CN101081295A - 抗生素、含有抗生素的组合物和将抗生素和/或所述组合物给药牲畜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗生素及其组合物，所述抗生素包含源自乳酸菌的抗蛋白酶的细菌素。也公开了用于牲畜的包含抗生素的饲料组合物，所述抗生素包含源自乳酸菌的抗蛋白酶的细菌素。公开了防止导致人类食物中毒的细菌在牲畜的胃和/或肠中生长的方法，其包括将饲料组合物给药牲畜，所述饲料组合物包含源自乳酸菌的抗蛋白酶的细菌素。

Description

抗生素、含有抗生素的组合物和将抗生素和/或所述组合物给药牲畜的方法

技术领域

本发明涉及抗生素、含有抗生素的组合物和将抗生素和/或所述组合物给药牲畜的方法。

背景技术

近年来，由属于沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)等细菌属的细菌引起的人类食物中毒(human food poisoning)急剧地增长。由这些细菌的污染也已经蔓延到养鸡和养猪工业。作为对策，在日本，已经采用反向消毒剂(reverse disinfectant)等为鸡舍(chicken coop)消毒。在国外，已经采用疫苗。然而，这些方法中没有一种能够防止人类免于被这些仍存在于牲畜肠中的细菌经食物中毒的方式感染。

抗沙门氏菌的抗生素在商业上可以以糖、有机酸、抗生素和混合物配方(formulation)的形式利用。也已经研究了沙门氏菌的感染机理。沙门氏菌具有I型菌毛，已知其与牲畜的肠中的粘膜上皮的细胞表面上的甘露糖-类似物受体(mannose-analogous receptor)结合，导致粘附和感染。具体地，由于糖类如甘露糖是天然物质，它们是高度安全的，并预期其可作为抗生素直接作用于沙门氏菌是高度有效的(Characteristics and Usefulness of MannanOligosaccharides，“Friend of the Chicken Rancher”，June issue，p.14-18(1996)，JP10-215790A，WO99/08544，JP2001-238608A))。然而，牲畜中存在的肠细菌降解甘露糖，因此，致使甘露糖无效，除非大量给药。需要开发针对降解甘露糖的细菌应用的抗生素(On the inhibitory effect on Salmonella infectionof oligosaccharides in chickens，“Poultry Diseases”，Vol.31，p.113-117(1995))。

此外，也已经研究了尼生素(nisin)，一种由乳酸菌产生的抗生素物质，用于抗沙门氏菌和弯曲杆菌。尼生素具有抗革兰氏阳性细菌的抗生素广谱性，但具有低的抗革兰氏阴性细菌的抗生素性质(Can.J.Microbiol.，Vol.47，p.322-331(2001))。因此，有尼生素用作抗生素与螯合剂(chelating agent)(Journal ofFood Protection，Vol.58(9)，p.977-93(1995))、TSP(Journal of FoodProtection，Vol.61(7)，p.839-844(1998))、溶菌酶和有机酸(WO03/005963)结合的实例。然而，在携带沙门氏菌的牲畜的肠中，尼生素被消化酶降解，并因而不具有持久的抗生素活性。因此，在本领域中有开发不被降解的抗生素的需要。

发明概述

因此，本发明的目的包括提供用于牲畜的抗生素，其有效地防止造成人类食物中毒的细菌在牲畜的消化道中生长，进一步地，本发明还提供了通过将含有所述抗生素的饲料组合物给药牲畜来防止导致人类食物中毒的细菌在牲畜的胃和/或肠中生长。

已发现如上所述的抗生素是抗蛋白酶(protease-resistant)的细菌素，并可被给药于牲畜。此细菌素分离自通常存在于牲畜的胃液和肠液中的乳酸菌。这样，防止造成人类食物中毒的细菌在牲畜的消化道中生长是可能的。在此发现的基础上作出了本发明。

本发明的一个目的在于提供抗生素，其包含分离自乳酸菌的抗蛋白酶的细菌素。

本发明的又一个目的在于提供组合物，其包含如上所述的抗生素和合适的赋形剂(excipient)。

本发明的又一个目的在于提供如上所述的组合物，其中配制所述的组合物用于给药于牲畜。

本发明的又一个目的在于提供如上所述的组合物，所述乳酸菌属于选自乳杆菌属(Lactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和其组合中的一个或多个属。

本发明的又一个目的在于提供如上所述的组合物，其中所述的乳酸菌选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、魏斯氏菌FERM BP-10474、Weissella cibaria、融合魏斯氏菌(Weissella confusa)、赫伦魏斯氏菌(Weissellahellenica)、坎氏魏斯氏菌(Weissella kandleri)、稍小魏斯氏菌(Weissellaminor)、类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)、Weissellathailandensis、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreun)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、阿根廷明串珠菌(Leuconostoc argentinum)、肉色明串珠菌(Leuconostoccarnosum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和其组合中的一种或多种。

本发明的又一个目的在于提供饲料组合物，其包含如上所述的抗生素。

本发明的又一个目的在于提供防止造成人类食物中毒的细菌在牲畜的胃和/或肠中生长的方法，其包括将如上所述的饲料组合物给药所述的牲畜。

本发明的又一个目的在于提供如上所述的方法，其中所述的细菌是选自沙门氏菌属、弯曲杆菌属、利斯特氏菌属(Listeria)、埃希氏菌属(Escherichia)、Welsh和其组合中的一个或多个属。

本发明的又一个目的在于提供包含分离自乳酸菌的抗蛋白酶的细菌素的抗生素在制备组合物中的用途，所述组合物用于防止造成人类食物中毒的细菌在牲畜的胃和/或肠中生长。

本发明的又一个目的在于提供乳酸菌在制备组合物中的用途，所述组合物用于防止造成人类食物中毒的细菌在牲畜的胃和/或肠中生长。

本发明的又一个目的在于提供如上所述的用途，其中所述组合物可为药物组合物或饲料组合物。

本发明的又一个目的在于提供如上所述的用途，其中所述细菌属于选自下组的菌属：沙门氏菌属、弯曲杆菌属、利斯特氏菌属、埃希氏菌属、Welsh和其组合。

附图说明

图1显示饲料中使用的各种抗生素对于沙门氏菌的杀菌效果图。

发明详述

下面详细描述本发明。

本发明的抗生素含有分离自乳酸菌的抗蛋白酶的细菌素，并可配制为组合物用于给药牲畜，或配入所述牲畜的饲料。

本发明的“牲畜”包括猪，以及家禽(poultry)，如鸡(chicken)、鹌鹑(quail)、母珠鸡(quinea hen)、家养的鹅(domestic goose)、野鸭(mallard)、火鸡(turkey)、瘦肉鸡(black-meat chicken)等。

一般地，“细菌素”指抗生素蛋白物质(Klaenhemmer，T.R.，Biochemie60(3)：337-349(1988))。然而，本发明的“抗蛋白酶的细菌素”是指不被蛋白降解酶(蛋白酶)降解的细菌素，和常规细菌素如尼生素形成对照。本发明的细菌素不被蛋白酶如牲畜的胃和肠中存在的消化酶降解。这样的蛋白酶的实例是胃蛋白酶(pepsin)(EC3.4.23.1，EC3.4.23.2，EC3.4.23.3)和胰蛋白酶(EC3.4.21.4)。

除了抗蛋白酶如消化酶之外，用于本发明的抗蛋白酶的细菌素也抗源自用于酿造和发酵的曲霉属(Aspergillus)的蛋白酶，以及源自用于食品加工的肉类的蛋白酶，而不被它们降解。这些蛋白酶的实例有“Umamizyme G”(Amano Enzyme，Inc.)，用于酿造和发酵的曲霉属的蛋白酶，和组织蛋白酶(cathepsin)，来自用于食品加工的肉类的蛋白酶。

本发明的抗蛋白酶的细菌素由乳酸菌产生并且是高度安全的。此抗蛋白酶的细菌素对于导致人类食物中毒的细菌具有抑菌(bacteriostatic)和杀菌的(bactericidal)的作用，并且通常存在于牲畜的胃和肠中。因此，当把此抗蛋白酶的细菌素，或含有它的培养液或培养上清液以此抗蛋白酶的细菌素、或含有它的培养液或培养上清液的形式给药时，或将它们配制成饲料组合物给药时，该细菌素不被蛋白酶降解。因此，所述细菌素是有活性的并抑制导致人类食物中毒的细菌的生长，而且存在于胃或肠中。由此防止了肉加工中处理牲畜的过程中感染上述来自肠道的细菌。此外，此细菌素来源于乳酸菌，并且比常规化学合成的化合物更安全，即使是被牲畜大量食用。所以从牲畜健康方面而言，此细菌素也是需要的。

在本发明中，术语“导致人类食物中毒的细菌”是指经常存在于牲畜的胃和肠中，而且当人食用或处理肉和/或蛋时导致人类食物中毒的细菌。具体地，所述“导致人类食物中毒的细菌”包括沙门氏菌属、弯曲杆菌属、利斯特氏菌属、埃希氏菌属(例如大肠埃希氏菌)、Welsh、耶尔森氏菌属(Yersinia)(小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和梭菌属(Clostridium)的细菌。具体地，“导致人类食物中毒的细菌”是沙门氏菌属和弯曲杆菌属的细菌。

沙门氏菌属的细菌经常存在于牲畜的肠中，所述牲畜如猪和家禽(domestic fowl)如鸡。在牲畜的加工中，细菌粘附于肉和蛋。当食入已粘附此细菌的一片肉或一个鸡蛋而没有被充分加热时，其结果是人类食物中毒，这导致严重的胃肠炎、恶心、呕吐等。弯曲杆菌属的细菌经常存在于家禽如鸡的肠中，并能在肉加工过程中污染鸡肉，并导致人类食物中毒，引起腹泻、腹痛、发烧、恶心、呕吐等。

通过根据下述实施例培养乳酸菌可有效地制备本发明的抗蛋白酶的细菌素。

已从发酵食品等中分离了产生本发明的抗蛋白酶的细菌素的乳酸菌。可以采用具有能通过下述筛选方法检测的抗生素活性的任何乳酸菌，即使它分离自除发酵食品或类似物之外的物质。

用于本发明的乳酸菌优选属于乳杆菌属、魏斯氏菌属、片球菌属或明串珠菌属。具体地，属于乳杆菌属的乳酸菌的优选实例为：植物乳杆菌、唾液乳杆菌和戊糖乳杆菌。属于魏斯氏菌属的优选实例为：魏斯氏菌AJ110263(Weissella sp.AJ110263)(FERM BP-10474)、Weissella cibaria、融合魏斯氏菌、赫伦魏斯氏菌、坎氏魏斯氏菌、稍小魏斯氏菌、类肠膜魏斯氏菌和Weissella thailandensis。属于片球菌属的优选实例为：戊糖片球菌。属于明串珠菌属的优选实例为：柠檬明串珠菌、假肠膜明串珠菌、阿根廷明串珠菌、肉色明串珠菌、肠膜明串珠菌。

在上述乳酸菌中，特别优选用于本发明的如下：植物乳杆菌菌株JCM1149、唾液乳杆菌菌株JCM1231、戊糖乳杆菌菌株IAM1558、戊糖片球菌菌株JCM5885和JCM5890、魏斯氏菌AJ 110263(Weissella sp.AJ110263)(FERM BP-10474)、Weissella cibaria菌株JCM12495、融合魏斯氏菌菌株JCM1093、赫伦魏斯氏菌菌株JCM10103、坎氏魏斯氏菌菌株JCM5817、稍小魏斯氏菌菌株JCM 1168、类肠膜明串珠菌菌株JCM9890、Weissella thailandensis菌株JCM10694、柠檬明串珠菌菌株JCM9698、假肠膜明串珠菌菌株JCM11045、阿根廷明串珠菌菌株JCM11052、肉色明串珠菌菌株JCM9695和肠膜明串珠菌菌株JCM6124。“JCM”保藏号的细菌菌株贮存在Riken Bioresource Center的“日本微生物保藏中心(Japan Collectionof Microorganisms)”(一个独立的行政机构)，2-1 Hirozawa，Wako，SaitamaPrefecture，Japan。魏斯氏菌AJ 110263(Weissella sp.AJ110263)(FERM BP-10474)，以保藏号FERM BP-10474在2003年10月31日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)的特许生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)(一个独立的行政机构)，Central 6，1-1-1 Tsukuba East，Ibaraki Prefecture，Japan。

给出的乳酸菌是否产生本发明的抗蛋白酶的细菌素(protease resistantbacteriocin)(有时缩略为“PRB”)可以例如通过如下方法测定。即，在如下方法中，当PRB在乳酸菌的培养物中产生时，形成指示菌株(indicator strain)的生长抑制区。

(1)通过乳酸菌通常的培养方法(或通过分离本发明的乳酸菌的培养方法)制备乳酸菌培养液。用NaOH将所述乳酸菌的培养液调节到pH 5.5至6.0，通过在12,000rpm x 10min离心分离，并用一次性注射器过滤单元(Disposable Syringe Filter Unit)(ADVANTEC“Dismic-25cs”)通过0.45μm醋酸纤维素(cellulose acetate)过滤以得到样品。当抗生素活性低时，在室温减压(reduced pressure)条件下进行4倍浓缩。需要时，可进行10倍浓缩。

(2)将无害利斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC33090T、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JCM2504T、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JCM2257、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)IFO12708、枯草芽孢杆菌JCM1465T、芽孢杆菌IAM1381、乳酸乳球菌乳亚种(Lactobacillus lactis sub sp.Lactis)ATCC19435、屎肠球菌(Enterococcus faecium)JCM5804T、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)JCM5803T、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC14917T和Lactobacillus sakei JCM1157T用作指示菌株，通过在下面进一步描述的spot-on-lawn方法，或活细菌计数法测定抗生素活性，并选择显示最强抗生素活性的指示菌株。

(3)将源自曲霉属的蛋白酶(由Amano Enzyme，Inc.产生的“UmamizymeG”等)用作酶。

(4)将10至100单位/mL量的(3)中描述的酶加入(1)的样品，并通过将该混合物在30℃保持一或多小时进行反应。

(5)将(2)中显示最强抗生素活性的指示菌株涂平板，将已用(4)的酶处理的0.01mL的样品逐滴加入指示菌株将在其中增殖的培养基，如MRS，培养在指示菌株生长的最适温度(对于无害利斯特氏菌、凝结芽孢杆菌、屎肠球菌和戊糖片球菌为37℃，其它为30℃)进行20至24小时。随后，确认指示菌株的生长抑制区。

本发明的组合物，其特征在于含有抗蛋白酶的细菌素，可包括乳酸菌培养液，其本身产生抗蛋白酶的细菌素，和/或可包括该培养液的干燥的细菌产物，或可包括培养上清液。通过分离和纯化上述物质中的任一种获得的细菌素也可包含在本发明的组合物中。本发明的组合物中也可加入合适的赋形剂或类似物，如下面进一步描述。简言之，源自乳酸菌的显示PRB活性的试剂可作为本发明的组合物的成分。另外，由乳酸菌产生的抗蛋白酶细菌素的活性存在于细胞内，并可分泌至细胞外。

需要时可根据本领域中通常采用的方法分离并纯化由乳酸菌的培养液产生的抗蛋白酶的细菌素。具体地，可通过得到具有抗蛋白酶的细菌素活性的级分(fraction)，并进行硫酸铵沉淀、柱层析、乙醇沉淀等来产生所述的细菌素。可使用适于细菌菌株利用和抗蛋白酶的细菌素产生的培养基组分培养用于本发明的乳酸菌。使用适当浓缩过的培养液使进一步处理更加有效。

可通过通常的方法，如下面所示的那些，培养乳酸菌。

本发明采用的培养基中可存在碳源，其可包括乳清(whey)、淀粉糖溶液(starch sugar solution)，或食用葡萄糖(food-use glucose)。本发明采用的培养基中也可存在氮源，其可包括乳清蛋白浓缩物水解产物、玉米肽(cornpeptide)、大豆肽(soy peptide)、commercial flavozonesolution material、廉价的精馏酒精残渣(low-end distilled spirit lees)或食用酶提取物。此外，可将乳酸菌生长和酶生产所需的各种有机和无机产物，和含有这些产物的产品(item)，如磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐、其它盐、维生素和酵母提取物适当地加入培养基。可根据普通的乳酸菌培养中那些通常的方法设定培养温度和时间；例如，在静止培养中，培养的温度和时间可分别为30℃至37℃和12至36小时。

在本发明中，对于牲畜的胃和肠中导致人类食物中毒的细菌的抗生素效果可通过指示菌株和导致食物中毒的细菌在含有胰蛋白酶、胃蛋白酶等的人造胃液处理溶液中的生长抑制来确定，或可通过体内给真实动物口服以检测胃和肠中导致人类食物中毒的细菌是否减少来确定。

本发明的抗生素和组合物可以以各种形式使用。实例为粉末、颗粒和片剂。可根据需要适当加入赋形剂、填充剂等。当乳酸菌培养液用作本发明的组合物时，可相对于牲畜的胃和肠中导致人类食物中毒的细菌量、季节等确定该组合物中本发明的乳酸菌的比例。当抗蛋白酶的细菌素纯度高或比活(specific activity)高时，少量给药，而当将培养基本身给药或比活低时，高比例给药。

本发明的抗生素或组合物的给药时间没有具体限制，只要显示本发明的抗生素效果。给药可能在任何时间。然而，在装运牲畜或家禽用于肉加工之前喂食是理想的。将抗生素混合或配制入牲畜饲料可获得特别有效的给药。

本发明的抗生素和组合物的给药的剂量(dose)没有具体限制，只要显示本发明的抗生素效果。例如，可根据利用的乳酸菌和给药的动物合适地调节剂量以便显示本发明的效果。

本发明的饲料组合物含有上述本发明的抗生素或组合物。该抗生素或组合物在饲料组合物中的比例通常为0.1至10重量百分数，优选2至10重量百分数。所述饲料组合物没有具体限制；可以按原样使用商品，或除玉米(corn)、小麦(wheat)、大麦(barley)、大豆渣(soy lees)和其它植物物质之外，可将肉骨粉(meat bone meal)(MBM)、鸡粉(chicken meal)、鱼酱(fish paste)和其它动物物质根据需要适当地加入商品中。此外，可根据需要加入碳水化合物、脂肪、蛋白质、无机物(如钙、镁、钠和磷)、维生素(如维生素A、B1、B2和D)和各种其它营养物。

通过如下非限制性的实施例具体描述本发明。

<参考实施例1>

将根据从发酵的食物matsoon分离的实施例描述筛选产生抗蛋白酶的细菌素的乳酸菌的方法

为了分离乳酸菌，将0.5％的发酵的奶matsoon(一种发酵食品)样品加入允许乳酸菌生长的液体培养基，如MRS培养基(下面的表1)和M17培养基(下面的表2)中。将样品在30℃至37℃培养(预培养)。培养分别进行1天、5天或10天。培养一完成就将细菌在上述含有0.5％碳酸钙的琼脂(1.2％)培养基上培养，并收集长出的乳酸菌菌落。

表1

MRS培养基组成(Merck)
		蛋白胨	10.0g/L
Lab-Lemco氏粉末	8.0g/L
		酵母提取物	4.0g/L
葡萄糖	20.0g/L
		吐温80	1.0g/L
磷酸二氢钾	2.0g/L
		乙酸钠	5.0g/L
柠檬酸铵	2.0g/L
		7水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)	0.20g/L

表2

M17培养基组成(Merck)
		源自大豆粉(soymeal)的蛋白胨	5.0g/L
源自肉的蛋白胨	2.5g/L
		源自酪蛋白(casein)的蛋白胨	2.5g/L
酵母提取物	2.5g/L
		肉提取物	5.0g/L
D(+)乳糖	5.0g/L
		抗坏血酸	0.5g/L
β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphoric acid sodium)	19.0g/L
		硫酸镁	0.25g/L

将收集的乳酸菌同样在液体培养基中在如上列出的培养条件下培养(初始培养)。接着，将乳酸菌接种到MRS琼脂培养基平板上，在该平板上已经加入预过滤的“Umamizyme G”(Amano Enzyme，Inc.)，一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶，并在30℃培养24小时。然后用乳杆菌AOAC培养基涂铺这些平板(下面的表3)，与指示菌株混合，并在30℃培养24小时，这导致指示菌株的生长抑制区形成。

表3：乳杆菌AOAC培养基组成

乳杆菌AOAC培养基组成(Difco)
		胨化乳(peptonized milk)	15.0g/L
酵母提取物	5.0g/L
		葡萄糖(dextrose)	10.0g/L
番茄汁(tomato juice)	5.00g/L
		磷酸二氢钾(KH2PO4)	2.0g/L
聚山梨醇酯(polysorbate)80	1.0g/L

可采用其它方法加入蛋白酶，如1)将蛋白酶与指示菌株混合，2)将蛋白酶涂在琼脂培养基上，3)在培养乳酸菌菌落的过程中加入蛋白酶(在此过程中，蛋白酶可在培养的开始、培养过程中，或培养一结束加入)，和4)培养乳酸菌菌落之后，消除细菌团(bacterial mass)或杀死培养液中的细菌，将含有蛋白酶的适量样品加入含有指示菌株的平板，并确认抑制区(inhibitionzone)的形成。上述1)至4)的方法通过实施例的方式给出，而并不构成对本发明的限制。蛋白酶也不限于“Umamizyme G”。

然后，通过抗生素谱分析(antibiotic spectral analysis)评价抗蛋白酶的细菌素活性。通过spot-on-lawn方法检测抗生素谱，其中顺序地将显示抗生素活性的乳酸菌的培养液上清稀释并点样(spot)在抗生素活性平板上，下面进一步描述。

首先，制备抗生素活性样品。将通过上述方法收集的具有抗生素活性的菌株的培养液在10,000rpm离心分离10分钟，得到培养上清液。然后将培养上清液通过过滤器以得到无菌的样品。然后将样品以二倍连续法(intwofold steps)稀释以制备2¹¹稀释的溶液。当活性低时，根据需要，在室温在两步中进行减压浓缩以制备2^-3稀释的溶液。

然后，将混合的指示菌株在抗生素活性平板上培养。将下面表4中的指示菌株在TSBYE培养基(下面表5)、TSB培养基(下面表6)或MRS培养基上培养。将芽孢杆菌属和微球菌属摇动培养，而其它菌株以静止的方式培养。凝结芽孢杆菌、利斯特氏菌、片球菌和肠球菌在37℃培养，其它菌株在30℃培养。

表4

菌株	培养基/培养温度(℃)	培养方法
			凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JCM2257	TSBYE/37	摇动(shaking)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCM1465T	TSBYE/30	摇动
			枯草芽孢杆菌IAM1381	TSBYE/30	摇动
环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JCM2504T	TSBYE/30	摇动
			藤黄微球菌(Micrococcus luteus)IFO12708	TSBYE/30	摇动
无害利斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC33090T	TSBYE/37	静止
			戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885	MRS/37	静止
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)JCM5803T	MRS/37	静止
			屎肠球菌(Enterococcus faecium)JCM5804T	MRS/37	静止
乳酸乳球菌乳亚种(Lactobacillus lactis subsp.lactis)ATCC19435	MRS/30	静止
			植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC14917T	MRS/30	静止
Lactobacillus sakei subsp.sakei JCM1157T	MRS/30	静止
			肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostocmesenteroides subsp.mesenteroides)JCM6124T	MRS/30	静止
Lactobacillus kimchi JCM10707T	MRS/30	静止

表5：TSBYE培养基组成

TSBYE培养基组成
		TSB培养基	30.0g/L
酵母提取物(Difco)	6.0g/L

表6：TSB培养基组成

Bacto Tryptic Soy Broth(TSB)培养基组成
		酪蛋白的胰酶消化液(pancreatic digest)	17.0g/L
大豆粉的酶消化液(enzymatic digest)	3.0g/L
		葡萄糖	2.5g/L
氯化钠	5.0g/L
		磷酸二氢钾	2.5g/L

也制备抗生素活性平板。将10mL量的MRS琼脂培养基(1.2％琼脂)和5mL的乳杆菌AOAC琼脂培养基(1.2％琼脂)单独通过加热到121℃、15分钟并保持在55℃灭菌。将灭菌的MRS琼脂培养基分散在无菌的培养皿上并在洁净的操作台上放置1小时。然后，将50μL的指示菌株培养液与在55℃保持的乳杆菌AOAC琼脂培养基混合，并铺在MRS平板上。将平板盖上平板盖置于洁净的操作台15分钟以干燥其表面。

将上述制备的抗生素活性样品以10μL的增量逐滴加入，将盖子盖在平板上，并进行干燥大约1小时。将平板在不同指示菌株的培养温度培养20小时并检测生长抑制区的形成。抗生素活性(AU/mL)定义如下。抗生素活性(AU/mL)＝(生长抑制区形成的最大稀释率)x 1,000/10。

以此方式分析样品的抗生素谱(antibiotic spectrum)，并发现其抵抗蛋白酶且显示宽的抗生素谱。

检测了通过上述方法选择的乳酸菌菌株AJ110263的细菌学特性。这通过16S核糖体DNA(rDNA)碱基序列同源性分析(Altshul，S.F.，Madden，T.F.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.和Lipman，D.J.(1997)，GappedBLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res.25：3389-3402)显示了与融合魏斯氏菌菌株ATCC1088198.22％的同源性(表7)。ATCC的保藏物的模式培养(type culture)用于同源性评价。

表7

16SrDNA的同源性	融合魏斯氏菌(Weissella confusa)	98.22％
			绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens)	95.20％
	稍小魏斯氏菌(Weissella minor)	92.54％
			坎氏魏斯氏菌(Weissella kandleri)	92.01％
	耐盐魏斯氏菌(Weissella halotolerans)	87.39％
			类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)	86.25％
	马里乳杆菌(Lactobacillus mali)	78.17％
			小片球菌(Pediococcus parvulus)	77.58％

菌株AJ110263的基本性质与乳酸菌的那些性质相配。认为糖发酵(糖消耗，参见表9)与由融合魏斯氏菌的发酵相似。然而，由于发现L-阿拉伯糖发酵不同并且16SrDNA的同源性小于100％，发现此新菌株与已知菌株完全不同。此细菌命名为魏斯氏菌AJ110263。将此细菌保藏在独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)特许生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)(一个独立的行政机构)。保藏号为FERM BP-10474。

表8：乳酸菌菌株AJ110263的基本性质

细胞类型	短的芽孢杆菌(0.8至1.0x1.0至1.5μm)
		革兰氏染色	(+)
芽孢(spore)	(-)
		运动性(mobility)	(-)
菌落形状(培养基：MRS培养基)(培养基温度：30℃)(培养时间：24 hr)	圆形边缘光滑微微突起的形状有一些光泽(luster)乳白色(milk-white)
		培养温度(37℃/45℃)	(+/-)
过氧化氢酶(catalase)	(-)
		酸/气体产生(葡萄糖)	(+/-)
O/F实验(葡萄糖)	(+/+)
		在pH 9.6生长	(+)
在NaOH(6.5％)中生长	(+)

表9：乳酸菌菌株AJ110263的糖发酵特性

糖发酵特性
			发酵(+)	L-阿拉伯糖	albutin
D-木糖	七叶苷(esculin)
		半乳糖		水杨苷(salicin)
葡萄糖	纤维二糖(cellobiose)
		果糖		麦芽糖
甘露糖	甘蔗糖(cane sugar)
		N-乙酰葡糖胺		龙胆二糖(gentiobiose)
苦杏仁苷(amygdalin)	葡糖酸盐(gluconate)
		发酵(-)		甘油(glycerol)	海藻糖(trehalose)
赤藓糖醇(erythritol)	菊糖(inulin)
			D-阿拉伯糖	松三糖(melezitose)
核糖(ribose)	棉子糖(raffinose)
			L-木糖	淀粉(starch)
阿东糖醇(adonitol)	糖原(glucogen)
			β-甲基-D-木糖	木糖醇(xylitol)
山梨糖(sorbose)	D-thranose
			鼠李糖(rhamnose)	D-来苏糖(D-lyxose)
卫矛醇(dulcitol)	D-塔格糖(D-tagatose)
			肌醇(inositol)	D-岩藻糖(D-fucose)
甘露醇(mannitol)	L-岩藻糖(L-fucose)
			山梨醇(sorbitol)	D-阿糖醇(D-arabitol)
α-甲基-D-甘露糖	L-阿糖醇(L-arabitol)
			α-甲基-D-葡萄糖	2-酮葡糖酸(2-Ketogluconic acid)
乳糖	5-酮葡糖酸(5-Ketogluconic acid)
			蜜二糖(melibiose)

通过下面的实施方案描述本发明。然而，本发明并不限于此。

<实施例1>

将分离自发酵的奶matsoon的乳酸菌魏斯氏菌AJ110263(FERMBP-10474)，和由模式培养得到的乳酸菌戊糖片球菌JCM5885、戊糖片球菌JCM5890、植物乳杆菌JCM1149和唾液乳杆菌JCM1231预培养并在MRS液体培养基(上面表1)上培养。对于魏斯氏菌，培养温度为30℃，而其它菌株为37℃。将上述乳酸菌接种到MRS琼脂培养基平板上并培养24小时，所述平板上已经以0U/mL(不加入)、200U/mL和400U/mL的量加入“Umamizyme G”，一种来自曲霉的蛋白酶。在培养中，将100mL的MRS培养基加到500mL Sakaguchi摇瓶中，接种100mL的上述培养液，并以100次/min摇动培养基。

然后，将不产生细菌素的Lactobacillus sakei菌株JCM1157用作指示菌株，并铺乳杆菌AOAC培养基。将这些平板在30℃培养24小时，导致指示菌株中生长抑制区的形成(下面表10)。由这些结果，显示上述菌株中的每一种产生抗蛋白酶的细菌素。

表10

菌株	蛋白酶(U/mL)
				0	200	400
	魏斯氏菌AJ110263	7	10				10
戊糖片球菌JCM5885				15	15	15
	戊糖片球菌JCM5890	10	12				12
植物乳杆菌JCM1149				15	17	23
	唾液乳杆菌JCM1231	13	18				18

将Lactobacillus sakei菌株JCM1157用作指示菌株。表中的值表示生长抑制区的直径。

<实施例2>

将乳酸乳球菌NCD0497(产生尼生素A的细菌)和乳酸乳球菌NCIMB702054(产生尼生素Z的细菌)单独地在MRS液体培养基中在30℃培养。以如实施例1中同样的方式，使用Lactobacillus sakei菌株JCM1157作为指示菌株进行抗生素评价。取代产生尼生素的细菌菌株，将10μL由ICNBiomedical生产的“尼生素A 1,000IU/mL溶液”点样在MRS琼脂培养基平板上并(不使用细菌菌株)进行上述的抗生素评价。

虽然不存在蛋白酶的条件下形成的指示菌株生长抑制区，由于尼生素引起的抗生素活性随蛋白酶浓度升高而减小(参见表11)。

表11

菌株	蛋白酶(U/mL)
				0	200	400
	加入尼生素A(不含任何细菌产生的细菌素)	30	ND				ND
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NCD0497(细菌产生的尼生素A)				30	13	ND
	乳酸乳球菌NCIMB702054(细菌产生的尼生素A)	30	13				ND

将Lactobacillus sakei JCM1157作为指示菌株。表中的值表示增殖抑制区(proliferation inhibition zone)的直径。

ND＝未测出

<实施例3>

将魏斯氏菌AJ110263(FERM BP-10474)、戊糖片球菌JCM5885、乳酸乳球菌NCD0497(产生尼生素A的细菌)和Lactobacillus sakei菌株JCM1157单独培养，并将培养液在10,000rpm离心分离10分钟以得到培养上清液。将200U/mL的“Umamizyme G”加入培养上清液并进行蛋白酶处理24小时之后，将上清液通过0.45μm醋酸纤维素(由ADVANTEC生产的“Dismic-25cs”)过滤以得到无菌的样品。采用spot-on-lawn方法检测抗生素谱。这显示甚至当用蛋白酶处理时，魏斯氏菌AJ110263(FERM BP-10474)和戊糖片球菌JCM5885都具有抗生素活性，与产生尼生素的细菌培养液和不产生细菌素的Lactobacillus sakei菌株JCM1157形成对比(参见表12)。因此可以理解魏斯氏菌AJ110263(FERM BP-10474)和戊糖片球菌JCM5885产生抗蛋白酶的细菌素。

表12

样品菌株指示菌株	魏斯氏菌AJ110263	戊糖片球菌CM5885	乳酸乳球菌NCD0497	Lactobacillussakei JCM1157T
					无害利斯特氏菌ATCC33090T	50	50	ND	ND
Bacillus circulagsJCM2504T	100	100	50	50
					凝结芽孢杆菌JCM2257	50	100	ND	ND
藤黄微球菌IFO12708	100	100	ND	ND
					枯草芽孢杆菌JCM1465T	100	100	ND	50
乳酸乳球菌乳亚种ATCC19435	50	50	ND	ND
					屎肠球菌JCM5804T	50	100	ND	ND
粪肠球菌JCM5809T	100	100	ND	50
					植物乳杆菌ATCC14917T	100	100	ND	50
Lactobacillussakei JCM1157T	50	50	ND	ND

在用蛋白酶处理培养液之后，通过spot-on-lawn方法使用培养上清液测定抗生素活性。该值表示抗生素活性。

抗生素活性(AU/mL)＝抑菌圈(inhibition circle)形成的最大稀释率x1,000/10。

ND＝未测出

<实施例4>

将表13中显示的不同乳酸菌，即魏斯氏菌AJ110263(FERM BP-10474)、戊糖片球菌JCM5885、植物乳杆菌JCM1149、唾液乳杆菌JCM1231、柠檬明串珠菌JCM9698、假肠膜明串珠菌JCM9696和JCM11045的培养液、乳酸乳球菌NCIMB702054(产生尼生素Z的细菌)，以与实施例3中同样的方式酶处理，并通过spot-on-lawn方法使用枯草芽孢杆菌作为指示菌株测定抗生素活性。以与实施例3中同样的方式使用“Umamizyme G”。此外，将100单位/mL源自枯草芽孢杆菌(Wako Junyaku)的α-淀粉酶加入乳酸菌的培养液，并在30℃反应1小时以上。类似地，采用枯草芽孢杆菌IAM1381作为指示菌株，通过spot-on-lawn方法测定抗生素活性以检验α-淀粉酶对于抗生素活性的影响。

如表13所示，甚至当用蛋白酶处理时，魏斯氏菌AJ110263(FERMBP-10474)、Weissella cibaria JCM12495、融合魏斯氏菌JCM1093、赫伦魏斯氏菌JCM10103、坎氏魏斯氏菌JCM5817、稍小魏斯氏菌JCM1168、类肠膜魏魏斯氏菌JCM9890、Weissella thailandensis JCM10694、戊糖片球菌JCM5885、植物乳杆菌JCM1149、唾液乳杆菌JCM1231、戊糖乳杆菌IAM1558、柠檬明串珠菌JCM9698、假肠膜明串珠菌JCM9696和JCM11045、阿根廷明串珠菌JCM11052、肉色明串珠菌JCM9695、肠膜明串珠菌JCM6124的培养液显示抗生素活性。由此，确定这些菌株中的每一种产生抗蛋白酶的细菌素。可以确认，当用α-淀粉酶处理时，这些培养液的抗生素活性减小。表13的残余活性如下计算：抗生素活性(AU/mL)＝抑制区形成时的最大稀释率x 1,000/10x(酶处理样品的抑菌圈直径/对照的抑菌圈直径)。

表13

菌株	残余抗生素活性
				对照	Umamizyme	α-淀粉酶
	尼生素产生者
乳酸乳球菌NCIMB702054				100	nd	100
	PRB产生着
魏斯氏菌AJ110263				100	100	30
	Weissella cibaria JCM12495	100	100				30
融合魏斯氏菌JCM1093				100	70	50
	赫伦魏斯氏菌(Weissella hellenica)JCM10103	100	100				40
坎氏魏斯氏菌JCM5817				100	100	40
	稍小魏斯氏菌JCM1168	100	100				40
类肠膜魏斯氏菌JCM9890				100	100	70
	Weissella thailandensis JCM10694	100	100				40
戊糖片球菌JCM5885				100	90	30
	植物乳杆菌JCM1149	100	80				30
唾液乳杆菌JCM1231				100	80	30
	戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)IAM1558	100	100				30
柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)JCM9698				100	80	40
	假肠膜明串珠菌JCM9696	100	100				50
假肠膜明串珠菌JCM11045				100	100	50
	阿根廷明串珠菌JCM11052	100	100				nd
肉色明串珠菌JCM9695				100	100	30
	肠膜明串珠菌JCM6124	100	100				40

<实施例5：用人造胃液和肠液处理后抗生素活性的评价>

(a)培养乳酸菌

乳酸乳球菌NCIMB8780(产生尼生素A的细菌)、乳酸乳球菌NCIMB702054(产生尼生素Z的细菌)、魏斯氏菌AJ110263(产生PRB的菌株)、唾液乳杆菌JCM1231(产生PRB的菌株)和植物乳杆菌ATCC14917(指示菌株)在30℃培养，而加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)JCM1131(不产生细菌素的菌株)和戊糖片球菌JCM5885(产生PRB的菌株)在37℃在MRS培养基中静止培养24小时。

(b)用人造胃液和肠液处理

将0.2％NaCl和0.2％胃蛋白酶(1∶5000)加入乳酸菌的培养液以将pH调节到2之后，将培养液在41℃用蛋白酶处理2小时(人造胃液处理)。在加入0.2％胰蛋白酶(1∶5000)以将pH调节到6之后，将培养液在41℃用蛋白酶处理2小时(人造肠液处理)。在这些处理的过程中，将乳酸和苛性钠(causticsoda)用作pH调节剂。

进行上述的消化酶处理以制备如下样品：培养液(培养液A)，其含有在MRS中培养的乳酸菌的细菌量(bacterial mass)，通过在10,000rpm将培养液A离心分离10min并将其通过0.45μm醋酸纤维素过滤器(由ADVANTEC生产的“Dismic-25cs”)得到的无菌上清液(sup.A)，消化酶处理溶液(培养液B)，和培养液B的无菌上清液(sup.B)。

(c)抗生素活性测试

将不受乳酸影响的植物乳杆菌ATCC14917用作指示菌株，将50μL量的此细菌涂在“GAM”琼脂平板上(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)。在用10μL量的上述(b)段中制备的样品点样后，将此平板的表面充分干燥，并在30℃培养24小时。确认生长抑制区的形成。结果在下面的表14中给出。表中的数字表示生长抑制区的直径(mm)。当经过人造胃液和肠液处理时，尼生素失去其抗生素活性，而抗蛋白酶的细菌素保持其抗生素活性。

表14

菌株	抗生素物质	对照		胃蛋白酶+胰蛋白酶
						培养液A	sup.A	培养液B	sup B
		加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)JCM1131(模式菌株(type strain))	(lac)	nd	nd					nd	nd
乳酸乳球菌NCIMB8780	尼生素A					16	15	nd	nd
		乳酸乳球菌NCIMB702054	尼生素Z	15	10					nd	nd
魏斯氏菌AJ110263	PRB					10	7	7	7
		戊糖片球菌JCM5885	PRB	5	5					3	3
唾液乳杆菌JCM1231	PRB					5	5	3	3

nd＝未测出

<实施例6：沙门氏菌增殖抑制实验(活细菌计数评价)>

(a)样品制备

采用实施例5的(a)和(b)中列出的方法培养乳酸菌，进行人造胃液和肠液处理，和制备无菌的上清样品。

(b)沙门氏菌增殖抑制实验(活细菌计数评价)

将用胰酶解酪蛋白大豆酪蛋白(trypticase soybean casein)(由BBL生产)预培养的肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)NBRC3313在TSBYE培养基中悬浮至10⁵个细菌/mL。加入10％量的乳酸菌培养上清液并评价对于沙门氏菌增殖的抑制作用。与不加入的体系和不产生细菌素的细菌的培养上清液相比，产生抗蛋白酶的细菌素的细菌的上清液显著抑制沙门氏菌的增殖。参见表15。

表15

菌株	抗生素物质	cfu/ml
					CT(0hr)×104	CT(6hr)×108	CT(24hr)×108
		对照	-	3.0				4.5	8.7
加氏乳杆菌JCM1131	Lac				7.5	3.3	7.9
		乳酸乳球菌NCIMB8780	尼生素A	4.33				2.8	3.0
魏斯氏菌AJ110263	PRB				4.3	3.3	1.6

<实施例7：对于饲料中的沙门氏菌的杀菌作用>

(a)培养乳酸菌

将魏斯氏菌AJ110263(产生PRB的细菌)在30℃在其中已加入0.1％L-Cys和0.1％L-Met的MRS培养基中培养24小时。在如下实验中将培养液用作含有抗蛋白酶的细菌素的溶液。

(b)制备用沙门氏菌人为污染的饲料

将肠炎沙门氏菌(SE)菌株KTE-61(抗利福平(rifampicin))在37℃在脑心浸液培养基(brain heart infusion medium)(Difco)中培养24小时。将300mL量的此培养液(10⁹ cfu/mL的活细菌计数)加入6kg的商品饲料混合物(商业的雏鸡(broiler)非化学饲料“BroAce F2”)并在混合器中混合以制备SE污染的饲料。

(c)加入抗生素

分别制备总共4部分(segment)，其形式为通过将0.2％的商品抗生素“Bio-Add”(0.2％甲酸+丙酸)加入(b)段中制备的人为污染沙门氏菌的饲料而得到的一部分，通过将2％的含有抗蛋白酶的细菌素的溶液加入同样的饲料而得到一部分，和无抗生素加入的部分(对照)。

(d)抗生素评价

随着时间，将饲料的每个部分取样并用磷酸盐缓冲溶液稀释以测定活细菌计数。对于活细菌计数，将稀释的溶液涂在其中已加入0.1mg/mL利福平的MLCB琼脂培养基(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)上，并在37℃培养24小时。如下面图1所示，乳酸菌的含有PRB的溶液对于饲料中的沙门氏菌显示即时的、连续的、稳定的和良好的杀菌结果。30小时后，保持了超过商品抗生素Bio-Add的抗菌效果。

<实施例8：弯曲杆菌增殖抑制实验(活细菌计数评价)>

(a)样品制备

通过在实施例5的(a)中列出的方法培养并过滤乳酸菌以制备无菌上清液。

(b)弯曲杆菌增殖抑制实验(活细菌计数评价)

将预培养的空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)菌株702在布鲁氏菌(Brucella)培养基中悬浮至10⁶个细胞/mL，并加入乳酸菌的1％的培养上清液。使用CCDA培养基进行弯曲杆菌活细菌计数。与不加入的体系(对照)相比，产生PRB的细菌的上清液显著抑制弯曲杆菌的增殖。如表1 6所示。

表16

菌株	抗生素物质	空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
					0hr	6hr	24hr
		对照	-	5.7×106				6.3×106	2.3×108
魏斯氏菌AJ110263	PRB				4.1×106	2.6×106	2.7×104
		戊糖片球菌JCM5885	PRB	5.1×106				4.9×106	n.d.×100
唾液乳杆菌JCM1231	PRB				5.3×106	4.1×106	n.d.×100

n.d.＝未测出

Claims (10)

1.抗生素，其包含分离自乳酸菌的抗蛋白酶的细菌素。

2.组合物，其包含权利要求1的抗生素和一种或多种合适的赋形剂。

3.权利要求2的组合物，其中配制所述的组合物用于给药于牲畜。

4.包含乳酸菌的组合物，所述乳酸菌属于选自乳杆菌属、魏斯氏菌属、片球菌属、明串珠菌属和其组合中的一个或多个属。

5.权利要求4的组合物，其中所述的乳酸菌选自植物乳杆菌、唾液乳杆菌、戊糖乳杆菌、魏斯氏菌FERM BP-10474、Weissella cibaria、融合魏斯氏菌、赫伦魏斯氏菌、坎氏魏斯氏菌、稍小魏斯氏菌、类肠膜魏斯氏菌、Weissella thailandensis、戊糖片球菌、柠檬明串珠菌、假肠膜明串珠菌、阿根廷明串珠菌、肉色明串珠菌、肠膜明串珠菌和其组合中的一种或多种。

6.饲料组合物，其包含权利要求1的抗生素。

7.饲料组合物，其包含权利要求4的组合物。

8.防止造成人类食物中毒的细菌在牲畜的胃和/或肠中生长的方法，其包括将权利要求2的组合物给药所述的牲畜。

9.防止造成人类食物中毒的细菌在牲畜的胃和/或肠中生长的方法，其包括将权利要求4的组合物给药所述的牲畜。

10.权利要求8或9的防止造成人类食物中毒的细菌生长的方法，其中所述的细菌是选自沙门氏菌属、弯曲杆菌属、利斯特氏菌属、埃希氏菌属、Welsh和其组合中的一个或多个属。