CN1269727A - 供治疗葡萄球菌感染的只含溶葡萄球菌素或含溶葡萄球菌素和抗生素的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

溶葡萄球菌素显示出是一种强有效的抗葡萄球菌制剂,它适合非胃肠道给予包括人体的哺乳动物。低剂量,级别为0.5—45mg/kg/天足以根除大多数葡萄球菌感染。溶葡萄球菌素也能抵抗诸如青霉素和万古霉素的常规的抗生素有耐药性的细菌。溶葡萄球菌素类似物,如变体和相关的酶显示出相似的活性。

Description

供治疗葡萄球菌感染的只含溶葡萄球菌素或 含溶葡萄球菌素和抗生素的药物组合物
                         发明背景
发明领域
本发明涉及给予溶葡萄球菌素治疗哺乳动物，包括人体，的葡萄球菌感染，和在所述治疗中使用的药物制剂。本发明也涉及治疗特定的疾病，包括葡萄球菌心内膜炎、葡萄球菌菌血症；和肾脏、肺部、皮肤、骨骼、烧伤、创伤和假体设备的葡萄球菌感染。本发明还涵盖了广义的溶葡萄球菌素，不仅包括野生型溶葡萄球菌素，而且包括重组溶葡萄球菌素的应用；溶葡萄球菌素变体是其氨基酸序列由于基因突变(如取代、加成和删除)、转录后加工、嵌合融合蛋白的基因工程等而从成熟肽的公开的“天然序列”(美国专利4,931,390)中变化的变体或这些变体的组合。
现有技术背景
溶葡萄球菌素是一种酶，首先在假葡萄球菌(Staphylococcus simulans)(以前称为S.staphylolyticus)里发现，依靠它对细菌的细胞壁肽葡聚糖里含甘氨酸的桥键的蛋白分解活性显示出抗微生物活性[Zygmunt等，Progr.Drug Res.16：309-333(1972)]。
在体外，溶葡萄球菌素对金黄色葡萄球菌特别有活性，因为该类细胞壁里的桥键含高比例的甘氨酸，但对其它葡萄球菌也有活性(同上)。
在动物感染模型里检查溶葡萄球菌素的活性。腹腔内感染后用腹腔内治疗的研究与体外实验相似，在此不作考虑。有两个报道述及，当动物患有腹腔内感染后，单剂皮下给予或多剂皮下给予总共约1毫克/千克溶葡萄球菌素制剂时，50％小鼠存活[Schuhardt等，J.Bacteriol.88：815-816(1964)；Harrison等，加拿大微生物杂志，13：93-97(1967)]。据报道，在这些研究中总剂量6毫克/千克能保护100％小鼠存活[Harrison等，同上]。用于两个研究里的细菌毒力似乎相当低，因为未治疗的感染小鼠在短期里根本不死亡。
一些实验使用了小鼠亚急性模型，测量用金黄色葡萄球菌的Giorgio菌株感染后负载在肾脏里的细菌[Dixon等，Yale J.Biol.Med.41：62-68(1968)；Schaffner等，Yale J.Biol.Med.39：230-244(1967)；Harrison等，Bacteriol。93：520-524(1967)]。当溶葡萄球菌素制剂在感染后6小时里静脉给予时，在1.5毫克/千克剂量或更高剂量下细菌数明显减少。但是，已有的感染较难控制；当停止治疗后24小时或更长的时间后，即使用125或250毫克/千克溶葡萄球菌素制剂治疗，也只适度减少细菌数。
一个研究(Goldberg等，Antimicrob.Chemother.1967：45-53(1967))在一种非普通的心内膜炎模型里使用有限数量的狗。狗模型尚没有进一步的发展。Goldberg等实验不可比，因此能有限地用来评价溶葡萄球菌素的给药。但是，通过判定狗的健康和心脏瓣膜和肾脏里的细菌数的减少，发现高剂量的溶葡萄球菌素(至少50毫克/kg/治疗)只适度有效。
因此，从现有技术用动物模型研究得到的数据未提示使用溶葡萄球菌是有效的，并能清除各个器官里的感染。
进行有限的人体试验，其目的是通过对鼻孔局部外用溶葡萄球菌素可以防止鼻子成为金黄色葡萄球菌的带菌体[Martin等，J.Lab.Clin.Med.70：1-8(1967)；J.Lab.Clin.Med.71：791-797(1968)；Quickel等Appl.Microbiol.22：446-450(1971)]。鼻子带菌本身不是疾病状态。但它对集中护理治疗的病人感染或对集中护理病人的自身感染构成了危险的因素。
本技术领域报道，用单剂非胃肠道给药的溶葡萄球菌素，三天后用抗生素庆大霉素治疗病重的病人。病人死亡，但其菌血症减轻(Stark等，N.Engl.J.Med.291：239-240(1974)]。
在动物和人体研究期间观察到的致免疫的现象引起了人们的极大关注。溶葡萄球菌制剂被外来物质污染可能与这些现象中的至少一些有关。
没有进一步开发出作为治疗剂的酶，因为在所讨论的研究里缺乏所需的有效性。这可能进一步由于生产和纯化溶葡萄球菌素的难度较大。
业已对溶葡萄球菌素的葡萄球菌基因进行了编序和克隆(美国专利4,931,390)。通过发酵Bacillus sphaericus非致病重组菌株来制备实验室使用的试剂，这较易于纯化。
本技术领域人员仍然在致力于开发能非胃肠道给药并可用来治疗葡萄球菌感染以及特定的组织感染，如心内膜炎的治疗剂。
发明综述
通过非胃肠道给予相对低剂量溶葡萄球菌素(50毫克/千克以下)能明显有效地治疗葡萄球菌感染，特别是耐药的感染，和/或典型地与发病率和死亡率有关的感染。进一步的是，溶葡萄球菌素显示出能有效地抗葡萄球菌，所述的葡萄球菌至少部分对现有的抗微生物剂，如β-内酰胺抗生素，包括青霉素酶稳定的青霉素、万古霉素等有耐药性。
本发明进一步包括结合疗法，所述的疗法包括交替或同时给予溶葡萄球菌素和一种或多种其它抗微生物剂。特别优选的与本发明溶葡萄球菌一致给药的抗生素是利福霉素(从微生物中分离得到，或合成或半合成地生产，如利福平)和糖肽(一组分子，其中天然形成的分子通常含一种七肽和一种或多种糖部分)，所述的糖肽可为天然形成和分离得到的(如万古霉素，替考拉宁等)或是半合成制剂。
克隆、重组和变体的溶葡萄球菌素的可利用性进一步扩展了本发明。已识别出了相关的酶，它可与溶葡萄球菌素一起使用或替代溶葡萄球菌素。
对溶葡萄球菌素基因的克隆和序列化涉及分离性质与野生型溶葡萄球菌素相似或不同的变体酶。一个这类改变的酶具有单个氨基酸改变，它由我们的研究得到，已对其作了特征化，并在体外和动物感染模型里显示有效的抗葡萄球菌活性。
其它的溶葡萄球菌素类似物包括序列与溶葡萄球菌素相同并具有内肽酶活性的天然形成的酶，或甚至是通过使一种酶的结合阈与另一个催化阈融合得到的嵌合酶，它们也是能治疗难以治疗的、由葡萄球菌或其它致病细菌引起的细菌疾病的有效制剂。
附图简述
图1是与万古霉素相比，溶葡萄球菌素对耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌株的杀菌活性的表示图。
图2是反映了溶葡萄球菌素对耐不同抗微生物剂的各种金黄色葡萄球菌的杀菌活性的图。
定义
用于本申请的术语含义与通常一般使用时的含义相同。某些术语用来揭示一类作用或化合物，以提供逻辑上能成组的项目或科学现象的一般描述。
溶葡萄球菌素类似物-任何酶，包括溶葡萄球菌素(野生型)、任何溶葡萄球菌素突变体或变体、任何保留了分解蛋白能力的相关酶，所述的酶能体内或体外对葡萄球菌的细胞壁肽葡聚糖里的含甘氨酸的桥键进行蛋白分解。通过对蛋白质(存在于发生菌株里的酶或通过在加工的任何阶段引入的酶或试剂)进行转录后加工，或通过使结构基因进行突变产生变体。突变包括位点删除、插入、除去阈和替换突变。本发明里的溶葡萄球菌素类似物可重组表达或用别的方式表达。
非胃肠道给药-通过注射给药，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、眼窝里注射、脊椎注射、腹腔内注射和直接输液，或通过注射(如髓内注射)释放到组织或器官。
发明详述
金黄色葡萄球菌是高度致命的人类病原体。它引起了各种人体疾病，从皮肤感染到威胁生命的菌血症和至关重要的器官感染。若不迅速控制，金黄色葡萄球菌感染会迅速从感染的原发位置扩展到其它器官。虽然感染没有特别的集中点，但特别易于感染的器官包括心脏瓣膜、肾脏、肺部、骨骼、脑膜和烧伤病人的皮肤。手术或创伤和有外来物存在的任何区域也易于感染。这些由于接触或在医院里逗留的感染是发病率和死亡率高的原因，即使使用了最佳的治疗，在特定的人群中会高达60％严重感染。其它种类的葡萄球菌(诸如S.epidermidis的凝固酶阴性的葡萄球菌)致命性较差，但会混入插管或假体装置；这在装置是移植的心脏瓣膜时会有毁灭性的结果。
在葡萄球菌里对现有抗微生物剂有耐药性似乎特别容易，金黄色葡萄球菌开始对青霉素有耐药性；该耐药性在抗生素时代开始后即迅速出现。事实上所有的葡萄球菌感染，不论是公众接触或医院里患的感染，由于产生了青霉素酶不再对第一代青霉素敏感；对青霉素酶稳定的青霉素(如甲氧苯青霉素)也有耐药性的菌株也有很大的问题，特别是在医院里获得的感染。[疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)，1997.金黄色葡萄球菌对万古霉素敏感性减少(Reduced susceptibility ofStaphylococcus aureus to vancomycin)--日本，1996。发病率和死亡率每周报道46：624-626(1997)。]
葡萄球菌感染的首选治疗是万古霉素，特别是在医院里的治疗。但是，从高死亡率可见，对于某些疾病，如金黄色葡萄球菌性心内膜炎和菌血症，它们需要迅速地减少细菌数以防止对心脏和通过血液扩散使其它器官感染而发生不能逆转的损伤，目前的治疗均不理想。目前不能有效治疗的一个原因是它们的作用，特别是体内作用相当慢，感染的部位需要迅速杀菌以使病人迅速康复。在这样危及生命的情况下，和在一些其它感染中(诸如骨髓炎，其中的治疗方案很冗长)，新颖的疗法或新的组合疗法大大地改善了疾病的结果。
业已发现，溶葡萄球菌素在中等剂量下活性很高。下面显示了在很严重的特征性很强的动物感染模型里，由耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的兔子的心内膜炎。特别是，我们显示，在用本发明剂量方案治疗的几乎所有动物中对心脏瓣膜完全杀菌，而用目前可得的抗微生物剂则没有新奇的结果。我们在此进一步显示，即使很低每日剂量溶葡萄球菌素与标准治疗剂组合能加强该模型系统里抗微生物活性。
我们使用的溶葡萄球菌素剂量明显地低于以前显示的对动物模型的器官上的细菌只有有限清除效果的剂量[Zygmunt等，Progr.Drug.Res.16：309-333(1972)；Goldberg等，Antimicrob.Ag.Chemother.1967：45-53(1967)]。
我们在下面也显示了对体外和小鼠急性感染模型里，由携带溶葡萄球菌素的Bacillus sphaericus的重组菌株突变产生的溶葡萄球菌素改变形式产生的抗葡萄球菌的活性。因此，本发明的另一方面涉及给予溶葡萄球菌素类似物的药物制剂，所述的类似物是溶葡萄球菌素或具有肽葡聚糖内肽酶活性的其它酶，包括含一个或直到五个氨基酸发生取代的基因修饰酶；有直到10个氨基酸发生删除或插入，包括发生在N-末端上的删除和插入的酶；或由不同酶的催化阈和结合阈的融合得到的嵌合酶等作为治疗剂来治疗人体或动物的感染。
例如，已揭示了另一种甘氨酰甘氨酸内肽酶(来自Staphylococcus capitisEPK1的ALE-1)。ALE-1不同于溶葡萄球菌素，但两种酶具有相当多的氨基酸相同(Sugai等，J.Bacteriol.179：1193-1202(1997)]。另一种与溶葡萄球菌素的相同程度低、当也具有内肽酶活性的肽葡聚糖水解酶是zoocin A，由Streptococcus zooepidemicus 4881产生[Simmonds等，应用和环境微生物学62：4536-4541(1996)；Simmonds等，基因(Gene)189：255-261(1997)]。嵌合蛋白可通过使这些酶或相似酶的一个阈与溶葡萄球菌素类似物的一个阈融合来制备。
虽然在早期研究中观察到的某些免疫副作用有些场合下会考虑，但其它场合(如紧急或短期场合)用通过发酵无害的细菌重组菌株得到的溶葡萄球菌素类似物的适当纯的制剂被希望不易诱发免疫副作用或其它副作用。
这些抗微生物酶的有效药剂包括水溶液或无水制剂(如，冻干、结晶或无定形的制剂，有或没有另外的溶剂供渗透平衡)供与液体再构建适合活性剂非胃肠道释放。释放优选地通过静脉注射(i.v.)、肌肉注射(i，m.)、皮下注射(s.c)或腹腔内注射(i.p.)途径，或囊内给药或吸入给药或通过直接滴注入感染部位，使血液和组织水平超过活性剂最小的抑制浓度(MIC)，这样能有效地降低细菌滴度，以治愈或减轻感染。
此外，活性溶葡萄球菌素类似物可与其它抗微生物剂同时或交替地共同给药，以更有效地治疗感染疾病。制剂可配制成或再构成，小体积适合静脉注射或外周注射的液体，或加到大体积的静脉滴注溶液里，或再构成大体积以通过静脉输液给予。与溶葡萄球菌素或其它抗微生物酶一起给予的制剂可与所述的酶一起进行混合组合来配制，或在所得的制剂里用公知的使这些制剂在感染部位的浓度达到合适水平的给药途径即席地使用。
溶葡萄球菌素的合适剂量和给药方案随着感染的严重程度和感染机体的敏感程度而改变，对于结合疗法，可根据组合里使用的特定的抗微生物剂而定。剂量范围是0.5-200mg/kg/天，优选的是3到25-50mg/kg/天，单剂或分次剂量给予，优选的是连续输液，或每天分成两次或四次剂量。
实施例
如Recsei(美国专利4,931,390)所述，用重组B.sphaericus菌株发酵产生含溶葡萄球菌素基因的溶葡萄球菌素类似物或其突变体来进行所有的实验。特别是，通过使B.sphaericus发酵制备的溶葡萄球菌素类似物不同于在N-末端有多达2个或直到2个另外的氨基酸的公开序列。
特别是，本文是数据来自用重组产生的溶葡萄球菌素类似物的制剂，其中大部分组分没有公开序列的两个N-末端氨基酸的组分。但是，发现不局限于这些制剂。任何有适当纯度和活性的制剂都能得到相似的结果。
实施例1
溶葡萄球菌素的体外活性
如表1a所示，实验显示溶葡萄球菌素制剂是活性的，能体外杀灭金黄色葡萄球菌的临床分离物；用标准肉汤微稀释方法(临床实验室标准的国家委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards)，1993)测得的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)≤1.0微克/毫升[临床实验室标准的国家委员会，1993。应用标准M7-A3。对需氧生长的细菌的稀释抗微生物剂的敏感性试验方法-第三版。临床实验室标准的国家委员会，美国宾夕法尼亚；临床实验室标准的国家委员会，1992。试验指南M26-T。测定抗微生物剂杀菌活性的方法。临床实验室标准的国家委员会，美国宾夕法尼亚]。
此外，溶葡萄球菌素显示能抵抗许多表皮(epidermidis)葡萄球菌分离物(凝固酶阴性种类)，对于13个被试验的临床分离物中的11个，其MIC≤8微克/毫升。MIC被定义为完全抑制细菌可见生长的最低浓度，MBC是暴露了24小时后杀死99.9％最初接种体的最低浓度。如表1a所示，对溶葡萄球菌素的易感性不被对甲氧苯青霉素和/或万古霉素的耐药性或降低的敏感性所影响。最近，美国也出现了对甲氧苯青霉素有耐药性且对万古霉素也只有中等易感性的金黄色葡萄球菌菌株[疾病控制和预防中心，发病率和死亡率每周道道199。46：813-815]。
  表1a  金黄色葡萄球菌对溶葡萄球菌素体外易感性的初步研究
      菌株     MIC(微克/ml)   MBC(微克/ml)
      1573c，m27916c，mCOLc，m450Mc，m402c404c，m41441227286c，m27698c，m27222c，m27287c，m27295c，m29293c，m27621c，m27622c，m27619VR*HP5827c，m，vHP5836c，m，v     0.5            10.25           0.50.13           0.250.25           0.50.5            0.50.5            0.50.25           0.250.25           0.250.25           0.50.25           0.50.25           0.250.25           0.250.13           0.250.06           0.250.06           0.250.06           0.250.5            0.50.5            0.50.5            1
c临床分离物；m耐甲氧苯青霉素物；vVISA菌株(对万古霉素有中等易感性)；*在实验室里派生自耐甲氧苯青霉素临床分离物，对万古霉素有中等易感性的菌株。
溶葡萄球菌素粘附于塑料材料上，会从溶液里失去；这会影响它的表观活性。因此，一些MIC测定也通过向稀释物里加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)来进行。否则，该方法与上述的是相同的。如表1b所示，在BSA存在下，溶葡萄球菌素对被试验菌株的体外活性改进了8到64倍。由于该观察涉及到溶葡萄球菌素对塑料材料的亲和力，预计葡萄球菌菌株对溶葡萄球菌素的易感性比已观察到的更高。
表1b.带有BSA和不带有BSA时溶葡萄球菌素对金黄色葡萄球菌的活性
    菌株      MIC(微克/毫升)
        有BSA    没有BSA
    417414404 c，m401 c27619c，m27295c，m27287c，m25756c，m             0.030.03                            0.250.008                           0.50.015                           0.50.008                           0.25≤0.004                         0.130.03                            0.250.008
c临床分离物；m耐甲氧苯青霉素
这些数据显示溶葡萄球菌素对多个抗生素有耐药性的金黄色葡萄球菌的临床分离物有极为有效的活性。
通过时间-杀死实验也研究了溶葡萄球菌素对金黄色葡萄球菌的杀菌活性。在该类型的一个实验里，将来自意大利Genoa的耐甲氧苯青霉素的临床分离物，金黄色葡萄球菌菌株AG461接种到Mueller-Hinton肉汤里(Difco)，在轻轻摇动、37℃下生长，直到每毫升有约108存活细胞(CFU/ml)，这用600 nm处的培养物的吸光度来测定。然后用新鲜肉汤将培养物稀释到约106CFU/ml，5毫升等分物放在数个不同的烧瓶里供暴露于不同浓度的抗菌素。继续轻轻振动、37℃下的培养，以一定的间隔取出样品来测定存活细胞。在消毒盐水(0.9％NaCl在蒸馏水里)里制备一系列10-倍稀释的样品，用琼脂包含的方法将0.1毫升合适稀释物的等分物一式两份地放在胰蛋白酶(Tryptic)大豆琼脂板(Remel)上。(在该方法中，等分物被加到2.5毫升顶部琼脂上，使之混合并倒在板上。顶部琼脂由熔融的胰蛋白酶大豆琼脂(Difco)构成，用Difco胰蛋白酶大豆肉汤稀释2-倍，得到最终的琼脂浓度为0.75％，w/v)。使板在36℃下培养24-48小时，人工数出菌落数。所有的溶葡萄球菌素稀释物在0.1-0.2％BSA存在下制备，以预防溶葡萄球菌素被塑料材料吸附。万古霉素(SigmaCHemical Co.)在无菌蒸馏水里稀释。
如图1所示，浓度为0.004-0.032微克/毫升的溶葡萄球菌素能快速杀菌，在接触后的一小时里至少99.9％细菌被杀死。在对比试验中，万古霉素的杀菌作用降低且慢得多，即使使用很高浓度的万古霉素(2和16微克/毫升)，接触三小时后几乎没有杀死什么细菌。所用的溶葡萄球菌素和万古霉素的不同浓度是它们各自MIC的一倍和八倍。
在另一个实验中(图2)，将金黄色葡萄球菌的三个不同的耐甲氧苯青霉素的临床分离物和第四菌株，27619VR，派生自耐甲氧苯青霉素临床分离物的实验室衍生出的“VISA”菌株(即对万古霉素具有中等的耐药性)接种入小心调节的Mueller-Hinton肉汤(Becton Dickinson)，在37℃下生长过夜。然后用新鲜肉汤稀释，在轻轻振动、37℃下培养，直到达到对数级的生长阶段。如图2所示，此时细菌滴度范围是2×106到9×107CFU/毫升。溶葡萄球菌素以1微克/毫升加到每个培养物里。以一定的间隔取出样品，用0.9％NaCl作系列稀释，通过喷在Mueller-Hinton琼脂(Becton Dickinson)上铺板。琼脂板在37℃度下培养48小时，人工数出菌落，如图2所示，所有的这些菌株能迅速地被溶葡萄球菌素杀死。
这些数据显示，溶葡萄球菌素对金黄色葡萄球菌同代的临床分离物，包括耐甲氧苯青霉素的菌株和同时耐甲氧苯青霉素和对万古霉素有中等耐药性的菌株，都有有效和迅速的杀菌活性。
动物模型研究
实施例2
溶葡萄球菌素在小鼠金黄色葡萄球菌感染模型里的对比效果
在小鼠的急性感染模型里，将溶葡萄球菌素的效果与万古霉素的相比。金黄色葡萄球菌Smith在小牛肉灌输肉汤(Difco)，并在含5％猪胃粘液素(Difco)里稀释，中等振摇培养过夜。对体重大约20克的雄性Swiss-Webster小鼠(Taconic农场，美国纽约)腹腔内注射105-106存活细胞，这约是在48小时里能再生地杀死所有未处理动物的接种物的10倍。在每个处理组里有6个小鼠。静脉注射溶葡萄球菌素(在0.1毫升5％右旋糖里供注射)或皮下注射(在0.2毫升里)，在10分钟里注射。皮下注射万古霉素。
如表2所示，静脉注射给予0.16mg/kg或皮下注射给予2.5mg/kg溶葡萄球菌素能100％保护感染小鼠。万古霉素对小鼠皮下给药是完全可生物利用的，不论皮下给予或静脉给予有相似的活性，在25毫克/kg剂量下100％有效。所有的未处理小鼠在不到24小时里都死亡。
表2溶葡萄球菌素对小鼠金黄色葡萄球菌感染的效应
   剂量(mg/kg)                     存活％
 静注溶葡萄球菌素  皮下注射溶葡萄球菌素  万古霉素
      00.080.160.310.631.252.551020      033100100100                                   067                83100               100100               100100100
该实施例显示，溶葡萄球菌素对用高致命的细菌剂量的小鼠急性感染模型里对抵抗金黄色葡萄球菌是有效的。当静脉给予，非常低剂量的纯的重组溶葡萄球菌素是有效的。以重量为基准，溶葡萄球菌素的有效性是万古霉素的16倍；以摩尔数为基准，溶葡萄球菌素的有效性是万古霉素的约200倍。
实施例3变化的溶葡萄球菌素酶的体外和体内活性
含美国专利4,931,390所述的克隆的溶葡萄球菌素基因的Bacillussphaericus菌株用N，N-亚硝基胍诱变。存活的克隆通过使它们在金黄色葡萄球菌菌株RN4880的热杀死细胞上铺板来筛选溶解活性，在32℃下培养过夜。保留产生明显澄清带的菌落。
这些菌落之一被进一步特征化。溶葡萄球菌素被编序列，发现在成熟溶葡萄球菌素蛋白质的相应位置218处含单个G-to-A突变，得到GGT(甘氨酸)到GAT(天冬氨酸)的编码改变。该突变菌株的发酵能产生体外和体内试验充足的物质。
如表3所示，变体酶在体外对金黄色葡萄球菌的活性很高，但野生型的溶葡萄球菌素制剂活性更大。在该实验中，通过在玻璃管中，在肉汤里稀释到最终体积1毫升时测量MIC。否则，用上述方法测量。
   表3变体溶葡萄球菌素抵抗体外金黄色葡萄球菌的活性
            MIC(微克/毫升)
  AG417    AG404c，m   AG402c   AG414
   Gly218Asp野生型溶葡萄球菌素   .03      .06          .06       .03.004     .008         .008      .004
c临床分离物；m耐甲氧苯青霉素
如表4所示，变化的溶葡萄球菌素酶在急性小鼠感染模型里对金黄色葡萄球菌也有很高的活性。变体比野生型溶葡萄球菌素的活性稍低，但它比万古霉素的活性大。
表4  变体溶葡萄球菌素对小鼠中金黄色葡萄球菌感染的活性
 剂量(毫克/kg)                     存活％
  对照    溶葡萄球菌素  Gly218Asp    万古霉素
     0    0
     0.040.080.160.310.631.252.5               017          083          173383           083100
实施例4
用溶葡萄球菌素处理的兔子血清里的抗微生物活性
对体重约5千克的新西兰白兔静脉输液125毫克溶葡萄球菌素。按间隔取血样，直到4小时，制备血清；制备2倍系列的稀释物，测定血清对金黄色葡萄球菌的耐甲氧苯青霉素菌株(MRSA 27619)的杀菌滴度。血清杀菌滴度24小时里杀死99.9％接种物的最高稀释度。在该试验里，除了微滴定坑里含不同稀释度的血清而不是不同浓度的纯化的抗微生物剂溶液外，基本上用最小杀菌方法测定细菌的存活性。
如表5所示，在整个试验期间，血清含很高杀菌浓度的溶葡萄球菌素。特别是，从30分钟到120分钟时间点上，滴度大于1∶256(被试验的最高稀释度)，这包括至少稀释256被仍能杀死99.9％细菌。在最后的时间点240分钟处，滴度为1∶64。表5对5千克兔子给予125毫克溶葡萄球菌素后血清的杀菌滴度
    开始输液后的时间(分钟)     血清杀菌滴度
    0     1∶128
    30     ＞1∶256
    60     ＞1∶256
    90     ＞1∶256
    120     ＞1∶256
    240     1∶64
该实施例显示，溶葡萄球菌素保留了兔子血清里的杀菌活性，在注射后能在循环里存在并保留活性达至少4小时。
实施例5
溶葡萄球菌素对兔子中实验性心内膜炎的效应
在体重约3千克的新西兰白兔里建立大动脉瓣膜心内膜炎。麻醉兔子，手术暴露右侧颈动脉，用聚乙烯插管插入心脏的左侧静脉。在至少24小时后，给兔子静脉注射106-107耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌菌株(MRSA 27619)。24小时后，动物被随机指派成不同的处理组：未处理对照(9个兔子)；阳性对照，万古霉素30毫克/kg，每天两次(15)；溶葡萄球菌素5毫克/kg，每天三次(11)；溶葡萄球菌素5毫克/kg，每天一次(10)；溶葡萄球菌素5毫克/kg，每天一次+万古霉素30毫克/kg，每天两次(11)。剔除未被治疗前血培养证实感染的兔子。另外，对包含在分析里的所有兔子进行解剖，通过动脉增殖体上进行性的或已存在的疾病状态来判断，以证实已患有心内膜炎感染。
所有的治疗都是静脉内给药，持续三天。按一定间隔评价兔子的健康状况。在最后的处理后18小时杀死兔子。取出大动脉增殖体，称重，测定存活的细菌数，表达为log10CFU/克。测定的限制是102CFU/克(log10CFU/克＝2.0)。每克细菌的平均滴度与单向分析的变量进行比较。Student-Newman-Keuls试验用来判断多个比较。用Fisher精确概率法比较小鼠的无菌化程度。统计学上有意义的被定义为p≤0.05。
如表6所示，每天给予溶葡萄球菌素三次是最有效的治疗。值得注意的统计数据是该处理能使一个兔子外的所有兔子的心脏瓣膜增殖体完全无菌。这远远优于该感染模型里作为阳性对照的标准方案：30毫克/kg万古霉素，每天两次。每天给予一次5毫克/kg溶葡萄球菌素不如每天给予三次的有效，但在减少增殖体上细菌数方面几乎与万古霉素的一样好；事实上，效果不是统计学上不同于万古霉素组。每天给予溶葡萄球菌素方案也可使一些动物的增殖体完全无菌。向标准的万古霉素方案里每天加入一次溶葡萄球菌素会明显降低平均细菌数，几乎可达到每天3次的溶葡萄球菌素治疗的水平。但是，就增殖体完全灭菌而言，每天三次的溶葡萄球菌素方案很清楚地优于其它所有的方案。
表6溶葡萄球菌素抵抗兔子中金黄色葡萄球菌性心内膜炎的效应
   处理    增殖体的平均log10CFU/克±标准衍生物  无菌增殖体数/总的被处理动物
   未处理对照       10.73±1.58          0/9
   万古霉素30毫克/kg每天两次       5.91±1.67a          0/15
   溶葡萄球菌素5毫克/kg每天一次       7.08±3.74a          2/10
   溶葡萄球菌素5毫克/kg每天三次       2.26±0.85a，b          10/11c
   溶葡萄球菌素5毫克/kg每天一次  +万古霉素30毫克/kg，每天两次       3.23±1.41a，b          3/11
ap＜0.05，与未处理对照比较；bp＜0.05与万古霉素相比；cp＝0.008相对于溶葡萄球菌素每天一次+万古霉素
在葡萄球菌的存在下也会发生肾脏脓肿。与未处理组相比每天三次给予溶葡萄球菌素会明显减少细菌，溶葡萄球菌素组只是稍高于102CFU/克组织，对照组是稍低于108CFU/克。
动物观察显示，在治疗循环早期用溶葡萄球菌素每天治疗三次，所有的兔子都呈良好的健康状态。
这些结果在以前研究的基础上是不可预见的。特别是，从没见过或报道过在该感染模型里用任何抗微生物剂可使所有的增殖体无菌。在治疗期间相当短的时间里，3天里，发生灭菌的事实表明，溶葡萄球菌素体内的作用极为迅速，这也提示，抗微生物的溶葡萄球菌素类似物能大大地改进患有严重葡萄球菌感染，需要迅速减少细菌负载的病人的治疗效果。
上述数据显示了溶葡萄球菌素类似物对金黄色葡萄球菌，包括MRSA(耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌)的作用。对甲氧苯青霉素和万古霉素都有耐药性的菌株已成为新的问题。在含糖肽的介质里生长循环后选择该类型的变体菌株。万古霉素对该所得的菌株的MIC为8微克/毫升，如所报道的，在美国和日本，也对于从病人分离得到的天然形成的VISA菌株。(疾病控制和预防中心，发病率和死亡率每周报道，1997；46：813-815)。若MIC低于或等于32微克/毫升，葡萄球菌分离物被认为对于万古霉素是易感的，若MIC大于或等于32微克/毫升，则对万古霉素完全有耐受性(临床实验室标准的国家委员会，1993。许可的标准M2-A5。抗微生物盘易感性试验的执行标准-第五版。临床实验室标准的国家委员会，美国宾夕法尼亚)。
如表7所示，溶葡萄球菌素在治疗患由耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌的VISA菌株引起的感染的心内膜炎的兔子的效果。
表7溶葡萄球菌素对由耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌的
          VISA菌株引起的兔子的心内膜炎的作用
   处理   CFU/克增殖体*    无菌/总增殖体
   对照       10.3        0/10
   万古霉素30毫克/kg每天两次       6.95        0/13
   溶葡萄球菌素5毫克/kg每天三次       6.29        2/10
   溶葡萄球菌素15毫克/kg每天两次       4.00**        0/5
*表达为平均值的log10
**明显优于万古霉素或较低剂量的溶葡萄球菌素(p＜0.05)。
为了抵抗VISA菌株，以5毫克/kg溶葡萄球菌素每天给予三次在减少大动脉增殖体里细菌负载数与万古霉素一样有效。以15毫克/kg溶葡萄球菌素每天给予两次比标准剂量万古霉素更有效(统计学上意义)，也比每天给予三次5毫克/kg溶葡萄球菌素更有效。此外，万古霉素即使以30毫克/kg每天给予两次也不能使试验动物的心脏瓣膜增殖体完全灭菌。另一方面，每天给予三次溶葡萄球菌素可使一些动物里的增殖体完全灭菌。
兔子心内膜炎模型现已被极良好地标准化，可作为抗微生物剂对治愈严重人体感染的能力的严格试验来接受。以前研究中，在已建立的感染里使用溶葡萄球菌素显示能有限地减少小鼠模型里肾脏的细菌负载，在狗心内膜炎模型里心脏瓣膜和其它器官里的细菌负载，其剂量范围是50-250mg/kg/处理。尽管以前研究中使用了高剂量，但没有观察到在治疗严重葡萄球菌感染里所需的剂量的有效性。以前得到的结果没有得到快速、实际上使所有心脏瓣膜无菌的结果，目前这在兔子心内膜炎模型里用极温和剂量的溶葡萄球菌素中已经看见。
本文呈现的结果不仅表明了溶葡萄球菌素对金黄色葡萄球菌性心内膜炎的有效性，也显示了这类效应远远地优于标准治疗所预期的效果。目前的治疗在处理导致组织不可逆转损伤的对生命有威胁的感染中常常是无效的，因此需要迅速地减少细菌数，以预防这类损伤，以及感染转移扩散至其它重要的器官。上述结果表明，溶葡萄球菌素类似物，单独使用或与其它制剂一起使用时对这类感染可能是有效的。此外，基于这些结果和溶葡萄球菌素抗葡萄球菌的体外活性，可以预期溶葡萄球菌素类似物单独使用或与其它制剂组合使用会有用地抵抗除了金黄色葡萄球菌意外的葡萄球菌菌种。适合与溶葡萄球菌素一起使用的制剂是万古霉素和其它糖肽、利福平和其它利福霉素类，和有抗葡萄球菌活性的其它抗感染剂。
可使用的溶葡萄球菌素类似物不仅可用来治疗溶葡萄球菌素性心内膜炎，而且也可治疗其它潜在致命的葡萄球菌疾病，如菌血症和其它重要器官，如肾脏、肺部、皮肤和骨骼的感染。本发明的方法也能用来治疗脑、伤口和假体装置的感染。这些相同的方法可用于治疗诸如骨髓炎等需要用目前使用的抗微生物剂长期治疗的感染类型。本发明进一步扩展了溶葡萄球菌素在治疗由对常规使用的抗生素有耐药性的葡萄球菌引起的感染和疾病中的应用。

Claims (31)

1.一种治疗哺乳动物中葡萄球菌感染的方法，包括对哺乳动物给予有效量的至少一种溶葡萄球菌素类似物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中溶葡萄球菌素类似物与至少一种其它抗微生物剂一起给予。
3.根据权利要求2所述的方法，其中其它抗微生物剂是利福平或糖肽。
4.一种治疗选自心脏瓣膜、血液、肾脏、肺、骨骼和脑膜的至少一个器官或组织被葡萄球菌感染的方法，包括选择患有至少一种所述疾病的哺乳动物，对所述的哺乳动物给予有效量的溶葡萄球菌素类似物。
5.一种治疗与插管或假体装置有关的葡萄球菌感染的方法，包括，选择带有这类感染的哺乳动物，对所述的哺乳动物给予有效量的溶葡萄球菌素类似物。
6.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中溶葡萄球菌素类似物是溶葡萄球菌素或对在葡萄球菌的细胞壁肽葡聚糖里含甘氨酸的桥键显示出分解蛋白的生物活性的溶葡萄球菌素的变体。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其中感染是心内膜炎。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其中感染是骨髓炎。
9.根据权利要求4或5所述的方法，其中感染是菌血症。
10.根据权利要求7所述的方法，其中类似物是溶葡萄球菌素。
11.根据权利要求8所述的方法，其中类似物是溶葡萄球菌素。
12.根据权利要求9所述的方法，其中类似物是溶葡萄球菌素。
13.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中哺乳动物是人体。
14.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中溶葡萄球菌素感染至少对非溶葡萄球菌素的抗微生物剂有部分的耐药性。
15.根据权利要求14所述的方法，其中抗微生物剂是β-内酰胺抗微生物剂或万古霉素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中β-内酰胺是甲氧苯青霉素。
17.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中溶葡萄球菌素类似物是重组产生的。
18.根据权利要求17所述的方法，其中类似物是溶葡萄球菌素。
19.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中类似物通过直接滴注、吸入或非胃肠道途径给予。
20.根据权利要求19所述的方法，其中类似物通过静脉内、肌内、皮下、腹腔内或膜内给药。
21.根据权利要求4或5所述的方法，其中溶葡萄球菌素与至少一种其它抗微生物剂一起给药。
22.根据权利要求21所述的方法，其中其它抗微生物剂是利福平或糖肽。
23.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中类似物以每剂不超过50毫克/kg给药。
24.根据权利要求23所述的方法，其中给予类似物的量为0.5mg/kg/天-200mg/kg/天。
25.根据权利要求24所述的方法，其中给予类似物的量为3mg/kg/天-50mg/kg/天。
26..根据权利要求25所述的方法，其中给予类似物的量为3mg/kg/天-25mg/kg/天。
27.根据权利要求24所述的方法，其中给予类似物的量不大于45mg/kg/天。
28.一种治疗溶葡萄球菌素感染的治疗组合物，包括溶葡萄球菌素类似物和药学上可接受的载体，所述的溶葡萄球菌素类似物对葡萄球菌的细胞壁肽葡聚糖里含甘氨酸的桥键有分解蛋白活性。
29.根据权利要求28所述的治疗组合物，其中组合物适合于人体非胃肠道给药。
30.根据权利要求28所述的组合物，其中组合物进一步包括第二种抗微生物剂。
31.根据权利要求28所述的组合物，其中溶葡萄球菌素类似物是重组产生的。
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