NL1013861C2

NL1013861C2 - Toepassing van Nisine of derivaat daarvan.

Info

Publication number: NL1013861C2
Application number: NL1013861A
Authority: NL
Inventors: Evert Johan Breukink
Original assignee: Stichting Tech Wetenschapp
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2001-06-18

Description

; «

Toepassing van Nisine of derivaat daarvan

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een toepassing van Nisine of derivaat daarvan.

Van Nisine is bekend dat het antimicrobiële eigenschappen bezit. Zo wordt Nisine gebruikt bij de behandeling 5 van uierontsteking, waarbij het feit dat Nisine niet giftig is (toegelaten als conserveringsmiddel voor voedingsmiddelen) van belang is. Ook is de toepassing van Nisine beschreven voor de behandeling maagzweren welke worden veroorzaakt door de bacterie Helicobacter pylori. Nisine verliest namelijk 10 onder de zeer zure omstandigheden in de maag haar antimicrobiële activiteit niet.

Een groot probleem bij de behandeling van infecties is dat micro-organismen resistent worden tegen een antibioticum, waardoor de infectieziekte niet meer doelmatig met dat 15 antibioticum kan worden behandeld. In de medische wereld bestaat derhalve een grote behoefte aan alternatieven voor de behandeling van infectieziekten veroorzaakt door een resistent micro-organisme, en in het bijzonder meer doelmatige alternatieven.

20 Verrassenderwijze heeft aanvraagster gevonden dat

Nisine of derivaten daarvan als krachtiger alternatief voor Vancomycine kunnen worden gebruikt. Vancomycine wordt heden ten dage gebruikt als antibioticum in die gevallen waarin het te bestrijden micro-organisme resistent is voor een ander 25 antibioticum. De uitvinding betreft derhalve de toepassing van Nisine of een derivaat daarvan voor de bereiding van een geneesmiddel voor de behandeling van een infectie met een resistent micro-organisme.

De uitvinding is gebaseerd op het inzicht dat Nisine 30 en derivaten daarvan aan Lipide II binden, een in de celmem-braan van een micro-organisme verankerde celwand precursor (undecaprenyl-pyrophosporyl-MurNAc- (pentapeptide) -GlcNAc) . De uitvinding is verder gebaseerd op het inzicht dat de aanwezigheid van een overmaat Vancomycine de activiteit van Nisine 35 verlaagt.

Onder een resistent micro-organisme wordt in de ' ’ ' ~ .-1 2 onderhavige aanvrage verstaan een micro-organisme dat resistent is tegen een antibioticum als gevolg van een in het micro-organisme aanwezig resistentiegen, zoals een op een plasmide (niet-chromosomaal) gelegen resistentiegen.

5 In de onderhavige aanvrage wordt onder de term "derivaat van Nisine" elke een peptide-omvattende verbinding verstaan welke een interne thioetherbrug (gebruikelijk 5) bezit, welke thioetherbrug ook wel een lanthionideresidu wordt genoemd en het peptide tot een cyclisch peptide vormt 10 dat aan Lipide II waarvan het pentapeptide de volgorde Ala-Glu-Lys-D-Ala-D-Ala bezit met een affiniteit die ten minste 0,1, bij voorkeur ten minste 0,5 en met meer voorkeur ten minste gelijk is aan die van Nisine A. Door binding aan Lipide II remt het derivaat van Nisine de celwandsynthese en 15 daarmee de groei. De voorkeur geniet een derivaat van Nisine A dat wordt gekenmerkt doordat het 1) poriën kan vormen in een membraanvesicle zoals blijkt uit de uitstroom van een in het membraanvesicle aanwezige merker, zoals carboxyfluoresceïne,- en 20 2) in vergelijking met Nisine A een activiteit bezit die ten minste 10% daarvan is bij een modelexperiment met vesicles met een enkele membraanlaag, welke vesicles 0,065 mol.% Lipide II bevatten. Het modelexperiment is hierna als voorbeeld beschreven. Bij voorkeur is de activiteit ten 25 minste 30, met meer voorkeur ten minste 50, nog meer voorkeur ten minst even groot en met de meeste voorkeur ten minste 1,5 keer zo groot. Door de porievorming wordt de celgroeiremmende activiteit van het derivaat van Nisine sterk vergroot.

Volgens een voorkeursuitvoering is het resistente 30 micro-organisme een meervoudig resistent micro-organisme.

Het zijn met name deze meervoudig resistente micro-organismen die de medische wereld voor problemen stellen.

In het bijzonder zal het meervoudig resistente micro-organisme een micro-organisme zijn gekozen uit de groep 35 bestaande uit Staphylococcus spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Enterococcen spp., Pseudomonas spp., en Listeria spp.

Daarenboven wordt gedacht dat het resistente micro-organisme een micro-organisme kan zijn gekozen uit de groep 101::1 3 bestaande uit Mycobacterium spp., Escherichia spp., Clostridium spp., Bacillus spp., Shigella spp., Yersina spp. en Vibrio spp.

Momenteel beschikken veel Westerse ziekenhuizen nog 5 slechts over één antibioticum waarmee de zoals hierboven genoemde meervoudig resistente organismen kunnen worden bestreden, te weten Vancomycine. Wanneer meervoudig resistente organismen ook een resistentie voor Vancomycine ontwikkelen, is daarmee de laatste optie voor het bestrijden van dergelij-10 ke infectieziekten verdwenen. Gevonden is dat sommige micro-organismen gevoeliger zijn voor Nisine dan voor Vancomycine. Verder zijn er sterke aanwijzingen dat ten minste een deel van de plaats waar Nisine of een derivaat ervan aan Lipide II bindt niet betrokken is bij de binding van Vancomycine aan 15 Lipide II. Dit vergroot het belang van de uitvinding. Immers, een micro-organisme dat (ook) resistentie voor Vancomycine heeft ontwikkeld kan nog steeds doelmatig met Nisine of een derivaat daarvan worden bestreden. Hiervoor zijn concrete aanwijzingen gevonden. In het bijzonder blijken Archaebacte-20 riën met een Lipide II dat door Vancomycine niet wordt herkend gevoelig voor Nisine.

Een uit het vak bekende test voor het meten van de Nisine activiteit kan worden gebruikt om derivaten na te lopen die minder gevoelig zijn voor remming door Vancomycine 25 (of meer algemeen een glycopeptide van de antibioticum klasse waar Vancomycine toe behoort), terwijl zij hun activiteit (in hoofdzaak) behouden. Volgens de uitvinding wordt derhalve bij voorkeur een derivaat van Nisine toegepast dat een verhouding R van i) de activiteit van het derivaat in aanwezigheid van 30 Vancomycine; en ii) de activiteit van het derivaat in afwezigheid van Vancomycine, groter is dan die van elk van Nisine A, Nisine Z, en T2S Nisine onder gebruikmaking van de werkwijze voor het bepalen van de activiteit zoals hierna beschreven. De gebruikte concentratie Vancomycine is daarbij 35 die concentratie die de activiteit van Nisine A met 50% remt. Geschikt is de verhouding R ten minste 2 keer groter, bij voorkeur ten minste 5 keer, en met meer voorkeur ten minste 15 keer groter en met de meeste voorkeur ten minste 50 keer groter.

,1013 S 61 4

Zoals in het vak bekend zal voor de bereiding van een geneesmiddel volgens de uitvinding Nisine of het derivaat ervan worden samengesteld met een of meer pharmaceutisch aanvaardbare vulstoffen en hulpstoffen, bijv. zoals beschre-5 ven in het standaardwerk Gennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences, (18e uitg., Mack Publishing Company, 1990, zie met name Deel 8: Pharmaceutical Preparations and their Manufacture).

De uitvinding zal worden toegelicht aan de hand van 10 het navolgende illustratieve voorbeeld.

Nisine Z werd geproduceerd en gezuiverd zoals beschreven door Kuipers, O.P. et al (J. Biol. Chem. 267. blz. 24340-24346 (1992)). Voorraadoplossingen Nisine met een concentratie van 2 mg/ml werden opgeslagen bij -80°C in 0,05% 15 azijnzuur.

Lipide II werd geïsoleerd met behulp van de door Brötz et al beschreven werkwijze (Antimicrob. Agents Chemot-her. 42., blz. 154-160 (1998)). Gezuiverd Lipide II werd opgeslagen in chloroform:methanol (1:1 vol./vol.) bij -20°C. 20 Grote unilamellaire vesicles werden met behulp van een extrusiewerkwijze bereid zoals beschreven door Hope M. et al (Biochim. Biophys. Acta 812 blz. 55-65 (1985)) onder gebruikmaking van DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocho-line; Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, Alabama, VS). De 25 vesicles bevatten Lipide II (0,065 mol.%) of geen Lipide II (controle). Het pentapeptide had de volgorde Ala-Glu-Lys-D-Ala-D-Ala. De bereide vesicles bevatten 50 mM carboxyfluo-resceïne (Kodak, Bunnik, Nederland) dat voor gebruik werd gezuiverd zoals beschreven door Ralston E. et al. (Biochim.

30 Biophys. Acta 649 blz. 133-137 (1981)). De bij de bereiding gebruikte buffer was 25 mM 4-morfolineethaansulfonzuur (MES), 50 mM K2S04 van pH=6. Scheiding van niet in de vesicles aanwezig CB en de vesicles geschiedde door de oplossing over een Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Zweden) te leiden.

35 Voor het elueren en het uitvoeren van de meting werd gebruik gemaakt van een buffer met 50 mM MES, 100 mM K2S04 van pH=6. De eindconcentratie van de vesicles was 25 μΜ.

De meting van de activiteit van Nisine is gebaseerd op het vermogen van Nisine om poriën in de vesiclemembraan te >1 o i ; ’ - ' i · 5 vormen. Hierdoor stroomt carboxyfluoresceïne (CB) uit de vesicles. In de vesicles is de concentratie CB zo hoog dat de fluorescentie (515 nm) bij belichting met licht van 492 nm wordt gequencht. Uit de vesicles gestroomd CB is dermate 5 verdund dat het goed fluoresceert. In de onderstaande tabel is aangegeven welke concentratie Nisine vereist was om na 1 min. 50% CB in het de vesicles omringende medium af te geven. De metingen werden uitgevoerd bij 20°C.

10 Zonder Lipide II Met Lipide II

Afwezigheid van Vancomycine >20 μΜ1 10 nM

Aanwezigheid van Vancomycine 1 bij 20 μΜ, de hoogste geteste waarde, was het percentage 15 lek 40.

De concentratie van 0,065 mol.% Lipide II en verdere hier beschreven omstandigheden zijn geschikt voor het nalopen van derivaten op hun (on)gevoeligheid voor remming door 20 Vancomycine. Hierbij neemt het te onderzoeken derivaat de plaats in van Nisine Z. De gebruikte concentratie Vancomycine is die concentratie welke de activiteit van 10 nM Nisine A voor 5 0 % remt.

Geschikte derivaten van Nisine A welke geen of niet 25 doelmatig poriën vormen en de celgroei remmen door remming van de celwandsynthese kunnen eenvoudig worden geselecteerd door het uitvoeren van een competitiereactie tussen Nisine A, Nisine Z of T2S Nisine of een porie-vormend derivaat van Nisine A enerzijds en het te onderzoeken derivaat van Nisine 30 anderzijds om binding aan Lipide II, waarbij die derivaten worden geselecteerd die de uitstroom remmen en een affiniteit voor Lipide II bezitten die een affiniteit bezitten die ten minste 10%, bij voorkeur ten minste 50% groter is dan die van Nisine A, en met meer voorkeur ten minste een even grote 35 affiniteit en bij voorkeur een ten minste 2 keer grotere affiniteit bezitten.

•I M O C' s": 1 I U i vJ v.; ►

Claims

1. Toepassing van Nisine of derivaat daarvan voor de bereiding van een geneesmiddel voor de behandeling van een infectie met een resistent micro-organisme.

2. Toepassing volgens conclusie 1, met het kenmerk, 5 dat het resistente micro-organisme een meervoudig resistent micro-organisme is.

3. Toepassing volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het meervoudig resistente micro-organisme een micro-organisme is gekozen uit de groep bestaande uit Staphvlococ- 10 cus spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Enterococcen spp., Pseudomonas spp., en Listeria spp.

4. Toepassing volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het toegepaste derivaat van Nisine een verhouding R van i) de activiteit van het derivaat in aanwe- 15 zigheid van Vancomycine; en ii) de activiteit van het derivaat in afwezigheid van Vancomycine, bezit die groter is dan die van elk van Nisine A, Nisine Z, en T2S Nisine. Λ ' '