NO320884B1 - Anvendelse av lysostafin eller variant derav til fremstilling av et medikament til behandling av infeksjoner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av lysostafin, eller en variant derav, som bibeholder evnen til lysostafin for proteolytisk angrep mot glycininneholdende broer i celleveggpeptidglykan hos stafylokokker, i fremstillingen av et farmasøytisk preparat for parenteral administrering til mennesker for å behandle stafylokk-infeksjoner som er minst delvis resistente overfor vancomycin, hvor nevnte lysostafin administreres i mer enn én dose. Stafylokokk-infeksjoner inkluderer stafylokokk-endokarditt; stafylokokk-bakteremi; og stafylokokk-infeksjon i nyrer, lunger, hud, ben, brannsår, sår og proteseinnretninger. Oppfinnelsen omfatter nevnte anvendelse av lysostafin i alminnelighet, inklusive ikke bare villtype-lysostafin, men også rekombinant lysostafin; lysostafinvarianter med aminosyresekvenser varierende fra den publiserte "naturlige sekvensen" til det modne peptidet (U.S. patent nr. 4.931.390), som skyldes genetiske mutasjoner (slike som substitusjoner, addisjoner og delesjoner), post-translasjons-prosessering, genteknologi av chimeriske fusjonsproteiner og dets like, eller en kombinasjon av disse variasjoner.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Lysostafin er et enzym, først identifisert i Staphylococcus simulans (tidligere kjent som S. staphylolyticus), som har antimikrobiell aktivitet som følge av dens aktivitet på glysininneholdende broer i celleveggen peptidoglykan hos bakterier [Zygmunt, et al., Progr. Drug Res. 16:309-333 (1972)].

In vitro er lysostafin spesielt aktive mot Staphylococcus aureus, fordi cellevegg-broene hos disse artene inneholder en høy andel av glysin, skjønt aktiviteten mot andre arter av stapyfylokokker har blitt demonstrert ( Ibid.)

Aktiviteten til lysostafin har også blitt undersøkt i dyre-infeksjonsmodeller. Studier hvori intraperitoneal behandling etterfulgt av intraperitoneal infeksjon er lik in vitro-eksperimenter, og tas ikke med i betraktning her. Det har vært to rapporter om overlevelse på 50% av behandlede mus når dyrene ble utsatt for intraperitoneal infeksjon etterfulgt av enkle eller flere subkutanadministreringer med en total på omtrent 1 mg/kg av en lysostafinrfemstilling [Schuhardt, et al., J. Bacteriol. 88:815-816

(1964); Harrison, et al., Can. J. Microbiol. 13:93-97 (1967)]. En totaldose på 6 mg/kg ble rapportert å beskytte 100% av musene i én av disse studiene [Harrison, et al., Ibid.]. Virulensen av bakteriell utfordring brukt i begge studier ser ut til å være svært lav, siden ubehandlede infiserte mus ikke alle døde innen en kort tidsperiode. Flere eksperimenter brukte en muse-subakutt modell som målte den bakterielle meng-den i nyrene etter infeksjon med Giorgio-stammen fra S. aurens [Dixon, et al., Yale J. Biol. Med. 41:62-68 (1968): Schaffher, et al., Yale J. Biol. Med. 39:230-244 (1967): Harrison, et al., J. Bacteriol. 93:520-524 (1967)]. Når en lysostafinrfemstilling ble administrert intravenøst innen 6 timer etter infeksjon, ble signifikante reduksjoner i antallet bakterier i nyrene observert med doser på 1,5 mg/kg eller høyere. Imidlertid ble etablerte infeksjoner mer refraktoriske; bare små reduksjoner i antallet bakterier ble sett når behandlingen ble tilbakeholdt i 24 timer eller lengre, selv med doser på 125 eller 250 mg/kg av en lysostafinrfemstilling. Effekten av flere behandlinger ble ikke studert.

En enkelt studie, Goldberg, et al., Antimicrob. Ag. Chemother, 1967:45-53 (1967), an-vendte et begrenset antall hunder i en uvanlig endokardittmodell. Hundemodellen har ikke blitt ytterligere utviklet. Eksperimentet til Goldberg, et al., var ikke komparativt, og har derfor begrenset anvendelse i vurderingen av administreringen av lysostafin. Imidlertid var høye doser av lysostafin (ved minst 50 mg/kg/behandling) bare moderat effektive, når en bedømte ut fra hundens helse og graden av reduksjon i antallet bakterier i hjerteklaffene og nyrene.

EP Al-359873 beskriver lokal administrering av lysostafin til brystkjertlene hos kveg for behandling av bovin mastitt. Dette er ikke et systemisk forsøk relevant for mennesker.

Juan et al. (mai 1995) beskriver tropikal behandling med lysostafin.

Følgelig viste ikke dataene ervervet fra tidligere studier med dyremodell at anvendelse av lysostafin ville være en effektiv og praktisk tilnærming for å bekjempe etablerte infeksjoner fra forskjellige organer.

Begrensede humane utprøvninger ble utført med det mål å utrydde S. aureus ved topisk applisering av lysostafin til neseborene [Martin, et al., J. Lab. Clin. Med. 70:1-8 (1967); Martin, et al., J. Lab. Clin. Med. 71:791-797 (1968); Quickel, et al., Appl. Microbiol. 22:446-450 (1971)]. Nasal "carriage" er ikke i seg selv en sykdomstilstand. Den utgjør en risikofaktor for infeksjon hos pasienter behandlet av kolonisert helsepersonale eller for selvinfeksjon i tilfelle av en kolonisert pasient.

Teknikkens stand rapporterer behandlingen av én svært syk pasient med en enkel dose av parenteral administrert lysostafin etterfulgt av et antibiotikum, gentamicin, tre dager senere. Pasienten døde, men utviste en reduksjon i bakteremia [Stark, et al., N. Engl. J. Med. 291:239-240(1974)].

Immunogenisk fenomen observert under dyre- og menneskestudiene, ble bemerket som svært viktig. Kontaminering av lysostafmfremstillingene med fremmede substanser kan ha vært ansvarlig for minst noen av disse fenomenene.

Ingen ytterligere utvikling av enzymet som et terapeutisk middel forekom, tatt i betraktning mangelen på ønsket effektivitet i studiene som ble diskutert. Dette kan videre skyldes vanskeligheten med å produsere og rense lysostafin.

Det stafylokokkale genet for lysostafin har nå blitt sekvensert og klonet [U.S. patent nr. 4.931.390]. Lysostafin for anvendelse som et laboratoriereagens har blitt produsert ved fermentering av en ikke-patogen rekombinant stamme av Bacillus sphaericus, fra hvilken den lett kan renses.

Det gjenstår for de som kjenner fagfeltet, å utvikle et terapeutisk middel som kan bli administrert parenteralt, og som kan bli brukt i behandlingen av stafylokokk-infeksjon generelt, såvel som infeksjon av spesifikke vev, som i endokarditt.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Administrering av relativt lave doser av lysostafin (under 50 mg/kg) via parenteral administrering, er en dramatisk effektiv terapi for behandlingen av stafylokokk-infeksjoner, spesielt infeksjoner som er resistente overfor behandling og/eller typisk assosiert med signifikant morbiditet og mortalitet. Ytterligere har lysostafin vist seg å være effektiv mot stafylokokk-bakterier som er minst delvis resistente overfor tilgjengelige antimikrobielle midler, slik som beta-laktam-antibiotika inklusive penicillinase-stabile penicilliner, vankomycin etc.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør ytterligere kombinasjonsterapier som omfatter vekslende, eller samtidig, administrering av lysostafin og én eller flere andre antimikrobielle midler. Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av lysostafin, eller en variant derav, som bibeholder evnen til lysostafin for proteolytisk angrep mot glycininneholdende broer i celleveggpeptidglykan hos stafylokokker, i fremstillingen av et farmasøytisk preparat for parenteral administrering til mennesker for å behandle stafylokk-infeksjoner som er minst delvis resistente overfor vancomycin, hvor nevnte lysostafin administreres i mer enn én dose. Spesielt foretrukne antibiotika for administrering sammen med lysostafin, er rifamyciner (isolerte fra mikroorganismer eller syntetisk eller semisyntetisk produsert, slik som rifampin) og glykopeptider (en gruppe molekyler blant de naturlig forekommende molekyler som vanligvis inneholder et heptapeptid og én eller flere sukkerdeler), enten naturlig produserte eller isolerte (slik som vancomycin, teicoplanin etc.) eller semisyntetiske fremstillinger.

Tilgjengeligheten av klonede, rekombinante forskjellige lysostafiner utvider foreliggende oppfinnelse ytterligere. Relaterte enzymer har blitt identifisert, og kan ytterligere bli brukt sammen med - eller i stedet for - lysostafin.

Kloningene og sekvenseringen av lysostafingenet tillater isoleringen av forskjellige enzymer som har egenskaper som er like eller forskjellige fra de av villtype-lysostafin. Ett slikt endret enzym som bærer en enkel aminosyreendring, og som var resultatet av vårt arbeid, har blitt karakterisert og vist seg å ha potent anti-stafylokokk-aktivitet in vitro og i en dyre-infeksjonsmodell.

Andre lysostafinanaloger, inklusive naturlig forekommende enzymer med sekvenshomologi til lysostafin og med endopeptidaseaktivitet, eller til og med kimære

enzymer ervervet ved å sammensmelte bindingsdomenet av ett enzym til det katalytiske domenet til et annet, vil være potente midler som kan anvendes i bakterielle sykdommer som er vanskelige å behandle forårsaket av stafylokokker eller andre patogene bakterier.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en grafisk fremstilling av den bakteriedrepende aktiviteten til lysostafin mot en methicillin-resistent S. aureus- stamme sammenlignet med vancomycin. Figur 2 er en graf som viser den bakteriedrepende aktiviteten til lysostafin over for forskjellige S. aurens- stammer med forskjellig antimikrobiell resistens.

Definisjoner

Betegnelser benyttet i foreliggende søknad er brukt, der hvor det er mulig, i betydningen av deres normale og typiske anvendelse. Visse betegnelser er brukt for å beskrive en klasse av virkninger eller forbindelser for å tilveiebringe en generisk beskrivelse av ele-menter eller vitenskapelige fenomener som logisk grupperes sammen. Lysostafin-analog - Ethvert enzym, inklusive lysostafin (villtype), enhver lysostafinmutant eller variant, enhver rekombinant eller ethvert relatert enzym som bibeholder den proteolytiske evnen, in vitro og in vivo, for proteolytisk angrep mot glycininneholdende broer i celleveggen peptidoglykan hos stafylokokker. Varianter kan bli dannet ved post-translasjonell prosessering av proteinet (enten ved enzymer tilstede i en produsentstamme eller ved midler av enzymer eller reagenser introdusert på ethvert stadium av prosessen) eller ved mutasjon av det strukturelle genet. Mutasjoner kan inkludere setedelesjon, insersjon, domenfjerning og erstatningsmutasjoner. Lysostafinanalogene beskrevet i foreliggende oppfinnelse kan være rekombinant uttrykt eller på annen måte.

Parenteral - Administrering ved injeksjon, inklusive intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraorbital, intraspinal, intraperitoneal og ved direkte perfusjon eller avlevering til organer eller vev gjennom injeksjon (f.eks. intramedulært).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Staphylococcus aureus er et svært virulent humant patogen. Det er årsaken til mange humane sykdommer, varierende fra lokaliserte hudinfeksjoner til livstruende bakteriemi og infeksjoner i vitale organer. Hvis den ikke kontrolleres raskt, kan en S. aureus-infeksjon spre seg raskt fra utgangsstedet for infeksjonen til andre organer. Skjønt focuset for infeksjonen ikke behøver å være åpenbar, inkluderer organer som er følsomme overfor infeksjon, hjerteklaffene, nyrer, lunger, ben, membraner og huden hos brente pasienter. Sår etter kirurgi eller skader, og enhver region hvor noe fremmed er tilstede, blir også ofte infisert. Disse infeksjonene, som kan oppstå i samfunnet eller under et hospitalopphold, er en årsak til signifikant morbiditet og mortalitet, som kan være så høy som 60% i alvorlige infeksjoner i visse populasjoner, selv når den best tilgjengelige behandling blir brukt. Andre arter av stafylokokker (koagulase-negative stafylokokker, slik som S. epidermidis) er mindre virulente, men kan kolonisere katetre eller proteseinnretninger; dette kan ha ødeleggende konsekvenser, for eksempel når innretningen blir implantert i hjerteklaffen.

Resistens overfor tilgjengelige antimikrobielle midler ser ut til å oppstå spesielt lett hos stafylokokker, som starter med penicillinresistens i S. aureus; denne resistensen dukket opp rett etter begynnelsen på anvendelsen av antibiotika. Nesten alle stafylokokk-infeksjoner, enten de oppstår i miljøet eller på sykehuset, er ikke lenger følsomme for førstegenerasjons-penicilliner, hvilket skyldes produksjonen av penicillinase, stammer som også er resistente overfor penicillinase-stabile penicilliner (slik som methicillin) er også nå et signifikant problem, spesielt ved infeksjoner ervervet i sykehus. [Centers for Disease Control and Prevention, 1997, Reduced susceptibility of Staphylococcus aureus to vancomycin ~ Japan, 1996. Morbidity and Mortality Weekly Report 46: 624-626

(1997)].

Vancomycin har blitt førstelinjebehandlingen for stafylokokkinfeksjon, spesielt på sykehus. Imidlertid er det tydelig fra de høye mortalitetsratene at ingen nåværende tilgjengelig behandling er ideell for visse sykdommer, slik som S. a«rew,s-endokarditt og bakteremi, som krever rask reduksjon i antallet bakterier for å forhindre irreversibel skade på hjertet og til de andre organene til hvilke infeksjonen ofte spres via blodstrømmen. Én grunn til at nåværende tilgjengelige terapier feiler, er at de virker relativt langsomt, spesielt in vivo, hvor rask sterilisering av infiserte steder kan kreves for fullstendig og rask helbredelse av pasienten. I en slik livstruende situasjon, og ved noen andre infeksjoner (for eksempel hvori behandlingsregimer er svært lange, slik som osteomyelitt), kan nye terapier eller nye kombinasjoner av terapier i høy grad forbedre resultatet for pasienten.

Lysostafin har blitt funnet å være svært aktivt ved moderate doser. Dette er demonstrert nedenfor i en svært alvorlig velkarakterisert dyreinfeksjonsmodell, endokarditt i kanin forårsaket av meticillin-resistent S. aureus (MRSA). Spesielt demonstrerte vi fullstendig sterilisering av hjerteklaffvegetasjoner i nesten alle dyrene behandlet med ett av doseregimene, et enestående resultat som ikke er blitt observert med nåværende tilgjengelige antimikrobielle midler. Ytterligere demonstrerer vi heri at kombinasjonen av til og med lavere daglig dose av lysostafin med et standard terapeutisk middel, potensierer den antimikrobielle aktiviteten til komponentene i dette modellsystemet.

Lysostafindosene vi benyttet var signifikant lavere enn de som tidligere er blitt vist å ha bare en begrenset effekt ved fjerning av bakterier fra organer i dyremodeller [Zygmunt et al., Progr. Drug. Res. 16:309-333 (1972); Goldberg et al., Antimicrob. Ag. Chemother. 1967-45-53 (1967)].

Nedenfor har vi også demonstrert aktivitet mot stafylokokker, in vitro, og i en akutt mu-seinfeksjonsmodell av en endret form av lysostafin, dannet ved mutagenisering av en rekombinant stamme av Bacillus sphaericus som bærer lysostafingenet. Det er derfor mulig å administrere farmasøytiske fremstillinger av lysostafinanaloger, enten lysostafin eller andre enzymer med peptidglykan-endopeptidaseaktivitet, inklusive genetisk modifiserte enzymer inneholdende én eller opp til fem aminosyresubstitusjoner; enzymer med delesjoner eller insersjoner på opptil 10 aminosyrer, inklusive slike delesjoner eller insersjoner ved den N-terminale enden, eller kimære enzymer som er et resultat fra sammensmelting av de katalytiske og bindingsdomenene fra forskjellige enzymer, som terapeutiske midler for å behandle infeksjoner i mennesker eller dyr.

For eksempel har en annen glysylglycin-endopeptidase (ALE-1, fra Staphylococcus capitis EPK1) blitt beskrevet. ALE-1 er forskjellig fra lysostafin, skjønt de to enzymene har betraktelig aminosyrehomologi [Sugai et al., J. Bacteriol. 179:1193-1202 (1997)]. En annen peptidglykanhydrolase med en lavere grad av homologi til lysostafin, men som også prosesserer endopeptidaseaktivitet, er zoocin A, produsert av Streptococcus zooepidemicus 4881 [Simmonds et al., Applied and Environmental Microbiology 62:4536-4541 (1996); Simmonds et al., Gene 189; 255-261 81997)]. Kimære proteiner kan bli produsert ved fusjonen av et domene av disse eller lignende enzymer til et domene av en lysostaifnanalog.

Mens visse immunologiske bivirkninger observert i mye tidligere studier som kan gi be-kymring i noen men ikke i andre situasjoner (slik som akutte eller situasjoner av kort varighet) er egnede rene fremstillinger av lysostafinanaloger, ervervet ved fermenter-ingen av ufarlige rekombinante stammer av bakterier, forventet å være mindre tilbøye-lige til å indusere immunogene eller andre bivirkninger.

Effektive farmasøytiske formuleringer fra disse antimikrobielle enzymene inkluderer vandige oppløsninger eller tørre fremstillinger (f.eks. lyofiliserte, krystallinske eller amorfe, med eller uten ytterligere oppløsninger for osmotisk balanse) for rekonstituering med flytende stoffer, egnet for parenteral avlevering av det aktive midlet. Avlevering er fortrinnsvis via intravenøse (i.v.) intramuskulære (i.m), subkutane (s.c) eller intraperitoneale (i.p.) måter eller intratekalt eller ved inhalasjon eller ved direkte inndrypping på et infisert sted for å tillate blod og vevsnivåer i overskudd av den minimale inhibitoriske konsentrasjonen (MIC) til det aktive midlet å bli oppnådd, og derved bevirke en reduksjon i bakterielle titre for å helbrede eller forbedre en infeksjon.

Videre kan den aktive lysostafinanalogen bli koadministrert, samtidig eller alternerende med andre antimikrobielle midler, for mer effektivt å behandle en infeksjonssykdom. Formuleringer kan være i, eller bli rekonstituert i, små volum av flytende middel egnet for bolus i.v. eller perifer injeksjon eller ved tilsetting til et større volum i.v. dryppoppløsning, eller kan være i, eller rekonstituert i, et større volum for å bli administrert ved langsom i.v. infusjon. Midler som skal bli koadministrert med lysostafin eller andre antibakterielle enzymer, kan bli formulert sammen med nevnte enzym som en fiksert kombinasjon, eller kan bli brukt improvisert i hvilke som helst formuleringer som er tilgjengelige og praktiske, og ved hvilken som helst måte for administrering som er kjent for å tilveiebringe adekvate nivåer av disse midlene på setene for infeksjon.

Egnede doser og regimer for lysostafin kan variere med alvorligheten av infeksjonen og sensitiviteten til den infiserte organismen og, i tilfellet av kombinasjonsterapi, kan avhenge av det spesielle antimikrobielle midlet(ene) brukt i kombinasjon. Dosene kan variere fra 0,5 til 200 mg/kg/dag, fortrinnsvis fra 3 til 25-50 mg/kg/dag, gitt som enkle eller delte doser, fortrinnsvis gitt ved kontinuerlig infusjon eller delt i to eller fire doser pr. dag.

EKSEMPLER

Alle eksperimenter ble utført ved å bruke lysostafin-analoger produsert ved fermentering av rekombinant B. sphaericus- stammer fremstilt ved genteknologi til å inneholde lysostafingenet beskrevet av Recsei (U.S. patent nr. 4.931.390) eller en mutant derav. Spesielt avvek lysostafinanaloger fremstilt ved fermentering av B. sphaericus fra den publiserte sekvensen ved å ha så mange som 2 færre eller opp til 2 ytterligere aminosyrer i den N-terminale enden.

Spesielt er dataene heri i stor grad avledet fra studier ved bruk av fremstillinger av rekombinant produserte lysostafinanaloger, hvori hovedkomponenten er én som mangler to N-terminale aminosyrer av den publiserte sekvensen. Imidlertid er ikke funnene begrenset til disse fremstillinger. Lignende resultater kan erverves ved enhver fremstilling som har egnet renhet og aktivitet.

Eksempel 1

In vivo- aktivitet av lysostafin

Som vist i tabell la, viste eksperimenter at lysostafinfremstillingen var aktiv og baktericidal in vitro mot kliniske isolater av S. aureus; de minimale inhibitoriske konsentrasjonene (MIC) og minimale baktericidale konsentrasjonene (MBC) ble bestemt til å være <1,0 ug/ml ved bruk av standard næringsmedium-mikrofortynningsmetoder [National Committe for Clinical Laboratory Standard, 1993. Approved Standard M7-A3. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically - Third edition. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanoca, PA; National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1992. Tentative Guideline M26-T. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova. PA].

Videre har lysostafin vist seg å være aktivt mot et antall av isolater av Staphylococcus epidermidis (en koagulase-negativ art) med MIC <8 ug/ml i 11 av 13 kliniske isolater

som ble testet. MIC ble definert som den laveste konsentrasjonen testet som fullstendig inhibert synlig vekst av bakteriene og MBC som den laveste konsentrasjonen som drepte 99,9% av start-inoculumet i 24 timers eksponering. Som vist i tabell la, er følsomhet for lysostafin ikke affisert ved resistens eller redusert sensitivitet til meticillin og/eller

vancomycin. S. aureus- stammer som er meticillinresistente, og som også har bare inter-mediatfølsomhet til vancomycin, har nylig dukket opp i U.S.A. [Centers for Disease Control and prevention, Morbidity and Mortality Weekly Report 1997. 46:813-815].

Lysostafin fester seg til plastmaterialer og kan tapes fra oppløsningen; dette kan virke inn på dens tydelige virkning. Derfor ble også noen MlC-bestemmelser utført med tilsettinger av 0,1% bovint serumalbumin (BSA) til diluenten. På annen måte var metoden identisk til det ovenfor siterte. Som vist i tabell lb, forbedret in vitro-aktiviteten av lysostafin mot stammene testet med 8- til 64-ganger, når de ble testet med tilstedeværelse av BDA. Siden denne observasjonen er relatert til affiniteten til lysostafin for plastmaterialer, er det å forvente, generelt, at stafylokokk-stammer er mer følsomme overfor lysostafin enn det som var observert tidligere.

Disse dataene viser den svært potente aktiviteten til lysostafin mot samtidige kliniske isolater av multiple antibiotika-resistente Staphylococcus aureus.

Den baktericidale aktiviteten til lysostafin overfor S. aureus ble også studert ved metoder som tidsavlivningseksperimenter. I ett eksperiment av denne typen ble S. aureus- stamme AG461, et meticillinresistent klinisk isolat fra Genoa, Italia, inokulert i Mueller-Hinton næringsmedium (Difco) og dyrket ved 37°C med forsiktig risting inntil den nådde omtrent 10 Q viable celler pr. ml (CFU/ml), estimert fra absorbansen av kulturen ved 600 nm. Kulturen ble deretter fortynnet med ferskt næringsmedium til omtrent IO<6> CFU/ml og 5 ml alikvoter ble plassert i flere forskjellige flasker for eksponering til forskjellige konsentrasjoner av antibakterielle midler. Inkubering ble fortsatt med forsiktig risting ved 37°C, og prøvene ble tatt ut ved intervaller for bestemmelse av levedyktige celler. Serie 10 ganger fortynninger av prøvene ble utført i sterilt saltvann (0,9% NaCl i destillert vann) og duplikat av 0,1 ml alikvoter av passende fortynninger ble platet på tryptic soya-agarplater (Remel) ved å bruke agar-inklusjonsmetoden. (I denne metoden blir alikvoter som skal plates ut tilsatt til 2,5 ml av toppagar, som blir blandet og helt på en plate. Toppagar bestod av smeltet tryptisk soya-agar (Difco) fortynnet 2 ganger med Difco tryptisk soya-næringsmedium for å gi en sluttagarkonsentrasjon på 0,785%, vekt/volum). Platene ble inkubert i 24-48 timer ved 36°C og koloniene ble tellet manuelt. Alle fortynninger med lysostafin ble utført med tilstedeværelse av 0,1-0,2% BSA, for å forhindre adsorpsjon av lysostafin til plastmaterialer. Vancomycin (Sigma Chemical Co.) ble fortynnet i sterilt, destillert vann.

Som vist i figur 1, ble lysostafin ved konsentrasjoner på 0,004 og 0,32 ug/ml raskt bakteriedrepende, hvor minst 99,9% av bakteriene ble drept innen én times kontakt. Til sammenligning ble den bakteriedrepende virkningen av vancomycin redusert og svært mye lavere, med svært liten avlivning av bakteriene observert i de tre timene som kontakten varte, selv om mye høyere konsentrasjoner av vancomycin (2 og 16 ug/ml) ble brukt. De forskjellige konsentrasjonene av lysostafin og vankomycin som ble brukt var én og åtte ganger deres respektive MIC.

I et annet eksperiment (figur 2), ble tre forskjellige meticillinresistente kliniske isolater av & aureus, og en fjerde stamme, 27619VR, en laboratoireavledet "VISA"-stamme (dvs. med intermediåtresistens mot vancomycin) avledet fra et meticillinresistent klinisk isolat, inokulert i kationjustert Mueller-Hinton-næringsmedium (Becton Dickinson) og dyrket ved 37°C overnatt. De ble deretter fortynnet i ferskt næringsmedium og inkubert ved 37°C med forsiktig risting inntil de ble vurdert å ha nådd det logaritmiske trinnet av vekst. Som indikert i figur 2, varierte de bakterielle titerne fra 2xl0<6> til 9xl07 CFU/ml på dette tidspunktet. Lysostafin ble tilsatt til hver kultur ved konsentrasjonene på 1 Hg/ml. Ved intervaller ble prøver tatt, fortynnet i serier med 0,9% NaCl og platet ved utspredning på Mueller-Hinton-agar (Becton Dickinson). Agarplatene ble inkubert i 48 timer ved 37°C og koloniene ble tellet manuelt. Som vist i figur 2, ble alle disse stammene raskt avlivet med lysostafin.

Disse dataene viser at lysostafin har potent og rask bakteriedrepende aktivitet overfor nålevende kliniske isolater av S. aureus, inklusive stammer som er resistente overfor meticillin og stammer som både er resistente mot meticillin og intermediat resistent overfor vancomycin.

Dyremodellstudier

Eksempel 2

Komparativ effekt av lysostafin i en muse- Å flMreMs- infeksjonsmodell

Effektiviteten av lysostafin ble sammenlignet med den med vancomycin i en akutt infeksjonsmodell i mus. S. aureus Smith ble dyrket overnatt med moderat risting, i Veal Infusion-næringssmedium (Difco) og fortynnet i næringsmedium inneholdende 5% "hog gastric mucin" (Difco). Swiss-Webster hannmus (Taconic Farms, Germantown, NY) som veide omtrent 20 gram, ble infisert intraperitonealt med IO<5->IO<6> viable celler, omtrent ti ganger inoculumet som reproduserbart drepte alle ubehandlede dyr innen 48 timer. Det var seks mus i hver behandlingsgruppe. Lysostafin ble administrert intrave-nøst (i 0,1 ml 5% dekstrose for injeksjon) eller subkutant (i 0,2 ml), innenfor 10 min. av infeksjon. Vancomycin ble administrert subkutant

Som vist i tabell 2, beskyttet lysostafin 100% av de infiserte musene når det ble gitt en dose på 0,16 mg/kg intravenøst eller ved en dose på 2,5 mg/kg når den ble administrert subkutant. Vancomycin, som i musen er fullstendig biotilgjengelig subkutan og har lignende aktivitet enten den blir gitt subkutant eller intravenøst, var 100% effektive ved dosen på 2,5 mg/kg. Alle de ubehandlede musene døde på mindre enn 24 timer.

Dette eksemplet viser at lysostafin er effektiv mot S. aureus-infeksjon i en akutt infeksjonsmodell i mus ved anvendelse av en svært virulent utfordrerdose med bakterier. Når det blir administrert intravenøst, var umåtelig lave doser av renset rekombinant lysostafin effektivt. På vektbasis var lysostafin 16 ganger mer effektiv enn vancomycin; på en molar basis var lysostafin omtrent 200 ganger så effektiv som vancomycin.

Eksempel 3

In vitro og in v/ vo- aktivitet av en variant av lvsostafinenzvm

En Bacillus sphaericu- stamme inneholdende det klonede lysostafingenet beskrevet i U.S.-patent nr. 4.931.390, ble mutagenisert med N,N-nitrosoguanidin. Overlevende kolonier ble screenet for tilstedeværelse av en lyrisk aktivitet ved å plante dem på et teppe av varmedrepte celler av S. aureus- stamme RN4880, og ble inkubert overnatt ved 32°C. Kolonier som produserer signifikante, klare soner, ble tatt vare på.

Én av disse klonene ble ytterligere karakterisert. Lysostafingenet ble sekvensert og funnet å inneholde en enkel G-til-A-mutasjon i codonet korresponderende til posisjon 218 i det modne lysostafin-proteinet, hvilket resulterte i en codonendring fra GGT (glycin) til GAT (aspartinsyre). Fermentering av denne mutantstammen produserte tilstrekkelig materiale for in vitro- og in vivo-testing.

Som vist i tabell 3, var variantenzymet svært aktivt overfor S. aureus in vitro, skjønt villtype-lysostafinfremstillingen var noe mer aktiv. I dette eksperimentet ble MIC bestemt ved næringsmedium-makrofortynning i 1 ml sluttvolum i glassrør. Metoden var ellers som beskrevet ovenfor.

Som vist i tabell 4 var variant-lysostafin-enzymet også svært aktivt mot S. aureus i den akutte museinfeksjonsmodellen. Her igjen var varianten noe mindre aktiv enn villtype-lysostafin, men den var mer aktiv enn vancomycin.

Eksempel 4

Antimikrobiell aktivitet i serumet til en kanin behandlet med lysostafin

En hvit New Zealand kanin som veide omtrent S kg ble gitt en intravenøs infusjon med 125 mg lysostafin. Blodprøver ble tatt i intervaller på opptil 4 timer, og serum ble fremstilt; to ganger seriefortynninger ble utført, og serumbakteiredrepende titer ble bestemt -mot en meticillin-resistent stamme fra S. aureus (MRSA 27619). Den serumbakteriedrepende titeren er den høyeste fortynning som dreper 99,9% av inokulumet i 24 timer. I denne testen er overlevelse av bakterier bestemt i det vesentlige som i den minimale bakteriedrepende metoden, med unntak av at mikrotiterbrønnene inneholder forskjellige fortynninger av serumet, snarere enn forskjellige konsentrasjoner av en oppløsning av et renset antimikrobielt middel.

Som vist i tabell 5, inneholdt serumet høye bakteriedrepende konsentrasjoner av lysostafin i hele tidsperioden. Spesielt i tidspunktene fra 30 minutter til 120 minutter, ble titeren større enn 1:256 (den høyeste fortynningen testet), som indikerer at fortynninger på minst 256 ganger fortsatt var istand til å drepe 99,9% av bakteriene. På det siste tidspunktet, 240 minutter, var titeren 1:64.

Dette eksempel demonstrerer at lysostafin opprettholder bakteriedrepende aktivitet i serumet hos kaniner, og at det forblir tilstede og aktivt i sirkulasjonen i minst 4 timer etter injeksjon.

Eksempel 5

Effektiviteten av l<y>sostafin mot eksperimentell endokarditt i kaniner Aorta-klaff-endokarditt ble etablert i hvite New Zealand-kaniner som veide omtrent 3 kg. Kaninene ble anestetisert, og høyre karotidarterie ble kirurgisk eksponert og kannu-lert med et polyetylenkateter som ble ført inn i venstre hjerteventrikkel. Etter minst 24 timer ble kaninene infisert intravenøst med IO<6->IO<7> celler av en meticillin-resistent S. aureus- stamme (MRS A 27619). Tjuefire timer senere ble dyrene tilfeldig vurdert til forskjellige behandlingsgrupper. Ubehandlet kontroll (9 kaniner); positiv kontroll, vancomycin 30 mg/kg to ganger daglig (15), lysostafin 5 mg/kg tre ganger daglig (11); lysostafin 5 mg/kg én gang daglig (10); lysostafin 5 mg/kg én gang daglig + vancomycin 30 mg/kg to ganger daglig (11). Alle kaniner hvis infeksjon ikke ble bekreftet ved forbehandlings-blodkultur, ble eliminert. I tillegg ble alle kaninene som var inkludert i analysen bekreftet ved autopsi å ha hatt etablert endokardittinfeksjon, bedømt ved tilstedeværelse av en aorta-vegetasjon som var indikativ på en pågående eller en tidligere eksisterende sykdomstilstand.

Alle behandlingene var intravenøse, og ble utført i tre dager. Helsetilstanden til kaninene ble vurdert ved intervaller. Kaninene ble avlivet 18 timer etter den siste behandlingen. Aorta-vegetasjoner ble fjernet og veid, og prosessert for å bestemme antallet av levedyktige bakterier, uttrykt som logioCFU/grarn. Grensen for deteksjon er IO<2> CFU/gram (logioCFU/gram=2,0). Gjennomsnittstitrene på bakteriene pr. gram ble sammenlignet med enveisanalyse av variasjon. Student-Newman-Keuls-testen ble benyttet for å justere multiple sammenligninger. Sammenligning av ratene for sterilisering ble utført ved bruk av Fisher's eksakte test. Statistisk signifikans ble definert som en P-verdi på <0,05.

Som vist i tabell 6, ble et regime på 5 mg/kg lysostafin tre ganger daglig den mest effektive behandlingen. En imponerende statistikk er at denne behandlingen fullstendig steriliserte hjerteklaffVegetasjonen i alle, bortsett fra én av kaninene. Dette var langt overlegen standardregimet brukt som en positiv kontroll i denne infeksjonsmodellen: 30 mg/kg av vancomycin to ganger daglig. Et regime på 5 mg/kg lysostafin én gang daglig var mindre effektivt enn regimet på tre ganger daglig, men var nesten like godt som vancomycin i å redusere bakterieantallet i vegetasjonen. Faktisk var effekten ikke statistisk forskjellig fra vancomycingruppen. Én ganger daglig-lysostafinregimet nådde også fullstendig sterilisering av vegetasjonene i noen dyr. Tilsettingen av lysostafin én gang daglig til standard-vancomycinregimet, produserte en dramatisk reduksjon i det gjennomsnittlige bakterieantallet, nesten til nivået som kunne sees med tre-ganger-daglig lysostafinbehandlinger. Imidlertid, når det gjelder antallet vegetasjoner som ble fullstendig sterilisert, var tre-ganger-daglig lysostafinregimet klart overlegent i forhold til alle andre.

Nyre-abscesser ble også vurdert for tilstedeværelse av stafylokokker. "Tre-ganger-daglig"-regimet av lysostafin reduserte dramatisk baketerieinnholdet sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppen til kun over IO<2> CFU/gram vev i lysostafingruppen sammenlignet med akkurat under IO<8> CFU/gram i kontrollene.

Observasjon av dyrene viste at kaniner behandlet med "tre-ganger-daglig"-regimet av lysostafin var alle ved god helse tidlig i behandlingssyklusen.

Disse resultater kunne man ikke ha ventet på basis av tidligere studier. Spesielt har sterilisering av nesten alle vegetasjoner aldri blitt sett eller rapportert før med noe antimikrobielt middel i denne infeksjonsmodellen. Det faktum at sterilisering forekom innenfor en relativt kort behandlingsperiode, 3 dager, indikerer at lysostafin virker svært raskt in vivo, og foreslår at antimikrobielle lysostafin-analoger i høy grad kan forbedre utkommet hos pasienter med alvorlige stafylokokkinfeksjoner som krever rask reduksjon i bakterieantallet.

De ovenfor nevnte dataene viser effektiviteten av lysostafin-analoger mot S. aureus, inklusive MRSA (meticillinresistent S. aureus). Stammer som er både meticillinresistente og resistente overfor vancomycin, er et nylig oppstått problem. En variantstamme av denne typen ble selektert etter sykluser med vekst i glykopeptidinneholdende medium. Vancomycin MIC for den resulterende stammen var 8 mg/ml, som også er rapportert for naturlig forekommende VIS A-stammer isolert fra pasienter i U.S.A. og Japan. (Centers for Disease Control and Prevention, Morbidity and Mortality Weekly Report 1997; 46:813-815). Stafylokokk-isolater blir betraktet å være følsomme overfor vancomycin hvis MIC er mindre eller lik 5 (xg/ml og å være fullstendig resistent hvis MIC er større enn eller lik 32 ug/ml (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1993. Approved Standard M2-A5. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests - Fifth edition. National Commitee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA.)

Som vist i tabell 7 var lysostafin effektiv i behandling av kaniner med infeksiøs endokarditt forårsaket av den meticillin-resistente VIS A-stammen.

Mot VIS A-stammen var lysostafin ved S mg/kg tre ganger daglig like effektiv som vancomycin i å redusere bakteriemengden i aortiske vegetasjoner. Lysostafin ved 15 mg/kg to ganger daglig var mer effektiv enn standard-doseregimet av vancomycin (statistisk signifikant) og var også signifikant mer effektiv enn lysostafin ved 5 mg/kg gitt tre ganger daglig. Videre kunne vancomycin, selv ved 30 mg/kg to ganger daglig, ikke oppnå fullstendig sterilisering av hjerteklaffvegetasjoner i noen av testdyrene. På den annen side ble fullstendig sterilisering oppnådd i noen dyr med tre ganger daglig regime av lysostafin.

Kanin-endokarditt-modellen er nå svært godt standardisert og er akseptert som en rigorøs test av evnen til antimikrobielle midler å kurere alvorlige humane infeksjoner. Tidligere arbeid med lysostafin i etablerte infeksjoner viste begrenset reduksjon i nyrebakteriell mengde i en musemodell og i hjerteklaffene og andre organer i en hunde-endokarditt-modell, ved doser varierende fra 50 til 250 mg/kg behandling. På tross av de høye dosene brukt i disse tidligere studiene, ble ikke effektiviteten av størrelsen som kreves i behandlingen av alvorlige stafylokokk-infeksjoner observert. Resultatene som er oppnådd tidligere ville ikke ha ført til forutsigelse av rask, total sterilisering av så å si alle hjerteklaff-vegetasjonene, som nå har blitt vist ved å bruke svært moderate doser av lysostafin i kanin-endokardittmodellen.

Resultatene presentert heri viser ikke bare uventet effektivitet av lysostafin mot S. awreus-endokarditt, men viser at slik effektivitet er langt overlegen den som er forventet for standardbehandlinger. Nåværende tilgjengelige behandlinger er ofte ikke effektive når det gjelder livstruende infeksjoner som kan føre til irreversibel vevsødeleggelse og som derfor krever rask reduksjon i bakterieantallet for å forhindre slik skade så vel som metastatisk spredning av infeksjon til andre vitale organer. De ovenfor nevnte resultatene indikerer at lysostafinanaloger, alene eller i kombinasjon med andre midler, har potensialet for effektivitet i behandlingen av slike infeksjoner. Videre, basert på disse resultatene og på in vrtro-aktiviteten av lysostafin mot stafylokokker, er det å forvente at lysostafinanaloger, alene eller i kombinasjon med andre midler, vil være nyttig mot arter av andre stafylokokker enn S. aureus. Blant midlene som er egnet for anvendelse sammen med lysostafin, er cancomycin og andre glykopeptider, rifampin og andre rifamyciner, og andre anti-infektive midler som har aktivitet mot stafylokokker.

Lysostafinanaloger kan bli brukt ikke bare i behandlingen av stafylokokk-endokarditt, men andre potensielle dødelige stafylokokk-sykdommer, slik som bakteremi og infeksjoner av andre vitale organer, slik som nyrer, lunger, hud og ben. De øyeblikkelige metodene er også anvendbare for behandlingen av infeksjoner i brannsår, sår og proteseinnretninger. De samme metodene kan bli brukt spesielt i behandling av sykdommer slik som osteomyelitt, som resulterer fra en infeksjon av en type eller alvorlighetsgrad som krever forlenget behandling med nåværende brukte antimikrobielle midler. Foreliggende oppfinnelse gjelder anvendelsen av lysostafinanaloger til fremstilling av et medikament til behandling av slike infeksjoner og sykdommer når de er forårsaket av stafylokokker som er resistente til vanlig brukte antibiotika. Mer spesifikt omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av lysostafin, eller en variant derav, som bibeholder evnen til lysostafin for proteolytisk angrep mot glycininneholdende broer i celleveggpeptidglykan hos stafylokokker, i fremstillingen av et farmasøytisk preparat for parenteral administrering til mennesker for å behandle stafylokk-infeksjoner som er minst delvis resistente overfor vancomycin, hvor nevnte lysostafin administreres i mer enn én dose.

Claims (14)

1. Anvendelse av lysostafin, eller en variant derav, som bibeholder evnen til lysostafin for proteolytisk angrep mot glycininneholdende broer i celleveggpeptidglykan hos stafylokokker, i fremstillingen av et farmasøytisk preparat for parenteral administrering til mennesker for å behandle stafylokk-infeksjoner som er minst delvis resistente overfor vancomycin, hvor nevnte lysostafin administreres i mer enn én dose.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor administreringen er i en dose på fra 0,5 til 200 mg/kg/dag gitt som oppdelte doser.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvori den farmasøytiske dosen omfatter fra 3 til 50 mg/kg/dag.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvori den farmasøytiske dosen omfatter fra 3 til 25 mg/kg/- dag.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor dosene er delt i 2 til 4 doser pr. dag.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor dosene er gitt ved kontinuerlig infusjon.

7. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor hver dose ikke overgår 50 mg/kg.

8. Anvendelse ifølge krav 1 til 7 sammen med minst ett annet antimikrobielt middel.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvori det andre antimikrobielle midlet er en rifamycin eller et glykopeptid.

10. Anvendelse ifølge krav 1 til 9, hvori infeksjonen er i hjerteklaff, blod, nyre, lunge, ben eller hjernehinner, eller er assosiert med et kateter eller proteseinnretning.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvori infeksjonen er endokarditt, osteomyelitt eller bakteremi.

12. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den parenterale administrering er ved intravenøs injeksjon.

13. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori lysostafin eller variant derav er rekombinant produsert.

14. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori infeksjonen er ved en Staphylococcus aureus- stamme som er meticillinresistent og har intermediatfølsomhet overfor vancomycin.