品的方法。

Claims (9)

1.一种含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物的生产方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，乳酸菌属于Weissella属、小球菌属、乳杆菌属或白联珠菌属中的任何一个属。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，属于Weissella属的乳酸菌是Weissella sp.FERMP-19577、Weissella cibaria JCM12495，Wissella confusa JCM1093、Weissella hellenica JCM10103、Weissella kandleri JCM5817、Weissella minor JCM1168、Weissella paramesenteroides JCM9890或Weissella thailandensis JCM10694中的任何一个。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，属于小球菌属的乳酸菌是戊糖片球菌。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，属于乳杆菌属的乳酸菌是植物乳杆菌、Lactobacillus salivarius或Lactobacillus pentosus中的任何一个。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，属于白联珠菌属的乳酸菌是Leuconostoc citreum、Leuconostoc pseudomesenteroides、Leuconostoc argentinum、Leuconostoccarnosum或Leuconostoc mesenteroides中的任何一个。
7.一种保存食品的方法，其特征在于，在食品的生产过程中使用如权利要求1至6中任何一项所述的乳酸菌培养物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述食品为发酵食品或加工过的肉制品。
9.一种产生细菌素的乳酸菌的筛选方法，它包括筛选即使在蛋白酶存在的情况下也具有抗菌活性的乳酸菌培养物的步骤。
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