DE69833377T2

DE69833377T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen enthaltend lysostaphin allein oder in kombination mit einem antibiotikum zur behandlung von staphylokokkeninfektionen

Info

Publication number: DE69833377T2
Application number: DE69833377T
Authority: DE
Inventors: P. Beth West Islip GOLDSTEIN; W. Michael Richmond CLIMO; P. Richard New York NOVICK; L. Gordon Richmond ARCHER
Original assignee: AMBI Inc
Current assignee: AMBI Inc
Priority date: 1997-07-23
Filing date: 1998-07-21
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-07-22
Also published as: CN1269727A; WO1999004809A1; HUP0002662A2; RU2234940C2; NO20000314D0; JP2001510805A; NZ502359A; PL338178A1; SK732000A3; AU754806B2; IL134056A0; HUP0002662A3; NO320884B1; US20020006406A1; DE69833377D1; ZA986593B; EP1001804B1; NO20000314L; HU0002662D0; CA2297083A1

Description

Titel der Erfindung
Hintergrund der Erfindung
Bereich der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Lysostaphin bei der Herstellung eines Arzneimittels zu Behandlung von Staphylococceninfektionen beim Menschen. Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Verfahren, die auf bestimmte Erkrankungsbedingungen gerichtet sind, einschließlich staphylococcaler Endokarditis, staphylococcale Bakteriämie; und staphlococcale Infektionen der Nieren, Lunge, Haut, Knochen, von Verbrennungen, Wunden und Prothesevorrichtungen. Die Erfindung umfasst die Verwendung von Lysostaphin im Allgemeinen, umfassend nicht nur das wildtyp-Lysostaphin sondern auch rekombinantes Lysostaphin; Lysostaphinvarianten mit einer Aminosäuresequenz, die von der publizierten „ natürlichen Sequenz" des maturen Peptids abweicht (U.S. Patent Nr. 4,931,390) auf Grund von genetischen Mutationen (wie Substitutionen, Additionen und Deletionen), posttranslationaler Prozessierung, gentechnische Herstellung von chimären Fusionsproteinen und der Gleichen oder einer Kombination dieser Variationsarten.
Hintergrund der Erfindung
Lysostaphin ist ein Enzym, das als erstes in Staphylococcus simulans (früher bekannt als S. staphylolyticus) identifiziert wurde, welches durch die Wirkung seiner proteolytischen Aktivität auf glyzinhaltige Brücken in dem Zellwand-Peptidoglykan von Bakterien eine antimikrobielle Aktivität hat [Zygmunt, et al., Progr. Drug Res. 16:309-333 (1972)].
In vitro ist Lysostaphin insbesondere gegen Staphylococcus auseus aktiv, weil die Zellwandbrücken dieser Spezies einen hohen Anteil an Glyzin enthalten, wenn auch eine Aktivität gegenüber anderen Staphylococcen-Spezien gezeigt worden ist (Ibid.).
Die Aktivität des Lysostaphins wurde auch in Tierinfektionsmodellen untersucht. Die Studien, bei denen eine intraperitoneale Behandlung einer intraperitonealen Infektion folgte, sind ähnlich zu den in vitro-Experimenten und werden hier nicht berücksichtigt. Es gibt zwei Berichte über das Überleben von 50% der behandelten Mäuse, wenn die Tiere einer intraperintonealen Infektion unterworfen wurden, gefolgt durch eine einmalige oder mehrfache subkutane Verabreichungen mit einer Gesamtmenge von etwa 1 mg/kg eines Lysostaphinpräparats [Schuhardt, et al., J. Bacteriol. 88:815-816 (1964); Harrison, et al., Can. J. Microbiol. 13:93-97 (1967)]. Es wurde in einer dieser Studien berichtet, dass eine Gesamtdosis von 6 mg/kg 100% der Mäuse schützte [Harrison, et al., Ibid.]. Die Virulenz der bakteriellen Herausforderung, die in beiden Studien verwendet wurde, scheint recht gering zu sein, weil die unbehandelten, infizierten Mäuse nicht alle innerhalb eines kurzen Zeitraumes starben.
Mehrere Experimente verwendeten ein subakutes Mausmodel, wobei die bakterielle Belastung in den Nieren nach einer Infektion mit dem Giorgio-Stamm von S. aureus gemessen wurde [Dixon, et al., Yale J. Biol. Med. 41:62-68 (1968); Schaffner, et al., Yale J. Biol. Med. 39:230-244 (1967); Harrison, et al., J. Bacteriol. 93:520-524 (1967)]. Wenn ein Lysostaphin-Präparat innerhalb von 6 Stunden nach der Infektion intravenös verabreicht wurde, wurde mit Dosen von 1,5 mg/kg oder höher eine signifikante Reduktion der Bakterienanzahl in den Nieren beobachtet. Die etablierten Infektionen waren jedoch beständiger; es wurden nur geringe Reduktionen in der Bakterienzahl beobachtet, wenn eine Behandlung über 24 Stunden oder länger vorenthalten wurde, sogar mit Dosen von 125 oder 250 mg/kg eines Lysostaphin-Präparats. Die Wirkung von Mehrfachbehandlungen wurde nicht untersucht.
Eine einzige Studie von Goldberg, et al., Antimicrob. Ag. Chemother. 1967:45-53 (1967) setzte eine limitierte Anzahl von Hunde in einem ungewöhnlichen Endokarditismodel ein. Das Hundemodel ist nicht weiterentwickelt worden. Das Experiment von Goldberg, et al. war nicht vergleichbar und hat deshalb eine eingeschränkte Verwendbarkeit bei der Einschätzung für die Verabreichung von Lysostaphin. Hohe Dosen von Lysostaphin jedoch (wenigstens 50 mg/kg/Behandlung) waren jedoch nur gering Wirksam, wie durch die Gesundheit der Hunde und das Ausmaß der Reduktion der Bakterienzahl an den Herzklappen und in den Nieren beurteilt wurde.
Dementsprechend lehren die Daten, die aus den Studien im Stand der Technik erhalten wurden, nicht, dass die Verwendung von Lysostaphin ein wirksamer und praktischer Ansatz sein würde, etablierte Infektionen aus verschiedenen Organen zu entfernen.
Es wurden limitierte humane Versuche durchgeführt, die auf die Ausrottung von in der Nase befallenen S. aureus durch die topikale Anwendung von Lysostaphin auf die Nasenhöhlen abzielten [Martin, et al., J. Lab. Clin. Med. 70:1-8 (1967); Martin, et al., J. Leb. Clin. Med. 71:791-797 (1968); Quickel, et al., Appl. Microbiol. 22:446-450 (1971)]. Das Tragen der Bakterien in der Nase ist an sich kein Erkrankungsstadium. Es stellt einen Risikofaktor für die Infektion von Patienten dar, die von kolonisierten Fachleuten der Gesundheitsfürsorge behandelt werden, oder für die Selbstinfektion im Falle eines kolonisierten Patienten.
Das EP 0359873 offenbart die lokale Verabreichung von Lysostaphin zu der Milchdrüse im Rind, um bovine Mastitis zu behandeln.
Cisani, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1982, Seiten 531-535, offenbart die topikale Verwendung von Lysostaphin in Kombination mit Lysozym.
Polak, et al., Diagn., Microbiol. Infect. Dis., Vol. 17, 1993, Seiten 265-270, offenbart die topikale Anwendung von Lysostaphin in Kombination mit einem beta-Lactam-Antibiotikum.
Huan, et al., Database Medline Nr. 95145215, Mai 1995, beschäftigt sich mit der Verwendung von Lysostaphin als ein topikales Antimikrobiotikum.
Climo, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1998), Band 42(6), Seiten 1355-1360, offenbart, dass Lysostaphin in der Vergangenheit eine eingeschränkte therapeutische Verwendung auf Grund seiner vermuteten Immunogenität hatte.
Die Fachliteratur berichtet von der Behandlung eines schwer kranken Patienten mit einer einzigen Dosis parenteral verabreichten Lysostaphins, gefolgt von einem Antibiotikum, Gentamycin, drei Tage später. Der Patient starb, wies aber eine Reduktion der Bakteriämie auf [Stark, et al., N. Engl. J. Med. 291:239-240 (1974)].
Die immunogenen Phänomene, die während des Verlaufs in humanen und Tierstudien beobachtet wurden, wurden als große Besorgnis wahrgenommen. Eine Kontamination der Lysostaphinpräparate mit fremden Substanzen können für wenigstens einige dieser Phänomene verantwortlich gewesen sein.
Es fand keine weitere Entwicklung des Enzyms als ein therapeutisches Mittel statt, angesichts des Mangels der gewünschten Wirksamkeit in den diskutierten Studien. Dies mag ferner an der Schwierigkeit liegen Lysostaphin herzustellen und aufzureinigen.
Das Staphylococcen-Gen für Lysostaphin ist nun sequenziert und kloniert worden (U.S. Patent Nr. 4,931,390]. Es wurde Lysostaphin für die Verwendung als Laborreagenz durch die Fermentation eines nicht-pathogenen rekombinanten Stamms von Bacillus sphaericus hergestellt, aus welchem es leicht aufgereinigt wird.
Es bleibt für die Fachleute auf diesem Gebiet ein Gegenstand ein therapeutisches Mittel zu entwickeln, das parenteral verabreicht werden kann und das bei einer Staphylococcen-Infektion im Allgemeinen, als auch bei einer Infektion bestimmter Gewebe, wie bei einer Endokarditis verwendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Die Verabreichung relativ geringer Dosen Lysostaphins (unter 50 mg/kg) mittels einer parenteralen Verabreichung ist eine dramatisch wirksame Therapie zur Behandlung von Staphylococceninfektionen, insbesondere von Infektionen, die resistent gegenüber einer Behandlung sind, und/oder typischerweise mit einer signifikanten Morbidität und Mortalität verbunden sind. Ferner wurde gezeigt, dass Lysostaphin gegen Staphylococcenbakterien wirksam ist, die zumindest zum Teil gegen erhältliche antimikrobielle Mittel resistent sind, wie Beta-Lactam-Antibiotika, einschließlich Penicillinase-stabile Penicilline, Vancomycin, usw.
Die Erfindung schließt ferner Kombinationstherapien ein, welche eine alternierende oder simultane Verabreichung von Lysostaphin und einem oder mehrerer anderer antimikrobieller Mittel umfasst. Besonders bevorzugte Antibiotika für die Verabreichung in Kombination mit Lysostaphin entsprechend dieser Erfindung sind Rifamycine (isoliert aus Mikroorganismen oder synthetisch oder semisynthetisch hergestellt, wie Rifampin) und Glykopeptide (eine Gruppe von Molekülen aus der die natürlich vorkommenden Moleküle gewöhnlich ein Heptapeptid und ein oder mehrere Zuckereinheiten enthalten), ob natürlich hergestellte und isolierte (wie Vancomycin, Teicoplanin, ect.) oder semisynthetische Präparate.
Die Erhältlichkeit von geklonten, rekombinanten und varianten Lysostaphinen dehnt diese Erfindung weiter aus. Es wurden verwandte Enzyme identifiziert und diese können ferner zusammen mit oder anstelle von Lysostaphin verwendet werden.
Das Klonieren und Sequenzieren des Lysostaphingens erlaubt die Isolation von varianten Enzymen, die Eigenschaften haben können, die ähnlich oder verschieden zu jenen des wildtyp Lysostaphins sind. Ein solch ein verändertes Enzym, das eine einzige Aminosäureveränderung trägt, und welches das Ergebnis unserer Arbeit war, wurde charakterisiert und es wurde gezeigt, dass es eine potente anti-staphylococcale Aktivität in vitro und in einem Tier-Infektionsmodel hat.
Andere Lysostaphinanalogons, einschließlich natürlich vorkommender Enzyme mit einer Sequenzhomologie zu Lysostaphin und mit einer Endopeptidaseaktivität, oder sogar chimäre Enzyme, die durch die Fusion der Bindungsdomäne eines Enzyms mit der katalytischen Domäne eines weiteren erhalten wurden, werden potente Mittel sein, die in der Lage sind schwierig zu behandelnde bakterielle Erkrankungen zu behandeln, die durch Staphylococcen oder andere pathogene Bakterien verursacht wurden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine graphische Repräsentation der bakteriziden Aktivität von Lysostaphin gegen einen methicillinresistenten S. aureus-Stamm, verglichen mit Vancomycin.
2 ist ein Graph, der die bakterizide Aktivität von Lysostaphin gegen eine Vielzahl von S. aureus-Stämmen mit einer Resistenz gegen unterschiedliche antimikrobielle Substanzen reflektiert.
Definitionen
Die Begriffe, die in dieser Anmeldung verwendet werden, werden, wo es möglich ist, im Sinne ihrer normalen und typischen Verwendung verwendet. Bestimmte Begriffe werden verwendet, um eine Klasse von Wirkungen oder Verbindungen zu beschreiben, um eine allgemeine Beschreibung dieser Gegenstände oder wissenschaftlichen Phänomene bereitzustellen, die logisch zusammengefasst sind.
Lysostaphin-Analogon – Irgendein Enzym, einschließlich Lysostaphin (wildtyp), irgendeine Lysostaphinmutante oder -variante, irgendein rekombinantes oder verwandtes Enzym, das die proteolytische Fähigkeit beibehält in vitro und in vivo proteolytisch glyzinhaltige Brücken in dem Zellwandproteoglykan von Staphylococcen anzugreifen. Varianten können durch posttranslationale Prozessierung des Proteins (entweder durch Enzyme, die in einem Produktionsstamm vorhanden sind, oder mittels Enzyme oder Reagenzien, die in irgendeinem Stadium dieses Prozesses eingeführt wurden) oder durch Mutationen des Strukturgens generiert werden. Die Mutationen können eine ortsspezifische Deletion, Insertion, Entfernen von Domänen und Replacement Mutationen mit einschließen. Die Lysostaphinanalogons, die in der vorliegenden Erfindung betrachtet werden, können rekombinant oder auf andere Weise exprimiert werden.
Parenteral – Eine Verabreichung mittels Injektion, einschließlich intravenös, intramuskulär, subkutan, intraorbital, intraspinal, intraperitoneal und mittels direkter Perfusion oder Abgabe an die Organe oder Gewebe durch Injektion (z.B., intramedullär).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Staphylococcus aureus ist ein hochvirulentes humanes Pathogen. Es ist die Ursache für eine Vielzahl menschlicher Erkrankungen, die von lokalen Hautinfektionen bis hin zu einer lebensbedrohlichen Bakteriämie und zu Infektionen lebenswichtiger Organe reichen. Wenn diese nicht schnell unter Kontrolle gebracht werden, kann sich eine S. aureus-Infektion schnell von der anfänglichen Infektionsstelle zu anderen Organen ausbreiten. Obwohl die Infektionsfoki nicht offensichtlich sein mögen, sind bei den Organen, die für eine Infektion besonders anfällig sind, das Herz, die Nieren, Lungen, Knochen, Hirnhaut und die Haut von Verbrennungspatienten eingeschlossen. Operative oder traumatische Wunden und irgendeine Region, in welcher ein Fremdkörper vorhanden ist, werden auch häufig infiziert. Diese Infektionen, die in der Gesellschaft oder während eines Krankenhausaufenthalts auftreten können, sind eine Ursache für eine signifikante Morbidität und Mortalität, die bis zu 60% hoch sein kann bei ernsten Infektionen in bestimmten Populationen, auch wenn die best mögliche Behandlung verwendet wird. Andere Staphylococcen-Spezien (Coagulase-negative Staphylococcen wie S. epidermidis) sind weniger virulent, können aber Katheter und Prothesevorrichtungen kolonisieren; dies kann verheerende Folgen haben, zum Beispiel, wenn die Vorrichtung eine implantierte Herzklappe ist.
Eine Resistenz zu erhältlichen antimikrobiellen Mitteln scheint besonders leicht bei Staphylococcen aufzutreten, beginnend mit einer Penicillinresistenz in S. aureus; diese Resistenz trat bald nach dem Beginn der Antibiotikaära auf. So gut wie alle Staphylococceninfektionen, ob sie in der Gesellschaft oder im Krankenhaus auftreten, sind nicht länger gegenüber den Penicillinen der ersten Generation auf Grund der Produktion der Penicillinase empfindlich; Stämme, die auch gegenüber Penicillinase-stabilen Penicillinen (wie Methicillin) resistent sind, sind nun auch ein signifikantes Problem, insbesondere bei im Krankenhaus erworbenen Infektionen. [Centers for Disease Control and Prevention, 1997. Reduced susceptibility of Staphylococccus aureus to Vancomycin – Japan, 1996. Morbidity and Mortality Weekly Report 46: 624-626 (1997).]
Vancomycin wurde die Behandlung der Wahl für Staphylococceninfektionen, insbesondere in Krankenhäusern. Es ist jedoch von den hohen Mortalitätsraten offensichtlich, dass keine derzeitig erhältliche Behandlung ideal für bestimmte Erkrankungen ist, wie einer S. aureus-Endokarditis und -Bakteriämie, die eine schnelle Reduktion der Bakterienzahl erfordern, um einen irreversiblen Schaden des Herzens oder der anderen Organe, zu welchen sich die Infektionen häufig über den Blutstrom ausbreiten, vorzubeugen. Ein Grund für das Versagen der derzeitig erhältlichen Therapien ist, dass sie relativ langsam wirken, insbesondere in vivo, wo eine schnelle Sterilisation der Infektionsstellen für eine vollständige und schnelle Erholung des Patienten nötig wäre. In einer solchen lebensbedrohlichen Situation, und bei einigen anderen Infektionen (zum Beispiel bei welchen die Behandlungskuren sehr langwierig sind, wie eine Osteomyelitis), können neuartige Therapien oder neue Kombinationen von Therapien den Ausgang für den Patienten drastisch verbessern.
Es wurde herausgefunden, dass Lysostaphin bei moderaten Dosen hoch wirksam ist. Dies wird unten in einem drastischen, gut charakterisierten Tierinfektionsmodel gezeigt, mittels einer Endokarditis in Kaninchen, die durch einen methicillinresistenten S. aureus (MRSA) verursacht wird. Im speziellen zeigen wir eine vollständige Sterilisation der Herzklappenvegetation (-umgebung, -flora, -bereich) in beinahe allen Tieren, die mit einer der Dosierungskuren behandelt wurden, ein noch nie da gewesenes Ergebnis, das mit derzeitig erhältlichen antimikrobiellen Mitteln nicht beobachtet worden ist. Wir zeigen ferner hierin, dass die Kombination von Lysostaphindosen, die sogar geringer sind, mit einem Standardtherapeutikum die antimikrobielle Aktivität der Verbindungen in diesem Modelsystem potenziert.
Die Lysostaphindosierungen, die wir verwendet haben, waren signifikant niedriger als jene, für die zuvor nur eine beschränkte Wirkung auf die Beseitigung der Bakterien aus Organen in Tiermodellen gezeigt wurde [Zygmunt et al, Progr. Drug. Res. 16:309-333 (1972); Goldberg et al, Antimicrob. Ag. Chemother. 1967: 45-53 (1967)].
Wir haben auch die Aktivität von einer veränderten Form des Lysostaphins, welches durch die Mutagenese eines rekombinanten Bacillus sphaericus-Stammes hergestellt wurde, der das Lysostaphingen trägt, in vitro und in einem akuten Mausinfektionsmodel gegen Staphylococcen unten gezeigt. Es ist deshalb ein weiterer realisierter Gegenstand der Erfindung pharmazeutische Präparate von Lysostaphinanalogons zu verabreichen, entweder Lysostaphin oder ein anderes Enzym mit Peptidoglykanendopeptidaseaktivität, einschließlich genetisch modifizierter Enzyme, die ein bis fünf Aminosäuresubstitutionen enthalten; Enzyme mit Deletionen oder Insertionen von bis zu 10 Aminosäuren, einschließlich solcher Deletionen oder Insertionen an dem N-Terminus; oder chimäre Enzyme, die sich aus der Fusion von katalytischen und Bindungsdomänen von verschiedenen Enzymen ergeben, wie therapeutische Mittel, um Infektionen in Menschen und Tieren zu behandeln.
Zum Beispiel wurde eine weitere Glyzyl-glyzinendopeptidase (ALE-1 aus Staphylocoocus capitis EPK1) beschrieben. ALE-1 unterscheidet sich von Lysostaphin, obwohl die beiden Enzyme eine erhebliche Aminosäurehomologie haben [Sugai et al., J. Bacteriol. 179:1193-1202 (1997)]. Eine weitere Peptidoglycanhydrolase mit einem geringeren Homologiegrad zu Lysostaphin, die aber auch eine Endopeptidaseaktivität besitzt, ist Zoocin A, hergestellt von Streptococcus zooepidemicus 4881 [Simmonds et al., Applied and Environmental Microbiology 62:4536-4541 (1996); Simmonds et al., Gene 189: 255-261 (1997)]. Chimäre Proteine können durch die Fusion von Domänen dieser Enzyme oder ähnlicher Enzyme mit einer Domäne eines Lysostaphinanalogons hergestellt werden.
Während bestimmte immunologische Nebenwirkungen, die in viel früheren Studien beobachtet wurden, einen Grund zur Sorge in einigen, aber nicht anderen Situationen (wie Notfall- oder kurzfristigen Situationen) geben können, wird erwartet, dass angemessen reine Präparate von Lysostaphinanalogons, die durch die Fermentation von harmlosen rekombinanten Bakterienstämmen erhalten werden, weniger dazu neigen immunogen zu sein oder andere Nebenwirkungen zu induzieren.
Wirksame pharmazeutische Formulierungen dieser antimikrobiellen Enzyme schließen wässerige Lösungen und Trockenpräparate (z.B. lyophilisierte, kristalline oder amorphe, mit oder ohne zusätzliche gelöste Substanzen für den osmotische Ausgleich) zur Rekonstitution mit Lipiden ein, geeignet für eine parenterale Verabreichung des aktiven Mittels. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise auf intravenösen (i.v.), intramuskulären (i.m.), subkutanen (s.c.) oder intraperitonealen (i.p.) Wegen oder intrathekal oder mittels Inhalation oder durch eine direkte Einflößung an einer infizierten Stelle, um so im Blut und Gewebe einen Überschuss in dem Level der minimalen inhibierenden Konzentration (MIC) des aktiven Mittels zu ermöglichen und so eine Reduktion der Bakterientiter zu bewirken, um eine Infektion zu kurieren oder zu mindern.
Darüber hinaus kann das aktive Lysostaphinanalogon simultan oder abwechselnd coverabreicht mit andern antimikrobiellen Mitteln werden, um so eine infektiöse Erkrankung effektiver zu behandeln. Formulierungen können in kleinen Flüssigkeitsvolumina vorliegen oder in kleinen Flüssigkeitsvolumina rekonstruiert sein, welche für einen Bolus i.v. oder für eine periphäre Injektion geeignet sind, oder durch die Zugabe zu einem größeren Volumen einer i.v. Tropflösung, oder möglicherweise in einem größerem Volumen vorliegen oder in einem größeren Volumen rekonstruiert sein, um durch eine langsame i.v. Infusion verabreicht zu werden. Mittel, die mit Lysostaphin oder einem anderen antibakteriellen Enzym coverabreicht werden sollen, können zusammen mit dem besagten Enzym als eine fixe Kombination formuliert werden, oder sie können unvorbereitet in beliebige Formulierungen, die erhältlich und geeignet sind und auf beliebigen Verabreichungswegen, von denen bekannt ist, dass sie adequate Level dieser Mittel an den Infektionsstellen bereitstellen, verwendet werden.
Geeignete Dosierungen und Kuren vom Lysostaphin können mit der Schwere der Infektion und der Sensitivität des infizierenden Organismus variieren, und im Falle einer Kombinationstherapie können sie von dem speziellen antimikrobiellen Mittel(n), die in Kombination verwendet wurden, abhängen. Die Dosierungen können von 0,5 bis 200 mg/kg/Tag, vorzugsweise von 3 bis 25-50 mg/kg/Tag, reichen, verabreicht als aufgeteilte Dosen, vorzugsweise verabreicht durch eine kontinuierliche Infusion oder aufgeteilt in zwei bis vier Dosierungen pro Tag.
Beispiele
Alle Experimente wurden unter Verwendung von Lysostaphinanalogons durchgeführt, hergestellt durch die Fermentation von rekombinanten B. sphaericus-Stämmen, die modifiziert sind, um das Lysostaphingen zu enthalten, das von Recsei (U.S. Patent Nr. 4,931,390) beschrieben wurden, oder einer Mutante davon. Speziell variierten die Lysostaphinanalogons, hergestellt durch die Fermentation von rekombinanten B. sphaericus, von der publizierten Sequenz, indem sie 2 Aminosäuren weniger oder 2 Aminosäuren zusätzlich an dem N-Terminus hatten.
Insbesondere sind die Daten hierin weitestgehend aus Untersuchungen abgeleitet, die Präparate aus rekombinant hergestellten Lysostaphinanalogons verwenden, worin die Hauptverbindung eine ist, der die zwei N-terminalen Aminosäuren der publizierten Sequenz fehlen. Die Ergebnisse sind jedoch nicht auf diese Präparate beschränkt. Ähnliche Ergebnisse können mit irgendeinem Präparat erhalten werden, das eine geeignete Reinheit und Aktivität hat.
Beispiel 1
In vitro Aktivität von Lysostaphin
Wie in Tabelle 1a dargestellt, zeigen die Experimente, dass das Lysostaphinpräparat in vitro aktiv und bakterizid gegen klinische Isolate von S. aureus war; die minimalen inhibitorische Konzentrationen (MIC) und die minimalen bakterizide Konzentrationen (MBC) wurden mit ≤ 1,0 μg/ml unter Verwendung von Standard Broth Mirkoverdünnungsverfahren bestimmt [National Commitee for Clinical Laboratory Standards, 1993. Approved Standard M7-A3. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically – Dritte Auflage. National Commitee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA; National Commitee for Clinical Laboratory Standards, 1992. Tentative Guideline M26-T. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents. National Commitee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA].
Darüber hinaus wurde gezeigt, das Lysostaphin gegen eine Anzahl von Staphylococcus epidermidis-Isolaten (eine Koagulase-negative Spezies) mit einer MIC ≤ 8 μg/ml für 11 von 13 getesteten, klinischen Isolaten aktiv ist. Die MIC wurde als die niedrigste getestete Konzentration definiert, die vollständig das sichtbare Wachstum der Bakterien inhibierte, und die MBC als die niedrigste Konzentration, die 99.9% des anfänglichen Inokulums innerhalb einer 24-ständigen Exposition abtötete. Wie in Tabelle 1a gezeigt wird die Empfindlichkeit gegenüber Lysostaphin nicht durch die Resistenz oder eine verminderte Sensitivität gegenüber Methicillin und/oder Vancomycin beeinflusst. S. aureus-Stämme, die methicillinresistent sind, und die auch nur eine intermediäre Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin haben, sind kürzlich in den U.S. aufgetaucht [Centers for Disease Control and Prevention, Morbidity and Mortlity Weekly Report 1997. 46:813-815]. Tabelle 1a. Vorläufige Untersuchung der in vitro-Empfindlichkeit von S. aureus gegenüber Lysostaphin

^cklinisches Isolat; ^mmethicillinresistent; ^vVISA-Stamm (intermediäre Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin); ^*Stamm mit einer intermediären Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin, abgeleitet, im dem Labor, von einem methicillinresistenten klinischen Isolat.

Lysostaphin klebt an Plastikmaterialien und kann aus einer Lösung verloren gehen; dies kann seine offensichtliche Aktivität beeinflussen. Deshalb wurden einige der MIC-Bestimmungen auch mit der Zugabe von 0,1% bovinem Serumalbumin (BSA) zu dem Verdünnungsmittel durchgeführt. Ansonsten war das Verfahren identisch zu dem oben beschriebenen. Wie in Tabelle 1b gezeigt verbesserte sich die in vitro- Aktivität des Lysostaphins gegen die gestesteten Stämme 8- bis 64-fach, wenn in der Anwesenheit von BSA getestet wurde. Da diese Beobachtung mit der Affinität des Lysostaphins zu Plastikmaterialien in Beziehung steht, wird erwartet, dass im Allgemeinen Staphylococcenstämme empfindlicher gegenüber Lysostaphin sind als wie zuvor beobachtet. Tabelle 1b. Aktivität von Lysostaphin geigen S. aureus mit und ohne BSA

^cklinisches Isolat; ^mmethicillinresistent

Diese Daten zeigen die sehr wirksame Aktivität des Lysostaphins gegen aktuelle klinische multiantibiotikaresistente Staphylococcus aureus-Isolate.
Die bakterielle Aktivität von Lysostaphin gegen S. aureus wurde auch mittels von zeitabhängige Sterbeexperimente [Engl.: time kill experiments]. In einem Experiment dieses Typs wurde der S. aureus-Stamm AG461, ein methicillinresistentes klinisches Isolat aus Genua, Italien, in Mueller-Hinton Broth (Difco) inokuliert und bei 37°C unter leichtem Schütteln hochgezogen, bis etwa 10⁸ lebensfähige Zellen pro ml (CFU/ml) erreicht waren, wie es durch die Absorption der Kultur bei 600 nm abgeschätzt wurde. Die Kultur wurde dann mit frischem Broth auf etwa 10⁶ CFU/ml verdünnt und 5 ml Aliquots wurde in mehrere verschiedene Kolben für die Exposition zu verschiedenen Konzentrationen der antibakteriellen Mittel gegeben. Die Inkubation wurde unter leichtem Schütteln bei 37°C fortgesetzt und es wurden in Intervallen Proben entnommen, um die lebensfähigen Zellen zu bestimmen. Es wurden serielle 10-fach Verdünnungen der Proben in steriler Kochsalzlösung (0,9% NaCl in destilliertem Wasser) hergestellt und 0,1 ml Dublikataliquots der entsprechenden Verdünnungen wurde auf Trypton-Soja-Agarplatten (Remel) unter Verwendung des Agarinklusionsverfahrens ausplattiert. (In diesem Verfahren wird das Aliquot, das ausplattiert werden soll, zu 2,5 ml des Abdeckagars zugegeben, der gemischt wird und auf die Platte gegossen wird. Der Abdeckagar besteht aus geschmolzenem Trypton-Soja-Agar (Difco), der 2-fach mit Difco Trypton-Soja-Broth verdünnt wurde, um eine Endkonzentration des Agars von 0,75% w/v zu erhalten.) Die Platten wurden für 24-48 Stunden bei 36°C inkubiert und die Kolonien manuell gezählt. Alle Verdünnungen des Lysostaphins wurden in der Anwesenheit von 0,1-0,2% BSA hergesellt, um eine Absorption des Lysostaphins an Plastikmaterialien vorzubeugen. Das Vancomycin (Sigma Chemical Co.) wurde in sterilem Wasser verdünnt.
Wie in 1 gezeigt ist, war Lysostaphin mit Konzentrationen von 0,004 und 0,032 μg/ml schnell bakterizid, wobei wenigstens 99,9% der Bakterien innerhalb einer Stunde in Kontakt abgetötet wurden. Im Vergleich war die bakterizide Wirkung von Vancomycin vermindert und viel langsamer, wobei nur sehr wenig Abtötung der Bakterien innerhalb von drei Stunden Kontakt beobachtet wurden, auch wenn viel höhere Konzentrationen von Vancomycin (2 und 16 μg/ml) verwendet wurden. Die verwendeten unterschiedlichen Konzentrationen von Lysostaphin und Vancomycin waren ein- und achtfach ihrer entsprechenden MIC.
In einem weiteren Experiment (2) wurden drei verschiedene methicillinresistente klinische Isolate von S. aureus und ein vierte Stamm, 27619VR, ein im Labor gewonnener „VISA"-Stamm (d.h. mit einer intermediären Resistenz gegenüber Vancomycin), der sich von einem methicillinresistenten klinischen Isolat ableitet, in Kationen-angepassten Mueller-Hinton Broth (Becton Dickinson) inokuliert und bei 37°C über Nacht herangezogen. Sie wurden dann in frischem Broth verdünnt und bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert, bis sie voraussichtlich die logarithmische Wachstumsphase erreicht hatten. Wie in 2 angegeben reichten die bakteriellen Titer zu diesem Zeitpunkt von 2×10⁶ bis 9×10⁷ CFU/ml. Es wurde zu jeder kultur Lysostaphin mit einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben. Es wurden in Intervallen Proben entnommen, seriell in 0,9% NaCl verdünnt und durch das Verteilen auf Mueller-Hinton-Agar (Becton Dickinson) ausplattiert. Die Platten wurden für 48 Stunden bei 37°C inkubiert und die Kolonien manuell gezählt. Wie in 2 gezeigt wurden alle Stämme schnell durch Lysostaphin abgetötet.
Diese Daten zeigen, dass Lysostaphin eine wirksame und schnelle bakterizide Aktivität gegen aktuelle klinische Isolate von S. aureus hat, einschließlich gegen Stämme, die gegenüber Methicillin resistent sind, und Stämme, die sowohl gegenüber Methicillin resistent als auch gegenüber Vancomycin mittelresistent sind.
Tiermodelluntersuchungen
Beispiel 2
Vergleichende Wirksamkeit von Lysostaphin in einem S. aureus Mausinfektionsmodel
Die Wirksamkeit von Lysostaphin wurde mit der von Vancomycin in einem akuten Infektionsmodel in Mäusen verglichen. S. aureus Smith wurde über Nacht unter moderater Bewegung in Veal Infusion Broth (Difco) kultiviert und in Broth, die 5% Mucin aus dem Schweinemagen (Difco) enthielt, verdünnt. Männliche Swiss-Webster-Mäuse (Taconic Farms, Germantown, NY), die etwa 20 Gramm wogen, wurden intraperitoneal mit 10⁵-10⁶ lebensfähigen Zellen infiziert, etwa das zehnfache des Inokulums, das reproduzierbar alle unbehandelten Tiere innerhalb 48h tötet. Es waren sechs Mäuse in jeder Behandlungsgruppe. Lysostaphin wurde intravenös (in 0,1 ml 5% Dextrose für die Injektion) oder subkutan (in 0,2 ml) innerhalb 10 min nach der Infektion verabreicht. Vancomycin wurde subkutan verabreicht.
Wie in Tabelle 2 gezeigt schütze Lysostaphin 100% der infizierten Mäuse, wenn es mit einer Dosierung von 0,16 mg/kg intravenös oder mit einer Dosierung von 2,5 mg/kg, bei subkutaner Verabreichung, verabreicht wurde. Vancomycin, das in der Maus subkutan vollständig bioverfügbar ist, und eine ähnliche Aktivität hat, ob es subkutan oder intravenös gegeben wird, war zu 100% bei einer Dosierung von 2,5 mg/kg wirksam. Alle unbehandelten Mäuse starben in weniger als 24 Stunden. Lysostaphin
Tabelle 2. Wirksamkeit von Lysostaphin gegen S. aureus-Infektionen in Mäusen
Dieses Beispiel zeigt, dass Lysostaphin gegen eine S. aureus-Infektion in einem akutem Infektionsmodell in Mäusen unter Verwendung einer hochvirulenten Bakteriendosis als Herausforderung wirksam ist. Wenn die Verabreichung intravenös erfolgte, waren äußerst geringe Dosen des gereinigten rekombinanten Lysostaphins wirksam. Auf einer Gewichtsgrundlage war Lysostaphin 16-mal so wirksam wie Vancomycin; auf einer molaren Grundlage war Lysostaphin etwa 200-mal so wirksam wie Vancomycin.
Beispiel 3
In vitro- und in vivo-Aktivität einer Lysostaphinenzymvariante
Es wurde ein Bacillus sphaericus-Stamm, der das geklonte Lysostaphingen enthält, beschrieben in dem U.S. Patent Nr. 4,931,390, mit N,N-Nitrosoguanidin mutagenisiert. Die überlebenden Kolonien wurden auf die Präsenz einer lytischen Aktivität untersucht, indem sie auf einem Rasen aus hitzeabgetöteten Zellen des S. aureus-Stamms RN4880 ausplattiert wurden und über Nacht bei 32°C inkubiert wurden. Kolonien, die signifikant klare Zonen produzierten, wurden bewahrt.
Einer diese Klone wurde weiter charakterisiert. Das Lysostaphingen wurde sequenziert und es wurde herausgefunden, dass es eine einzige G- nach A-Mutation in dem Codon enthielt, das der Position 218 des maturen Lysostaphinproteins entspricht, was zu einer Codonveränderung von GGT (Glyzin) zu GAT (Asparaginsäure) führt. Die Fermentation dieses Mutantenstamms produzierte ausreichend Material für in vitro und in vivo-Tests.
Wie in Tabelle 3 gezeigt, war die Enzymvariante hoch wirksam gegen S. aureus in vitro, obwohl das wildtyp Lysostaphinpräparat etwas mehr wirksam war. In diesem Experiment wurden die MICs mittels Broth-Makroverdünnungen in 1 ml Endvolumina in Glasröhrchen bestimmt. Ansonsten war die Methodologie wie oben beschrieben. Tabelle 3. Aktivität von variantem Lysostaphin gegen S. aureus in vitro

^cklinisches Isolat; ^m methicillinresistent

Wie in Tabelle 4 gezeigt ist war die Lysostaphinenzymvariante auch in einem akuten Mausinfektionsmodel gegen S. aureus hoch aktiv. Auch hier wiederum war die Variante etwas weniger aktiv als das wildtyp Lysostaphin, sie war aber mehr aktiv als Vancomycin.
Tabelle 4. Aktivität von variantem Lysostaphin gegen S. aureus in vitro
Beispiel 4
Antimikrobielle Aktivität in dem Serum von einem Kaninchen, das mit Lysostaphin behandelt wurde
Einem weißen Neuseelandkaninchen, das ungefähr 5 kg wog, wurde eine intravenöse Infusion von 125 mg Lysostaphin gegeben. Es wurden Blutproben in Intervallen von bis zu 4 h entnommen und das Serum hergestellt; es wurden zweifache serielle Verdünnungen gemacht und bakteriziden Titer des Serums gegen einen methicillinresistenten S. aureus-Stamm (MRSA 27619) bestimmt. Der bakterizide Titer des Serums ist die höchste Verdünnung, die 99,9% des Inokulums in 24 h abtötet. In diesem Test wurde das Uberleben der Bakterien im Wesentlichen wie in dem minimalen bakteriziden Verfahren bestimmt, mit Ausnahme, dass die Mikrotiterlöcher verschiedene Verdünnungen des Serums und nicht verschiedene Konzentrationen einer Lösung eines gereinigten antimikrobiellen Mittels enthielten.
Wie in Tabelle 5 gezeigt enthielt das Serum hohe bakterizide Konzentrationen von Lysostaphin über die gesamte Zeitspanne hinweg. Insbesondere zu den Zeitpunkten 30 Minuten bis 120 Minuten war der Titer größer als 1:256 (die höchst getestete Verdünnung), was anzeigt, dass Verdünnungen von wenigstens 256-fach immer noch in der Lage waren 99,9% der Bakterien abzutöten. Zum spätesten Zeitpunkt, 240 Minuten, war der Titer 1:64.
Tabelle 5. Bakterizide Titer des Serums von Lysostaphin nach der Verabreichung von 125 mg an ein 5 kg Kaninchen
Dieses Beispiel zeigt, dass Lysostaphin die bakterizide Aktivität in dem Kaninchenserum aufrechterhält und dass es vorhanden und im Kreislauf für wenigstens 4 Stunden nach der Injektion aktiv bleibt.
Beispiel 5
Wirksamkeit von Lysostaphin gegen eine experimentelle Endokarditis in Kaninchen
Es wurde in weißen Neuseeland-Kaninchen, die etwa 3 kg wogen, eine Aortenklappenendokarditis etabliert. Die Kaninchen wurden anästhesiert und die rechte Karotidarterie operativ freigelegt und mit einem Polyethylenkatheter eine Kanüle gelegt, der in das linke Herzventrikel vorgeschoben wurde. Nach wenigstens 24h wurden die Kaninchen intravenös mit 10⁶-10⁷ Zellen eines methicillinresistenten S. aureus-Stamm (MRSA 27619) infiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Tiere zufällig verschiedenen Behandlungsgruppen zugewiesen: unbehandelte Kontrolle (9 Kaninchen); Positivkontrolle, Vancomycin 30 mg/kg zweimal täglich (15); Lysostaphin 5 mg/kg dreimal täglich (11); Lysostaphin 5 mg/kg einmal täglich (10); Lysostaphin 5 mg/kg einmal täglich + Vancomycin 30 mg/kg zweimal täglich (11). Alle Kaninchen, deren Infektion nicht durch eine Blutkultur vor der Behandlung bestätigt wurde, wurden eliminiert. Zusätzlich wurden bei allen Kaninchen, die in die Analyse eingeschlossen wurden, durch Autopsie bestätigt, dass sie eine etablierte Endokarditisinfektion gehabt haben, beurteilt durch die Anwesenheit einer Aortenvegetation, die eine angehende oder zuvor existierendes Erkrankungsstadium indiziert.
Alle Behandlungen waren intravenös und wurden für drei Tage durchgeführt. Der Gesundheitszustand der Kaninchen wurde in Intervallen beurteilt. Drei Kaninchen wurde 18 h nach der letzten Behandlung getötet. Die Aortenvegetationen wurden entfernt, gewogen und weiter verarbeit, um die die Zahl der lebensfähigen Bakterien zu bestimmen, die als der log₁₀CFU/Gramm ausgedrückt wurde. Die Nachweisgrenze ist 10² CFU/Gramm (log₁₀CFU/Gramm = 2,0). Die mittleren Bakterientiter pro Gramm wurden durch eine einfaktorielle Varianzanalyse verglichen. Der Student-Newman-Keuls-Test wurde verwendet, um sie für multiple Vergleiche anzugleichen. Der Vergleich für die Sterilisationsraten wurde unter Verwendung des Fisher-Test gemacht. Die statistische Signifikanz wurde als der p-Wert von < 0,05 definiert.
Wie in Tabelle 6 gezeigt, war eine Kur von 5 mg/kg Lysostaphin dreimal täglich die wirksamste Behandlung. Eine beeindruckende Statistik ist, dass diese Behandlung die Herzklappenvegetation in allen außer einem der Kaninchen vollständig sterilisierte. Dies war weit besser als die Standardkur, die als eine Positivkontrolle in diesem Infektionsmodel verwendet wurde: 30 mg/kg Vancomycin zweimal täglich. Eine Kur mit 5 mg/kg Lysostaphin einmal täglich war weniger wirksam als die dreimal tägliche Kur, war aber beinahe so gut wie Vancomycin bei der Reduktion der Bakterienzahlen in der Vegetation; tatsächlich war die Wirkung statistisch von der Vancomycin-Gruppe nicht unterschiedlich. Die einmal tägliche Lysostaphin-Kur erreichte auch eine vollständige Sterilisation der Vegetationen in einigen Tieren. Die Zugabe von Lysostaphin einmal täglich zu der Standard-Vancomycin-Kur erzeugte eine drastische Verminderung der mittleren Bakterienzahl auf beinahe den Level, der mit den dreimal täglichen Lysostaphinbehandlungen gesehen wurde. Jedoch in Bezug auf die Zahl der Vegetationen, die vollständig sterilisiert wurden, war die dreimal tägliche Lysostaphin-Kur eindeutig besser als alle anderen. Tabelle 6. Wirksamkeit von Lysostaphin gegen eine S. aureus-Endokarditis in Kaninchen

^ap < 0,05 verglichen mit der unbehandelten Kontrolle; ^bp < 0,05 verglichen mit Vancomycin; ^cp = 0,008 vs Lysostaphin einmal täglich + Vancomycin

Es wurden auch Nierenabszesse auf die Präsenz von Staphylococcen hin beurteilt. Eine dreitägige Kur mit Lysostaphin reduzierte die bakterielle Belastung dramatisch, verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe, auf etwas mehr als 10² CFU/Gramm Gewebe in der Lysostaphingruppe, verglichen mit etwas unter 10⁸ CFU/Gramm in den Kontrollen.
Die Beobachtung der Tiere zeigte, dass die Kaninchen, die mit der dreitägigen Lysostaphinkur behandelt wurden alle früh im Behandlungszyklus bei guter Gesundheit waren.
Diese Ergebnisse konnten auf der Grundlage früherer Experimente nicht vorhergesehen werden. Insbesondere die Sterilisation von nahezu allen Vegetationen wurde mit niemals zuvor mit irgendeinem anderen antimikrobiellen Mittel in diesem Infektionsmodel gesehen oder davon berichtet. Die Tatsache, dass die Sterilisation innerhalb einer relativ kurzen Behandlungsperiode von 3 Tagen geschah, zeigt an, dass Lysostaphin sehr schnell in vivo wirkt und dass die antimikrobiellen Lysostaphinanalogons außerordentlich das Ergebnis für die Patienten mit ersten Staphylococceninfektionen verbessern könnten, die eine schnelle Reduktion der bakteriellen Belastung benötigen.
Die oben genannten Daten zeigen die Wirksamkeit von Lysostaphinanalogons gegen S. aureus, einschließlich der von MRSA (methicillinresistenter S. aureus). Stämme, die sowohl methicillinresistent als auch resistent gegenüber Vancomycin sind, sind ein neu aufkommendes Problem. Eine Stammvariante dieses Typs wurde nach Wachstumszyklen in einem Glykopeptid-enthaltenden Medium ausgewählt. Die Vancomycin MIC für den resultieren Stamm war 8 μg/ml, wie es auch für die natürlich vorkommenden VISA-Stämme berichtet wurde, die aus Patienten in den U.S. und Japan isoliert wurden. (Centers for disease Control and Prevention, Morbidity and Mortality Weekly Report 1997; 46:813-815). Von den Staphylococcenisolaten wird angenommen, dass sie gegenüber Vancomycin empfindlich sind, wenn die MIC weniger oder gleich 4 μg/ml ist, und dass sie vollständig resistent sind, wenn die MIC größer oder gleich 32 μg/ml ist (National Commitee for Clinical Laboratory Standards, 1993. Approved Standard M2-A5. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests – Fünfte Auflage. National Commitee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA.) Wie in Tabelle 7 gezeigt war Lysostaphin bei der Behandlung von Kaninchen mit einer infektiösen Endokarditis wirksam, verursacht durch den Methyicillin-resistenten VISA-Stamm. Tabelle 7. Wirksamkeit von Lysostaphin gegen eine Endokarditis in Kaninchen, verursacht durch einen methicillinresistenten VISA-Stamm von S aureus

^*Ausgedrückt als der log 10 des Mittels
^**signifikant besser als Vancomycin oder die geringere Dosis von Lysostaphin (p < 0,05)

Gegen den VISA-Stamm war Lysostaphin mit 5 mg/kg dreimal täglich genauso wirksam wie Vancomycin bei der Verminderung der bakteriellen Belastung der Aortenvegetationen. Lysostaphin mit 15 mg/kg zweimal täglich war wirksamer als die Standarddosierungskur von Vancomycin (statistisch signifikant) und war auch signifikant wirksamer als Lysostaphin mit 5 mg/kg, das dreimal täglich verabreicht wurde. Darüber hinaus konnte Vancomycin sogar mit 30 mg/kg zweimal täglich keine vollständige Sterilisation Herzklappenvegetationen in irgendeinem der getesteten Tiere erreichen. Auf der anderen Seite wurde eine vollständige Sterilisation mit einer dreimal täglichen Lysostaphinkur in einigen Tieren erreicht.
Das Kaninchenendokarditismodel ist nur sehr gut standardisiert und als ein rigoroser Test für die Fähigkeit von antimikrobiellen Mitteln akzeptiert, um ernste humane Infektionen zu kurieren. Frühere Arbeiten mit Lysostaphin in etablierten Infektionen zeigten eine limitierte Reduktion der bakteriellen Belastung in Nieren in einem Mausmodell und den Herzklappen und anderen Organen in einem Endokarditismodel im Hund, wobei Dosen verwendet wurden, die von 50 bis 250 mg/kg/Behandlung reichten. Trotz der hohen Dosierungen, die in diesen vorhergegangenen Untersuchungen verwendet wurden, wurde keine Wirksamkeit in der Größenordnung beobachtet, wie sie bei der Behandlung von schweren Staphylococceninfektionen benötigt wird. Die Ergebnisse, die früher erhalten wurden, hätten nicht zu der Vorhersage der schnellen, vollständigen Sterilisation nahezu aller Herzklappenvegetationen geführt, wie es nun unter Verwendung moderater Lysostaphindosen in dem Kaninchenendokarditismodel gesehen wurde.
Die Ergebnisse, die hierin präsentiert werden, demonstrieren nicht nur die unerwartete Wirksamkeit von Lysostaphin gegen eine S. aureus-Endokarditis, sondern auch zeigen auch, dass eine solche Wirksamkeit weit besser ist, als die für die Standardverfahren erwartete Wirksamkeit. Derzeitig erhältliche Behandlungen sind häufig nicht wirksam für den Umgang mit lebensbedrohlichen Infektionen, die zu irreversiblen Gewebeschäden führen können, und deshalb eine schnelle Reduktion der Bakterienzahl benötigen, um einen solchen Schaden sowie eine metastatische Ausbreitung der Infektion auf andere lebenswichtige Organe vorzubeugen. Die oben genannten Ergebnisse zeigen an, dass Lysostaphinanalogons, alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, das Potential für eine Wirksamkeit in der Behandlung solcher Infektionen haben. Ferner, basierend auf diesen Ergebnissen und auf der in vitro-Aktivität von Lysostaphin gegen Staphylococcen, wird erwartet, dass Lysostaphinanalogons, alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, nützlich gegen andere Staphylococcenspezien S. aureus als sein werden nützlich sein werden. Unter diesen Mitteln, die dafür geeignet sind zusammen mit Lysostaphin verwendet zu werden, sind Vancomycin und andere Glykopeptide, Rifampin und andere Rifamycine, und andere antiinfektiöse Mitteln, die eine Aktivität gegen Staphylococcen haben.
Die Lysostaphinanalogons können nicht nur bei der Behandlung einer staphylococcalen Endokarditis verwendet werden, sondern auch bei anderen potentiell letalen Staphylpcoccen-Erkrankungen, wie eine Bakteriämie und Infektionen von anderen lebenswichtigen Organen wie Nieren, Lunge, Haut und Knochen. Die vorliegenden Verfahren sind auch auf die Behandlung von Infektionen von Verbrennungen, Wunden und Prothesevorrichtungen anwendbar. Diese selben Verfahren können insbesondere bei der Behandlung von Erkrankungen wie einer Osteomyelitis verwendet werden, die von einem Infektionstyps oder -schwere herrühren, sodass eine anhaltende Behandlung mit derzeitig verwendeten antimikrobiellen Mitteln benötigt wird. Die vorliegende Erfindung dehnt sich ferner auf die Verwendung von Lysostphinanalogons bei der Behandlung solcher Infektionen und Erkrankungen aus, wenn sie durch Staphylococcen verursacht werden, die resistent gegenüber routinemäßig verwendeten Antibiotika sind.

Claims

Verwendung von Lysostaphin oder einer Variante davon, welche die Fähigkeit des Lysostaphins beibehält proteolytisch glyzinhaltige Brücken in dem Zellwandpeptidoglycan von Staphylococcen anzugreifen, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur parenteralen Verabreichung an Menschen, um Staphylococceninfektionen zu behandeln, die zumindest teilweise gegenüber Vancomycin resistent sind, wobei die Verabreichung in einer Dosierung erfolgt, die als aufgeteilte Dosen gegeben wird, um so eine einzelne Verabreichung auszuschließen.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Verabreichung eine Dosierung von 0,5 bis 200 mg/kg/Tag ist, verabreicht als aufgeteilte Dosen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Behandlung die Verabreichung von 3 bis 50 mg/kg/Tag umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die Behandlung die Verabreichung von 3 bis 25 mg/kg/Tag umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in welchen die Dosen in zwei bis vier Dosen pro Tag aufgeteilt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in welchen die Dosen als eine kontinuierliche Infusion verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, in welcher jede Dosis nicht 50 mg/kg übersteigt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Behandlung die Verabreichung des Lysostaphins oder einer Variante davon zusammen mit wenigstens einem anderen antimikrobiellen Mittel umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 8, worin das andere antimikrobielle Mittel ein Rifamycin oder ein Glycopeptid ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Infektion eine Herzklappen-, Blut-, Nieren-, Lungen-, Knochen- oder Hirnhautinfektion ist oder mit einem Katheter oder einer Prothesevorrichtung assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 10, worin die Infektion eine Endokarditis, Osteomyelitis oder Bakteriämie ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die parenterale Verabreichung durch eine intravenöse Injektion erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Lysostaphin oder die Variante davon rekombinant hergestellt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Infektion durch einen Staphylococcus aureus-Stamm vorliegt, der methicillinresistent ist und eine intermediäre Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin hat.