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Die
Erfindung bezieht sich auf den Bereich der antibiotischen Peptide.
Insbesondere ist die Erfindung auf cyclische und kurze Peptide (weniger
als 10 Aminosäurereste)
mit einzigartigen Mustern aus aromatischen und kationischen Resten
gerichtet, welche ein weites Spektrum an antimikrobiellen Aktivitäten besitzen.
Diese besonders kompakten Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung
arbeiten mit einer hervorragenden Wirksamkeit und einer geringen
hämolytischen
Wirkung im Vergleich zu anderen langen Peptiden mit aromatischen und
kationischen Resten.
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Das
Auftauchen von bakteriellen Stämmen,
die gegenüber
konventionellen Antibiotika resistent sind, hat die Suche nach neuen
therapeutischen Mitteln, einschließlich verschiedener antimikrobieller
Peptide tierischen Ursprungs, veranlasst. Es wurde erkannt, dass
antimikrobielle Peptide eine wichtige Rolle beim wirtseigenen Abwehrmechanismus
in den meisten lebenden Organismen, einschließlich den Pflanzen, Insekten,
Amphibien und Säugern,
spielen und sie sind dafür
bekannt, dass sie eine potente antibiotische Wirkung gegen Bakterien,
Pilze und sogar bestimmte Viren besitzen. Die antimikrobiellen Peptide
verteilen sich leicht mit einem Anteil von >95% in Phospholipidbilayern, wobei sie
an das Lipid gebunden sind, und umfassen eine Membranintegrität. Sie sind
in der Lage kleine, transiente Steigerungen in der Leitfähigkeit
des planaren Lipidbilayers entstehen zu lassen und partiell den
cytoplasmatischen Membranpotentialgradienten von Bakterien zu depolarisieren.
Die Schutzfunktion von antimikrobiellen Peptiden bei der Wirtsabwehr
ist überzeugend
in Drosophila demonstriert worden, wo deren reduzierte Expression
das Überleben
nach einer mikrobiellen Herausforderung dramatisch reduzierte. In
Säugetieren
wird diese Funktion durch eine fehlerhafte Abtötung der Bakterien in der Lunge
von Patienten mit cystischer Fibrose (CF) und in kleinen Mäusen vermutet.
Die antimikrobiellen Peptide, die in Säugetieren gefunden wurden,
werden in die cysteinreichen Defensine (α- und β-Defensin) und verschiedene
Cathelicidinfamilien klassifiziert. Die Cathelicidinfamilie enthält eine
hochkonservierte Signalsequenz und Proregion („Cathelin") und eine variable antibakterielle
Sequenz in der C-terminalen
Domäne.
Viele der Cathelicidine enthalten eine charakteristische Elastaseschnittstelle
zwischen der anionischen Cathelindomäne und der C-terminalen kationischen
Peptiddomäne.
Es wurde eine proteolytische Prozessierung an dieser Stelle in Rind-
und Schweineneutrophilen beobachtet, die für die mikrobizide Wirkung notwendig
war. Basierend auf der Aminosäurezusammensetzung
und der Struktur wird die Cathelicidinfamilie in drei Gruppen klassifiziert.
Die erste Gruppe enthält
die amphipathischen α-helikalen Peptide
wie LL-37, CRAMP, SMAP-29, PMAP-37, BMAP-27 und BMAP-28. Die zweite
Gruppe enthält
die Arg/Pro- oder Trp-reichen Peptide einschließlich Bac5, Bac7, PR-39 und
Indolicidin. Die dritte Gruppe schließt die Cys-enthaltenden Peptide wie
die Protegrine mit ein. Da die antimikrobiellen Peptide im Allgemeinen
Moleküle
mit einer niedrigen molekularen Masse sind (<5 kDa), die Breitbandwirkungen besitzen
und einen wichtigen Teil bei Abwehr des Wirts gegen mikrobielle
Infektionen darstellen, stellen sie einen Ausgangspunkt für das Designen
von antibiotischen Verbindungen mit einer niedrigen molekularen
Masse bereit. Darüber
hinaus sind sie dafür
bekannt, dass sie dazu neigen sich in amphipathische Strukturen
mit Clustern aus hydrophoben und geladenen Regionen zu falten, ein
Merkmal, das nahe mit ihrer membranolytischen Wirkung verwandt ist.
Obwohl sie häufig
eine antimikrobielle Breitbandwirkung ausweisen, wirken die Peptide
zu verschiedenen Graden hämolytisch
auf humane Erythrozyten, was ihr therapeutisches Potential streng
limitiert. Auf diese Aufgabe wurde erstens abgezielt, um antimikrobielle
Peptide mit Aktivitäten
gegen klinisch wichtige bakterielle Stämme durch synthetische Modifikationen
ihrer Primärstruktur
zu designen, und zweitens, um einige Informationen über wichtige
Strukturmerkmale des Peptids zu erhalten. Unsere Ergebnisse haben
gezeigt, dass es möglich
ist die Wirkungen von natürlich
auftretenden Peptidantibiotika zu verbessern oder deren Toxizitäten zu reduzieren,
indem synthetische Analogons mit modifizierten Primär- und/oder
Sekundärstrukturen
hergestellt wurden. Die Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf
Antibiotika und betrifft neuartige breitbandantimikrobielle Peptide
und deren Derivate, die eine tryptophanreiche Sequenz enthalten
und antimikrobielle Wirkungen mit jedoch geringen hämolytischen
Aktivitäten
aufweisen. Kurz, die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet,
antibiotische Peptide mit einer antimikrobiellen Breitbandwirkung
gegen grampositive und gramnegative Bakterien, Protozoen, Fungi
und den in einer Hülle
verpackten Virus HIV-1 zu designen.
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Die
vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, cyclische und kurze
Peptide mit einer verbesserten Serumkompatibilität und mit reduzierten hämolytischen
Wirkungen zu designen. Darüber
hinaus weisen die Peptide der Erfindung antimikrobielle Breitbandwirkungen
gegen grampositive und gramnegative Bakterien und Pathogene, die
gegenüber
vielen Arzneimitteln resistent sind, auf. Die antimikrobiellen Peptide
dieser Erfindung sind im Allgemeinen aus weniger als 10 Aminosäureresten
zusammengesetzt und umfassen die Aminosäuresequenz: (A1X1A2)N wobei:
A1 Arginin, Lysin, Valin oder Isoleucin repräsentiert,
X1 Tryptophan, Phenylalanin oder Prolin repräsentiert,
A2 Arginin, Lysin, Valin oder Isoleucin repräsentiert,
N
1, 2 oder 3 repräsentiert,
und
die Topologie cyclisch oder linear ist.
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Die
Erfindung bietet mehrere Vorteile. Erstens, die Peptide der Erfindung
sind weniger als 10 Aminosäurereste
lang und extrem kompakt, so dass sie effektiv die Zellmembran mit
relativ wenigen Aminosäuren durchspannen.
Zweitens, die besten Peptide gemäß der Erfindung
leisten großartig
eine Breitbandwirkung gegen antibiotikaresistente Bakterien, kombiniert
mit einer Wirkung gegen den medizinisch wichtigen Fungus. Zusätzlich besitzen
diese Peptide die anti-Endotoxinwirkung und arbeiten synergistisch
mit traditionellen Antibiotika. Das wichtigste an der Erfindung
bietet die verbesserte Serumkompatibilität und das Auftreten einer extrem
geringen Hämolyse
der humanen roten Blutkörperchen
im Vergleich zu den natürlich
auftretenden Protegrin- und Indolicinanalogons.
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1 Überlebenskurve
von (A) Bacillus substilis ATCC6633; (B) Staphylococcus aureus ATCC9144; (C)
E. coli ATCC25922; (D) Pseudomonas aeruginosa ATCC29213, behandelt
mit PAC-525 (ausgefüllter Kreis)
und Pac-524 (offener Kreis).
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2 Pac-525
induzierte Permeabilisierung der äußeren Membran, die mittels
eines NPN-Uptake-Assays bestimmt wurde (0 μg/ml: ausgefülltes Quadrat; 1 μg/ml: offener
Kreis; 2 μg/ml:
offenes Quadrat; 3 μg/ml:
offenes Dreieck).
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3 Die
Tryptophanfluoreszenz zeigt die SDS-induzierten Veränderungen
in der lokalen Umgebung von Pac-525 an (kein SDS: ausgefüllter Kreis;
mit SDS: offener Kreis).
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4 Circulardichroismusspektren von (A)
Pac-525 und (B) Pac-526, gezeigt in Phosphatpuffer (offener Kreis)
oder in 10 mM SDS (ausgefüllter
Kreis).
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5 Die
Figur zeigt die extrem geringe Hämolyse
von humanen roten Blutkörperchen
(ausgefüllter Kreis:
Melittin; offener Kreis: Pac-525; ausgefülltes Dreieck: Pac-527).
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Wie
die tryptophanreichen Peptide, die im U.S. Pat Nr. 6303575; im U.S.
Pat Nr. 6180604; im U.S. Pat Nr. 5821224; im U.S. Pat Nr. 5547939;
im U.S. Pat Nr. 5534939; im U.S. Pat Nr. 5459325 und im U.S. Pat Nr.5324716
beschreiben werden, sind alle natürlich auftretenden Peptide,
die die Aminosäuresequenz
haben, länger
als 10 Reste und in vivo einer raschen Proteolyse unterworfen sind.
Die Indolicidinanalogons haben die allgemeine Aminosäuresequenz
I-L-P-W-K-W-P-W-W-P-W-X, wobei X 1 oder 2 ausgewählte Aminosäuren repräsentiert (U.S. Pat Nr. 5534939).
Diese früher
beschriebenen tryptophanreichen Peptide sind von den Peptiden der
vorliegenden Erfindung insofern unterscheidbar, da unser Design
der antimikrobiellen Peptide auf cyclische und kurze Peptide (weniger
als 10 Aminosäuren)
mit mikrobiellen Breitbandwirkungen, einer verbesserten Selektivität und einer
geringen Hämolyse
gerichtet ist. Die Cyclisierung der linearen antimikrobiellen Peptide
kann mehrere Vorteile in Bezug auf die Selektivität und Stabilität haben,
zum Beispiel: (i) Ungefaltete Peptide können auf Grund von hydrophoben
Wechselwirkungen Aggregate bilden, die zu einer unspezifischen Adsorption
an normalen Säugetierzellen
und einer geringen Löslichkeit
führen.
Das Auferlegen von Beschränkungen
auf ihre ungefalteten Konformationen und die daraus folgende Einschränkung bei
der Exposition von Abschnitten mit hydrophoben Aminosäuren, kann
die hydrophoben Wechselwirkungen limitieren. Darüber hinaus können diese Beschränkungen
die Rolle der elektrostatischen Wechselwirkungen bei der anfänglichen Bindung
an die negativ geladene Zielmembran steigern und auf diese Weise
die Selektivität
für die
bakteriellen Zellen gegenüber
den Säugetierzellen
wesentlich erhöht
werden. (ii) Um von Proteasen gebunden und geschnitten zu werden,
muss ein Peptid die Schnittstelle in einer erweiterten Struktur
präsentieren.
Folglich kann auf Grund ihrer rigiden und beschränkenden Struktur die Cyclisierung
von kurzen Peptiden die Zugänglichkeit für die Wirkung
von Proteasen limitieren. (iii) Da die Cyclisierung nur die Wirkung
gegenüber
gramnegativen Bakterien zu betreffen scheint, können weitere Studien entlang
dieser Linie beim Designen von bakterienspezifischen lytischen Peptiden
behilflich sein. Die Peptide der Erfindung können durch die folgenden Formeln
beschrieben werden: (A1X1A2)N wobei:
A1 Arginin, Lysin, Valin oder Isoleucin repräsentiert,
X1 Tryptophan, Phenylalanin oder Prolin repräsentiert,
A2 Arginin, Lysin, Valin oder Isoleucin repräsentiert,
N
1, 2 oder 3 repräsentiert,
und
die Topologie cyclisch oder linear ist.
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Beispiele
für mikrobizide
Peptide gemäß der Erfindung:
Cyclo-K
F I
Linear-K F I
Cyclo-R F I
Linear-R F I
Cyclo-R
F V
Linear-R F V
Cyclo-K F R
Linear-K F R
Cyclo-K
W V
Linear-K W V
Cyclo-K W I
Linear-K W I
Cyclo-K
W R
Linear-K W R
Cyclo-R W V
Linear-R W V
Cyclo-K
W R R W I
Linear-K W R R W I
Cyclo-K W R R W V
Linear-K
W R R W V
Cyclo-K W I K W R
Linear-K W I K W R
Cyclo-K
W V K W I
Linear-K W V K W I
Cyclo-K W I K W I
Linear-K
W I K W I
Cyclo-K W I K W I K W I
Linear-K W I K W I K
W I
Cyclo-K F I K F I K F I
Linear-K F I K F I K F I
Cyclo-K
W R R W V R W I
Linear-K W R R W V R W I
Cyclo-I W R V
W R R W K
Linear-I W R V W R R W K
Cyclo-K F R R F V R
F I
Linear-K F R R F V R F I
Cyclo-K P R R P V R P I
Linear-K
P R R P V R P I
Cyclo-K W I R W V R W I
Linear-K W I R
W V R W I
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Beispiel 1: Design, Synthese,
Aufreinigung und Charakterisierung von Peptiden
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Die
Peptidanalogons und ihre Namen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Alle
Aminosäuren
sind mit dem Einbuchstabencode der Aminosäuren bezeichnet.
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Alle
linearen Peptide wurden mittels Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung
der standardmäßigen Fmoc
(N-(9-Fluorenyl)methoxycarbonyl)-Chemie
manuell auf PAL-Harz (5-(4-Fmoc-aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxy)-valeriansäure-MBHA-Harz)
hergestellt. Die Fmoc Schutzgruppe auf dem Harz wurde durch 20%
Piperidin/DMF entfernt. Die Kopplungsreaktion dauerte etwa 1 ∼ 1,5 Stunden
und wurde durch den Ninhydrintest überprüft. Das rohe Peptid wurde von
dem Harz durch das Mischen mit einer 95% TFA-Abspaltlösung für 1 bis
1,5 Stunden abgespalten. Das rohe Peptid wurde mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie
(RP-HPLC für
Englisch: reverse phase high-pressure liquid chromatography) aufgereinigt. Die
Säule für die RP-HPLC-Aufreinigung war
eine semi-präparative
C18 Umkehrphasen-Säule.
Die mobile Phase für
die Elution war eine Mischung aus Acetonitril und D.I. H2O, gemischt in verschiedenen Verhältnissen, wobei
der programmierte Gradient (Tabelle 1) verwendet wurde. Die Wellenlänge für die Detektion
war auf 225 nm und 280 nm eingestellt und die Durchflussgeschwindigkeit
war 4 ml/min. Die Hauptpeptidprodukte wurden mittels FAB-MS (Fast-Atom-Bombardement-Massenspektroskopie)
charakterisiert, um das Molekulargewicht von jedem Peptid zu bestimmen.
Die Reinheit von jedem Peptid wurde mittels einer analytischen RP-HPLC analysiert.
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Beispiel 2: Detektion
der Peptidwirkungen in vitro
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Im
Allgemeinen wurden die antimikrobiologischen Wirkungen der antimikrobiellen
Mittel unter Verwendung von standardmäßigen NCCLS bakteriellen Inhibierungsassays
oder Tests der minimalen Hemmkonzentration (MIC) gestestet. Der
MIC-Wert ist die niedrigste Peptidkonzentration, bei der das sichtbare
Wachstum der Testorganismen inhibiert und reduziert ist. Die Testorganismen,
die in den MIC-Assays verwendet wurden, sind in Tabelle 2 aufgelistet.
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Kurz,
es wurden Übernachtkulturen
der Testorganismen verdünnt,
um ein Inoculum herzustellen, das etwa 105 Kolonien
in Mueller-Hinton Broth (MHB) enthielt. Von den Peptidvorratslösungen wurden
serielle Zweifachverdünnungen
der Peptide in einem Volumen von 50 μl in einer 96-Well-Mikrotiterplatte
hergestellt und alle Wells wurden anschließend mit der verdünnten Kultur
der Testorganismen inokuliert. Nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C wurden
die Ergebnisse auf die Trübheit
hin untersucht (Zeltwachstum). Die MIC-Werte für jedes Peptid sind in der
Tabelle 3 und der 1 gezeigt. Die MIC-Werte
wurden dreimal für
verschiedene Ereignisse gemessen (2) und die
Mittelwerte sind gezeigt. Entsprechend diesen Ergebnissen fanden
wir heraus, dass Pac 521-530 die größten antimikobiellen Wirkungen
gegenüber
gram-positiven und gramnegativen Bakterien aufwiesen. Darüber hinaus
zeigten Pac 521-530 größere antimikrobielle
Wirkungen als Pac 301-310.
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Beispiel 3: Membranpermeabilisierungsassays
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Es
wurde die Permeabilisierungswirkung der Peptidvarianten auf die äußere Membran
durch den 1-N-Phenylnaphthylamin (NPN)-Uptake-Assay unter Verwendung
von intakten E. coli-Zellen bestimmt. NPN fluoresziert leicht in
einer wässrigen
Umgebung, weist jedoch in einer hydrophoben Umgebung eine starke
Fluoreszenz auf. Da NPN hydrophob ist, ermöglicht es eine direkte Messung
des Permeabilitätsgrades
der äußeren Membran.
Unter allgemeinen Bedingungen nimmt E. coli wenig oder kein NPN
auf. In der Anwesenheit von Permeabilisierungsverbindungen (EDTA,
Polymyxin B, Neomycin oder antimikrobielle Peptide) lagert sich NPN
in die bakterielle äußere Membran
ein und führt
zu einer Zunahme der Fluoreszenz. Kurz, es wurden 1 ml Übernachtkultur
verwendet, um 50 ml Medium zu inokulieren, und unter schütteln bei
37°C inkubiert.
Die Zellen wurden zu einer OD600 = 0,4 – 0,6 wachsen
gelassen und dann abzentrifugiert (3500 rpm, 10 min). Dann wurden
sie gewaschen und in Puffer zu einer OD600 =
0,5 resuspendiert. Die OD600 wurde festgehalten.
Es wurde 1 ml Zellen (OD600 = 0,5) in eine
Küvette gegeben
und für
2 – 5
s gemessen. Es wurden 20 μl
NPN (0,5 mM) (schütteln
um zu mischen) zugegeben und dann für 2 – 5 s gemessen. Es wurden 10 μl antibiotische
100X gewünschte
Endkonzentration (schütteln
um zu mischen) zugegeben und gemessen, bis der Maximalwert erreicht
wurde (1 – 5
min). Folglich variiert die Fluoreszenz mit der Peptidkonzentration
Die Peptidkonzentration, die zu 50% der maximalen Zunahme im NPN-Uptake
führte,
wurde als der P50 festgehalten. In der Tat
waren alle Peptide in der Lage mit der Membran zu wechselwirken,
wie durch den NPN-Uptake-Assay, gezeigt in Tabelle 5 und 2,
demonstriert wurde.
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Beispiel 4: Charakterisierung
der Umgebung von Trp-Resten
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Auf
Grund der Sensitivität
von Tryptophan gegenüber
der Polarität
seiner Umgebung, ist es für
Polaritäts-
und Bindungsassays verwendet worden. Die Fluoreszenzemissionsspektren
wurden auf einem LS-55 Spektrofluorimeter [Perkin-Elmer] festgehalten.
Die Messungen wurden zwischen 300 und 450 nm in 1 nm Schrittgrößen unter
Verwendung einer 5 mm Quarzzelle bei 25°C durchgeführt. Die Anregungswellenlänge war
auf 280 nm festgesetzt, wobei sowohl die Anregungs- als auch die
Emissionsspaltweite auf 5 nm eingestellt waren. In dem Phosphatpuffer
wiesen die Serien der antimikrobiellen Peptide ein Emissionsmaximum
bei 357 nm auf. In der Anwesenheit von SDS wiesen sie eine Blauverschiebung
des Emissionsmaximums um 8 nm mit einer gleichzeitigen Zunahme der
Intensität
auf. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Tryptophanseitenketten sich
in eine hydrophobere Umgebung bewegt haben. Die Ergebnisse dieser
Studie sind in 3 gezeigt.
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Beispiel 5: Sekundärstruktur
der Peptide, bestimmt durch eine CD-Spektroskopie
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Die
CD-Spektren wurden auf einem AVIV 62DS Spektropolarometer nach der
Kalibrierung mit einer d-10-Camphersulfonsäure aufgezeichnet. Alle Messungen
wurden unter Verwendung einer Küvette
mit 1 mm Weglänge
und mit einer Peptidkonzentration von 30 μM in 10 mM Natriumphosphatpuffer
(pH 7,2) durchgeführt.
Es wurden die Spektren des fernen UV's im Bereich von 190 – 260 nm
gesammelt, wobei eine 0,5 nm Schrittgröße und eine Sekunde Zeit für die Mittelwertbildung
verwendet wurden. In der Abwesenheit eines Phospholipids sind Pac
301-310 und Pac 521-530 durch eine ungeordnete Struktur gekennzeichnet
(Tabelle 6). Die Strukturen werden jedoch durch SDS induziert (4).
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Beispiel 6: Lyse von Erythrocyten
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Pac
521-530 wurden hinsichtlich der Hämolyse von humanen roten Blutkörperchen
(RBK) getestet. Die RBKs mit EDTA wurden 3-mal mit PBS (phosphatgepufferte
Saline) gespült
(800 g, 10 min) und in PBS resuspendiert. Die RBKs wurden mit phosphatgepufferter
Saline auf 10% verdünnt
und 50 μl
in jedes Eppendorf gegeben. Die Peptide, die sich in PBS lösten, wurden
dann zu 50 μl
10% RBK-Lösung
zugegeben und für eine
Stunde bei 37°C
inkubiert (Endkonzentration der RBKs, 5% v/v). Die Proben wurden
bei 800 g für
10 min mit einer OD540 zentrifugiert. Es
wurden verschiedene Konzentrationen der Peptide mit den vorbehandelten RBKs
inkubiert und der Prozentsatz der Hämolyse bestimmt. Die Ergebnisse
zeigen, dass Pac 525 wesentlich weniger hämolytisch auf die RBKs wirkte
als andere antimikrobielle Peptide (Tabelle 7 und 5).
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Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
