DE69835279T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von infektionen unter verwendung von kationischen peptiden allein oder in kombination mit antibiotika - Google Patents

Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von infektionen unter verwendung von kationischen peptiden allein oder in kombination mit antibiotika Download PDF

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Description

  • Technischer Bereich
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen ein Verfahren für die Behandlung von Infektionen, die durch Mikroorganismen bedingt sind, unter Verwendung kationischer Peptide oder Verbindungen einer Kombination kationischer Peptide und antibiotischer Mittel und insbesondere die Verwendung dieser Peptide und antibiotischer Mittel, um erworbene Resistenz, Toleranz und inherente Resistenz eines infektiven Organismus gegen ein antibiotisches Mittel zu überwinden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Für die meisten gesunden Individuen sind Infektionen störend, aber im allgemeinen nicht lebensbedrohlich. Viele Infektionen werden erfolgreich durch das Immunsystem der Person bekämpft. Die Behandlung ist eine Hilfestellung und im allgemeinen ohne weiteres in entwickelten Länder verfügbar. Infektiöse Erkrankungen sind jedoch in Entwicklungsländern und in immun-kompromittierten Personen ein schweres Problem.
  • In Entwicklungsländern ist das Fehlen angemessener sanitärer Einrichtungen und der sich daraus ergebenden schlechten Hygiene eine Umgebung, die bakterielle, parasitäre, Pilz- und virale Infektionen fördert. Die schlechte Hygiene und Ernährungsmängel können die Wirksamkeit natürlicher Barrieren wie der Haut und der Schleimhautmembran gegenüber der Besiedelung durch infektiöse Mittel oder die Fähigkeit des Immunsystems die Mittel zu entfernen, verringern. Gleichermaßen kann ein beständiger Angriff von Pathogenen die Verteidigung des Immunsystems der Antikörperproduktion und der phagozytotischen Zellen (z.B. der polymorphen Neutrophilen) auf ein anormales Niveau belasten. Ein Zusammenbruch der Verteidigung des Wirts kann auch aufgrund solcher Zustände wie Kreislaufstörung, mechanische Verschlüsse, Müdigkeit, Rauchen, übermäßiges Trinken, genetische Defekte, AIDS, eine Knochenmarkstransplantation, Krebs und Diabetes auftreten. Ein zunehmend vorherrschendes Problem in der Welt sind opportunistische Infektionen von Individuen, die HIV-positiv sind.
  • Obwohl Vakzine erhältlich sein können, um gegen einige dieser Organismen zu schützen, sind Vakzinierungen nicht immer aufgrund von Faktoren wie der unzureichenden Verabreichungsmechanismen und einer wirtschaftlichen Armut durchführbar oder aufgrund solcher Faktoren wie der zu späten Verabreichung während der Infektion, der Unfähigkeit des Körpers, eine Immunantwort gegen das Vakzin auszubilden oder der Evolution des Pathogens, wirksam. Für andere pathogene Mittel sind keine Vakzine erhältlich. Wenn der Schutz gegen die Infektion nicht möglich ist, wird im allgemeinen auf die Behandlung der Infektion abgezielt. Die Hauptwaffe im Arsenal der Behandlung sind Antibiotika. Während Antibiotika sich als wirksam gegen viele Bakterien erwiesen haben und daher eine unzählige Anzahl von Leben gerettet haben, sind sie kein Allheilmittel. Die Überverwendung von Antibiotika in bestimmten Situationen hat die Verbreitung resistenter bakterieller Stämme gefördert. Und von großer Wichtigkeit ist auch, daß antibakterielle Mittel gegen virale Infektionen nutzlos sind.
  • Eine Vielzahl von Organismen stellen kationische (positiv geladene) Peptide her, Moleküle die als Teil eines nichtspezifischen Verteidigungsmechanismus gegen Mikroorganismen verwendet werden. Wenn isoliert, sind diese Peptide gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen, umfassend Bakterien, Pilze und bestimmte umhüllte Viren, toxisch. Ein kationes Peptid, das in Neutrophilen gefunden worden ist, ist das Indolicidin. Während Indolicidin gegen viele Pathogene wirkt, gibt es beachtenswerte Ausnahmen und verschiedene Grade der Toxizität.
  • Zusätzlich kann weder die Antibiotikatherapie allein oder die kationische Peptidtherapie allein wirksam alle Infektionen bekämpfen. Durch die Ausweitung der Kategorien der Mikroorganismen, die auf die Therapieantwort reagieren oder durch das Überwinden der Resistenz eines Mikroorganismus gegenüber einem antibiotischen Mittel, wird die Gesundheit und das Wohlbefinden verbessert werden. Zusätzlich wird die Lebensqualität verbessert, beispielsweise aufgrund einer verkürzten Dauer der Therapie, verkürzter Krankenhausaufenthalte umfassend Intensivabteilungen mit der gleichzeitigen Verringerung des Risikos schwerer nosokomikaler (im Krankenhaus erworbener) Infektionen.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart kationische Peptide umfassend Analoge von Indolizidin und Cecropin-/Melittin-Fusionspeptide in Kombination mit Antibiotika, so daß die Kombination entweder synergistisch dazu in der Lage ist, die Toleranz des Mikroorganismus zu überwinden, die Resistenz gegenüber der Antibiotikabehandlung zu überwinden oder andere verwandte Vorteile zur Verfügung stellt.
  • Die WO-A-9708199, die WO-A-9522338, die WO-A-9222308 offenbaren alle kationische Peptide. Die WO-A-9638473, die WO-A-9112815, Antibacterial Agents Chemother., 40(8), 1801-5, 1996 und Clinical Infect. Disease, 24, Suppl. 1, S 148-50 (Jan. 1997) offenbaren alle eine Synergie zwischen kationischen Peptiden und Antibiotika.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Offenbarung stellt im allgemeinen die gemeinsame Verabreichung kationischer Peptide mit einem antibiotischen Mittel zur Verfügung und stellt auch Indolicidinanaloga zur Verfügung. Die Erfindung betrifft kationische Peptide wie im Anspruch 1 definiert.
  • In anderen Ausführungsformen weist das kationische Peptidanalog ein oder mehrere Aminosäuren auf, die zu einer korrespondierenden D-Aminosäure verändert wurden und in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die N-terminale und/die C-terminale Aminosäure eine D-Aminosäure. Andere bevorzugte Modifikationen umfassen Analoga, die an der N-terminalen Aminosäure acetyliert sind, an der C-terminalen Aminosäure amidiert sind, an der C-terminalen Aminosäure esterifiziert sind und die durch die Aufnahme von Homoserin/Homoserinlaktonen an der C-terminalen Aminosäure modifiziert sind. In anderen Aspekten wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend ein Indolicidinanalog und ein Antibiotikum.
  • Zusätzlich wird eine Vorrichtung, die eine medizinische Vorrichtung sein kann, zur Verfügung gestellt, die mit einem kationischen Peptid und einem antibiotischen Mittel beschichtet ist.
  • Die Offenbarung stellt im allgemeinen auch Verfahren für die Behandlung von Infektionen zur Verfügung, die durch einen Mikroorganismus unter Verwendung einer Kombination kationischer Peptide und eines antibiotischen Mittels ausgelöst werden. In einem Aspekt umfaßt das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Kombination eines antibiotischen Mittels und eines kationischen Peptids an einen Patienten, wobei die Verabreichung eines antibiotischen Mittels allein unwirksam ist. Bevorzugte Antibiotika und Peptide werden zur Verfügung gestellt.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren für die Verbesserung der Aktivität eines antibiotischen Mittels gegen eine Infektion in einem Patienten, die durch einen Mikroorganismus ausgelöst wird, zur Verfügung gestellt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines antibiotischen Mittels und eines kationischen Peptids an den Patienten. In noch einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren für die Verbesserung der antibiotischen Aktivität von Lysozym oder Nisin, umfassend die Verabreichung von Lysozym oder Nisin mit einem antibiotischem Mittel, zur Verfügung gestellt.
  • In anderen Aspekten werden Verfahren für die Behandlung von Infektionen an einem Patienten zur Verfügung gestellt, die durch ein Bakterium ausgelöst werden, das gegenüber einem antibiotischen Mittel tolerant ist, die durch einen Mikroorganismus, der inherent gegenüber einem antibiotischen Mittel resistent ist, ausgelöst werden oder die durch einen Mikroorganismus ausgelöst wird, das eine erworbene Resistenz gegenüber einem antibiotischen Mittel aufweist; umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis des antibiotischen Mittels und eines kationischen Peptids an den Patienten, wodurch die Toleranz, die inherente oder erworbene Resistenz gegenüber dem antibiotischen Mittel ausgeräumt wird.
  • In noch weiteren verwandten Aspekten werden Verfahren für das Töten eines Mikroorganismus, der gegenüber einem antibiotischen Mittel tolerant, inherent resistent ist oder der eine Resistenz erworben, zur Verfügung gestellt, umfassend das in Kontakt bringen des Mikroorganismus mit dem antibiotischen Mittel und einem kationischen Peptid, wobei die Toleranz, die inherente Resistenz oder erworbene Resistenz gegen das antibiotische Mittel ausgeräumt wird.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch Verweis auf die vorhergehend detaillierte Beschreibung und die angefügten Zeichnungen offensichtlich werden. Zusätzlich sind verschiedene Referenzen unten dargestellt, die in größerem Detail bestimmte Verfahren oder Zusammensetzungen beschreiben und die daher in ihrem gesamten Umfang durch Verweis aufgenommen werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A-E zeigen die Ergebnisse des Zeit-Abtötungstestverfahrens für MBI 11CN, MBI 11F3CN, MBI 11B7CN, MBI 11F4CN und MBI 26 plus Vancomycin. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten × 10–4 über die Zeit wird dargestellt.
  • 2 ist eine graphische Darstellung, die die Stabilität von MBI 11B7CN in Hitze-inaktiviertem Kaninchenserum darstellt.
  • 3 zeigt die HPLC-Spuren, die die Wirkungen von Amastatin und Bestatin auf den Peptidabbau zeigen.
  • 4 ist ein Chromatogramm, das die Extraktion von Peptiden in Kaninchenplasma zeigt.
  • 5 ist eine Zeichnung, die die Änderung der in vivo MBI 11CN-Mengen im Blut zu verschiedenen Zeiten nach intraperitonealer Injektion darstellt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bevor die Erfindung dargestellt wird, kann es für das Problemverständnis nützlich sein, Definitionen bestimmter Begriffe, die hierin verwendet werden, darzustellen.
  • Die hierin verwendeten Aminosäurebezeichnungen sind entweder wie der übliche Ein- oder Drei-Letter-Code dargestellt. Ein großer Buchstabe deutet auf eine Aminosäure der L-Form hin; ein kleiner Buchstabe deutet auf eine Aminosäure der D-Form hin.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet ein „antibiotisches Mittel" ein Molekül, das dazu neigt, Leben zu verhindern, zu inhibieren oder zu zerstören. Der Begriff „antimikrobielles Mittel" bezeichnet ein antibiotisches Mittel, das spezifisch gegen einen Mikroorganismus gerichtet ist.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „kationisches Peptid" ein Peptid, das eine positive Nettoladung innerhalb des pH-Bereichs von 4-10 aufweist. Ein kationisches Peptid weist mindestens eine Länge von 5 Aminosäuren auf und besitzt mindestens eine basische Aminosäure (z.B. ein Arginin, ein Lysin, ein Histidin). Vorzugsweise hat das Peptid eine meßbare anti-mikrobielle Aktivität, wenn es allein verabreicht wird.
  • Wie hierin verwendet, weist ein „Peptid-Analog", ein „Analog" oder eine „Variante" eines kationischen Peptids wie Indolicidin mindestens eine Länge von 5 Aminosäuren auf, weist mindestens eine basische Aminosäure auf (z.B. ein Arginin und ein Lysin) und weist eine anti-mikrobielle Aktivität auf Wenn nicht anders angegeben, bezeichnet eine benannte Aminosäure die L-Form. Basische Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin, Histidin und Derivate. Hydrophobe Reste umfassen Tryptophan, Phenylalanin, Isoleucin, Leucin, Valin und Derivate.
  • Auch im Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt sind Aminosäurederivate, die durch chemische Mittel wie Methylierung (z.B. α-Methylvalin), Amidierung, insbesondere die C-terminale Aminosäure durch Alkylamin (z.B. Ethylamin, Ethanolamin und Ethylendiamin) und Veränderung einer Aminosäurenseitenkette, wie durch Acylierung der ε-Aminosäuregruppe des Lysins verändert worden sind. Andere Aminosäuren, die in das Analog aufgenommen werden können, umfassen alle D-Aminosäuren, die den 20 L-Aminosäuren, die üblicherweise in Proteinen gefunden werden, entsprechen, Iminoaminosäuren, seltene Aminosäuren wie Hydroxyllysin oder Nicht-Protein-Aminosäuren wie Homoserin und Ornithin. Ein Peptidanalog kann auch keine oder eine oder mehrere dieser Derivate und D-Aminosäuren aufweisen. Zusätzlich kann ein Peptid auch als ein Retro-, Inverto- oder Retro-Inverto-Peptid synthetisiert werden.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet „inhärente Resistenz" eines Mikroorganismus gegen ein antibiotisches Mittel die natürliche Resistenz gegenüber der Wirkung des Mittels selbst in Abwesenheit der vorherigen Aussetzung gegenüber dem Mittel. (R.C. Moellering Jr., Principles of Anit-infective Therapy; In: Principles and Practice of Infectious Diseases, 4. Ausgabe, Hrsg.; G.L. Mandell, J.E. Bennett, R. Dolin. Chruchill Livingstone, New York, U.S.A., 1995, Seite 200).
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet "erworbene Resistenz" eines Mikroorganismus gegenüber einem antibiotischen Mittel eine Resistenz, die nicht durch normal erreichbare Serumkonzentrationen eines empfohlenen antibiotischen Mittels, beruhend auf der empfohlenen Dosierung, inhibiert wird. (NCCLS-Richtlinien).
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet die „Toleranz" eines Mikroorganismus gegenüber einem antibiotischen Mittel, wenn es eine mikrostatische statt einer mikrozidalen Wirkung des Mittels gibt. Die Toleranz wird durch ein MBC:MIC-Verhältnis, das größer oder gleich 32 ist, gemessen. (Textbook of Diagnostic Microbiology, Hrsg., C.R. Mahon und G. Manuselis, W.B. Saunders Co., Toronto Kanada, 1995, Seite 92).
  • Wie oben erwähnt, stellt diese Offenbarung Verfahren für die Behandlung von Infektionen zur Verfügung, die durch einen Mikroorganismus ausgelöst werden, Verfahren für das Abtöten eines Mikroorganismus und Verfahren für die Förderung der Aktivität eines antibiotischen Mittels. Insbesondere sind diese Verfahren besonders verwendbar, wenn der Mikroorganismus gegenüber einem antibiotischen Mittel durch einen Mechanismus wie Toleranz, inherente Resistenz oder erworbene Resistenz resistent ist. In dieser Offenbarung werden Infektionen durch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosierung eines kationischen Peptids allein oder in Kombination mit einem antibiotischen Mittel an einen Patienten mit einer Infektion behandelt. Gleichermaßen kann die Kombination mit den Mikroorganismus in Kontakt gebracht werden, um das Abtöten zu bewirken.
  • I. KATIONISCHE PEPTIDE
  • Wie oben bemerkt, ist ein kationisches Peptid ein Peptid, das eine positive Nettoladung innerhalb des pH-Bereiches 4-10 aufweist. Ein Peptid ist mindestens 5 Aminosäuren lang und vorzugsweise nicht mehr als 25, 27, 30, 35 oder 40 Aminosäuren lang. Peptide, die 12 bis 30 Reste aufweisen, sind bevorzugt. Beispiele von nativen kationischen Peptiden umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die beispielhaften Peptide, die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt werden.
  • Figure 00080001
  • Figure 00090001
  • Figure 00100001
  • Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • Figure 00130001
  • Zusätzlich zu den oben aufgeführten Peptiden sind Chimären und Analoge dieser Peptide im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich. Für diese Erfindung müssen Analoge nativer kationischer Peptide eine positive Nettoladung beibehalten, aber können D-Aminosäuren, Aminosäurederivate, Einfügungen, Deletionen und ähnliches, von denen einige unten diskutiert werden, enthalten. Chimäre umfassen Fusionen kationischer Peptide, wie die oben aufgeführten Peptide oder Fragmente davon, und Fusionen kationischer Peptide mit nicht-kationischen Peptiden.
  • Wie hierin beschrieben, ist die Modifikation jedes der Reste umfassend den N- oder den C-Terminus im Umfang der Erfindung. Eine bevorzugte Modifikation des C-Terminus ist die Amidierung. Andere Modifikationen des C-Terminus umfassen die Esterifizierung und die Laktonbildung. Die N-terminalen Modifikationen umfassen Acetylierung, Acylierung, Alkylierung, PEG-ylierung, Myristylierung und ähnliches. Zusätzlich können die Peptide verändert sein, so dass sie ein Polymer-modifiziertes Peptid wie unten beschrieben bilden. Peptide können auch markiert sein wie durch eine radioaktive Markierung, eine fluoreszente Markierung, eine massenspektrometrische Markierung, Biotin und ähnliche.
  • A. Indolicidin und Analoge
  • Wie hierin verwendet bezeichnet „Indolicidin" ein antimikrobielles kationisches Peptid. Die Indolicidine können aus einer Vielzahl von Organismen isoliert werden. Ein Indolicidin wird aus Rinder-Neutrophilen isoliert und ist ein 13 Aminosäuren langes Peptid, das in seiner nativen Form am Carboxy-Terminus amidiert ist (Selsted et al., J. Biol. Chem. 267:4292, 1992). Eine Aminosäuresequenz des Indolicidins wird in der SEQ ID NR: 1 dargestellt.
  • B. Cecropin Peptide
  • Die Cecropine sind kationische Peptide, die eine antimikrobielle Aktivität sowohl gegen Gram-positive als auch Gram-negative Bakterien aufweisen. Die Cecropine sind sowohl aus wrbellosen (z.B. Insektenhemolymphe) als auch aus Wirbeltieren (z.B. Schweinedärme) isoliert worden. Im allgemeinen weisen diese Peptide 35 bis 39 Reste auf. Ein beispielhaftes Cecropin weist die Sequenz KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK (SEQ ID NR. 79). Einige weitere Cecropin Sequenzen werden in der Tabelle 1 aufgeführt. Im Zu sammenhang mit dieser Erfindung umfassen Cecropine Analoge, die eine oder mehrere Insertionen, Deletionen, modifizierte Aminosäuren, D-Aminosäuren und ähnliches aufweisen.
  • C. Melittin Peptide
  • Melittin ist ein kationisches Peptid, das in Bienengift gefunden wird. Eine Aminosäuresequenz eines beispielhaften Melittinpeptids ist GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKKRQQ (SEQ ID NR. 80). Wie die Cecropine, zeigt Mellitin eine antimikrobielle Aktivität sowohl gegen Gram-positive als auch gegen Gram-negative Bakterien. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung umfaßt Melittin Analoge, die eine oder mehrere Insertionen, Deletionen, modifizierte Aminosäuren, D-Aminosäuren und ähnliches aufweisen.
  • D. Cecropin-Mellitin chimäre Peptide
  • Wie hierin erwähnt, umfassen kationische Peptide Fusionspeptide nativer kationischer Peptide und Analoge der Fusionspeptide. Insbesondere werden Fusionen von Cecropin und Mellitin zur Verfügung gestellt. Eine beispielhafte Fusion hat die Sequenz: Cecropin A (Reste 1-8)/Melittin (Reste 1-18). Andere Fusionspeptide, die im Zusammenhang mit dieser Erfindung nützlich sind, werden durch die allgemeinen Formeln unten wiedergegeben.
    Figure 00150001
    wobei R1 ein hydrophober Aminosäurerest, R2 ein hydrophiler Aminosäurerest und X von etwa 14 bis 24 Aminosäurereste bedeutet.
  • E. Drosocin und Analogie
  • Wie hierin angegeben, umfassen die kationischen Peptide Drosocin und Drosocinanaloge. Die Drosocine werden aus Drosophila melanogaster isoliert. Ein beispielhaftes Drosocin ist ein 19 Aminosäuren langes Peptid, das die Sequenz: GKPRPYSPRPTSHPRPIRV (SEQ ID NR: 89; GenBank Zugangsnr. S35984) aufweist. Analoge des Drosocins umfassen Peptide, die Insertionen, Deletionen, modifizierte Aminosäuren, D-Aminosäuren und ähnliches aufweisen.
  • F. Peptidsynthese
  • Die Peptide können durch chemische Standardverfahren, umfassend die Synthese durch ein automatisches Verfahren, synthetisiert werden. Im allgemeinen werden Peptidanaloge beruhend auf der Standardfestphase Fmoc-Schutzstrategie, mit HATU als Kopplungsreagenz synthetisiert. Das Peptid wird von dem Festphasenharz mit Trifluoressigsäure, die geeignete Fängersubstanzen enthält, gespalten, was auch zur Entschützung der funktionellen Seitenkettengruppen führt. Das Rohpeptid wird weiter unter Verwendung präparativer Reverser-Phasen-Chromatographie gereinigt. Andere Reinigungsverfahren wie Verteilungschromatographie, Gelfiltration, Gelelektrophorese oder Ionenaustausch-Chromatographie können verwendet werden.
  • Andere Syntheseverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, wie die tBoc-Schutzstrategie oder die Verwendung verschiedener Kopplungsreagenzien oder ähnliches können verwendet werden, um gleichwertige Peptide zu erzeugen. Die Peptide können als ein lineares Molekül oder als verzweigte Moleküle synthetisiert werden. Die verzweigten Peptide enthalten üblicherweise ein Kernpeptid, das eine Anzahl von Anheftungspunkten für weitere Peptide zur Verfügung stellt. Lysin wird am häufigsten als Kernpeptid verwendet, da es eine funktionelle Carboxylgruppe und zwei funktionelle (Alpha und Epsilon) Amingruppen aufweist. Andere Diaminsäuren können auch verwendet werden. Um diese multimeren Peptide zu synthetisieren, wird das Festphasenharz mit der Kernmatrix derivatisiert und die anschließende Synthese und Spaltung vom Harz folgt dem Standardverfahren. Die Multimerpeptide können im Zusammenhang mit dieser Erfindung wie jedes der linearen Peptide verwendet werden.
  • G. Rekombinante Herstellung der Peptide
  • Die Peptide können alternativ durch rekombinante Produktion synthetisiert werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,593,866). Eine Vielzahl von Wirtsystemen, umfassend Bakterien (z.B. E. coli), Hefe (z.B. Saccharomyces cerevisiae), Insekten- (z.B. Sf9) und Säugetierzellen (z.B. CHO, COS-7), sind für die Herstellung von Peptidanaloga geeignet. Viele Expressionsvekto ren sind entwickelt worden und sind für jeden dieser Wirte erhältlich. Im allgemeinen werden Bakterienzellen und Vektoren, die in Bakterien funktionell sind, in dieser Erfindung verwendet. Es kann jedoch manchmal bevorzugt sein, Vektoren zu haben, die in anderen Wirten funktionell sind. Vektoren und Verfahren für die Klonierung und Expression in E. coli werden hier diskutiert, sowie beispielsweise in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1987) und in Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., 1995).
  • Eine DNA-Sequenz, die ein kationisches Peptid kodiert, wird in einen für den Wirt geeigneten Expressionsvektor eingefügt. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Gen in einen Vektor kloniert, um ein Fusionsprotein zu erzeugen. Der Fusionspartner wird so ausgewählt, dass er einen anionischen Bereich aufweist, so dass ein bakterieller Wirt gegenüber der toxischen Wirkung des Peptids geschützt wird. Diese Schutzregion neutralisiert im wesentlichen die antimikrobiellen Wirkungen des Peptids und kann auch den Peptidabbau durch Wirtsproteasen verhindern. Der Fusionsparner (das Trägerprotein) der Erfindung kann des weiteren dazu dienen, das Fusionsprotein in Einschlusskörper, in die äußere Membran oder in die extrazelluläre Umgebung zu transportieren. Die Trägerproteine, die im Zusammenhang mit dieser Erfindung geeignet sind, umfassen insbesondere, sind aber nicht beschränkt auf Glutathion-S-Transferase (GST), das Protein A aus Staphylococcus aureus, zwei synthetische IgG-Bindungsdomänen (ZZ) des Proteins A, das äußere Membranprotein F, die β-Galactosidase (lacZ) und verschiedene Produkte des Bakteriophagen λ und des Bakteriophagen T7. Des weiteren muss nicht das gesamte Trägerprotein verwendet werden, solange der schützende anionische Bereich vorhanden ist.
  • Um die Isolierung der Peptidsequenz zu ermöglichen, werden Aminosäuren, die gegenüber einer chemischen Spaltung (z.B. CNBr) oder einer enzymatischen Spaltung (z.B. V8 Protease, Trypsin) zugänglich sind, verwendet, um das Peptid und den Fusionspartner zu verbinden. Für die Expression in E. coli ist der Fusionspartner vorzugsweise ein normales intrazelluläres Protein, das die Expression auf Einschlusskörperbildung hinleitet. In solchen Fällen besteht nach der Abspaltung zur Freisetzung des Endproduktes freizusetzen keine Notwendigkeit für eine Renaturierung des Peptids.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die DNA-Kassette, die den Fusionsparner und das Peptidgen umfaßt, in einen Expressionsvektor eingeführt werden, der ein Plasmid, ein Virus oder ein anderes nach dem Stand der Technik bekanntes Vehikel sein kann. Zumindest sollte der Expressionsvektor eine Promotersequenz enthalten. Andere regulatorische Sequenzen können jedoch auch enthalten sein. Solche Sequenzen umfassen einen Enhancer, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Transkriptionsterminationssignalsequenz, eine Sekretionssignalsequenz, einen Replikationsursprung, einen selektierbaren Marker und ähnliche. Die regulatorischen Sequenzen werden wirksam miteinander verbunden, um die Transkription und die anschließende Translation zu erlauben. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor ein Plasmid, der einen induzierbaren oder konstitutiven Promotor enthält, um eine wirksame Transkription der eingefügten DNA-Sequenz in dem Wirt zu ermöglichen. Die Transformation der Wirtszelle mit der rekombinanten DNA kann unter Verwendung von Ca++-vermittelten Verfahren durch Elektroporation oder andere Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Das Peptidprodukt wird durch Standardverfahren wie Affinitäts-, Größenausschluß- oder Ionenaustauschchromatographie, HPLC und ähnliche isoliert. Ein isoliertes Peptid sollte vorzugsweise in der Coomassie-Blaufärbung eines SDS-PAGE eine Hauptbande aufweisen, die mindestens 90% des Materials beträgt.
  • II. TESTEN
  • Die kationischen Peptide der vorliegenden Erfindung werden entweder allein oder in Kombination mit einem antibiotischen Mittel oder einem anderen Analog auf ihr Potential als antibiotische therapeutische Mittel unter Verwendung einer Reihe von Testverfahren untersucht. Vorzugsweise werden alle Peptide anfänglich in vitro untersucht, wobei die vielversprechenden Kandidaten für die weitere Bewertung in vivo ausgewählt werden und dann Kandidaten für vorklinische Studien ausgewählt werden. Die in vitro-Testverfahren umfassen das Messen der antibiotischen Aktivität, der Toxizität, der Löslichkeit, die Pharmakologie, die Sekundärstruktur, die liposomale Permeabilisierung und ähnliche. Die in vivo-Testverfahren umfassen die Bewertung der Wirksamkeit in Tiermodellen, die Antigenizität, die Toxizität und ähnliche. Im allgemeinen werden in vitro-Testverfahren zuerst durchgeführt, gefolgt von in vivo-Testverfahren.
  • Peptide, die eine gewisse antimikrobielle Aktivität aufweisen, werden bevorzugt, obwohl eine solche Aktivität nicht für die Förderung der Aktivität des antibiotischen Mittels notwendig sein muss. Auch sollten die Peptide für die in vivo-Verwendung vorzugsweise annehmbare Toxizitätsprofile, wie durch Standardverfahren gemessen, aufweisen. Eine niedrigere Toxizität ist bevorzugt.
  • A. In vitro-Testverfahren
  • Die kationischen Peptide, die Indolicidinanaloge umfassen, werden beispielsweise durch ein Agaroseverdünnungs-MIC-Testverfahren, ein Wachstumsmediumverdünnungs-Testverfahren, durch ein Zeit-Abtötungs-Testverfahren oder äquivalente Verfahren untersucht. Die antibiotische Aktivität wird als Inhibierung des Wachstums oder des Tötens des Mikroorganismus (z. B. Bakterien, Pilze) gemessen.
  • Kurz gesagt, ein Kandidatenpeptid in Müller-Hinton-Wachstumsmedium, das mit Calcium und Magnesium ergänzt wurde, wird mit geschmolzener Agarose vermischt. Andere Wachstumsmedien und Agar können, so lange wie das Peptid frei durch das Medium diffundieren kann, verwendet werden. Die Agarose wird in Petrischalen oder Vertiefungen gegossen, es wird ermöglicht, dass es sich verfestigt, und ein Teststamm wird auf die Agaroseplatte aufgetragen. Der Teststamm wird teilweise nach der geplanten Anwendung des Peptids ausgewählt. So wird zum Beispiel, wenn ein Indolicinanalog mit Aktivität gegen S aureus erwünscht ist, ein S. aureus-Stamm verwendet. Es kann wünschenswert sein, das Analog auf verschieden Stämme und/oder auf klinische „Isolate" der Testspezies zu untersuchen. Die Platten werden über Nacht inkubiert und visuell auf bakterielles Wachstum kontrolliert. Eine minimale inhibitorische Konzentration (MIC) eines kationischen Peptids steht für die niedrigste Konzentration des Peptids, die das Wachstum des Organismus komplett inhibiert. Peptide, die eine gute Aktivität gegen den Teststamm oder die Gruppe von Stämmen aufweisen, und typischerweise einen MIC von weniger oder gleich 16 μg/ml haben, werden für das weitere Testen ausgewählt.
  • Alternativ können Zeit-Abtötungskurven verwendet werden, um die Unterschiede in den Koloniezahlen über eine gesetzte Zeitperiode, typischerweise 24 Stunden, zu bestimmen. Kurz gesagt, es wird eine Suspension von Organismen bekannter Konzentration hergestellt und ein Kandidatenpeptid hinzugefügt. Aliquots der Suspension werden zu gesetzten Zeiten entfernt, verdünnt, auf Medium plattiert, inkubiert und gezählt. Die MIC wird als die niedrigste Konzentration des Peptids gemessen, die das Wachstum des Organismus komplett inhibiert. Im allgemeinen werden niedrigere MIC-Werte bevorzugt.
  • Kandidaten kationischer Peptide können weiter auf ihre Toxizität gegenüber normalen Säugetierzellen getestet werden. Ein beispielhaftes Testverfahren ist ein Rote-Blutzellen(RBC) (Erythrozyten)-Hämolysetestverfahren. Kurz gesagt, werden in diesem Testverfahren rote Blutzellen aus Gesamtblut isoliert, typischerweise durch Zentrifugation, und frei von Plasmakomponenten gewaschen. Eine 5 %-ige (v/v) Erythrozyten-Suspension wird in isotonischer Kochsalzlösung mit unterschiedlichen Konzentrationen des Peptidanaloges inkubiert. Im allgemeinen wird das Peptid in einem geeigneten Formulierungspuffer vorliegen. Nach Inkubation von ungefähr einer Stunde bei 37°C werden die Zellen zentrifugiert und die Absorption des Überstands bei 540 nm bestimmt. Eine relative Messung der Lyse wird durch Vergleich zur Absorption nach kompletter Lyse der Erythrozyten unter Verwendung von NH4Cl oder einem Äquivalent (unter Herstellung eines 100%-Werts) bestimmt. Ein Peptid mit < 10% Lyse bei 100 μg/ml ist geeignet. Vorzugsweise ist die Lyse bei 100 μg/ml < 5%. Diejenigen Peptide, die nicht lytisch oder nur gemäßigt lytisch sind, sind wünschenswert und für weiteres Überprüfen geeignet. Andere in vitro-Toxizitätstestverfahren, z.B. die Messung der Toxizität bezüglich kultivierter Säugetierzellen, können verwendet werden, um die in vitro-Toxizität abzuschätzen.
  • Die Lösbarkeit des Peptids in dem Formulierungspuffer ist ein zusätzlicher Parameter, der überprüft werden kann. Verschiedene unterschiedliche Testverfahren können verwendet werden, wie z.B. das Sichtbarwerden im Puffer. Kurz gesagt, das Peptid wird in Lösung wie Wachstumsmedium oder Formulierungspuffer suspendiert. Das Sichtbarwerden wird gemäß einer Skala abgeschätzt, die sich von (a) klar, kein Präzipitat, (b) leichtes, diffuses Präzipitat bis zu (c) trübes, schweres Präzipitat erstreckt. Feinere Abstufungen können verwendet werden. Im allgemeinen ist weniger Präzipitat wünschenswerter. Jedoch kann einiges Präzipitat akzeptabel sein.
  • Zusätzliche in vitro-Testverfahren können durchgeführt werden, um das Potential des Peptids als ein Therapeutikum abzuschätzen. Solche Testverfahren beinhalten die Peptidlöslichkeit in Formulierungen, die Pharmakologie in Blut oder Plasma, die Serum-Proteinbindung, die Analyse der Sekundärstruktur, z.B. durch Zirkulardichroismus, die Liposomendurchlässigkeit und die bakterielle Innermembrandurchlässigkeit.
  • B. In vivo-Testverfahren
  • Peptide, einschließlich Peptidanaloge, die auf der Basis der Resultate von den in vitro-Testverfahren ausgewählt wurden, können in vivo auf ihre Wirksamkeit, Toxizität und ähnliches getestet werden.
  • Die antibiotische Aktivität der ausgewählten Peptide kann unter Verwendung von Tiermodellen in vivo auf ihre Fähigkeit, mikrobielle Infektionen zu verbessern, abgeschätzt werden. Eine Anzahl von Verfahren und Tiermodellen sind erhältlich. Innerhalb dieser Testverfahren ist ein Peptid als ein Therapeutikum nützlich, wenn die Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen verglichen mit der Inhibierung eines Vehikels alleine statistisch signifikant ist. Diese Messung kann direkt aus Kulturen, die von Körperflüssigkeiten oder anderen Stellen isoliert wurden, oder indirekt durch Abschätzung der Überlebensraten infizierter Tiere gemacht werden. Zur Abschätzung der antibakteriellen Aktivität sind verschiedene Tiermodelle erhältlich, wie akute Infektionsmodelle, einschließlich jener, bei denen (a) normale Mäuse eine letale Dose von Mikroorganismen erhalten, (b) neutropenische Mäuse eine letale Dose von Mikroorganismen erhalten oder (c) Kaninchen ein Inokulum in das Herz erhalten, sowie chronische Infektionsmodelle. Das ausgewählte Modell wird zum Teil von der beabsichtigten klinischen Indikation des Analogs abhängen.
  • Zum Beispiel werden in einem normalen Mausmodell Mäuse ip. oder iv. mit einer letalen Dosis von Bakterien inokuliert. Typischerweise ist die Dosis derart, das 90-100% innerhalb von zwei Tagen sterben. Die Wahl eines Mikroorganismusstammes für dieses Testverfahren hängt zum Teil von der beabsichtigten Anwendung des Analogs ab und in den begleitenden Beispielen werden Testverfahren mit drei unterschiedlichen Staphylococcus-Stämmen durchgeführt. Kurz gesagt, kurz bevor oder nach Inokulation (im allgemeinen innerhalb 60 Minuten), wird das Analog in einem geeigneten Formulierungspuffer injiziert. Mehrfache Injektionen des Analogs können verabreicht werden. Die Tiere werden bis zu acht Tage nach Infektion beobachtet, und das Überleben der Tiere wird aufgezeichnet. Eine erfolgreiche Behandlung rettet entweder die Tiere vor dem Tod oder verzögert den Tod in einem statistisch signifikanten Grad im Vergleich zu Kontrolltieren ohne Behandlung.
  • Die in vivo-Toxizität eines Peptids wird durch die Verabreichung eines Dosisbereichs an die Tiere, typischerweise Mäuse, gemessen, mittels einer Route, die zum Teil durch die beabsichtigte klinische Verwendung definiert wird. Das Überleben der Tiere wird aufgezeichnet und der LD50, LD90-100 und die maximale tolerierte Dosis (MTD) kann errechnet werden, um einen Vergleich der Analoge zu ermöglichen.
  • Weiterhin ist für die in vivo-Verwendung eine niedrige Immunogenität bevorzugt. Um die Immunogenität zu messen, werden Peptide in normale Tiere, üblicherweise Kaninchen, injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer einzelnen oder nach mehreren Injektionen wird Serum gewonnen und auf Antikörperreaktivität gegen das Peptidanalog getestet. Antikörper gegen Peptide können mit Hilfe des ELISAs, Immunpräzipitationstestverfahren, Western Blots und anderen Methoden identifiziert werden (siehe Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988). Bevorzugt ist keine oder eine geringe Antikörperreaktivität. Zusätzlich können die Pharmakokinetiken der Analoge in Tieren und die Histopathologie der Tiere, die mit Analogen behandelt wurden, bestimmt werden.
  • Die Selektion von kationischen Peptiden als potentielle Therapeutika wird auf in vitro und in vivo-Testverfahrenresultate basiert. Im allgemeinen sind Peptide, die eine niedrige Toxizität bei hohen Dosismengen und hohe Effizienz bei niedrigen Dosismengen aufweisen, bevorzugte Kandidaten.
  • III. ANTIBIOTISCHE MITTEL
  • Ein antibiotisches Mittel beinhaltet jedes Molekül, das darauf gerichtet ist, Leben zu verhindern, zu inhibieren oder zu zerstören und beinhaltet als solches antibakterielle Mittel, Antifungizide, antivirale Mittel und antiparasitäre Mittel. Diese Mittel können aus einem Organismus, der das Mittel herstellt, isoliert werden, oder von einer kommerziellen Quelle beschafft werden (z.B. einer pharmazeutischen Firma, wie Eli Lilly, Indianapolis, IN; Sigma, St. Louis, MO).
  • Antibakterielle antibiotische Mittel schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Penizilline, Cephalosporine, Carbacepheme, Cephamycine, Cabapeneme, Monobactame, Aminoglykoside, Glykopeptide, Chinoline, Tetrazykline, Makrolide und Fluorchinoline. Beispiele von antibiotischen Mitteln schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Pencillin G, (CAS-Registrierungsnr.: 61-33-6); Methicillin (CAS-Registrierungsnr.: 61-32-5); Nafcillin (CAS-Registrierungsnr.: 147-52-4); Oxacillin (CAS-Registrierungsnr.: 66-79-5); Cloxacillin (CAS- Registrierungsnr.: 61-72-3); Dicloxacillin (CAS-Registrierungsnr.: 3116-76-5); Ampicillin (CAS-Registrierungsnr.: 69-53-4); Amoxicillin (CAS-Registrierungsnr.: 26787-78-0); Ticarcillin (CAS-Registrierungsnr.: 34787-01-4); Carbenicillin (CAS-Registrierungsnr.: 4697-36-3); Mezlocillin (CAS-Registrierungsnr.: 51481-65-3); Azlocillin (CAS-Registrierungsnr.: 37091-66-0); Piperacillin (CAS-Registrierungsnr.: 61477-96-1); Imipenem (CAS-Registrierungsnr.: 74431-23-5); Aztreonam (CAS-Registrierungsnr.: 78110-38-0); Cephalothin (CAS-Registrierungsnr.: 153-61-7); Cefazolin (CAS-Registrierungsnr.: 25953-19-9); Cefaclor (CAS-Registrierungsnr.: 70356-03-5); Cefamandol Natriumfomat (CAS-Registrierungsnr.: 42540-40-9); Cefoxitin (CAS-Registrierungsnr.: 35607-66-0); Cefuroxim (CAS-Registrierungsnr.: 55268-75-2); Cefonicid (CAS-Registrierungsnr.: 61270-58-4); Cefmetazol (CAS-Registrierungsnr.: 56796-20-4); Cefotetan (CAS-Registrierungsnr.: 69712-56-7); Cefprozil (CAS-Registrierungsnr.: 92665-29-7); Loracarbef (CAS-Registrierungsnr.: 121961-22-6); Cefetamet (CAS-Registrierungsnr.: 65052-63-3); Cefoperazon (CAS-Registrierungsnr.: 62893-19-0); Cefotaxim (CAS-Registrierungsnr.: 63527-52-6); Ceftizoxim (CAS-Registrierungsnr.: 68401-81-0); Ceftriaxon (CAS-Registrierungsnr.: 73384-59-5); Ceftazidim (CAS-Registrierungsnr.: 72558-82-8); Cefepim (CAS-Registrierungsnr.: 88040-23-7); Cefixim (CAS-Registrierungsnr.: 79350-37-1); Cefpodoxim (CAS-Registrierungsnr.: 80210-62-4); Cefsulodin (CAS-Registrierungsnr.: 62587-73-9); Fleroxacin (CAS-Registrierungsnr.: 79660-72-3); Nalixidinsäure (CAS-Registrierungsnr.: 389-08-2); Norfloxacin (CAS-Registrierungsnr.: 70458-96-7); Ciprofloxacin (CAS-Registrierungsnr.: 85721-33-1); Ofloxacin (CAS-Registrierungsnr.: 82419-36-1); Enoxacin (CAS-Registrierungsnr.: 74011-58-8); Lomefloxacin (CAS-Registrierungsnr.: 98079-51-7); Cinoxacin (CAS-Registrierungsnr.: 28657-80-9); Doxycyclin (CAS-Registrierungsnr.: 564-25-0); Minocyclin (CAS-Registrierungsnr.: 10118-90-8); Tetracyclin (CAS-Registrierungsnr.: 60-54-8); Amikacin (CAS-Registrierungsnr.: 37517-28-5); Gentamicin (CAS-Registrierungsnr.: 1403-66-3); Kanamycin (CAS Registriernr.: 8063-07-8); Netilmicin (CAS Registriernr.: 56391-56-1); Tobramycin (CAS Registriernr.: 32986-56-4); Streptomycin (CAS Registriernr.: 57-92-1); Azithromycin (CAS Registriernr.: 83905-01-5); Clarithromycin (CAS Registriernr.: 81103-11-9); Erythromycin (CAS Registriernr.: 114-07-8); Erythromycinestolat (CAS Registriernr.: 3521-62-8); Erythromycinethylsuccinat (CAS Registriernr.: 41342-53-4); Erythromycinglucoheptonat (CAS Registriernr.: 23067-13-2); Erythromycinlactobionat (CAS Registriernr.: 3847-29-8); Erythromycinstearat (CAS Registriernr.: 643-22-1); Vancomycin (CAS Registriernr.: 1404-90-6); Teicoplanin (CAS Registriernr.: 61036-64-4); Chloramphenicol (CAS Registriernr.: 56-75-7); Clindamycin (CAS Registriernr.: 18323-44-9); Trimethoprim (CAS Registriernr.: 738-70-5); Sulfamethaxazol (CAS Registriernr.: 723-46-6); Nitrofurantoin (CAS Registriernr.: 67-20-9); Rifampin (CAS Registriernr.: 13292-46-1); Mupirocin (CAS Registriernr.: 12650-69-0); Metronidazol (CAS Registriernr.: 443-48-1); Cephalexin (CAS Registriernr.: 15686-71-2); Roxithromycin (CAS Registriernr.: 80214-83-1); Co-Amoxiclavuanat; Kombinationen von Piperacillin und Tazobactam; und ihre verschiedenen Salze, Säuren, Basen und andere Derivate.
  • Tabelle 2 stellt Kategorien von Antibiotika, ihre Wirkungsweise und Beispiele von Antibiotika dar.
  • Tabelle 2
    Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Anti-fungale Mittel schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Terbinafinhydrochlorid, Nystatin, Arnphotericin B, Griseofulvin, Ketoconazol, Miconazolnitrat, Flucytosin, Fluconazol, Itraconazol, Clotrimazol, Benzoesäure, Salicylsäure und Selensulfid.
  • Anti-virale Mittel schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Amantadinhydrochlorid, Rimantadin, Acyclovir, Famciclovir, Foscarnet, Ganciclovir-Natrium, Idoxuridin, Ribavirin, Sorivudin, Trifluridin, Valacyclovir, Vidarabin, Didanosin, Stavudin, Zalcitabin, Zidovudin, Interferon Alpha und Edoxudin.
  • Anti-parasitäre Mittel schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Priethrine/Piperonylbutoxid, Permethrin, Iodochinon, Metronidazol, Diethylcarbamazincitrat, Piperazin, Pyrantelpamoat, Mebendazol, Thiabendazol, Praziquantel, Albendazol, Proguanil, Chinidingluconat-Injektion, Chininsulfat, Chlorochinphosphat, Meflochinhydrochlorid, Primachinphosphat, Atovachon, Cotrimoxazol (Sulfamethoxazol/Trimethoprim) und Pentamidinisothionat.
  • IV. VERSTÄRKTE AKTIVITÄT BEI KOMBINATIONEN VON KATIONISCHEN PEPTIDEN UND ANTIBIOTISCHEN MITTELN
  • Eine verstärkte Aktivität tritt auf, wenn eine Kombination von Peptid und antibiotischem Mittel, die Aktivität über die individuellen Effekte des Peptids oder antibiotischen Mittels alleine oder über additive Effekte des Peptids plus des antibiotischen Mittels hinaus verstärkt. Eine verstärkte Aktivität ist besonders wünschenswert in mindestens vier Szenarien: (i) der Mikroorganismus ist auf das antibiotische Mittel sensitiv, aber die Dosierung weist damit assoziierte Probleme auf; (2) der Mikroorganismus ist auf das antibiotische Mittel tolerant und wird am Wachstum gehindert, aber nicht getötet; (3) der Mikroorganismus ist inhärent resistent gegen das antibiotische Mittel; und (4) der Mikroorganismus hat eine erworbene Resistenz für das antibiotische Mittel. Eine verstärkte Wirksamkeit, die aus der Verabreichung des antibiotischen Mittels in Kombination mit einem kationischen Peptid in den obigen Szenarios ergibt: (1) erlaubt die Verabreichung von niedrigeren Dosen des antibiotischen Mittels oder kationischen Peptids; (2) stellt einen zellzerstörenden Effekt wieder her; (3) überwindet inhärente Resistenz und (4) überwindet erworbene Resistenz.
  • A. Verstärkung der Aktivität des antibiotischen Mittels oder kationischen Peptids
  • Eine synergistische Kombination des kationischen Peptids und des antibiotischen Mittels kann eine Reduktion in der Dosierung von einem oder beiden Mitteln ermöglichen, um einen ähnlichen therapeutischen Effekt zu erreichen. Dies würde erlauben, dass geringere Dosen verwendet werden, um so das Auftreten der Toxizität (z.B. von Aminoglycosiden) zu vermindern und die Kosten der teuren Antibiotika (z.B. Vancomycin) zu senken. Von einer gleichzeitigen oder sequentiellen Verabreichung des Peptids und antibiotischen Mittels wird erwartet, dass sie eine effektivere Behandlung der Infektionen, die durch Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten) verursacht werden, liefern. Insbesondere könnte dies unter Verwendung von Dosen des Peptids oder antibiotischen Mittels erreicht werden, die alleine keinen therapeutischen Erfolg erreichen würden. Wahlweise kann das antibiotische Mittel und das Peptid bei therapeutischen Dosen von jedem verabreicht werden, wobei aber die Kombination der beiden Mittel noch stärkere Effekte liefert.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „Synergie" auf den in vitro Effekt der Verabreichung einer Kombination des kationischen Peptids und eines antibiotischen Mittels, derart, dass (1) die anteilig inhibitorische Konzentration (FIC) weniger oder gleich 0,5 in einem hier beschriebenen FIC-Test ist; oder (2) es mindestens eine hundertfache (2log10) Zunahme im Abtöten nach 24 Stunden für die Kombination, im Vergleich mit dem antibiotischen Mittel alleine, in einem Zeittötungskurventest, wie hier beschrieben, gibt.
  • Solche Synergie wird in geeigneter Weise in einem in vitro-Testverfahren, wie z.B. in kinetischen Tötungsstudien oder einem fraktionierten inhibitorischen Konzentrations-(FIC)-Testverfahren, wie durch Agarose- oder Wachstumsmediumsverdünnungs-Testverfahren, bestimmt. Das Agaroseverdünnungstestverfahren ist bevorzugt.
  • Kurz gesagt, in einem Verdünnungstestverfahren wird ein Schachbretttestverfahren von kationischen Peptiden und antibiotischen Mitteln, das in Verdopplungsverdünnungen titriert ist, mit einem mikrobiellen (z.B. bakteriellen) Isolat angeimpft. Der FIC wird durch Beobachten des Einflusses eines antibiotischen Mittels auf die MIC ("minimale inhibitorische Konzentration") des kationischen Peptids und umgekehrt bestimmt. Der FIC wird durch die folgende Formel berechnet:
    Figure 00280001
  • Ein FIC von ≤ 0,5 ist ein Hinweis auf eine Synergie. Eine zusätzliche Reaktion hat einen FIC-Wert von > 0,5 und ist kleiner als oder gleich 1, während eine indifferente Reaktion einen FIC-Wert von > 1 und ≤ 2 hat. Obwohl ein synergistischer Effekt bevorzugt ist, kann ein zusätzlicher Effekt anzeigen, dass die Kombination des antibiotischen Mittels und des kationischen Peptids therapeutisch sinnvoll ist.
  • B. Überwinden der Toleranz
  • Die Toleranz ist mit einem Defekt in den bakteriellen, zellulären, autolytischen Enzymen verbunden, derart, dass ein antibakterielles Mittel eher bakteriostatische als Bakterien-abtötende Aktivität zeigt (Mahon und Manuselis, Textbook of Diagnostic Microbiology, W.B. Saunders Co., Toronto, Kanada, S. 92, 1995). Bei antibiotischen Mitteln, die nur bakteriostatische Aktivität haben, kann die Gabe von kationischen Peptiden in Kombination mit den antibiotischen Mitteln die Bakterien-abtötende Aktivität wiederherstellen. Alternativ kann das Hinzufügen eines Peptids zu einem antibiotischen Mittel die Rate eines Bakterien-abtötende Effekts des Antibiotikums erhöhen.
  • Bakterienabtötende Effekte von Antibiotika können in vitro durch eine Vielzahl von Testverfahren gemessen werden. Üblicherweise ist das Testverfahren eine Messung der MBC („minimale Bakterien-abtötende Konzentration"), die eine Erweiterung der MIC-Bestimmung ist. Das Agaroseverdünnungs-Testverfahren ist so angepasst, um jeweils MBC und MIC für ein antimikrobielles Mittel alleine und für das Mittel in Kombination mit einem kationischen Peptid zur Verfügung zu stellen. Wahlweise können kinetische Zeittötungs- (oder Wachstums-) Kurven verwendet werden, um MIC und MBC zu bestimmen.
  • Kurz gesagt, im Anschluss an die Bestimmung von MIC, wird die MBC von den Testverfahrenplatten durch Abstreichen der Inokula auf Platten, die antibiotisches Mittel in Konzentration um und oberhalb des MIC beinhalten, durch Resuspendieren des Abstrichs in Kochsalz oder Medium und Plattieren eines Aliquots auf Agaroseplatten bestimmt. Wenn die Anzahl von Kolonien auf diesen Agaroseplatten weniger als 0,1% des anfänglichen Inokulums ist (wie durch eine Plattenzählung sofort nach Animpfung der MIC-Testplatten bestimmt), dann ist eine ≥ 99,9%ige Tötung eingetreten. Der MBC-Endpunkt ist als die niedrigste Konzentration des antimikrobiellen Mittels definiert, das 99,9% der Testbakterien abtötet.
  • Daher wird Toleranz von einem Mikroorganismus auf ein antimikrobielles Mittel dann angezeigt, wenn die Anzahl von Kolonien, die auf Subkulturplatten wachsen, den 0,1 %igen Cut-Off (Schwellen)-Wert für mehrere aufeinander folgende Konzentrationswerte oberhalb des beobachteten MIC überschreitet. Eine Kombination des antimikrobiellen Mittels und des kationischen Peptids, das die Toleranz durchbricht, fuhrt zu einer Abnahme des MBC:MIC Verhältnisses auf < 32.
  • C. Überwinden der inhärenten Resistenz
  • Die Kombination eines kationischen Peptids mit einem antibiotischen Mittel, für das ein Mikroorganismus inhärent resistent ist (d.h. das Antibiotika hat sich niemals therapeutisch aktiv gegen den in Frage kommenden Organismus gezeigt), wird verwendet, um die Resistenz des Mikroorganismus gegen das Mittel zu übertragen. Das Überwinden- der inhärenten Resistenz ist besonders sinnvoll für Infektionen, wo der verursachende Organismus auf die meisten, wenn nicht alle, der gegenwärtig verschriebenen Antibiotika resistent wird oder geworden ist. Zusätzlich bietet das Verabreichen einer Kombinationstherapie mehr Möglichkeiten, wenn die Toxizität eines antibiotischen Mittels und/oder der Preis ein Gesichtspunkt ist.
  • Das Überwinden der Resistenz kann zweckmäßiger Weise in vitro gemessen werden. Die Resistenz wird überwunden, wenn die MIC für ein bestimmtes antibiotisches Mittel gegen einen bestimmten Mikroorganismus von dem resistenten Bereich zu dem sensitiven Bereich reduziert wurde (gemäß dem Nationalen Komitee für Klinische Laborstandards (NCCLS)) (siehe auch Moellering, in Principles and Practice of Infectious Diseases, 4. Edition, Mandell et al., Hrsg., Churchill Livingstone, NY, 1995). NCCLS-Standards sind auf mikrobiologischen Daten in Bezug auf pharmakokinetische Daten und klinische Studien basiert. Resistenz wird bestimmt, wenn der Organismus, der die Infektion verursacht, nicht von den normal erreichbaren Serumkonzentrationen des antibiotischen Mittels, basierend auf empfohlener Dosierung, inhibiert wird. Empfänglichkeit wird bestimmt, wenn der Organismus auf die Therapie mit dem antibiotischen Mittel, das bei der empfohlenen Dosierung für den Typ der Infektion und des Mikroorganismus verwendet wird, reagiert.
  • D. Überwinden der erworbenen Resistenz
  • Die erworbene Resistenz in einem Mikroorganismus, der vorher sensitiv gegen ein antibiotisches Mittel war, tritt im allgemeinen aufgrund von Mutationsereignissen in der chromosomalen DNA, der Aneignung von einem Resistenzfaktor, der über Plasmide oder einen Phagen übertragen wurde, oder durch Austausch eines Resistenzgens oder -gene von einem Plasmid oder Phagen auf die chromosomale DNA, auf.
  • Wenn ein Mikroorganismus Resistenz gegen ein Antibiotikum erwirbt, kann die Kombination von einem Peptid und einem antibiotischen Mittel die Aktivität des antibiotischen Mittels wiederherstellen, indem der Resistenzmechanismus des Organismus überwunden wird. Dies ist besonders nützlich für Organismen, die schwierig zu behandeln sind oder wo die gegenwärtige Therapie teuer oder toxisch ist. Die Befähigung, ein weniger teures oder weniger toxisches antibiotisches Mittel zu verwenden, das in der Vergangenheit effektiv gewesen war, ist eine Verbesserung für bestimmte augenblickliche Therapien. Die Wiedereinführung eines antibiotischen Mittels würde frühere klinische Studien und Verschreibungsdaten, die in ihrer Bewertung verwendet wurden, wieder anwendbar werden lassen. Die Aktivität wird in vitro durch MICs oder kinetische Tötungskurven und in vivo gemessen, unter Verwendung von Tier- und menschlichen klinischen Studien.
  • E. Verstärkung des Effekts von Lysozym und Nisin
  • Die Kombination von Lysozym oder Nisin mit einem Antibiotikum kann deren antibakterielle Effektivität verbessern und erlaubt die Verwendung in Situationen, in denen das einzelne Mittel inaktiv oder ungeeignet ist.
  • Lysozyme brechen bestimmte Bakterien durch Spaltung der Glykosidbindung zwischen N-Acetygiucosamin und N-Acetylmuraminsäure in der Polysaccharidkomponente der bakteriellen Zellwände auf. Lysozym besitzt jedoch nur schwache antibakterielle Aktivität innerhalb eines engen Aktivitätsspektrums. Die Zugabe von einem Antibiotikum kann die Effektivität dieser Aktivität verbessern und das Aktivitätsspektrum verbreitern.
  • Nisine sind 34-Reste-Peptidantibiotika mit in erster Linie Anti-Gram-positiver bakterieller Aktivität. Nisin wird in der Nahrungsverarbeitungsindustrie als ein Konservierungsmittel verwendet, speziell für Käse, Dosenfrüchte und -gemüse. Nisin bildet vorübergehende Potentialabhängige Poren in den bakteriellen cytoplasmatischen Membranen, aber weist auch schwache antibakterielle Aktivität mit einem engen Aktivitätsspektrum auf. Die Zugabe von einem Antibiotikum kann die Effektivität von Nisin verbessern und das Aktivitätsspektrum verbreitern.
  • F. In vivo Testverfahren
  • Das in vivo-Testen schließt die Verwendung von Tierinfektionsmodellen ein. Üblicherweise, aber nicht ausschließlich, werden Mäuse verwendet. Der Testorganismus wird ausgewählt gemäß der beabsichtigten Kombination von kationischem Peptid und Antibiotikum, das beurteilt werden soll. Im allgemeinen wird der Testorganismus intraperitoneal (IP) oder intravenös (IV) bei 10 bis 100 Mal der 50%igen letalen Dosis (LD50) injiziert. Der LD50 wird unter Verwendung eines Verfahrens berechnet, das von Reed und Muench (Reed LJ und Muench H. The American Journal of Hygiene, 27:493-7.) beschrieben wurde. Das antibiotische Mittel und das kationische Peptid werden IP, IV oder subkutan (SC) individuell sowie in Kombination in verschiedene Gruppen von Mäusen injiziert. Die antimikrobiellen Mittel können in einer oder in mehrfachen Dosen gegeben werden. Die Tiere werden für 5 bis 7 Tage beobachtet. Andere Infektionsmodelle können auch gemäß der klinischen Indikation für die Kombination der antibiotischen Mittel verwendet werden.
  • Die Anzahl von Mäusen in jeder Gruppe, die den infektiösen Angriff überlebt, wird nach 5 bis 7 Tagen bestimmt. Wenn die Testorganismen Bakterien sind, können zusätzlich bakterielle Koloniezählungen vom Blut, peritonealer Spülungsflüssigkeit, Flüssigkeit von anderen Körperstellen, und/oder Gewebe von unterschiedlichen Körperstellen, die zu verschiedenen Zeitintervallen genommen wurden, verwendet werden, um die Effizienz zu ermitteln. Die Proben werden seriell in isotonischer Kochsalzlösung verdünnt und für 20-24 Stunden bei 37°C in einem für das Bakterium geeigneten Wachstumsmedium inkubiert.
  • Eine Synergie zwischen dem kationischen Peptid und dem antibiotischen Mittel wird unter Verwendung eines Infektionsmodells, wie oben beschrieben, ermittelt. Für eine Bestimmung der Synergie sollte einer oder mehrere der folgenden Punkte auftreten. Die Kombinationsgruppe sollte größere Überlebensraten zeigen, verglichen mit der Gruppe, die nur mit einem Mittel behandelt wurde; die Kombinationsgruppe und die Gruppe mit dem antibiotischen Mittel haben äquivalente Überlebensraten, wobei die Kombinationsgruppe eine niedrigere Konzentration des antibiotischen Mittels erhalten hat; die Kombinationsgruppe hat ein äquivalen tes oder besseres Überleben zu verschiedenen Zeitpunkten, verglichen mit einer Gruppe mit einem antibiotischen Mittel mit einer niedrigeren Mikroorganismenbeladung.
  • Das Überwinden der Toleranz kann durch niedrigere bakterielle Koloniezählungen zu verschiedenen Zeitpunkten in der Kombinationsgruppe über die der Gruppe mit dem antibiotischen Mittel gezeigt werden. Dies kann auch in besseren Überlebensraten für die Kombinationsgruppe resultieren.
  • Ähnliche Tiermodelle zu denen, die oben beschrieben wurden, können verwendet werden, um festzulegen, wann eine inhärente oder erworbene Resistenz überwunden wird. Der verwendete Mikroorganismusstamm ist per Definition resistent gegen das antibiotische Mittel, und so wird die Überlebensrate in der Gruppe des antibiotischen Mittels nahe, wenn nicht gleich zu 0% sein. Daher wird das Überwinden der angeborenen Resistenz des Mikroorganismus zum antibiotischen Mittel durch erhöhtes Überleben der Kombinationsgruppe gezeigt. Das Testen auf Umkehr zu erworbener Resistenz kann in einer ähnlichen Weise durchgeführt werden
  • V. KOMBINATIONEN VON PEPTIDEN UND ANTIBIOTISCHEN MITTELN
  • Wie hier diskutiert, werden kationische Peptide in Kombination mit antibiotischen Mitteln verabreicht. Die Kombination verstärkt die Aktivität der antibiotischen Mittel. Solche Kombinationen können verwendet werden, um ein synergistisches Ergebnis hervorzurufen, um Toleranz zu überwinden, um angeborene Resistenz zu überwinden, oder um erworbene Resistenz des Mikroorganismus gegen das antibiotische Mittel zu überwinden.
  • Um einen synergistischen Effekt zu erreichen, wird einem Patienten eine Kombination von antibiotischem Mittel und kationischem Peptid verabreicht oder in solch einer Art verabreicht, um mit dem Mikroorganismus in Kontakt zu kommen. Jede Kombination von antibiotischem Mittel und kationischem Peptid kann einen synergistischen Effekt ergeben und ist daher innerhalb des Zusammenhangs dieser Erfindung nützlich.
  • Insbesondere sind gewisse Mikroorganismen bevorzugte Angriffsziele. In Verbindung mit diesen Mikroorganismen, sind gewisse gewöhnlich verwendete antibiotische Mittel bevorzugt, die verstärkt werden sollen. Die Tabelle unten stellt diese Mikroorganismen, antibiotischen Mittel und kationischen Peptidkombinationen, die bevorzugt sind, dar.
  • Tabelle 3
    Figure 00340001
  • Um Toleranz zu überwinden, wird einem Patienten eine Kombination von antibiotischem Mittel und kationischem Peptid verabreicht oder in solch einer Weise verabreicht, um mit dem Mikroorganismus in Kontakt zu kommen. Jede Kombination von antibiotischem Mittel und kationischen Peptid, die Toleranz überwindet, ist innerhalb des Zusammenhangs dieser Erfindung nützlich. Insbesondere sind bestimmte Mikroorganismen, die Toleranz gegen spezifische antibiotische Mitteln aufweisen, bevorzugte Ziele. Die Tabelle unten stellt diese Mikroorgansimen, antibiotischen Mittel und kationischen Peptidverbindungen, die bevorzugt sind, dar.
  • Tabelle 4
    Figure 00340002
  • Um die inhärente Resistenz zu überwinden, wird einem Patienten eine Kombination von antibiotischem Mittel und kationischem Peptid verabreicht oder in solch einer Weise verabreicht, um mit dem Mikroorganismus in Kontakt zu kommen. Jede Kombination von antibiotischem Mittel und kationischem Peptid, die Resistenz überwindet, ist im Zusammenhang mit dieser Erfindung nützlich. Insbesondere sind bestimmte Mikroorganismen, die angeborene Resistenz zu spezifischen antibiotischen Mitteln besitzen, bevorzugte Ziele. Die Tabelle unten stellt diese Mikroorganismen, antibiotischen Mittel und kationischen Peptidkombinationen, die bevorzugt sind, dar.
  • Tabelle 5
    Figure 00350001
  • Um erworbene Resistenz zu überwinden, wird einem Patienten eine Kombination von antibiotischem Mittel und kationischem Peptid verabreicht oder in solch einer Weise verabreicht um mit dem Mikroorganismus in Kontakt zu kommen. Jede Kombination von antibiotischem Mittel und kationischem Peptid, die die Resistenz überwindet, ist innerhalb des Zusammenhangs mit dieser Erfindung nützlich. Insbesondere sind gewisse Mikroorganismen, die erworbene Resistenz zu spezifischen antibiotischen Mitteln aufweisen, bevorzugte Ziele. Die Tabelle unten legt diese Mikroorganismen, antibiotischen Mittel und kationischen Peptidkombinationen, die bevorzugt sind, dar.
  • Tabelle 6
    Figure 00350002
  • Figure 00360001
  • Zusätzliche bevorzugte Kombinationen für Indolicidinanaloge sind unten aufgelistet:
    Figure 00360002
  • VI. FORMULIERUNGEN UND DARREICHUNG
  • Wie oben bemerkt, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung und Verhinderung von Infektionen durch Darreichung einer therapeutisch effektiven Menge eines Peptidanalogs des Indolicidins, wie hier beschrieben, an einen Patienten zur Verfügung. Für solche Behandlungen geeignete Patienten können durch gut etablierte Kennzeichen einer Infektion, wie z.B. Fieber, Eiterkulturen von Organismen und ähnliches, identifiziert werden. Infektionen, die mit Peptidanaloga behandelt werden können, beinhalten diejenigen, die durch oder aufgrund von Mikroorganismen verursacht werden. Beispiele für Mikroorganismen schließen Bakterien (z.B. Gram-positive, Gram-negative), Pilze (z.B. Hefe und Schimmelpilze), Parasiten (z.B. Protozooen, Nematoden, Cestoden und Trematoden), Viren und Prione ein. Spezifische Organismen in diesen Klassen sind gut bekannt (siehe z.B., Davis et al., Microbiology, 3. Edition, Harper & Row, 1980). Infektionen beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf toxisches Schocksyndrom, Diphtherie, Cholera, Typhus, Meningitis, Keuchhusten, Botulismus, Tetanus, eiterbildende Infektionen, Ruhr, Gastroenteritis, Anthrax (Milzbrand), Lyme-Krankheit, Syphilis, Röteln, Blutvergiftung (Sepsis) und Pest.
  • Noch spezifischer schließen klinische Indikationen ein, sind aber nicht begrenzt auf 1/Infektionen, die einer Einführung von intravaskulären Vorrichtungen oder peritonealen Dialysekathetern folgen; 2/Infektionen, die mit medizinischen Vorrichtungen oder Prothesen verbunden sind; 3/Infektionen während der Hämodialyse; 4/S. aureus nasale und extranasale Übertragung; 5/Infektionen von Brandwunden; 6/Operationswunden; 7/Akne, einschließlich schwerer Akne vulgaris; 8/nosokomiale Pneumonie; 9/Meningitis; 10/zystische Fibrose; 11/infektiöse Endokarditis; 12/Osteomyelitis und 13/Sepsis in einem abwehrgeschwächten Wirt.
    • 1/Infektionen, die auf die Einführung von kontaminierten intravaskulären Vorrichtungen, wie z.B. zentralen Venenkathetern oder peritonealen Dialysekathetern folgen. Diese Katheter sind Stulpen oder Nicht-Stulpen, obgleich die Infektionsrate höher für Nicht-Stulpen-Katheter ist. Sowohl die lokale wie auch die systemische Infektion kann aus kontaminierten intravaskulären Vorrichtungen herrühren, mehr als 25.000 Patienten entwickeln jedes Jahr in den Vereinigten Staaten die Vorrichtungs-bezogene Bakteriämie. Die hauptverantwortlichen Organismen sind Koagulase-negative Staphylokokken (CoNS); Staphylococcus aureus, Entereococcus spp, E. coli und Candida spp.
  • Das Peptid und/oder Antibiotikum, vorzugsweise als eine Salbe oder Creme, kann an der Katheterseite vor Einführung des Katheters und dann wieder bei jedem Kleiderwechsel aufgetragen werden. Das Peptid kann in die Salbe oder Creme bei einer Konzentration vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 2% (w/v) eingefügt werden.
    • 2/Infektionen, die mit medizinischen Vorrichtungen oder Prothesen zusammenhängen, z.B. Katheter, Transplantate, prothetische Herzklappen, künstliche Gelenke, usw. Ein bis fünf Prozent der Dauerprothesen werden inftziert, was normalerweise das Entfernen oder das Ersetzen der Prothesen erfordert. Die Hauptorganismen, die für diese Infektionen verantwortlich sind, sind CoNS und S. aureus.
  • Vorzugsweise kann das Peptid und/oder Antibiotikum beschichtet werden, entweder kovalent gebunden oder durch irgendwelche anderen Mittel, auf die medizinische Vorrichtung entweder bei der Herstellung der Vorrichtung oder nach Herstellung, aber vor der Einführung der Vorrichtung. In solch einer Anwendung wird das Peptidantibiotikum vorzugsweise als eine 0,5 bis 2%ige Lösung eingesetzt.
    • 3/Infektionen während Hämodialyse. Infektion ist die zweite führende Todesursache in Patienten auf chronischer Hämodialyse. Ungefähr 23% der Bakteriämien entstehen aufgrund von Zugangsstelleninfektionen. Die Mehrzahl der Transplantatinfektionen werden durch Gerinnungs-positive (S. aureus) und Gerinnungs-negative Staphylokokken bewirkt. Um die Infektion zu bekämpfen, kann das Peptid alleine oder in Kombination mit einem Antibiotikum als eine Salbe oder eine Creme an der Dialysestelle vor jedem Hämodialyseverfahren eingesetzt werden.
    • 4/S. aureus nasale und extranasale Übertragung. Infektion durch diesen Organismus kann in borkigen Verletzungen oder infizierten Wunden resultieren. Sie ist auch mit erhöhten Infektionsraten im Anschluss an die Herzchirurgie, die Hämodialyse, die orthopädische Chirurgie und Neutropenie verbunden, sowohl Krankheits-induziert als auch durch ärztliche Einwirkungen entstanden. Nasale und extranasale Übertragung von Staphylokokken kann in Krankenhaus-Epidemien des Stamm der gleichen Staphylokokken resultieren, die die nasale Passage oder die extranasale Stelle eines Patienten oder Krankenhausarbeiters kolonisieren. Viel Aufmerksamkeit wurde auf die Ausrottung der nasalen Kolonisierung gelegt, aber die Resultate der Behandlung waren im allgemeinen unbefriedigend. Die Verwendung topischer antimikrobieller Substanzen, wie z.B. Bacitracin, Tetracyclin oder Chlorhexidin, führt eher zu der Unterdrückung der nasalen Kolonisierung als zu ihrer Ausrottung.
  • Das Peptid alleine oder in Kombination mit einem Antibiotikum wird vorzugsweise intranasal appliziert, für die nasale Anwendung als eine 0,5 bis 2%ige Salbe, Creme oder Lösung formuliert. Die Anwendung kann einmal oder mehrere Male stattfinden, bis die Kolonisierung der Staphylokokken reduziert oder eliminiert ist.
    • 5/Brandwundeninfektionen. Obgleich das Auftreten von invasiven Brandwundeninfektionen signifikant reduziert wurde, bleibt die Infektion die häufigste Ursache der Erkrankungsrate und der Sterblichkeit in umfangreich verbrannten Patienten. Die Infektion ist der vorherrschende bestimmende Faktor der Wundheilung, Auftreten von Komplikationen und das Ergebnis bei Patienten mit Brandwunden. Die hauptverantwortlichen Organismen sind Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Streptococcus pyogenes und verschiedene Gram-negative Organismen. Häufige Wundreinigungen und die Bildung einer Epidermis oder eines Surrogates wie z.B. einem Transplantat oder einem Hautersatz, ist essentiell zur Verhinderung der Infektion.
  • Das Peptid alleine oder in Kombination mit Antibiotika kann als eine Salbe oder Creme auf Brandwunden angewendet werden und/oder systemisch verabreicht werden. Die lokale Anwendung kann eine systemische Infektion nach einer oberflächlichen Besiedelung verhindern oder eine oberflächliche Infektion beseitigen. Das Peptid wird vorzugsweise als eine 0,5 bis 2%ige Creme oder Salbe verabreicht. Die Anwendung auf die Haut könnte einmal am Tag oder so oft, wie Kleidung gewechselt wird, durchgeführt werden. Die systemische Verabreichung könnte durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektionen oder Infusionen stattfinden. Andere Wege der Verabreichung könnten auch verwendet werden.
    • 6/Operationswunden, insbesondere solche, die mit fremden Material, z.B. Nahtmaterialien, verbunden sind. Nicht weniger als 71% von allen im Krankenhaus erworbenen (nosokomialen) Infektionen treten bei Chirurgie-Patienten auf, 40% von diesen Infektionen an der operativen Stelle. Trotz Anstrengungen um die Infektion zu verhindern, wird geschätzt, dass zwischen 500.000 und 920.000 chirurgische Wundinfektionen die ungefähr 23 Millionen chirurgischen Verfahren, die jährlich in den Vereinigten Staaten durchgeführt werden, erschweren. Die infizierenden Organismen sind verschieden, aber Staphylokokken sind wichtige Organismen in diesen Infektionen.
  • Das Peptid alleine oder mit einem Antibiotikum kann als eine Salbe, Creme oder Flüssigkeit an die Wundstelle oder als eine Flüssigkeit in der Wunde vor und während des Schließens der Wunde verabreicht werden. Nach Wundschluß könnte das Peptidantibiotikum bei Kleiderwechseln verabreicht werden. Für Wunden, die infiziert sind, könnte das Peptidantibiotikum lokal (topisch) und/oder systemisch verabreicht werden.
    • 7/Akne, einschließlich schwere Akne vulgaris. Dieser Zustand wird durch Besiedlung und Infektion von Haarfollikeln und Talg-absondernden Zysten durch das Propionibacterium acne verursacht. Die meisten Fälle verbleiben milde und führen nicht zur Narbenbildung, obgleich eine Untergruppe von Patienten große entzündliche Zysten und Knötchen entwickeln, die sich entleeren können und in signifikanter Narbenbildung resultieren.
  • Das Peptid alleine oder mit einem Antibiotikum kann in Seife eingefügt werden oder örtlich als eine Creme, Lotion oder Gel an die betroffenen Flächen entweder einmal am Tag oder mehrmals während des Tages angewendet werden. Die Länge der Behandlung kann so lang sein, wie die Läsionen anwesend sind oder verwendet werden, um zurückkehrende Läsionen zu verhindern. Das Peptidantibiotikum könnte auch oral oder systemisch verwendet werden, um Akneläsionen zu behandeln oder zu verhindern.
    • 8/Im Krankenhaus erworbene (nosokomiale) Pneumonie. Nosokomiale Pneumonien machen beinahe 20% von allen nosokomialen Infektionen aus. Patienten mit dem höchsten Risiko die nosokomiale Pneumonie zu entwickeln, sind solche in einer Intensivstationseinheit, Patienten mit veränderten Graden des Bewusstseins, ältere Patienten, Patienten mit chronischer Lungenentzündung, künstlich beatmete Patienten, Raucher und postoperative Patienten. In einem ernsthaft gefährdeten Patienten sind vermutlich multi-Antibiotika resistente nosokomiale Pathogene die Ursache der Pneumonie.
  • Die hauptverantwortlichen Organismen sind P. aeruginosa, S. aureus, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter spp. Das Peptid alleine oder in Kombination mit anderen Antibiotika könnte oral oder systemisch angewendet werden, um die Pneumonie zu behandeln. Die Anwendung könnte einmal am Tag oder zahlreiche Anwendungen am Tag sein. Peptidantibiotika könnten direkt in die Lunge mittels Inhalation oder mittels Installation eines endotrachealen Tubus angewendet werden.
    • 9/Meningitis. Die bakterielle Meningitis bleibt eine verbreitete weltweite Erkrankung. Ungefähr 25.000 Fälle treten jährlich auf, von denen 70% in Kindern unter 5 Jahren auftreten. Trotz eines offensichtlichen kürzlichen Abfalls des Auftretens der schweren neurologischen Folgeerscheinungen unter Kindern, die die bakterielle Meningitis überleben, sind die Probleme des öffentlichen Gesundheitswesens als ein Resultat dieser Erkrankung weltweit signifikant. Die hauptverantwortlichen Organismen sind H. influenzae, Streptococcus pneumoniae und Neisseria meningitidis. Gemeinschaftserworbene medikamentenresistente S. pneumoniae entwickeln sich als ein weit verbreitetes Problem in den Vereinigten Staaten. Das Peptid alleine oder in Kombination mit bekannten Antibiotika könnte oral oder systemisch zur Behandlung der Meningitis verabreicht werden. Die bevorzugte Route würde intravenös entweder einmal am Tag oder verschiedene Verabreichungen pro Tag sein. Die Behandlung würde vorzugsweise bis zu 14 Tage dauern.
    • 10/Zystische Fibrose. Zystische Fibrose (CF) ist die am meisten bekannte genetische Erkrankung der kaukasischen Bevölkerung. Die Lungenentzündung ist die am meisten bekannte Ursache des frühzeitigen Todes in zystischen Fibrosepatienten. Die optimale antimikrobielle Therapie für CF ist nicht bekannt und es wird im allgemeinen vermutet, dass die Einführung von besseren antipseudomonalen Antibiotika hauptsächlich dazu beitrug, die Lebenserwartung von CF-Patienten zunehmen zu lassen. Die am meisten bekannten Organismen, die mit der Lungenentzündung in CF verbunden sind, sind S. aureus, P. aeruginosa und H. influenzae.
  • Das Peptid alleine oder in Kombination mit anderen Antibiotika könnte oral oder systemisch oder mittels Aerosol verwendet werden, um die zystische Fibrose zu behandeln. Vorzugsweise erfolgt die Behandlung bis zu 3 Wochen während der akuten pulmonalen Erkrankung und/oder für bis zu 2 Wochen jede 2 bis 6 Monate, um akute Exazerbationen (Verschlimmerungen) zu verhindern.
    • 11/Infektiöse Endokarditis. Die infektiöse Endokarditis resultiert aus der Infektion der Herzklappentaschen, obgleich jeder Teil des Endokardiums oder jedes prothetische Material, das in das Herz eingeführt wurde, miteinbezogen sein kann. Sie ist normalerweise tödlich, wenn unbehandelt. Die meisten Infektionen sind nosokomial vom Ursprung, verursacht durch Pathogene, die in zunehmendem Maße resistent auf erhältliche Medikamente sind. Die hauptverantwortlichen Organismen sind Viridans streptococci, Enterococcus spp, S. aureus und CoNS.
  • Das Peptid alleine oder in Kombination mit anderen Antibiotika könnte oral oder systemisch verabreicht werden, um Endokarditis zu behandeln, obgleich die systemische Anwendung bevorzugt sein würde. Die Behandlung ist vorzugsweise 2 bis 6 Wochen länger und kann als eine kontinuierliche Infusion oder mehrere Anwendungen während des Tages gegeben werden.
    • 12/Osteomyelitis (Knochenmarkentzündung). In der frühen akuten Erkrankung ist die vaskuläre Versorgung zum Knochen durch Infektion gefährdet, die sich in das umgebende Gewebe ausbreitet. Innerhalb dieses nekrotischen und ischämischen Gewebes können die Bakterien schwierig auszumerzen sein, selbst nach einer starken Wirtsreaktion, Operation und/oder antibiotischen Therapie. Die hauptverantwortlichen Organismen sind S. aureus, E. coli und P. aeruginosa.
  • Das Peptidantibiotikum könnte systemisch alleine oder in Kombination mit anderen Antibiotika verabreicht werden. Eine Behandlung würde 2 bis 6 Wochen dauern. Das Peptidantibiotikum könnte als eine kontinuierliche Infusion oder zahlreiche Anwendungen während des Tages gegeben werden. Das Peptidantibiotikum könnte als ein antibiotisch-imprägnierter Zement oder als antibiotisch beschichtete Kügelchen für die Gelenkersatzverfahren verwendet werden.
    • 13/Sepsis im immungefährdeten Wirt. Die Behandlung von Infektionen in Patienten, die aufgrund der Chemotherapie-induzierten Granulozytopenie und der Immunsuppression bezüglich der Organ- oder Knochenmarkstransplantation, immungefährdet sind, ist immer eine große Herausforderung. Der neutropenische Patient ist besonders anfällig auf die bakterielle Infektion, daher sollte die antibiotische Therapie sofort initiiert werden, um mögliche Pathogene zu erfassen, wenn die Infektion vermutet wird. Organismen, die voraussichtlich Infektionen in grannulozytopenischen Patienten hervorrufen, sind: S. epidermis, S. aureus, S. viridans, Enterococcus spp, E. coli, Klebsiella spp, P. aeruginosa und Candida spp.
  • Das Peptid alleine oder mit einem Antibiotikum wird vorzugsweise oral oder systemisch für 2-6 Wochen lang verabreicht. Das Peptidantibiotikum könnte als eine kontinuierliche Infusion oder mehrfache Verabreichung während des Tages gegeben werden.
  • Die effektive Behandlung der Infektion kann auf mehrere, unterschiedliche Wege untersucht werden. Der Patient kann reduziertes Fieber, reduzierte Anzahl von Organismen, einen niedrigeren Grad an entzündlichen Molekülen (z.B. IFN-γ, IL-12, IL-1, TNF) und ähnliches vorweisen.
  • Die in vivo therapeutische Wirksamkeit der Gabe eines kationischen Peptides und antibiotischen Mittels in Kombination ist auf einem erfolgreichen klinischen Ergebnis basiert und erfordert nicht die 100%ige Eliminierung der Organismen, die in die Infektion eingezogen sind. Das Erreichen eines Grades von antimikrobieller Aktivität an der Stelle der Infektion, die erlaubt, dass der Wirt überlebt, oder der Mikroorganismus ausgemerzt wird, ist ausreichend. Wenn die Abwehrmaßmahmen des Wirtes maximal effektiv sind, wie z.B. in einem ansonsten gesunden Individuum, kann nur ein minimaler antimikrobieller Effekt ausreichend sein. Daher kann das Reduzieren der Organismusbeladung durch gerade einen log (ein Faktor 10) den Abwehrkräften des Wirtes möglich machen, die Infektion zu kontrollieren. Zusätzlich kann der klinische therapeutische Erfolg mehr von dem Erhöhen eines frühen Bakterien-abtötenden Effekts als von dem langfristigen Effekt abhängen. Diese frühen Maßnahmen sind ein signifikanter und kritischer Teil des therapeutischen Erfolgs, weil sie dem Wirt Zeit einräumen, die Abwehrmechanismen zu aktivieren. Dies ist besonders zutreffend für lebensbedrohende Infektion (z.B. Meningitis) und andere schwere chronische Infektionen (z.B. infektöse Endokarditis).
  • Peptide und antibiotische Mittel der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise als eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht. Kurz gesagt, die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere der Peptidanaloga, die hier beschrieben werden, umfassen, in Kombination mit einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägersubstanzen, Verdünnungsmitteln oder Vehikeln. Wie hier bemerkt, kann der Formulierungspuffer die Wirksamkeit oder Aktivität des Peptidanalogons beeinflussen.
  • Das antibiotische Mittel kann sein: ein Cytokin, antivirales Mittel (z.B. Acyclovir; Amantadinhydrochlorid; Didanosin; Edoxudin; Famciclovir; Foscarnet; Ganciclovir; Idoxuridin; Interferon; Lamivudin; Nevirapin; Penciclovir; Podophyllotoxin; Ribavirin; Rimantadin; Sorivudin; Stavudin; Trifluridin; Vidarabin; Zalcitabin und Zidovudin); ein antiparasitäres Mittel (z.B. 8-Hydroxychinolinderivate; Cinchonaaikaloide; Nitroimidazolderivate; Piperazinderivate; Pyrimidinderivate und Chinolinderivate); parasitäres Mittel (z.B. Albendazol; Atovachon; Chlorochinphosphat; Diethylcarbamazincitrat; Eflornithin; Halofantrin; Iodochinol; Ivermectin; Mebendazol; Meflochinhydrochiorid; Melarsoprol B; Metronidazol; Niclosamid; Nifurtimox; Paromomycin; Pentamidinisethionat; Piperazin; Prazichantel; Primachinphosphat; Proguanil; Pyrantelpamoat; Pyrimethamin; Pyrviniumpamoat; Chinidingluconat; Chininsulfat; Natriumstibogluconat; Suramin und Thiabendazol); antifungales Mittel (z.B. Allylamine; Imidazole; Pyrimidine und Triazole, 5-Fluorocytosin; Amphotericin B; Butoconazol; Chlorphenesin; Ciclopirox; Cliochinol; Clotrimazol; Econazol; Fluconazol; Flucytosin; Griseofulvin; Itraconazol; Ketoconazol; Miconazol; Naftifinhydrochlorid; Nystatin; Selensulfid; Sulconazol; Terbinafinhydrochlorid; Terconazol; Tioconazol; Tolnaftat und Undecylenat).
  • Die Zusammensetzungen können in einem Zuführungsvehikel verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung in einem Liposom (siehe z.B. WO 96/10585; WO 95/35094) eingeschlossen sein, komplexiert mit Lipiden, eingeschlossen in langsame Freisetzungs- oder verzögerte Freisetzungsvehikel, wie z.B. Polygalactid und ähnliche. In anderen Ausführungsformen können die Zusammensetzungen als ein Lyophilisat hergestellt werden, durch Einsetzen geeigneter Hilfsstoffe, um Stabilität anzubieten.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in verschiedenen Arten verabreicht werden. Zum Beispiel können kationische Peptide mit oder ohne antibiotische Mittel durch intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion oder Implantation, subkutane Injektion oder Implantation, intradermale Injektion, Spülung, Inhalation, Implantation, intramuskuläre Injektion oder Implantation, intrathekale Injektion, Blasenauswaschung, Suppositorien, Pessarien, topische (z.B. Creme, Salben, Hautpflaster, Augentropfen, Ohrentropfen, Shampoos) Anwendung, enterischer, oraler oder nasaler Weg verabreicht werden. Die Zusammensetzung wird vorzugsweise intravenös verabreicht. Systemische Wege beinhalten intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektionen einschließlich einem Depot für die langfristige Freisetzung, intraokulär oder retrobulbär, intrathecal, intraperitoneal (z.B. durch intraperitoneale Spülung), transpulmonar unter Verwendung des Sprüh- oder Zerstäuberwirkstoffes oder transdermal verabreicht werden. Topische Wege beinhalten die Verabreichung in der Form von Salben, Augentropfen, Ohrentropfen oder Spülungsflüssigkeiten (für z.B. Spülung von Wunden). Die Zusammensetzungen können lokal angewendet werden als eine Injektion, Tropfen, Spray, Tabletten, Creme, Salbe, Gel und ähnliches. Sie können als ein Bolus oder als vielfache Dosen über eine Zeitperiode verabreicht werden.
  • Die Menge des Peptids im Serum und anderen Geweben nach Verabreichung kann durch verschiedene bekannte Techniken kontrolliert werden, wie z.B. bakterielle, chromatographische oder Antikörper-basierte wie z.B. ELISA, Testverfahren.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden in einer Art verabreicht, die der Infektion oder der zu behandelnden Krankheit entspricht. Die Menge und Häufigkeit der Anwendung wird durch Faktoren bestimmt wie z.B. dem Zustand des Patienten, der Ursache der Infektion und der Schwere der Infektion. Entsprechende Dosierungen können durch klinische Studien ermittelt werden, aber werden im allgemeinen von etwa 0,1 bis 50 mg/kg reichen. Der allgemeine Bereich der Dosierungen für die antibiotischen Mittel wird unten dargestellt.
  • Tabelle 7
    Figure 00450001
  • Zusätzlich können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in der Art von gewöhnlichen Desinfektionsmitteln verwendet werden oder in irgendwelchen Situationen, bei denen Mikroorganismen unerwünscht sind. Zum Beispiel können diese Peptide als Oberflächendesinfektionsmittel verwendet werden, als Beschichtung einschließlich der kovalenten Bindung, für medizinische Vorrichtungen, als Beschichtung für Kleidung, wie z.B. um das Wachstum von Bakterien zu verhindern oder um Mücken abzuwehren, in Filtern für die Luftreinigung, wie z.B. in einem Flugzeug, in der Wasseraufreinigung, als Bestandteile von Shampoos und Seifen, als Nahrungskonservierungsstoffe, kosmetische Konservierungsstoffe, Medienkonservierungsstoffe, Herbizide oder Insektizide, Bestandteile von Baumaterialien, wie z.B. in Silikondichtungsstoffen und in der Tierproduktherstellung, wie z.B. in der Behandlung von Tierhäuten. Wie hier verwendet bezieht sich „medizinische Vorrichtung" auf irgendeine Vorrichtung für die Verwendung in einem Patienten, wie z.B. ein Implantat oder eine Prothese. Solche Vorrichtungen beinhalten Stents, Schläuche, Sonden, Kanülen, Katheter, synthetische vaskuläre Transplantate, Blutuntersuchungsvorrichtungen, künstliche Herzklappen, Nadeln und ähnliches.
  • Für diese Zwecke werden üblicherweise die Peptide alleine oder in Verbindung mit einem Antibiotikum in üblicherweise verwendeten Zusammensetzungen oder in einem geeigneten Applikator, wie z.B. zur Anwendung für die Kleidung, aufgenommen. Sie können in das Material während der Herstellung eingeschlossen werden oder imprägniert werden, wie z.B. für einen Luftfilter, oder anderweitig für Vorrichtungen angewendet werden. Die Peptide und Antibiotika brauchen nur in einer Lösung, die für die Vorrichtung oder den Artikel geeignet ist, suspendiert werden. Polymere sind eine Art von Trägermaterial, das verwendet werden kann.
  • Die Peptide, insbesondere die markierten Analoga, können in der Bildanalyse verwendet werden und in diagnostischen Testverfahren oder für Zielstellen in eukaryontischen, multizellulären und einzelzell-zellulären Organismen und in Prokaryonten. Zur Verwendung als ein Zielsystem können die Analoga mit anderen Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Antikörpern und ähnlichen gekoppelt werden.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • SYNTHESE, AUFREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON KATIONISCHEN PEPTIDEN UND ANALOGA
  • Die Peptidsynthese basiert auf der Standardfestphasen Fmoc Schutzstrategie. Das verwendete Instrument ist ein 9050 Plus PepSynthesiser (PerSeptive Biosystems Inc.). Poylethylenglycolpolystyrol-Graftharze (PEG-PS) werden als die Festphase verwendet, derivatisiert mit einem Fmoc-geschützten Aminosäurelinker für die C-terminale Amidsynthese. HATU (O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-Tetramethyluroniumhexafluorphosphat) wird als das Kopplungsreagenz verwendet. Während der Synthese werden die Kopplungsschritte kontinuierlich überwacht, um sicherzustellen, dass jede Aminosäure in hohen Ausbeuten eingebaut wird. Das Peptid wird von dem Festphasenharz abgespalten, unter Verwendung von Trifluoressigsäure und geeigneten Empfängersubstanzen und das Rohpeptid wird unter Verwendung der präparativen reverse Phasenchromatographie aufgereinigt. Üblicherweise wird das Peptid als das Trifluoracetatsalz hergestellt, aber andere Salze, wie z.B. Acetat, Chlorid und Sulfat können auch durch Salzaustausch hergestellt werden.
  • Alle Peptide werden durch Massenspektrometrie analysiert, um sicherzustellen, dass das Produkt die erwartete Molekularmasse hat. Das Produkt sollte einen einzelnen Peak haben, der mehr als 95% der gesamten Peakfläche darstellt, wenn es der analytischen Reversephase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) unterworfen ist, ein Trennungsverfahren, das auf der Hydrophobizität des Peptids beruht. Zusätzlich sollte das Peptid eine Einzelbande zeigen, die für mehr als 90% der gesamten Bandintensität zählt, wenn es der Säure-Harnstoff-Gelelektrophorese unterworfen ist, einer Trennungsmethode, die auf dem Verhältnis Ladung zu Masse des Peptids basiert.
  • Der Peptidgehalt, die Menge des Produktes, das eher Peptid als zurückgehaltenes Wasser, Salz oder Lösungsmittel ist, wird durch quantitative Aminosäureanalyse, freie Aminderivatisierung oder spektrophotometrische Mengenbestimmung gemessen. Die Aminosäureanalyse stellt auch Informationen über das Verhältnis der in dem Peptid anwesenden Aminosäuren zur Verfügung, das bei der Bestätigung der Authentizität des Peptids mithilft.
  • Peptidanaloga und ihre Namen sind unten aufgelistet. In dieser Liste, und an anderer Stelle, werden die Aminosäure durch den Ein-Buchstaben Aminosäurecode bezeichnet und Kleinbuchstaben repräsentieren die D-Form der Aminosäure.
  • Figure 00480001
  • BEISPIEL 2
  • SYNTHESE VON MODIFIZIERTEN PEPTIDEN
  • Kationische Peptide, wie z.B. Indolicidinanaloge, werden modifiziert, um die physikalischen Eigenschaften des Originalpeptids zu ändern, entweder durch Verwendung von modifizierten Aminosäuren in der Synthese oder durch post-synthetische Modifikation. Solche Modifikationen beinhalten: Acetylierung an dem N-Terminus, Fmoc-derivatisierter N-Terminus, Polymethylierung, Peracetylierung und verzweigte Derivate.
  • α-N-terminale Acetylierung. Vor dem Abspalten des Peptids von dem Harz und dem Entschützen wird das vollständig geschützte Peptid mit N-Acetylimidazol in DMF für 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt, was in der selektiven Reaktion an dem α-N-Terminus resultiert. Das Peptid wird dann entschützt/abgespalten und aufgereinigt, wie bei einem unmodifizierten Peptid.
  • Fmoc-derivatisierter α-N-Terminus. Wenn der letzte Fmoc-Entschützungsschritt nicht ausgeführt wird, bleibt die α-N-Terminus-Fmoc-Gruppe an dem Peptid. Das Peptid wird dann an der Seitenkette entschützt/abgespalten und aufgereinigt, wie bei einem unmodifizierten Peptid.
  • Polymethylierung. Das aufgereinigte Peptid wird in einer Methanollösung mit einem Überschuss an Natriumbicarbonat behandelt, gefolgt von einem Überschuss Methyljodid. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit organischem Lösungsmittel extrahiert, neutralisiert und aufgereinigt, wie bei einem unmodifiziertem Peptid. Unter Verwendung dieses Verfahrens wird ein Peptid nicht vollständig methyliert sein; Methylierung von MBI 11CN brachte einen Durchschnitt von 6 Methylgruppen ein. Daher wird das modifizierte Peptid ein Gemisch von methylierten Produkten sein.
  • Peracetylierung. Ein aufgereinigtes Peptid in DMF-Lösung wird mit N-Acetylimidazol für eine Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Das Rohprodukt wird konzentriert in Wasser aufgelöst, lyophilisiert, in Wasser wieder aufgelöst und aufgereinigt, wie bei einem unmodifiziertem Peptid. Die komplette Acetylierung der primären Amingruppen wird beobachtet.
  • Vier/Acht verzweigte Derivate. Die verzweigten Peptide werden auf einem vier oder acht verzweigten Kern, der an das Harz gebunden ist, synthetisiert. Die Synthese und die Entschützung/Abspaltung verlaufen wie bei einem unmodifiziertem Peptid. Diese Peptide werden durch Dialyse gegen 4 M Guadininhydrochlorid, dann Wasser aufgereinigt und dann durch Massenspektrometrie analysiert.
  • BEISPIEL 3
  • IN VITRO TESTVERFAHREN, UM DIE KATIONISCHE PEPTIDAKTIVITÄT ZU MESSEN
  • Ein kationisches Peptid kann alleine auf antimikrobielle Aktivität vor dem Feststellen seiner verstärkten Aktivität mit antibiotischen Mitteln getestet werden. Das Peptid hat vorzugsweise messbare antimikrobielle Aktivität.
  • Agaroseverdünnungstestverfahren
  • Das Agaroseverdünnungs-Testverfahren misst die antimikrobielle Aktivität von Peptiden und Peptidanaloga, die als die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) der Peptide ausgedrückt ist.
  • Um in vivo Bedingungen zu imitieren, wird das Calcium- und Magnesium-ergänzte Mueller-Hinton-Nährmedium in Verbindung mit einer niedrig-EEO-Agarose als dem bakteriellen Wachstumsmedium verwendet. Agarose wird eher als Agar verwendet, da die geladenen Gruppen im Agar die Peptiddiffusion durch das Medium verhindern. Das Medium wird autoklaviert und dann auf 50-55°C in einem Wasserbad vor der aseptischen Hinzugabe der antimikrobiellen Lösungen abgekühlt. Dasselbe Volumen von verschiedenen Konzentrationen der Peptidlösung wird zu der gekühlten, geschmolzenen Agarose hinzugefügt, die dann zu einem Füllstand von 3-4 mm ausgegossen wird.
  • Das bakterielle Inokulum wird auf einen 0,5 McFarland Trübungsstandard (PML Microbiological) adjustiert und dann 1:10 vor der Anwendung auf die Agaroseplatte verdünnt. Das endgültige Inokulum, das auf die Agarose aufgetragen wird, ist ungefähr 104 CFU an einer Stelle mit 5-8 mm Durchmesser. Die Agaroseplatten werden bei 35-37°C für 16 bis 20 Stunden inkubiert.
  • Die MIC wird als die niedrigste Konzentration des Peptids, die das Wachstum des Organismus vollständig inhibiert, wie durch visuelle Inspektion bestimmt, aufgezeichnet. Repräsentative MICs für verschiedene Indolicidinanaloga gegen Bakterien sind in Tabelle 8 gezeigt und repräsentative MICs gegen Candida sind in Tabelle 9 unten gezeigt.
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Tabelle 9
    Figure 00560001
  • Nährlösungsverdünnungstestverfahren
  • Üblicherweise wird 100 μl der Calcium- und Magnesium-ergänzten Mueller-Hinton-Nährlösung in jede Vertiefung einer 96-well (Vertiefung) Mikrotiterplatte verabreicht und 100 μl Volumen von zweifach serienmäßigen Verdünnungen des Peptids werden quer über die Platte hergestellt. Eine Reihe der Vertiefungen erhält kein Peptid und wird als Wachstumskontrolle verwendet. Jede Vertiefung wird mit ungefähr 5 × 105 CFU der Bakterien inokuliert und die Platte wird bei 35-37 °C 16-20 Stunden inkubiert. Die MIC wird bei der niedrigsten Konzentration des Peptids, das komplett das Wachstum des Organismus inhibiert, wie durch visuelle Inspektion bestimmt, aufgezeichnet.
  • Zeittötungstestverfahren
  • Zeittötungskurven werden verwendet, um die antimikrobielle Aktivität von kationischen Peptiden über ein Zeitintervall zu bestimmen. Kurz gesagt wird in diesem Testverfahren eine Suspension von Mikroorganismen, äquivalent zu einem 0,5 McFarland Standard, in 0.9%iger Kochsalzlösung hergestellt. Diese Suspension wird dann verdünnt, derart, dass, wenn sie zu einem Gesamtvolumen von 9 ml der Kationen-adjustierten Mueller-Hinton-Nährlösung hinzu gegeben wurde, die Inokulumgröße 1 × 106 CFU/ml ist. Ein Aliquot von 0,1 ml wird von jedem Röhrchen bei vorbestimmten Intervallen bis zu 24 Stunden entfernt, in 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt und in dreifachen Ansätzen ausplattiert, um die lebensfähigen Koloniezahlen zu bestimmen. Die Anzahl von Bakterien, die in jeder Probe zurückbleiben, wird über die Zeit aufgezeichnet, um die Tötungsrate des kationischen Peptids zu bestimmen. Im allgemeinen zeigt eine drei oder mehr log10-Reduktion in bakteriellen Zählungen in der antimikrobiellen Suspension, verglichen zu den Wachstumskontrollen, eine adäquate Bakterienabtötende Reaktion an.
  • Wie in 1A-D gezeigt, weisen die meisten der Peptide eine drei oder größere log10-Reduktion in den bakteriellen Zählungen in der antimikrobiellen Lösung auf, verglichen zu den Wachstumskontrollen, was darauf hinweist, dass diese Peptide die Kriterien für eine Bakterien-abtötende Reaktion erfüllt haben.
  • BEISPIEL 4
  • VERFAHREN, UM DIE VERSTÄRKTE AKTIVITÄT VON ANTIBIOTISCHEM MITTEL UND KATIONISCHEN PEPTIDKOMBINATIONEN ZU MESSEN
  • Tötungskurven
  • Zeittötungskurven, die sich aus der Kombination von kationischen Peptid und antibiotischem Mittel ergeben, werden mit denen verglichen, die sich aus dem Mittel alleine ergeben.
  • Das Testverfahren wird wie oben beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme, dass Duplikatröhrchen für jede Konzentration des antibiotischen Mittels alleine oder für die Kombination des antibiotischen Mittels und kationischen Peptids aufgestellt sind. Synergie wird durch mindestens eine 100-fache (2 log10) Zunahme im Töten bei 24 Stunden durch die Zusammenstelliung des antibiotischen Mittels und kationischen Peptids nachgewiesen, verglichen zu dem antibiotischen Mittel alleine. Ein Zeittötungstestverfahren wird in 1E für MBI 26 in Kombination mit Vancomycin gegen einen bakteriellen Stamm gezeigt. Die Kombination von Peptid und antibiotischem Mittel ergab ein größeres Töten als entweder das Peptid oder das antibiotische Mittel alleine.
  • FIC-Messungen
  • In diesem Verfahren wird die Synergie unter Verwendung der Agaroseverdünnungstechnik bestimmt. Eine Anordnung von Platten oder Röhrchen, von denen jedes eine Kombination des Peptids und Antibiotikums in einem einzigartigen Konzentrationsgemisch enthält, wird mit bakteriellen Isolaten inokuliert. Wenn Festphasetestverfahren durchgeführt werden, wird die Calcium- und Magnesium-ergänzte Mueller-Hinton-Nährlösung in Kombination mit einer niedrigen EEO Agarose als dem bakteriellen Wachstumsmedium verwendet. Nährlösungsverdünnungstestverfahren können auch verwendet werden, um die Synergie zu bestimmen. Synergie wird für kationische Peptide in Kombination mit einer Anzahl von konventionellen antibiotischen Mitteln bestimmt, z.B. Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme, Monobactame, Aminoglycoside, Macrolide, Fluorochinolone, Nisin und Lysozym.
  • Synergie wird ausgedrückt als eine anteilige inhibitorische Konzentration (FIC), die nach der Gleichung unten berechnet wird. Ein FIC ≤ 0,5 ist ein Nachweis auf Synergie. Eine zusätzli che Reaktion hat einen FIC > 0,5 und ≤ 1, während eine indifferente Reaktion eine FIC Wert > 1 und ≤ 2 hat.
  • Figure 00590001
  • Tabellen 10, 11 und 12 stellen Kombinationen von kationischen Peptiden und antibiotischen Mitteln dar, die einen FIC Wert von weniger als oder gleich 1 aufweisen. Obgleich der FIC in vitro gemessen wird, und die Synergie als ein FIC von weniger als oder gleich 0.5 definiert ist, kann ein zusätzlicher Effekt therapeutisch sinnvoll sein. Wie unten gezeigt, obgleich alle Mikroorganismen empfänglich (NCCLS Haltepunktdefinitionen) auf die getesteten antibiotischen Mittel sind, verstärkt die Hinzugabe des kationischen Peptids die Wirksamkeit des antibiotischen Mittels.
  • Tabelle 10
    Figure 00590002
  • Figure 00600001
  • Tabelle 11
    Figure 00600002
  • Figure 00610001
  • Tabelle 12 1. Amikacin
    Figure 00620001
  • 2. Ceftriaxone
    Figure 00630001
  • 3. Ciprofloxacin
    Figure 00630002
  • Figure 00640001
  • 4. Gentamicin
    Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • 5. Mupirocin
    Figure 00660002
  • Figure 00670001
  • 6. Piperacillin
    Figure 00670002
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • 7. Tobramycin
    Figure 00700002
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • 8. Vancomycin
    Figure 00720002
  • Figure 00730001
  • BEISPIEL 5
  • ÜBERWINDEN DER TOLERANZ DURCH VERABREICHEN EINER KOMBINATION VON ANTIBIOTISCHEN MITTEL UND KATIONISCHEM PEPTID
  • Toleranz auf ein antibiotisches Mittel ist mit einem Defekt in bakteriellen, zellulären autolytischen Enzymen verbunden, derart, dass ein antimikrobielles Mittel eher bakteriostatisch als Bakterien-abtötend wirkt. Toleranz wird angezeigt, wenn ein Verhältnis der minimalen Bakterien-abtötenden Konzentration (MBC) zur minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) (MBC:MIC) ≥ 32 ist.
  • Das Agaroseverdünnungs-Testverfahren wird angeglichen, um beides, sowohl den MBC und MIC für ein antimikrobielles Mittel alleine, als auch ein Mittel in Kombination mit einem Peptid zur Verfügung zu stellen. Nach der Bestimmung des MIC wird der MBC von dem Agaroseverdünnungs-Testverfahrensplatten durch Abstreichen der Inokula auf den Platten bei und oberhalb des MIC und durch Resuspendieren des Abstrichs in 1,0 ml Kochsalzlösung bestimmt. Ein 0,01 ml Aliquot wird auf Agaraosemedium plattiert (Subkulturplatten) und die resultierenden Kolonien werden gezählt. Wenn die Anzahl der Kolonien geringer ist als 0,1% des anfänglichen Inokulums (wie durch eine Plattenzählung sofort nach Inokulation der MIC-Testplatten bestimmt), dann ist > 99,9% Tötung eingetreten. Der MBC-Endpunkt wird als die niedrigste Konzentration des antimikrobiellen Mittels definiert, die 99,9% der Testbakterien abtötet.
  • Daher tritt Toleranz eines Mikroorganismus gegen ein antimikrobielles Mittel ein, wenn die Anzahl der Kolonien, die auf Subkulturplatten wachsen, den 0,1%igen Cutoff (Schwellenwert) für verschiedene fortlaufende Konzentrationen oberhalb des beobachteten MIC über steigt. Eine Kombination von antimikrobiellem Mittel und kationischem Peptid, das die Toleranz bricht, resultiert in einer Abnahme in dem MBC:MIC Verhältnis auf < 32. Tabelle 13 zeigt, dass die Kombination von Vancomycin und MBI 26 die Toleranz der aufgelisteten Organismen überwindet.
  • Tabelle 13
    Figure 00740001
  • BEISPIEL 6
  • ÜBERWINDUNG DER ANGEBORENEN RESISTENZ DURCH DARREICHUNG EINER KOMBINATION DES ANTIBIOTISCHEN MITTELS UND KATIONISCHEN PEPTIDS
  • Peptide werden auf ihre Fähigkeit getestet, die angeborene antimikrobielle Resistenz der Mikroorganismen einschließlich derer, die in Hospitalplätzen angetroffen werden, auf spezifische antimikrobielle Mittel zu überwinden. Das Überwinden der Resistenz wird nachgewiesen, wenn das antibiotische Mittel alleine geringe oder keine Aktivität gegen den Mikroorganismus aufweist, aber wenn es, in Kombination mit einem kationischem Peptid verwendet, in der Anfälligkeit des Mikroorganismus resultiert.
  • Das Agaroseverdünnungs-Testverfahren, das oben beschrieben ist, wird verwendet, um die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) der antimikrobiellen Mittel und kationischen Peptide alleine oder in Kombination zu bestimmen. Alternativ können die Nährlösungsverdünnungstestverfahren oder Zeittötungskurven verwendet werden, um die MICs zu bestimmen. Die Tabellen 14-17 stellen MIC Werte für antibiotische Mittel alleine oder in Kombination mit Peptid bei den gezeigten Konzentrationen dar. In allen Fällen ist der Mikroorga nismus angeboren resistent zu deren Wirkungsweise, daher ist das antibiotische Mittel nicht effektiv gegen den getesteten Mikroorganismus. Zusätzlich wird das antibiotische Mittel nicht klinisch verschrieben gegen den Testmikroorganismus.
  • In den unten dargestellten Daten sind die MIC Werte für die antibiotischen Mittel, wenn sie in Kombination mit dem Peptid verabreicht werden, von gleich zu oder oberhalb des Resistenzhaltepunktes, bis zu unterhalb des Punktes, verringert.
  • Tabelle 14
    Figure 00750001
  • Tabelle 15
    Figure 00750002
  • Tabelle 16
    Figure 00750003
  • Tabelle 17 1. Amikacin
    Figure 00760001
  • 2. Ceftriaxone
    Figure 00760002
  • 3. Gentamicin
    Figure 00760003
  • 4. Mupirocin
    Figure 00770001
  • 5. Piperacillin
    Figure 00770002
  • 6. Tobramycin
    Figure 00770003
  • BEISPIEL 7
  • ÜBERWINDEN DER ERWORBENEN RESISTENZ DURCH VERABREICHUNG EINER KOMBINATION DES ANTIBIOTISCHEN MITTELS UND KATIONISCHEN PEPTIDS
  • Ein antibiotisches Mittel kann gegen einen vorher sensitiven Mikroorganismus ineffektiv werden, wenn der Mikroorganismus eine Resistenz gegen das Mittel erwirbt. Jedoch kann die erworbene Resistenz überwunden werden, wenn das Mittel in Kombination mit einem kationischen Peptid verabreicht wird. Zum Beispiel werden Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE) sensitiv für Vancomycin, wenn es in Verbindung mit einem kationischen Peptid wie z.B. MBI 26 verwendet wird. Diese Kombination wird wahrscheinlich effektiv gegen andere Organismen sein, die Resistenz gegen Vancomycin entwickelt haben, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Stämme des Methycillin-resistenten S. aureus (MRSA).
  • In ähnlicher Weise werden Teicoplanin-resistente Enterokokken sensitiv gegen Teicoplanin, wenn Teicoplanin in Kombination mit kationischem Peptiden, wie z.B. MBI 26, verwendet wird.
  • Wie vorher beschrieben, wird das Agaroseverdünnungs-Testverfahren verwendet, um den MIC für die antibiotischen, die allein oder in Kombination mit kationischen Peptiden verabreicht werden, zu bestimmen. Alternativ kann das Nährlösungsverdünnungstestverfahren oder die Zeittötungskurven verwendet werden. Tabellen 18 und 19 stellen Ergebnisse dar, die zeigen, dass die Verabreichung eines kationischen Peptids in Kombination mit einem antibiotischen Mittel die erworbene Resistenz überwindet. Tabelle 20 stellt Ergebnisse dar, die die Verabreichung von MBI 26 in Kombination mit Teicoplanin gegen Teicoplanin-resistente Enterokokken zeigt.
  • Tabelle 18
    Figure 00780001
  • Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Tabelle 19
    Figure 00810001
  • Tabelle 20 1. Amikacin
    Figure 00820001
  • 2. Ceftriaxone
    Figure 00820002
  • 3. Ciprofloxacin
    Figure 00820003
  • Figure 00830001
  • 4. Geatamicin
    Figure 00830002
  • Figure 00840001
  • 5. Mupirocin
    Figure 00840002
  • 6. Piperacillin
    Figure 00840003
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • 7. Tobramycin
    Figure 00860002
  • Figure 00870001
  • 8. Vanocomycin
    Figure 00870002
  • Figure 00880001
  • Diese Daten zeigen, dass erworbene Resistenz überwunden werden kann. Zum Beispiel wird die erworbene Resistenz von S. aureus, einem Gram-positiven Organismus, auf Piperacillin überwunden, wenn es mit MBI 27 kombiniert wird, und die erworbene Resistenz auf Ciprofloxacin wird mit den Peptiden MBI 21A1 oder MBI 21A2 überwunden. Ähnliche Resultate werden für die Peptide MBI 26 und MBI 31 in Verbindung mit Methycillin und Erythromycin, und für Peptid MBI 26 in Kombination mit Vancomycin oder Teicoplanin gegen resistente Enterokokken erhalten:
  • BEISPIEL 8
  • SYNERGIE VON KATIONISCHEN PEPTIDEN UND LYSOZYM ODER NISIN
  • Die Effektivität von Lysozym oder Nisin wird verbessert, wenn jedes der Mittel in Kombination mit einem antibiotischen Mittel verabreicht wird. Die Verbesserung wird durch Messung der MICs von Lysomzym oder Nisin alleine und in Kombination mit dem Antibiotikum gezeigt, wobei der Lysozym- oder Nisin- oder Antibiotikum-MIC-Wert kleiner in Kombination ist als alleine. Die MICs können durch das Agaroseverdünnungs-Testverfahren, das Nährlösungsverdünnungstestverfahren oder durch Zeittötungskurven gemessen werden.
  • BEISPIEL 9
  • ERYTHROCYTENHÄMOLYSE DURCH KATIONISCHE PEPTIDE
  • Ein rotes Blutzellen (RBC)-Lysetestverfahren wird verwendet, um Peptide nach ihrer Fähigkeit zu gruppieren, RBC unter standardisierten Bedingungen im Vergleich mit MBI 11CN und Gramicidin-S zu lysieren. Peptidproben und gewaschene Schaf-RBC werden in isotonischer Kochsalzlösung hergestellt, mit dem End pH, der zwischen 6 und 7 eingestellt ist. Peptidproben und RBC-Suspension werden zusammengemischt, um Lösungen zu erhalten, die 1%ig (v/v) sind an RBC und 5,50 oder 500μg/ml Peptid haben. Das Testverfahren wird, wie oben beschrieben, durchgeführt. Jeder Satz von Testverfahren beinhaltet auch jeweils MBI 11CN (500 μg/ml) und Gramicidin-S (5 μg/ml) als „niedrige Lyse" und „hohe Lyse" Kontrollen.
  • MBI11B7CN, MBI11F3CN und MBI11F4CN werden unter Verwendung dieses Verfahrens getestet und die Ergebnisse werden in Tabelle 21 unten dargestellt.
  • Tabelle 21
    Figure 00890001
    • N/D = nicht bestimmt
  • Peptide, die bei 5 μg/ml RBC zu einem gleichen oder größerem Maß wie Gramicidin-S, die „Hochlysekontrolle", lysieren, werden als hoch-lytisch betrachtet. Peptide, die bei 500 μg/ml RBC zu einem gleichen oder geringerem Ausmaß als MBI 11CN, die „Niedriglysekontrolle", lysieren, werden als nicht-lytisch betrachtet. Die drei getesteten Analoga sind alle „mäßig lytisch", da sie eine größere Lysis als MBI 11CN und eine geringere als Gramicidin-S verursachen. Zusätzlich ist eine der Analoga, MBI 11F3CN, signifikant weniger lytisch als die anderen zwei Varianten bei allen drei getesteten Konzentrationen.
  • Eine Kombination von kationischem Peptid und antibiotischem Mittel wird auf Toxizität gegenüber eukaryontischen Zellen durch Messung des Ausmaßes der Lysis von roten Blutzellen von Säugern getestet. Kurz gesagt, rote Blutzellen werden von Gesamtblut durch Zentrifugation abgetrennt, frei von Plasmakomponenten gewaschen und in isotonischer Kochsalzlösung als eine 5%ige (v/v) Suspension resuspensiert. Das Peptid und das antibiotische Mittel werden in isotonischer Kochsalzlösung oder in einer anderen akzeptablen Lösung vorgemischt und ein Aliquot von dieser Lösung wird zu der roten Blutzellsuspension hinzugefügt. Nach Inkubation mit konstanter Bewegung bei 37°C für eine Stunde, wird die Lösung zentrifugiert und die Absorption des Überstandes bei 540 nm gemessen, was freigelassenes Hämoglobin nachweist. Vergleich des A540 für einen 100%igen lysierten Standard stellt ein relatives Maß der Hämoglobinfreisetzung von roten Blutzellen zur Verfügung, das die lytische Fähigkeit der Kombination des kationischen Peptids und des antibiotischen Mittels anzeigt.
  • BEISPIEL 10
  • PHARMAKOLOGIE VON KATIONISCHEN PEPTIDEN IN PLASMA UND BLUT
  • Die in vitro Lebensdauer von freien Peptiden in Plasma oder in Blut wird durch Messen der Menge des Peptids, das nach gesetzten Inkubationszeiten anwesend ist, bestimmt. Blut wird von Schafen gesammelt, mit einem Antikoagulant (nicht Heparin) behandelt und für die Plasmapräparation zentrifugiert, um Zellen zu entfernen. Formuliertes Peptid wird entweder zu der Plasmafraktion oder zu dem Gesamtblut hinzugefügt und inkubiert. Nach der Inkubation wird das Peptid identifiziert und direkt durch reverse-Phase-HPLC oder einen Antikörper-basiertes Testverfahren quantifiziert. Das antibiotische Mittel wird durch ein geeignetes Testverfahren quantifiziert, ausgewählt auf der Basis seiner Struktur. Chromatographische Bedingungen sind wie oben beschrieben. Extraktion ist nicht erforderlich, da der freie Peptidpeak nicht irgendeinen der Peaks vom Blut oder Plasma überlagert.
  • Eine 1 mg/ml Lösung von MBI 11B7CN in isotonischer Kochsalzlösung wird zu frisch bereitetem, hitze-inaktivierten Kaninchenserum hinzugefügt, um eine endgültige Peptidkonzentration von 100 μg/ml zu ergeben und wird bei 32°C inkubiert. Die zu verschiedenen Inkubationszeiten nachgewiesenen Peptidmengen sind in 2 gezeigt.
  • Eine Reihe von Peptidstabilitätsstudien wird durchgeführt, um die Wirkung der Proteaseinhibitoren auf den Peptidabbau zu untersuchen. Das Peptid wird zu Kaninchenserum oder Plasma entweder mit oder ohne Proteaseinhibitoren hinzugefügt, dann für 3 Stunden bei 22°C inkubiert. Getestete Proteaseinhibitoren beinhalten Amastatin, Bestatin, COMPLETE Protease Inhibitor Cocktail, Leupeptin, Pepstatin A und EDTA. Amastatin und Bestatin verhindern bei 100 μM den Abbau des MBI 11B7CN im Plasma über 3 Stunden. Für diese Experimente wurden 10 mM Stammlösungen von Amastatin und Bestatin in Dimethylsulfoxid hergestellt. Diese Lösungen werden 1:100 in Hitze-inaktivierten Kaninchenserum verdünnt und 15 Minuten vor Hinzugabe der Peptide bei 22°C inkubiert. MBI 11B7CN wird zu dem Serum bei einer Endkonzentration von 100 μg/ml hinzugefügt und 3 Stunden bei 22°C inkubiert. Nach der Inkubationsperiode werden die Serumproben auf einer analytischen C8-Säule (Water Nova Pak C8 3.9 × 170 mm) mit Nachweis bei 280 nm analysiert. In 3 eluiert MBI 11B7CN nach 25 Minuten und zeigt unterschiedliche Grade von Degradation.
  • Das Peptid wird vom Plasma unter Verwendung von C8 Sep Pak Kartuschen bei Peptidkonzentration zwischen 0 und 50 μg/ml extrahiert. Jede Extraktion enthält auch MBI 11CN bei 10 μg/ml als einen internen Standard. Sofort nach Hinzugabe der Peptide zu frischem Kaninchenplasma werden die Proben gemischt, dann 1:10 mit einer 1 %igen wässrigen Trifluoracetat Essigsäure (TFA) Lösung verdünnt, um eine finale TFA-Konzentration von 0,1% zu erhalten. Fünfhundert μl von dieser Lösung wird sofort auf eine C8 Sep Pak Kartusche geladen und mit 0,1%iger TFA in 40% Acetonitril/60% H2O eluiert. Zwanzig μl von diesem Eluat wird auf eine 4,6 × 45 mm analytische C18-Säule geladen und wird mit einem Acetonitrilgradienten von 25% bis 65% über 8 Säulenvolumen eluiert. Die Peptide werden bei 280 nm nachgewiesen. Wie in 4 gezeigt, eluiert MBI 11B7CN und MBI 11CN jeweils nach 5 und 3 Minuten. Außerdem wird MBI 11B7CN über einen Hintergrund bei Konzentrationen von 5 μg/ml und oberhalb nachgewiesen.
  • Die in vivo Lebensdauer der Kombination aus kationischem Peptid und antibiotischem Mittelzusammensetzung wird durch Verabreichung, üblicherweise durch intravenöse oder interperitoneale Injektion, von 80-100% der maximalen tolerierbaren Dosis der Kombination in einem geeigneten Tiermodell, üblicherweise eine Maus, bestimmt. Zu gesetzten Zeiten nach Injektion wird jede Gruppe von Tieren anästhesiert, Blut gezogen und Plasma durch Zentrifugation erhalten. Die Menge des Peptids oder Mittels in dem Plasmaüberstand wird wie für die in vitro Bestimmung (5) analysiert.
  • BEISPIEL 11
  • TOXIZITÄT VON KATIONISCHEN PEPTIDEN IN VIVO
  • Die akute Einzeldosistoxizität von verschiedenen Indolicidinanaloga wird in Schweizer CD1 Mäusen ausgetestet unter Verwendung unterschiedlicher Verabreichungswege. Um die anhaftenden Toxizitäten der Peptidanaloga in der Abwesenheit von irgendwelchen Effekten der Formulierung/Freigabevehikel zu bestimmen, werden alle Peptide in isotonischer Kochsalzlösung mit dem End pH zwischen 6 und 7 verabreicht.
  • Intraperitoneale Route. Gruppen von 6 Mäusen werden mit Peptiddosen von zwischen 80 und 5 mg/kg in 500 μl Dosisvolumen injiziert. Nach Verabreichung des Peptids werden die Mäuse über einen Bereich von 5 Tagen beobachtet, zu dem Zeitpunkt, wenn die Menge der Dosis, die 50% Mortalität bewirkt (LD50), die Menge der Dosis die 90 bis 100% Mortalität (LD90-100) bewirkt und die maximal tolerierte Dosis (MDT) Menge bestimmt werden. Die LD50-Werte werden unter Verwendung des Verfahrens von Reed und Muench (J. of Amer. Hyg. 27:493-497, 1938) berechnet. Die Ergebnisse, die in Tabelle 22 dargestellt sind, zeigen, dass sich die LD50-Werte für MBI11CN und Analoga zwischen 21 bis 52 mg/kg erstrecken.
  • Tabelle 22
    Figure 00920001
  • Die Einzeldosis-Toxizität einer Kombination von kationischem Peptid und antibiotischem Mittel wird in ausgekreuzten ICR-Mäusen untersucht. Intraperitoneale Injektion der Kombination in isotonischer Kochsalzlösung wird bei zunehmenden Dosismengen durchgeführt. Das Überleben der Tiere wird 7 Tage lang überwacht. Die Anzahl der Tiere, die bei jeder Dosismenge überlebt, wird verwendet, um die maximale tolerierte Dosis (MTD) zu bestimmen. Zusätzlich kann die MTD nach Verabreichung des Peptids und Mittels durch unterschiedliche Wege, zu verschiedenen Zeitpunkten und in unterschiedlichen Formulierungen nachgewiesen werden.
  • Intravenöse Route. Gruppen von 6 Mäusen werden mit Peptiddosen von ungefähr 20, 16, 12, 8, 4 und 0 mg/kg in 100 μl Volumen (4 ml/kg) injiziert. Nach Verabreichung werden die Mäuse über eine Periode von 5 Tagen beobachtet, zu dem Zeitpunkt, wenn die LD50, die LD90-100 und MDT Mengen bestimmt werden. Die Ergebnisse des IV Toxizitätstestens der MBI11CN und drei Analoga sind in Tabelle 23 gezeigt. Die LD50, LD90-100 und MDT Werte erstrecken sich jeweils von 5,8 bis 15 mg/kg, 8 bis 20 mg/kg und < 4 bis 12 mg/kg.
  • Tabelle 23
    Figure 00930001
  • Zusätzlich werden Mäuse vielfach auf intravenösem Weg mit MBI11CN injiziert. In einem repräsentativen Experiment ist das Peptid, das in 10 Injektionen von 0,84 mg/kg in 5 Minuten Intervallen verabreicht wird, nicht toxisch. Jedoch führen zwei Injektionen des Peptids bei 4,1 mg/kg, verabreicht in einem 10 Minuten Intervall, zu 60% Toxizität.
  • Subkutane Route. Die Toxizität von MBI 11CN wird auch nach subkutaner (SC) Verabreichung bestimmt. Für das SC Toxizitätstesten werden Gruppen von 6 Mäusen mit Peptiddosen von 128, 96, 64, 32 und 0 mg/kg in 300 μl Dosisvolumen (12 ml/kg) injiziert. Nach Verabreichung werden die Mäuse für eine Periode von 5 Tagen beobachtet. Keines der Tiere starb bei irgendeiner der Dosismengen innerhalb der 5 Tage Beobachtungsperiode. Daher werden die LD50, LD90-100 und MDT alle größer als 128 mg/kg genommen. Mäuse, die höhere Dosismengen erhalten, zeigten Symptome ähnlich zu denen, die nach IV Injektionen gesehen wurden, was vermuten lässt, dass das Peptid in die systemische Zirkulation eingetreten ist. Diese Symptome sind reversibel und verschwinden bei allen Mäusen an dem zweiten Tag der Beobachtungen.
  • Um den Einfluss des Dosierens der Mäuse mit dem Peptidanalog ermitteln zu können, werden eine Reihe von histopathologischen Untersuchungen durchgeführt. Gruppen von Mäusen wird das Analog zu Dosismengen gegeben, die entweder an, unter dem MDT oder über dem MDT, eine letale Dosis, sind. Zahlreiche Injektionen können verwendet werden, um mögliche Behandlungsregime zu imitieren. Gruppen von Kontrollmäusen werden nicht injiziert oder nur mit Puffer injiziert.
  • Nach Injektion werden die Mäuse zu bestimmten Zeiten getötet und ihre Organe sofort in eine 10%ige abgestimmte Formalinlösung platziert. Von Mäuse, die als ein Ergebnis der toxischen Effekte des Analogs sterben, werden sofort ihre Organe konserviert. Gewebeproben werden genommen und als gefärbte Mikrosektionen auf Glasplättchen präpariert, die dann mikroskopisch untersucht werden. Beschädigung an Geweben wird ermittelt und diese Information kann verwendet werden, um verbesserte Analoga, verbesserte Methoden der Darreichung oder verbesserte Dosierungsregime zu entwickeln.
  • Mäuse, denen eine nicht-letale Dosis gegeben wurde, sind immer lethargisch, mit aufgerichtetem Fell und Hinweis auf Ödeme und Hypotonie, erholen sich aber zum Normalzustand innerhalb von zwei Stunden. Gewebe von diesen Tieren zeigen, dass es dort einige Verletzungen an den Blutgefäßen, besonders innerhalb der Leber und Lunge, zu beiden Beobachtungszeiten gibt, aber andere anfängliche Abnormalitäten kehrten zum Normalzustand innerhalb der 150 Minuten Beobachtungszeit zurück. Es ist möglich, dass die Blutgefäßverletzung eine Konsequenz der kontinuierlichen Einwirkung von hohen zirkulierenden Peptidmengen ist.
  • Im Gegensatz dazu haben Mäuse, denen eine letale Dosis gegeben wurde, völlig normale Gewebe und Organe, außer bei der Leber und dem Herz von jeweils ip und iv dosierten Mäusen. Im allgemeinen wird diese Beschädigung als eine Zersetzung der Zellen identifiziert, die die Blutgefäße auskleiden. Es erscheint als ob der schnelle Tod von Mäusen aufgrund dieser Beschädigung eintritt, und dass das Peptid nicht über diesen Punkt durchgedrungen ist. Erhebliche Verletzungen an der hepatischen Pfortader und an den koronaren Arteriolen im Herzen werden beobachtet.
  • BEISPIEL 12
  • IN VIVO EFFIZIENZ VON KATIONISCHEN PEPTIDEN
  • Kationische Peptide werden auf ihre Fähigkeit getestet, Mäuse von letalen bakteriellen Infektionen zu retten. Das verwendete Tiermodell ist eine intraperitoneale (ip) Inokulation von Mäusen mit 106-108 Gram-positiven Organismen mit anschließender Verabreichung des Peptids. Die drei untersuchten Pathogene Methicillin-sensitive S. aureus (MSSA), Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) oder S. epidermidis werden ip in die Mäuse injiziert. Bei unbehandelten Mäusen tritt der Tod innerhalb 12-18 Stunden mit MSSA und S. epidermis und innerhalb 6-10 Stunden mit MRSA ein.
  • Das Peptid wird auf zwei Routen verabreicht, intraperitoneal nach einer Stunde Post-Infektion oder intravenös mit einzelnen oder multiplen Dosen, die zu verschiedenen Zeiten Pre- und Post-Infektion gegeben werden.
  • MSSA Infektion. In einem typischen Protokoll werden Gruppen von 10 Mäusen intraperitoneal mit einer LD90-100 Dosis (5,2 × 106 CFU/Maus) von MSSA (Smith, ATCC Nr. 19640) in einer Gehirn-Herz-Infusion, die 5% Mucin enthält, injiziert. Dieser Stamm von S. aureus ist nicht resistent zu irgendeinem gewöhnlichen Antibiotikum. 60 Minuten nach Infektion wird formuliertes MBI 10CN oder MBI 11CN intraperitoneal in einem Bereich von Dosismengen injiziert. Eine Injektion der Formulierung alleine dient als eine Negativkontrolle und Verabreichung von Ampicillin dient als eine Positivkontrolle. Das Überleben der Mäuse wird nach 1, 2, 3 und 4 Stunden nach Infektion und zweimal täglich danach für insgesamt 8 Tage untersucht.
  • MBI10CN ist maximal aktiv gegen MSSA (70-80% Überlebensrate) bei Dosen von 15-38 mg/kg, obgleich die 100% Überlebensrate nicht erreicht wird. Unter 15 mg/kg gibt es eine klare dosisabhängige Überlebensrate. Bei diesen niedrigeren Dosismengen erscheint es, dass es einen tierabhängigen Grenzwert gibt, da die Mäuse entweder am Tag 2 sterben oder die gesamte 8-Tagesperiode überleben. MBI 11CN andererseits rettet 100% der Mäuse von einer MSSA Infektion bei einer Dosismenge von 36 mg/kg und war daher so effektiv wie Ampicillin. Es gab wenig oder keine Aktivität zu irgendeinem der niedrigeren Dosismengen, was anzeigt, dass eine minimale Blutstrompeptidmenge erreicht werden muss, während der Zeit, in der die Bakterien eine Gefahr für den Wirt sind.
  • S. epidermidis Infektion. Peptidanaloga haben im allgemeinen niedrigere MIC Werte gegen S. epidermidis in vitro, daher können niedrigere Blutpeptidmengen gegen Infektionen effektiver sein.
  • In einem typischen Protokoll werden Gruppen von 10 Mäusen intraperitoneal eine LD90-100 Dosis (2,0 × 108 CFU/Maus) von S. epidermidis (ATCC Nr. 12228) in der Hirn-Herz-Infusionsnährlösung, die 5% Mucin enthält, injiziert. Dieser Stamm von S. epidermidis ist nach 5 Tagen zu 90% letal. Nach 15 Minuten und 60 Minuten Post-Infektion werden verschiedene Dosen von formulierten MBI 11CN intravenös durch die Schwanzvene injiziert. Eine Injektion der Formulierung alleine dient als die Negativkontrolle und Injektion von Gen tamicin dient als die Positivkontrolle: beide werden 60 Minuten Post-Infektion injiziert. Das Überleben der Mäuse wird 1, 2, 3, 4, 6 und 8 Stunden Post-Infektion und zweimal täglich danach für einen Gesamtbereich von 8 Tagen beobachtet.
  • MBI11CN verlängert das Überleben der Mäuse. Die Effizienz wird bei allen drei Dosismengen bei Behandlung 15 Minuten nach Infektion beobachtet, jedoch gibt es geringere Aktivität bei 30 Minuten nach Infektion und keinen signifikanten Effekt nach 60 Minuten Post-Infektion. Der Zeitpunkt der Verabreichung erscheint in diesem Modellsystem wichtig zu sein, wobei eine einzelne Injektion von 6 mg/kg 15 Minuten Post-Infektion die beste Überlebensrate ergibt.
  • MRSA Infektion. Die MRSA Infektion, die während einer kurzen Zeitperiode letal ist, erfordert eine viel höhere bakterielle Beladung als MSSA. In einem typischen Protokoll werden Gruppen von 10 Mäusen intraperitoneal mit einer LD90-100Dosis (4,2 × 107 CFU/Maus)von MRSA (ATCC Nr. 33591) in der Hirn-Herz-Infusion, die 5% Mucin enthält, injiziert. Die MBI 11CN Behandlungsprotokolle mit den Behandlungszeiten relativ zur Zeit der Infektion sind folgendermaßen:
    0 mg/kg Formulierung alleine (Negativkontrolle), injiziert bei 0 Minuten
    5 mg/kg Drei 5,5 mg/kg Injektionen bei –5, +55 und +115 Minuten
    1 mg/kg (2 h) Fünf 1,1 mg/kg Injektionen bei –5, +55, +115, +175 und + 235 Minuten
    1 mg/kg (20 Min.) Fünf 1,1 mg/kg Injektionen bei –10, –5, 0, +5 und +10 Minuten
    Vancomycin (Positivkontrolle) injiziert bei 0 Minuten
  • Das Überleben der Mäuse wird bei 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 20, 24 und 30 Stunden Post-Infektion und zweimal täglich danach für einen Gesamtbereich von 8 Tagen aufgezeichnet. Es gab keine Veränderung in der Anzahl der überlebenden Mäuse nach 24 Stunden. Das 1 mg/kg (20 Min.) Behandlungsprotokoll, mit Injektionen in 5 Minuten Entfernung voneinander um die Infektionszeit herum zentriert, verzögerte den Tod der Mäuse in einem signifikanten Ausmaß, mit einem Überlebenden, der am Ende der Studie zurückblieb.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00970001
  • Figure 00980001
  • Figure 00990001
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  • Figure 01260001
  • Figure 01270001

Claims (29)

  1. Indolizidin-Analogon ausgewählt aus:
    Figure 01280001
  2. Indolizidin-Analogon nach Anspruch 1, wobei das Analogon wenigstens eine Aminosäure aufweist, die zu einer korrespondierenden D-Aminosäure verändert ist.
  3. Indolizidin-Analogon nach Anspruch 1, wobei die N-terminate und/oder C-terminale Aminosäure eine D-Aminosäure ist.
  4. Indolizidin-Analogon nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Analogon an der N-terminalen Aminosäure acetyliert ist.
  5. Indolizidin-Analogon nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Analogon an der C-terminalen Aminosäure amidiert ist.
  6. Indolizidin-Analogon nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Analogon an der C-terminalen Aminosäure verestert ist.
  7. Indolizidin-Analogon nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Analogon durch Einschluß von Homoserin oder Homoserinlacton an der C-terminalen Aminosäure modifiziert ist.
  8. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz eine oder mehrere kodierende Sequenzen eines Indolizidin-Analogons nach Anspruch 1 umfaßt.
  9. Expressionsvektor, umfassend einen Promoter in funktionsfähiger Verbindung mit dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8.
  10. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 9 transfiziert oder transformiert ist.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Indolizidin-Analogon nach einem der Ansprüche 1-7 und einen physiologisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, zusätzlich umfassend ein antibiotisches Mittel.
  13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das Antibiotika aus Penicillinen, Cephalosporinen, Carbacephemen, Cephamycinen, Carbapenemen, Monobactamen, Chinolonen, Tetracyclinen, Aminoglycosiden, Macroliden, Glycopeptiden, Chloramphenicolen, Glycylcyclinen, Licosamiden oder Fluorochinolonen ausgewählt ist.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-13, wobei die Zusammensetzung in ein Liposom inkorporiert ist.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11-13, wobei die Zusammensetzung in ein langsam freisetzendes Vehikel eingeschlossen ist.
  16. Vorrichtung, die mit einer Zusammensetzung beschichtet ist, die ein Indolizidin-Analogon nach Anspruch 1-7 umfaßt.
  17. Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung zusätzlich ein antibiotisches Mittel umfaßt.
  18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei die Vorrichtung eine medizinische Vorrichtung ist.
  19. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die medizinische Vorrichtung ausgewählt ist aus einem Katheter, einer künstlichen Herzpumpe, einer Kanüle oder einem Stent.
  20. Indolizidin-Analogon nach einem der Ansprüche 1-7 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11-15 zur therapeutischen Verwendung.
  21. Verwendung eines Indolizidin-Analogon nach einem der Ansprüche 1-7 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11-15 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Infektionen.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die genannte Infektion auf Mikroorganismen beruht.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus einem Bakterium, Pilz, Parasiten oder Virus.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei der Pilz Hefe und/oder Schimmelpilz ist.
  25. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Bakterium ein Gram-negatives Bakterium ist.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Gram-negative Bakterium ausgewählt ist aus Acinetobacter spp., Bacteroides spp., Borrelia spp., Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema spp., Ureaplasma spp., Bordetella pertussis, Brucella spp., Campylobacter spp., Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Legionella spp., Moraxella catarrhalis, Myco plasma spp., Neisseria spp., Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Enterobacter spp., E. coli, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. marcescens, oder S. maltophilia.
  27. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Bakterium ein Gram-positives Bakterium ist.
  28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei das Gram-positive Bakterium ausgewählt ist aus Bacillus spp., Corynebacterium spp., Diphtheroiden, Listeria spp., Mycobacterium spp., Peptostreptococcus spp., Propionibacterium acne, Clostridium spp., Viridans-Streptokokken, E. faecalis, S. aureus, E. faecium, S. pyogenes, S. pneumoniae, oder Koagulase-negativen Staphylokokken.
  29. Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Indolizidin-Analogon durch intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion oder Implantation, intramuskuläre Injektion oder Implantation, intrathekale Injektion, subkutane Injektion oder Implantation, intradermale Injektion, Spülung, Blasenspülung, Suppositorien, Pessarien, orale Aufnahme, topische Applikation, enterische Applikation, Inhalation, Aerosolierung oder Nasenspray oder -tropfen verabreicht wird.
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