CN116711852A - 一种富含益生菌酱油的制备方法及益生菌酱油 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富含益生菌酱油的制备方法及益生菌酱油，通过制备益曲剂，在酱油制曲阶段加入益生菌，同时制备益酵液，实现在酱油的制曲和发酵阶段加入益生菌，明显提高酱油的风味水平，削弱杂菌对酱油风味的影响，添加益生菌可以在发酵过程中和保质期内抑制腐败微生物的生长，保证酱油的安全。本发明首次提出向灭菌后的酱油中直接添加植物乳杆菌，抑制有害杂菌的生长，显著的提高酱油的保藏时间。

Description

一种富含益生菌酱油的制备方法及益生菌酱油
技术领域
本发明属于酱油酿造领域，具体涉及到一种富含益生菌酱油的制备方法及益生菌酱油。
背景技术
酱油是广受人们喜爱的中国传统发酵调味品，已有3000多年历史，具有独特的风味及纯郁的鲜味，亦能为各种菜肴提供诱人的色泽。随着人们对食品安全问题的愈加关注和对食品营养价值的要求越来越高，酱油作为日常生活中不可或缺的要素，对其品质的要求也在不断的提升。传统的酱油酿造过程主要以米曲霉、鲁氏接合酵母、球拟酵母等真菌为主，酿造过程中少涉及到益生菌的参与。
益生菌对人体具有多方面的保健作用，比如调节肠道菌群、改善便秘、缓解乳糖不耐症、降低高脂血症发生机率、提高人体免疫力、预防过敏、幽门螺杆菌感染等疾病。同时，益生菌已经在多种食品中得到应用，其中，益生菌酸奶获得了消费者广泛的青睐。
但是，目前，对于酿造酱油中如何添加益生菌，实现其提升品质的最佳效果尚未见报道。同时，现有酱油体系中往往添加食品防腐剂，安全性较差。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种富含益生菌酱油的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种富含益生菌酱油的制备方法，包括，
制备益曲剂：将植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081活化后，接种于培养基中，静置培养后，加入低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖和大豆低聚糖，混合，制得益曲剂；
制备益酵液：将植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081培养活化后，接种于培养基中，静置培养后，加入到同等质量6～10％盐含量的盐溶液中，制得益酵液；
原料预处理：将原料倒入清水，加入低聚果糖，搅拌，灭菌制得预处理的原料；
制备酱油大曲：将预处理的原料冷却，接种米曲霉，同时接种益曲剂，搅拌均匀后进行堆积培养，大曲表面布满黄绿色孢子时，大曲成熟；
富含益生菌酱油：向大曲中加入食盐水发酵3个月，第一个月发酵温度为45℃，同时在发酵的第一个月加入益酵液，在第二个月和第三个月的发酵温度为30℃，发酵结束后过滤得到富含益生菌零添加酱油生样品；
所得富含益生菌零添加酱油生样品灭菌后，添加植物乳杆菌和戊糖乳杆菌，即得到富含益生菌零添加酱油。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述制备益曲剂，其中，低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖和大豆低聚糖含量分别占静置培养后物质的质量百分数的2～4％。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述制备益曲剂，其中，静置培养时间为20～24h。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述原料预处理，其中，麸皮包括大豆麸和炒小麦麸按照质量比6:4混合的混合料。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述原料预处理，其中，低聚果糖含量占麸皮和清水总质量的百分比为0.2～04％。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述制备酱油大曲，其中，米曲霉按0.3～0.5％的质量分数接种，益曲剂的接种量为1～2％。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述益酵液含量为大曲总体积的1～2％。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述添加植物乳杆菌和戊糖乳杆菌，即得到富含益生菌零添加酱油，其中，植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的接种量为106CFU/mL。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种富含益生菌酱油的制备方法制得的产品。
本发明有益效果：
(1)本发明提供一种富含益生菌酱油的制备方法，通过制备益曲剂，在酱油制曲阶段加入益生菌，同时制备益酵液，实现在酱油的制曲和发酵阶段加入益生菌，明显提高酱油的风味水平，削弱杂菌对酱油风味的影响，添加益生菌可以在发酵过程中和保质期内抑制腐败微生物的生长，保证酱油的安全。
(2)本发明首次提出向灭菌后的酱油中直接添加植物乳杆菌，抑制有害杂菌的生长，显著的提高酱油的保藏时间；植物乳杆菌因能通过营养竞争、产生安全高效的抑菌物质来抑制腐败菌和致病菌的生长，是一种具有开发潜力的天然生物防腐剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例中牛津杯抑菌实验结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
酱油中细菌总数测定参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》；
本发明中风味物质分析方法：取5mL稀释10倍的样品于15mL顶空瓶中，加入1.0gNaCl及混标溶液(30μL 0.125mg/L 2-辛醇和50μL 0.125mg/L十九烷酸甲酯)，于55℃、600r/min条件下平衡10min，然后插入经老化的75μm CAR/PDMS萃取头顶空吸附40min，吸附结束后拔出萃取头，并插入GC进样口，于250℃下解析5min后进行GC-MS分析。
本发明中感官评定分析：选10名经过培训的专业人员(男:女＝1:1)分别对不同酱油成品的色、香、味进行评价并打分，满分为10分。具体感官评分表如下：
另外：色泽评分为红色评分*40％+黄色评分*40％+黑色评分*20得到；滋味评分为鲜味评分*50％+甜味评分*50％得到。
本发明中所用原料：
植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081：上海北诺生物科技有限公司；米曲霉3.042：沂水锦润生物科技有限公司，低聚果糖：安琪酵母；其他原料无特殊说明，均为普通市售。
本发明中MRS培养基配方：10g蛋白陈、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉、1000ml蒸馏水，分装后121℃高压灭菌15分钟到20分钟。
实施例1
(1)益曲剂的配置：将植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081在MRS培养基培养到108CFU/mL后，以2％的接种量接种于新的MRS培养基中，静置培养24h后向培养基中按2％的总质量分数依次加入低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖和大豆低聚糖(质量比为1:1:1:1)。
(2)益酵液的配置：将植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081在MRS培养基培养到108CFU/mL后，以2％的接种量接种于新的MRS培养基中，静置培养24h后，加入到9％的盐(氯化钠)溶液中。
(3)原料预处理：用天平称量600g的大豆，400g炒小麦，倒入清水1200g的清水，按0.4％的质量分数加入低聚果糖，清水温度在87℃，用玻璃棒搅拌，装入适当容器中，121℃灭菌20分钟。
(4)酱油大曲制备：将灭菌后的原料冷却至40℃，将提前活化好的米曲霉按照0.5％的质量分数接种于大曲培养基中，同时再接种2％益曲剂，搅拌均匀后进行堆积培养，培养箱温度控制在30℃；
15h后，进行翻曲，将堆积的曲料打散，相当于二次接菌，30℃平铺培养；
培养22h后，再一次将曲料打散，继续平铺培养；
40h，大曲表面布满黄绿色孢子时，大曲成熟。
(5)富含益生菌零添加酱油的发酵：向酱油大曲中加入同等质量的10％盐含量的食盐水发酵3个月，第一个月发酵温度为45℃，同时在发酵的第一个月加入大曲总体积2％的益酵液，在第二个月和第三个月的发酵温度为30℃，发酵结束后过滤得到富含益生菌零添加酱油生样品。
(6)杀菌处理：对所得富含益生菌零添加酱油生样品在121℃条件下灭菌20min，后向酱油中添加106CFU/mL的植物乳杆菌后即得到富含益生菌零添加酱油。
实施例2
灭菌后未加入益生菌：
(1)益曲剂的配置：将将植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081在MRS培养基培养至108CFU/mL，以2％的接种量接种于新的MRS培养基中，静置培养24h后向培养基中按2％的质量分数加入低聚果糖。
(2)益酵液的配置：将植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081在MRS培养基培养到108CFU/mL后，以2％的接种量接种于新的MRS培养基中，静置培养24h后，加入到9％的盐(氯化钠)溶液中。
(3)原料预处理：用天平称量600的大豆，400g的炒小麦，倒入清水1200g左右的清水，按0.4％的质量分数加入低聚果糖，清水温度在87℃左右，用玻璃棒搅拌，装入适当容器中，121℃灭菌20分钟。
(4)酱油大曲制备：将灭菌后的原料冷却至40℃，将米曲霉按0.5％的质量分数接种于大曲培养基中同时再接种2％益曲剂，搅拌均匀后进行堆积培养，培养箱温度控制在30℃左右。
15h后，进行翻曲，将堆积的曲料打散，相当于二次接菌，30℃平铺培养。
培养22h后，再一次将曲料打散，继续平铺培养。40h，大曲表面布满黄绿色孢子时，大曲成熟。
(5)富含益生菌零添加酱油的发酵：向酱油大曲中加入同等质量10％盐含量的食盐水发酵3个月，第一个月发酵温度为45℃，同时在发酵的第一个月加入大曲总体积2％的益酵液，在第二个月和第三个月的发酵温度为30℃，发酵结束后过滤得到富含益生菌零添加酱油生样品。
(6)杀菌处理：对所得富含益生菌零添加酱油生样品在121℃条件下灭菌20min，即得到酱油。
实施例3
未加入益曲剂和益酵液：
(1)原料预处理：用天平称量600g左右的大豆和400g左右的炒小麦，倒入1200g左右的清水，按0.4％的质量分数加入低聚果糖，清水温度在87℃左右，用玻璃棒搅拌，装入适当容器中，121℃灭菌20分钟。
(2)酱油大曲制备：将灭菌后的原料冷却至40℃左右，将提前活化好的米曲霉的种曲按0.5％的质量分数接种于大曲培养基中，搅拌均匀后进行堆积培养，培养箱温度控制在30℃右。15h后，进行翻曲，将堆积的曲料打散，相当于二次接菌，30℃平铺培养。培养22h后，再一次将曲料打散，继续平铺培养。40h，大曲表面布满黄绿色孢子时，大曲成熟。
(3)富含益生菌零添加酱油的发酵：向酱油大曲中加入10％的食盐水发酵3个月，第一个月发酵温度为45℃，在第二个月和第三个月的发酵温度为30℃，发酵结束后过滤得到富含益生菌零添加酱油生样品。
(4)杀菌处理：对所得富含益生菌零添加酱油生样品在121℃条件下灭菌20min，向酱油中分别添加106CFU/mL的植物乳杆菌和戊糖乳杆菌后即得到富含益生菌零添加酱油。
实施例4
传统酿造，包括：
(1)原料预处理：用天平称量600g左右的大豆和400g左右的炒小麦，倒入1200g左右的清水，按0.4％的质量分数加入低聚果糖，清水温度在87℃左右，用玻璃棒搅拌，装入适当容器中，121℃灭菌20分钟。
(2)酱油大曲制备：将灭菌后的原料冷却至40℃左右，将米曲霉按0.5％的质量分数接种于大曲培养基中，搅拌均匀后进行堆积培养，培养箱温度控制在30℃左右。
15h后，进行翻曲，将堆积的曲料打散，相当于二次接菌，30℃平铺培养。
培养22h后，再一次将曲料打散，继续平铺培养。40h，大曲表面布满黄绿色孢子时，大曲成熟。
(3)富含益生菌零添加酱油的发酵：向酱油大曲中加入10％的食盐水发酵3个月，第一个月发酵温度为45℃，在第二个月和第三个月的发酵温度为30℃，发酵结束后过滤得到酱油生样品。
(4)杀菌处理：对所得酱油生样品在121℃条件下灭菌20min，后即得到酱油。
表1不同杀菌处理酱油样品的感官评分表
表2不同酱油挥发性风味物质种类及其相对含量
如表1所示在酱油发酵阶段加入了益曲剂和益酵液的实施例1和实施例2从整体上感官评分都高于未添加益曲剂和益酵液的实施例3和4。
在酱油发酵过程中加入益曲剂和益酵液能得到更好的风味丰度。经过益曲剂和益酵液的发酵酯类的增幅最明显，对酱油酯类香气的增加最明显。其中，益曲剂中含有低聚果糖促进益生菌的生长，抑制了制曲腐败微生物，有利于酱油红棕色的形成。
由表2可知，四种样品共检测出的挥发性物质以酯和醇类物质在各样品中最为丰富。比较不同物质在各样品中的相对含量，实施例1的风味物质主要由酯和醇构成，其中酯的相对含量高达80.35％，酯类物质易挥发，易被人类嗅觉所感知，对酱油风味整体影响较大。
与实施例4所述酱油相比，添加益曲剂和益酵液的酱油中酯类和醇类明显增多，酯类和醇类也是酱油香味的主要提供者。未经过益生菌发酵的酱油中醛类占比高，在酱油的酿造过程中添加植物乳杆菌可以降解酱油生产过程中的醛类物质，将醛类物质转化为醇类或者酸来增加酱油的风味，减少醇类的影响。
表3不同酱油中的风味活性物质对比
如表3所示酯类物质和醇类物质是酱油的主要香味来源，从整体上看经过益曲剂和益酵液发酵的实施例1中的酯类和醇类含量更高。在醇类风味物质中添加了益酵液和益曲剂主要促进了异丁醇、异丙醇、2-甲基-1-丁醇的积累。愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈疮木酚的增加有助于酱油特征酱香的形成。乳酸乙酯含量的增加与植物乳杆菌的发酵产乳酸相关，其代谢生成的乳酸可与乙醇酯化促进乳酸乙酯的形成。
同时，实例1酱油中乙醇含量明显高于及实例4，乙醇含量的提升促进乙醇与有机酸的酯化反应，使得酱油中的乙酯类物质含量增加。同时实施例1与4相比，乳酸含量也大幅度增加，乳酸是酱油中重要的有机酸，具有柔和适口的酸感，是酱油酸味的重要来源，同时还是乳酸酯类物质的前体物，能促进酱油香气的形成。
对比例1
相比实施例1，不制备益曲剂：
(1)益酵液的配置：将植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081在MRS培养基中培养至108CFU/mL，以2％的接种量接种于新的MRS培养基中，静置培养24h后，加入到10％的盐溶液中。
(2)原料预处理：用天平称量600g的大豆和400g炒小麦，倒入1200g的清水，按0.4％的质量分数加入低聚果糖，清水温度在87℃，用玻璃棒搅拌，装入适当容器中，121℃灭菌20分钟。
(3)酱油大曲制备：将灭菌后的原料冷却至40℃，将米曲霉按0.5％的质量分数接种于大曲培养基中，搅拌均匀后进行堆积培养，培养箱温度控制在30℃；
15h后，进行翻曲，将堆积的曲料打散，相当于二次接菌，30℃平铺培养；
培养22h后，再一次将曲料打散，继续平铺培养；
40h，大曲表面布满黄绿色孢子时，大曲成熟。
(4)富含益生菌零添加酱油的发酵：向酱油大曲中加入同等质量10％盐含量的食盐水发酵3个月，第一个月发酵温度为45℃，同时在发酵的第一个月加入大曲总体积2％的益酵液，在第二个月和第三个月的发酵温度为30℃，发酵结束后过滤得到富含益生菌零添加酱油生样品。
(5)杀菌处理：对所得富含益生菌零添加酱油生样品在121℃条件下灭菌20min，后向酱油中添加106CFU/mL的植物乳杆菌后即得到富含益生菌零添加酱油。
对比例2
相比实施例1，不制备益酵液：
(1)益曲剂的配置：将植物乳杆菌ATCC 14917、戊糖片球菌ATCC 8081在MRS培养基培养至108CFU/mL，以2％的接种量接种于新的MRS培养基中，静置培养24h后向培养基中加入按2％的质量分数的依次加入低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖和大豆低聚糖。
(2)原料预处理：用天平称量600g的大豆和400g炒小麦，倒入1200g的清水，按0.4％的质量分数加入低聚果糖，清水温度在87℃，用玻璃棒搅拌，装入适当容器中，121℃灭菌20分钟。
(3)酱油大曲制备：将灭菌后的原料冷却至40℃，将米曲霉按0.5％的质量分数接种于大曲培养基中，同时再接种2％益曲剂，搅拌均匀后进行堆积培养，培养箱温度控制在30℃；
15h后，进行翻曲，将堆积的曲料打散，相当于二次接菌，30℃平铺培养；
培养22h后，再一次将曲料打散，继续平铺培养；
40h，大曲表面布满黄绿色孢子时，大曲成熟。
(4)富含益生菌零添加酱油的发酵：向酱油大曲中加入10％的食盐水发酵3个月，第一个月发酵温度为45℃，在第二个月和第三个月的发酵温度为30℃，发酵结束后过滤得到富含益生菌零添加酱油生样品。
(5)杀菌处理：对所得富含益生菌零添加酱油生样品在121℃条件下灭菌20min，后向酱油中添加106CFU/mL的植物乳杆菌后即得到富含益生菌零添加酱。
提供风味物质有益效果的对比试验结果。
表4风味物质对比
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对比例3
(1)实施例4制得的酱油，装瓶，开盖敞口放置1个月，设置为A组。
(2)实施例1制得的酱油，装瓶，开盖敞口放置1个月，设置为B组。
(3)对A组和B组进行感官品评，结果如下表所示：
表5感官对比
组别 气味 浑浊度 漂浮物
A组 明显的腐败气味 较浑浊、悬浮物增多 有白毛出现
B组 醇香、酱香浓厚 澄清、透亮 正常
(4)分离A组腐败微生物，分离出一株人型葡萄球菌，进行牛津杯抑菌实验，结果如图1所示。
抑菌实验：
采用牛津杯抑菌实验对其抑菌能力进行测定。将10mL 2％的无菌水琼脂作为底层培养基，并用镊子将无菌牛津杯水平放置在上面。用40～50℃的半固体LB培养基将人型葡萄球菌稀释至106～107CFU/mL。
上层培养基为已放置在牛津杯的下层培养基的上面，为倒入的大约10mL含有人型葡萄球菌的半固体LB培养基。
待培养基凝固后向牛津杯中加入100μL的不同外源添加物，并在室温(4℃)下扩散3～5h。
最后，将它们在37℃下培养24h。对照组中未加入外源添加物。通过抑菌圈的大小判断抑菌能力，并利用游标卡尺确定抑制圈的直径(包含牛津杯的直径，牛津杯直径为8mm)，并将结果重复测定三次。
其中，外源添加物为植物乳杆菌(和戊糖片球菌)无细胞上清液：
将植物乳杆菌(和戊糖片球菌)在37℃下的MRS培养基中培养12h，然后在4℃下以8000×g离心10min以获得无细胞上清液；
通过离心收集无细胞上清液；
用牛津杯抑菌实验测定无细胞上清液和菌体对污染菌的抗菌活性。
如图1看出植物乳杆菌和戊糖片球菌对人型葡萄球菌均有抑制作用，这表明植物乳杆菌和戊糖片球菌确实能有效抑制酱油污染菌的生长。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。

Claims (9)

1.一种富含益生菌酱油的制备方法，其特征在于：包括，
制备益曲剂：将植物乳杆菌ATCC14917、戊糖片球菌ATCC8081活化后，接种于培养基中，静置培养后，加入低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖和大豆低聚糖，混合，制得益曲剂；
制备益酵液：将植物乳杆菌ATCC14917、戊糖片球菌ATCC8081培养活化后，接种于培养基中，静置培养后，加入到同等质量的6～10％盐含量的盐溶液中，制得益酵液；
原料预处理：将大豆、炒小麦倒入清水，搅拌，灭菌制得预处理的原料；
制备酱油大曲：将预处理的原料冷却，接种米曲霉，同时接种益曲剂，搅拌均匀后进行堆积培养，大曲表面布满黄绿色孢子时，大曲成熟；
富含益生菌酱油：向大曲中加入食盐水发酵3个月，第一个月发酵温度为45℃，同时在发酵的第一个月加入益酵液，在第二个月和第三个月的发酵温度为30℃，发酵结束后过滤得到富含益生菌零添加酱油生样品；
所得富含益生菌零添加酱油生样品灭菌后，添加植物乳杆菌和戊糖乳杆菌，即得到富含益生菌零添加酱油。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述制备益曲剂，其中，低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖和大豆低聚糖含量分别占静置培养后物质的质量百分数的2～4％。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述制备益曲剂，其中，静置培养时间为20～24h。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述原料预处理，其中，大豆和炒小麦按照质量比6:4混合的混合料。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述原料预处理，其中，低聚果糖含量占原料和清水总质量的百分比为0.2～0.4％。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述制备酱油大曲，其中，米曲霉按0.3～0.5％的质量分数接种，益曲剂的接种量为1～2％。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述益酵液含量为大曲总体积的1～2％。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述添加植物乳杆菌和戊糖片球菌，即得到富含益生菌零添加酱油，其中，植物乳杆菌和戊糖片球菌的接种量为106CFU/mL。
9.如权利要求1～8中任一所述的制备方法制得的富含益生菌酱油。
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