DE69932281T2

DE69932281T2 - Antimikrobiell wirkendes Peptid

Info

Publication number: DE69932281T2
Application number: DE69932281T
Authority: DE
Inventors: Michimasa Iwate-ken Hirata
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2019-03-25
Also published as: EP0955312B1; EP0955312A3; EP0955312A2; DE69932281D1; CA2264258A1; JPH11335396A; JP4037525B2; US6040291A; CA2264258C; ATE332922T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues antimikrobiell wirkendes Peptid und genauer auf ein antimikrobiell wirkendes Peptid, das ein partielles Peptid von einem vom Menschen stammenden antimikrobiell wirkenden Protein ist, in dem Aminosäurereste teilweise substituiert sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen antimikrobiell wirkenden Wirkstoff ebenso wie auf ein Arzneimittel wie ein Arzneimittel zur Behandlung bakterieller Infektionen und ein Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks, die jeweils das antimikrobiell wirkende Peptid als einen aktiven Bestandteil enthalten. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Wirkstoff zum Entfernen von Endotoxin, der das antimikrobiell wirkende Peptid auf einem unlöslichen Träger immobilisiert umfasst.
CAP18 (kationisches antimikrobiell wirkendes Protein mit 18 kDa) ist ein antimikrobiell wirkendes Protein, das in vom Menschen stammenden und in Granulocyten von Kaninchen vorkommt.
Die japanische Patentanmeldung mit der Offenlegungsnummer 8-504085 (1996) beschreibt die gesamte Aminosäuresequenz von vom Menschen stammendem CAP18 einschließlich ihres Signalpeptidteils. Sie beschreibt auch ein partielles Peptid, das 37 C-terminale Aminosäurereste des vom Menschen stammenden CAP18 umfasst, mit einer Aminosäuresequenz, bei der in der einen Teil davon gegen eine von einem Kaninchen abgeleitete Sequenz substituiert ist.
Minophagen Medical Review, Band 43, Nr. 1, S. 1 bis 15 (1998) beschreibt die gesamte Aminosäuresequenz von vom Menschen stammenden CAP18. Es beschreibt auch partielle Peptide, die C-terminal 34, 32, 30, 27, 24 und 22 Aminosäurereste, respektive, des vom Menschen stammenden CAP18 umfassen. Es zeigt auch Daten über die antimikrobiellen Aktivitäten dieser Peptide auf Escherichia coli, Salmonella, methicillin-sensiblen Staphylococcus aureus (MSSA) und methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MSRA).
Gendai Iryo (Current Medical Treatment), Band 28, (Sonderausgabe III), S. 2367 bis 2375 (1996) beschreibt die gesamte Aminosäuresequenz von vom Menschen stammenden CAP18. Es beschreibt auch partielle Peptide, die C-terminal 34, 30, 27, 24 und 22 Aminosäurereste, respektive, des vom Menschen stammenden CAP18 umfassen. Es zeigt auch Daten über die Inhibierung der Lipopolysaccharidaktivität (LPS, auch als Endotoxin bezeichnet) durch diese Peptide.
Schock: Vom molekularen und zellulären Niveau zum gesamten Körper (Shock: From Molecular and Cellular Level to Whole Body) (Proceedings of the Third Interantional Shock Congress: Shock 95, Hamamatsu, Japan, 21. bis 23. Oktober 1995), herausgegeben von Okada K., Ogatà, N., Elsevier Science B.V., S. 109 bis 115, (1996) beschreibt die gesamte Aminosäuresequenz von vom Menschen stammenden CAP18. Es beschreibt auch partielle Peptide, die C-terminal 34, 30, 27, 24 und 22 Aminosäurereste, respektive, des vom Menschen stammenden CAP18 umfassen. Es beschreibt auch Daten zur Bindungsaktivität dieser Peptide an LPS.
Bakterielle Enditoxine; Lipopolysaccharide von den Genen zur Therapie (Bacterial Endotoxins; Lipopolysaccharides from Genes to Therapy), herausgegeben von Levin, J., Alving, C. R., Munford, R. S., Redl, H., Wiley-Liss Inc. New York, S. 317 bis 326 (1995) beschreibt partielle Peptide, die C-terminal 37 und 32 Aminosäurereste, respektive, des vom Menschen stammenden CAP18 umfassen. Es beschreibt auch Daten auf den Einfluss dieser Peptide auf die Produktion eines Gewebefaktors durch LPS, auf die Unterdrückung der Sterblichkeit auf Grund von endotoxinem Schock und auf die antimikrobielle Aktivität.
Lerrick et al. (Immunotechnology 1995, Band 1, S. 65 bis 72) beschreiben Peptide, die von der C-terminalen Domäne vom Menschen stammenden CAP18 abgeleitet sind und antimikrobielle und LPS-bindende Aktivität besitzen.
Keine der oben beschriebenen Veröffentlichungen jedoch beschreibt oder schlägt solche Peptide mit Substitution mit einem anderen spezifizierten Aminosäurerest oder Aminosäureresten gegen einen Aminosäurerest oder Aminosäurereste an einer spezifizierten Position oder spezifizierten Positionen im Bereich, der mit den bekannten partiellen Peptiden von CAP18 gemeinsam ist, vor. Keine unter ihnen beschreibt oder schlägt vor, dass solche partiellen Peptide mit der Substitution des spezifischen Aminosäurerests oder der Reste eine LPS-bindende Aktivität, eine antimikrobielle Aktivität und eine LPS-neutralisierende Aktivität haben, die merklich größer ist, als diejenige der bekannten partiellen Peptide.
Wenn ein Peptid, das vom Menschen stammt und eine große LPS-bindende Aktivität, eine große antimikrobielle Aktivität und eine große LPS-neutralisierende Aktivität hat, erhalten wird, können ein äußerst preisgünstiger antimikrobiell wirkender Wirkstoff, ein Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen, ein Mittel zur Unterdrückung von Endotoxinschocks und ähnliche zur Verfügung gestellt werden, die für Menschen sicher sind.
Tossi et al. (FEBS Letters, 1994, Band 339, S. 108 bis 112) offenbaren Peptide, die von der C-terminalen Domäne von Kaninchen-CAP18 abgeleitet sind und antimikrobielle Aktivität haben. Einige Alaninmutanten zeigen verbesserte Aktivität.
Die vorliegende Erfindung wurde unter de oben beschriebenen Gesichtspunkten gemacht und es ist ihr Gegenstand, ein vom Menschen abgeleitetes Peptid mit einer großen LPS-Bindungsaktivität, einer großen antimikrobiellen Aktivität und einer großen LPS-neutralisierenden Aktivität und einen antimikrobiell wirkenden Wirkstoff, einen Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen, ein Mittel zur Unterdrückung von Endotoxinschocks und einen Endotoxin entfernenden Wirkstoff und ähnliches zur Verfügung zu stellen, die das Peptid als einen aktiven Bestandteil umfassen.
Zusammenfassung der Erfindung
Als Ergebnis intensiver Untersuchungen durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung zur Erzielen des vorgenannten Gegenstandes wurde nun gefunden, dass ein Peptid, das ein partielles Peptid des vom Menschen stammenden CAP 18 mit einer Substitution mit einem anderen spezifizierten Aminosäurerest oder Aminosäureresten gegen einen Aminosäurerest oder Aminosäurereste an einer spezifizierten Position oder spezifizierten Positionen LPS-bindende Aktivität, antimiktobielle Aktivität und LPS-neutralisierende Aktivität haben, die deutlich größer ist, als die der bekannten partiellen Peptide, und dass ein solches Peptid als ein antimikrobiell wirkender Wirkstoff, ein Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen, ein Wirkstoff zur Unterdrückung von Endotoxinschocks und ein Wirkstoff zum Entfernen von Endotoxin verwendet werden kann, und so wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Auch wenn es außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt, kann ein Peptid mindestens die folgende Aminosäuresequenz umfassen:
Lys Xal Phe Lys Arg Ile Val Xa2 Arg Ile Xaa Xa2 Phe Leu Arg Xa2 Leu Val (SEQ ID Nr. 1), wobei Xal einen hydrophoben Aminosäurerest repräsentiert, Xa2 jeweils, unabhängig voneinander, einen hydrophilen Aminosäurerest repräsentieren, und Xaa einen beliebigen Aminosäurerest repräsentiert (im Folgenden als erfindungsgemäßes Peptid bezeichnet).
Das erfindungsgemäße Peptid besteht aus einer Aminosäuresequenz, die unter den folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (f) ausgewählt ist:

(a) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 2);
(b) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 3);
(c) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 4);
(d) Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 5)
(e) Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 6), und
(f) Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val (SEQ ID Nr. 7).

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung einen antimikrobiell wirkenden Wirkstoff, ein Arzneimittel; das einen Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen einschließt, und ein Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks zur Verfügung, die jeweils das erfindungsgemäße Peptid als einen aktiven Wirkstoff enthalten (im Folgenden als erfindungsgemäßer, antimikrobiell wirkender Wirkstoff, erfindungsgemäßes Arzneimittel, erfindungsgemäßer Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen, erfindungsgemäßes Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks, respektive, bezeichnet) ebenso wie einen Wirkstoff zum Entfernen von Endotoxin, der der das erfindungsgemäße Peptid auf einem unlöslichen Träger immobilisiert umfasst (im Folgenden als erfindungsgemäßer Endotoxin entfernender Wirkstoff bezeichnet).
Der erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Wirkstoff kann eine antimikrobiell wirkende Zusammensetzung sein, die das erfindungsgemäße Peptid und einen Träger umfasst. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann eine Arzneimittelzusammensetzung sein, die das erfindungsgemäße Peptid und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst. Der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen kann eine Zusammensetzung zur Behandlung bakterieller Infektionen sein, die das erfindungsgemäße Peptid und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst. Das erfindungsgemäße Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks kann eine Zusammensetzung zum Unterdrücken von Endotoxinschocks sein, die das erfindungsgemäße Peptid und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Helixraddarstellung eines in Beispiel 1 hergestellten Peptids (A1).
2 ist eine Helixraddarstellung eines in Beispiel 1 hergestellten Peptids ((b)).
3 ist eine Helixraddarstellung eines in Beispiel 1 hergestellten Peptids (A3).
4 ist eine Helixraddarstellung eines in Beispiel 1 hergestellten Peptids ((d)).
5 zeigt antimikrobielle Aktivitäten von Polymyxin 8 und Peptiden (A1, (b), A3 und (d)), die in Beispiel 1 mit mehreren Bakterien gewonnen wurden.
6 zeigt antimikrobielle Aktivitäten von Polymyxin B und Peptiden (A7, (e) und (f)), die in Beispiel 1 mit mehreren Bakterien gewonnen wurden.
7 zeigt die Beziehung zwischen Dosierung und antimikrobieller Aktivität der Peptiden A7, (e) und (f)), die in Beispiel 1 mit mehreren gram-negativen Bakterien gewonnen wurden.
8 zeigt die Beziehung zwischen Dosierung und antimikrobieller Aktivität der Peptide A7, (e) und (f)), die in Beispiel 1 mit mehreren gram-positiven Bakterien gewonnen wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Das erfindungsgemäße Peptid besteht aus irgendeiner der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (f):

Die hier verwendete Bezeichnung „Aminosäure" bezeichnet eine L-Aminosäure, solange nicht speziell etwas anderes angegeben ist.
Weiterhin ist der hier verwendete hydrophobe Aminosäurerest nicht besonders eingeschränkt, solange er ein hydrophober Aminosäurerest ist, aber er ist vorzugsweise ein aus der von Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin und Tryptophan gebildeten Gruppe ausgewählter Rest. Bevorzugter ist der hydrophobe Aminosäurerest ein Phenylalaninrest oder ein Leucinrest.
In der vorliegenden Erfindung ist der hydrophile Aminosäurerest nicht besonders eingeschränkt, solange er ein hydrophiler Aminosäurerest ist, aber er ist vorzugsweise ein aus der von Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin und Histidin gebildeten Gruppe ausgewählter Rest. Ein bevorzugterer hydrophiler Aminosäurerest ist ein Lysinrest.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der beliebige Aminosäurerest irgendeinen Aminosäurerest, der aus den oben beschriebenen hydrophoben Aminosäureresten und hydrophilen Aminosäureresten ausgewählt ist. Besonders ist ein Rest bevorzugt, der aus der aus Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin und Histidin bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Bevorzugter ist ein hydrophober Aminosäurerest, wobei Phenylalanin oder Leucin besonders bevorzugt sind.
Weil seine Aminosäuresequenz durch die vorliegende Erfindung offengelegt wurde, kann das erfindungsgemäße Peptid mittels eines bekannten chemischen Syntheseverfahrens hergestellt werden (siehe z.B. ein Flüssigphasensynthesverfahren, ein Festphasenverfahren, etc.; Izumiya, N., Kato, T., Aoyagi, N., Waki, M., „Basis and Experiment of Peptide Synthesis", 1985, Maruzen Co., Ltd.), das auf dieser Sequenz basiert. Z.B. kann bei der Herstellung eines Peptids mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Peptidsequenz mittels eines Festphasensyntheseverfahrens, wenn die 18-Position in der Aminosäuresequenz ein Valinrest ist, das in der SEQ ID Nr. 1 gezeigte Peptid erhalten werden, indem die Carboxylgruppe eines Valins mit einer geschützten α-Aminogruppe (N^α) direkt oder über einen Spacer an ein unlösliches Harz gebunden wird, das eine Chlormethylgruppe oder Oximethylgruppe hat, die N^α-Schutzgruppe entfernt wird, und dann nacheinander an der 17-Position bis zur 1-Position der Aminosäuresequenz jede Aminosäure in geschützter Form mittels eines Festphasensyntheseverfahrens gebunden wird ((N^α)-geschützte und an der Seitenkette mit einer funktionellen Gruppe (falls vorhanden) – geschützte Aminosäure wird einfach als geschützte Aminosäure bezeichnet), und dann das unlösliche Harz und die Schutzgruppe an der (N^α)-Gruppe oder der funktionellen Gruppe an der Seitenkette (falls vorhanden) der Aminosäuren entfernt wird.
Das oben beschriebene unlösliche Harz mit einer Chlormethylgruppe oder Oximethylgruppe, der Spacer oder das Harz mit gebundenen geschützten Aminosäuren, das aus einem unlöslichen Harz besteht, an das eine entsprechend der Umstände geschützte Aminosäure, etc., gebunden ist, die verwendet werden, um das erfindungsgemäße Peptid zu synthetisieren, können mittels eines bekannten Verfahrens hergestellt werden und es gibt auch verschiedene kommerziell erhältliche Produkte.
Als unlösliches Harz kann jedes Harz verwendet werden, solange es an die Carboxylgruppe der geschützten Aminosäure am C-Ende direkt oder über einen Spacer entsprechend der Bedingungen binden kann und später eliminiert werden kann. Bevorzugte unlösliche Harze sind z.B. Chlormethylharz (chlormethyliertes Styrol/Divinylbenzol-Copolymer), und ein Oximethylharz oder 4-Oximethyl-Pam (Phenylacetamidmethyl)-Harz, in das im Falle einer Boc-(t-Butyloxicarbonyl)-Strategie ein Spacer eingeführt wurde, oder ein Oximethylphenoximethyl-Harz (Wang) und Derivate davon, im Falle einer Fmoc (9-Fluorenylmethyloxicarbonyl)-Strategie.
Die geschützte Aminosäuregruppe ist eine Aminosäuregruppe, deren funktionelle Gruppe oder Gruppen mit einer Schutzgruppe oder Schutzgruppen mittels eines bekannten Verfahrens geschützt werden und verschiedene geschützte Aminogruppen sind kommerziell erhältlich.
Wenn das erfindungsgemäße Peptid synthetisiert wird, ist es bevorzugt, irgendeine der unten gezeigten Schutzgruppen auszuwählen. Zuerst ist die Schutzgruppe für die α-Aminogruppe einer Aminosäure Boc-(t-Butyloxicarbonyl) oder Fmoc (9-Fluorenylmethyloxicarbonyl). Die Schutzgruppe für die Guanidingruppe von Arginin (Arg) ist Tos (Tosyl), NO₂ (Nitro), Mtr (4-Methoxi-2,3,6-trimethylbenzylsulfonyl) oder Pmc (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl). Die Schutzgruppe für die ε-Aminogruppe von Lysin (Lys) ist Z (Benzoylcarbonyl) oder Cl × Z (2-Chlorbenzyloxicarbonyl), Boc oder Npys (3-Nitro-2-pyridinsulfenyl). Die Schutzgruppe für die Imidazoylgruppe von Histidin (His) ist Tos, Z, Pac (Phenacyl), Bom (Benzyloximethyl), Dnp (Dinitrophenyl) oder Trt (Trityl). Die Schutzgruppe für die Marcaptogruppe von Cystein (Cys) ist Bzl (Benzyl), MBzl (4-Methoxibenzyl), 4-MeBzl (4-Methylbenzyl), Acm (Acetamidomethyl), Trt, Npys, t-Bu (t-Butyl) oder t-BuS (t-Butylthio). Bevorzugt sind MBzl, 4-MeBzl, Trt, Acm und Npys. Die Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyrosin (Tyr) ist Bzl, Cl₂ × Bzl (2,6-Dichlorbenzyl) oder t-Bu oder die Hydroxylgruppe von Tyr kann auch ungeschützt sein. Die Schutzgruppe für die Indolgruppe von Tryptophan (Trp) ist CHO (Formyl) oder die Indolgruppe von Trp kann auch ungeschützt sein. Die Schutzgruppe für die Thiomethylgruppe von Methionin (Met) ist Methylsulfoxid oder die Thiomethylgruppe von Methionin kann auch ungeschützt sein. Die Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Serin (Ser) und Threonin (Thr) ist Bzl oder t-Bu. Die Schutzgruppe für die Carboxylgruppe von Asparaginsäure (Asp) und Glutaminsäure (Glu) ist OBzl (Benzylester), OtBu (t-Butylester), OcHex (Cycloheylester), OPac (Phenacylester) etc. Die Schutzgruppe für die Carbamidgruppe von Asparagin (Asn) und Glutamin (Gln) ist Trt oder Xan (Xanthyl).
Es ist bevorzugt, dass jede Schutzgruppe passend aus den an sich bekannten in Abhängigkeit von den Bedingungen bei der Peptidsynthese ausgewählt wird.
Das Binden der geschützten Aminosäure wird mittels gewöhnlicher Kondensationsverfahren erreicht, z.B. ein DCC-(Dicyclohexylcarbodiimid)-Verfahren, ein DIPCDI-(Diosopropylcarbodiimid)-Verfahren (Tartar, A., et al.; J. Org. Chem., 44, 5000 (1979)), ein Verfahren mit aktiviertem Ester, ein Verfahren mit gemischtem oder symmetrischen Säureanhydrid, ein Carboyldiimidazolverfahren, ein DCC-HONSu (N-Hydroxisuccinimid)-Verfahren (Weygand, F,. et al., Z. Naturforsch., B, 21, 426 (1966), ein DCC-HOBt (1-Hydroxibenzotriazol)-Verfahren (Koenig, W., et al., Chem. Ber., 103, 788, 2024, 2034 (1970)), ein Diphenylphosphorylazidverfahren, ein BOP-HOBt-Verfahren (Hudson, D., J. Org. Chem., 53, 617 (1988) unter Verwendung eines BOP-Reagenzes (Benzotriazolyl-N-hydroxitrisdimethylaminophosphoniumhexafluorphosphid), ein HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat)-HOBt-Verfahren (Knorr, R., et al., Tetrahedron Lett., 30, 1927 (1989)), ein TBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorborat)-HOBt-Verfahren (Knorr, R., et al., Tetrahedron Lett., 30, 1927 (1989)),etc. Jedoch sind unter diesen Verfahren bevorzugt das DCC-Verfahren, das DCC-HOBt-Verfahren, das BOP-Verfahren, das HBTU-HOBt-Verfahren und das Verfahren mit dem symmetrischen Säureanhydrid.
Die Kondensationsreaktion wird gewöhnlich in einem organischen Lösemittel wie Dichlormethan, Dimethylformamid (DMF), N-Methylpyrrolidon (NMP) und Ähnlichen oder einem aus diesen bestehenden gemischten Lösemittel durchgeführt.
Als Reagenz zum Abspalten der Schutzgruppe von einer α-Aminogruppe können Trifluoressigsäure/Dichlormethan, HCl/Dioxan, Piperidin/DMF oder Piperidin/NMP, etc. verwendet werden, und diese werden passend in Abhängigkeit von der Art der Schutzgruppe ausgewählt.
Der Grad des Fortschritts der Kondensationsreaktion in jedem Stadium der Synthese kann mittels des Verfahrens von E. Kaiser et al. bestimmt werden [Anal. Biochem., 34, 595 (1970)] (Ninhydrinreaktion).
Wie oben beschrieben, kann ein geschütztes Peptidharz mit einer gewünschten Aminosäuresequenz erhalten werden.
Eine Behandlung des geschützten Peptidharzes mit Fluorwasserstoff, TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) (E. Gross, Herausgeber, Yajima, H., et al.; „The Peptide" 5, 65 (1983), Academic Press], TMSOTf (Trimethylsilyltriflat [Fujii, N., et al.; J. Chem Soc., Chem Commun., 274 (1987)], TMSBr (Trimethylsilylbromid [Fujii, N., et al., Chem Pharm. Bull., 35, 3880 (1987)], Trifluoressigsäure oder Ähnlichem kann das Harz und die Schutzgruppe gleichzeitig abspalten. Das oben beschriebene Abspaltungsreagens wird geeignet in Abhängigkeit von der verwendeten Strategie (Boc oder Fmoc), den Arten der Harze und der Schutzgruppen ausgewählt. Das erfindungsgemäße Protein kann mittels einer Folge der oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Alternativ kann das erfindungsgemäße Peptid durch Herstellen eines Polynukleotids (DNS oder RNS) hergestellt werden, das der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Peptids entspricht, und durch Herstellen eines Peptids mittels einer genetischen Engineering-Technik unter Verwendung des Polynukleotids.
Das so hergestellte erfindungsgemäße Peptid kann mittels auf dem Gebiet der Proteinchemie allgemein bekannter Isolierungs/Reinigungsverfahren für Proteine gereinigt werden. Genauer können z.B. Extraktion, Umkristallisieren, Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat etc., Zentrifugieren, Dialyse, Ultrafiltration, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Normalphasenchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Gelfiltrationsverfahren, Gelpermeationschromatographie, Affinitätschromatographie, Electrophorese, Gegenstromverteilung etc. und Kombinationen von diesen genannt werden. Am effektivsten ist ein Verfahren mit Inversphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
Das hergestellte erfindungsgemäße Peptid kann mit einer Säure hydrolisiert werden, z.B. mit Salzsäure, Methansulfonsäure oder Ähnlichen und seine Aminosäurezusammensetzung kann mittels eines bekannten Verfahrens untersucht werden. Damit kann bestimmt werden, ob das erfindungsgemäße Peptid korrekt hergestellt wurde.
Genauer wird die Aminosäuresequenz des hergestellten Peptids mittels eines bekannten Verfahrens zur Bestimmung von Aminosäuresequenzen bestimmt (z.B. Edman-Abbautechnik, etc.), um sicherzustellen, ob das erfindungsgemäße Peptid richtig hergestellt wurde.
Das erfindungsgemäße Peptid schließt eine Form als Salz ein. Wie später beschrieben wird, ist das erfindungsgemäße Peptid als Arzneimittel besonders nützlich und daher ist das Salz des Peptids vorzugsweise ein pharmazeutisch verwendbares Salz.
Das erfindungsgemäße Peptid kann durch Zugabe einer Säure ein Salz bilden. Beispiele für die Säure schließen anorganische Säuren (wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure) oder organische Carboxylsäuren (wie Essigsäure, Propionsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Weinsäure und Salicylsäure), saure Zucker wie Glucuronsäure, Galacturonsäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure etc., saure Polysaccharide wie Hyaluronsäure, Chondroitinsulfate, Alginsäure, oder organische Sulfonsäuren (wie Methansulfonsäure und p-Toluolsulfonsäure) und Ähnliche ein. Unter diesen Salzen ist ein pharmazeutisch verwendbares Salz bevorzugt.
Das erfindungsgemäße Peptid kann mit einer basischen Substanz ein Salz bilden. Beispiele für ein solches Salz schließen z.B. pharmazeutisch verwendbare Salze ein, die aus Salzen mit anorganischen Basen ausgewählt werden, wie Alkalimetallsalze (Natriumsalz, Lithiumsalz, Kaliumsalz, etc.), Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze und Ähnliche oder Salze mit organischen Basen wie Diethanolaminsalze, Cyclohexylaminsalze und Ähnliche.
Weil das erfindungsgemäße Peptid wie durch die später beschriebenen Beispiele offensichtlich wird eine große antimikrobielle Aktivität, große Endotoxin bindende Aktivität und große Endotoxin neutralisierende Aktivität ausübt, kann das erfindungsgemäße Peptid als ein aktiver Bestandteil des erfindungsgemäßen antimikrobiell wirkenden Wirkstoffs, des erfindungsgemäßen Arzneimittels zur Behandlung bakterieller Infektionen, des erfindungsgemäßen Mittels zum Unterdrücken von Endotoxinschocks und des erfindungsgemäßen Wirkstoffs zum Entfernen von Endotoxin verwendet werden, wie unten im Detail beschrieben wird.
Der Grund für die große antimikrobielle Aktivität, große Endotoxin (LPS)-bindende Aktivität und große Endotoxin (LPS)-neutralisierende Aktivität des erfindungsgemäßen Peptids wird folgendermaßen vermutet.
Das Peptid in der LPS-bindenden Domäne von vom Menschen stammenden CAP18 hat eine α-Helix-Strukur, die, wenn sie in ihre axiale Richtung projiziert wird (Helixraddarstellungen sind in den 1 und 3 dargestellt) einen hyrdophilen Teil einschließt (d.h. einen Teil, der reich an hydrophilen Aminosäureresten (basischen Aminosäureresten) wie Arginin und Lysin ist) und einen hydrophoben Teil (d.h. einen Teil, der reich an hydrophoben Aminosäureresten wie Phenylalanin, Leucin und Isoleucin ist). Es ist anzunehmen, dass der hydrophile Teil des Peptids ionisch an einen Teil der Phosphatgruppe des Lipid A-Teils von LPS bindet, und der hydrophobe Teil des Peptids hydrophob an den Fettsäureteil des Lipid A bindet, was zur antimikrobiellen Aktivität und der LPS-neutralisierenden Aktivität führt. Eine Substitution mit einem anderen spezifischen Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest an einer spezifischen Position ändert das Gleichgewicht zwischen dem hydrophilen Teil und dem hydrophoben Teil (2 und 4) und diese Veränderung wäre mit einer Steigerung der antimikrobiellen Aktivität, der LPS-bindenden Aktivität und der LPS-neutralisierenden Aktivität verknüpft.
Das erfindungsgemäße Peptid wurde auf der Basis eines grundlegenden Konzepts zur Verfügung gestellt, dass die Bildung der Aminosäuresequenz des Peptids unter Berücksichtigung des Gleichgewichts zwischen dem hydrophilen Teil und dem hydrophoben Teil im Helixrad, wenn die α-Helix-Struktur des Peptids in seine axiale Richtung projiziert wird, die antimikrobielle Aktivität, die LPS-bindende Aktivität und die LPS-neutralisierende Aktivität vergrößert. Es wird also das Gleichgewicht zwischen dem hydrophilen Teil und dem hydrophoben Teil für die antimikrobielle Aktivität, die LPS-bindende Aktivität und die LPS-neutralisierende Aktivität des erfindungsgemäßen Peptids als wichtig betrachtet.
<2> Erfindungsgemäßer antimikrobiell wirkender Wirkstoff
Der erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Wirkstoff ist ein antimikrobiell wirkender Wirkstoff, der das erfindungsgemäße Peptid als einen aktiven Bestandteil umfasst. Der erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Wirkstoff hat eine starke antimikrobielle Aktivität auf verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien.
Es reicht für den erfindungsgemäßen antimikrobiell wirkenden Wirkstoff aus, mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid zu umfassen. So kann der erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Wirkstoff aus dem erfindungsgemäßen Peptid alleine bestehen oder die Form einer Zusammensetzung haben, die aus dem erfindungsgemäßen Peptid und einem geeigneten Träger besteht.
Der erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Wirkstoff kann als ein Arzneimittel verwendet werden und er kann statt oder in Kombination mit einem konventionellen antimikrobiell wirkenden Wirkstoff verwendet werden, wie er als Konservierungsstoff Nahrungsmitteln zugegeben wird, um Nahrungsmittel vor bakterieller Kontamination zu schützen, oder zu ihrer Konservierung.
Der erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Wirkstoff kann auch auf einer Oberfläche eines geeigneten Materials angewandt werden oder mit einem geeigneten Material zu Herstellung eines antimikrobiell wirkenden Materials vermischt werden. Solches antibakterielles Material kann in der unterschiedlichen Formen verwendet werden wie Perlen, einem Film, einer Platte, einem Faden, einem Vliesstoff, Schwamm, Stoff, Gestrick, kurzen Faser, Röhrchen, Hohlfaser oder Ähnlichem. Genauer kann es für ein künstliches Organ, für einen Katheder, für Fäden für Wundnahten (Verbindungsfaser) für chirurgische Operationen, Dialysemembranen und ähnliches ebenso verwendet werden wie für Sanitärarfikel, antimikrobiell wirkende Filter und ähnliches.
Unter den im erfindungsgemäßen antimikrobiell wirkenden Wirkstoff verwendeten erfindungsgemäßen Peptiden haben die Peptide mit irgendeiner der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (f) große antimikrobielle Aktivität wie aus den unten beschriebenen Beispielen ersichtlich ist, bei denen ihre antimikrobielle Aktivität speziell gezeigt wird und sie sind somit bevorzugt.

Unter den Peptiden mit den Aminosäuresequenzen (a) bis (f) übt das Peptid mit der Aminosäuresequenz (e) oder (f) eine sehr große antimikrobielle Aktivität sowohl auf grampositive wie auf gram-negative Bakterien aus und ist damit besonders bevorzugt.
<Erfindungsgemäße Arzneimittelzusammensetzung>
Die erfindungsgemäße Arzneimittelzusammensetzung ist eine Arzneimittelzusammensetzung, die das erfindungsgemäße Peptid umfasst.
Die erfindungsgemäße Arzneimittelzusammensetzung kann für unterschiedliche medizinische Anwendungen verwendet werden und basiert auf den Aktivitäten der erfindungsgemäßen Peptide wie einer großen antimikrobiellen Aktivität, großer Endotoxin bindenden Aktivität und großer Endotoxin neutralisierenden Aktivität. Es reicht für die erfindungsgemäße Arzneimittelzusammensetzung aus, mindestens das erfindungsgemäße Peptid als aktiven Bestandteil zu umfassen. So kann die erfindungsgemäße medizinische Zusammensetzung aus dem erfindungsgemäßen Peptid alleine bestehen oder sie kann in Form einer Zusammensetzung vorliegen, die das erfindungsgemäße Peptid und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst. Der pharmazeutisch verwendbare Träger, der verwendet werden kann, ist nicht besonders eingeschränkt und schließt einen Arzneistoffträger, ein Bindemittel, einen Schmierstoff, einen Farbstoff, ein Sprengmittel, einen Puffer, einen isotonischen Wirkstoff, einen Konservierungsstoff, ein Narkotikum und Ähnliche ein, die im medizinischen Bereich verwendet werden können.
Die erfindungsgemäße Arzneimittelzusammensetzung kann mittels jedes geeigneten Verabreichungsverfahrens in Abhängigkeit vom Zweck der Behandlung angewandt werden und unter Injizieren (subkutan, intrakutan, intravenös, intaperitoneal etc.), in die Augen tropfen, Einträufeln, perkutaner Verabreichung, oraler Verabreichung, Inhalation und Ähnlichen ausgewählt werden.
Auch die Dosierungsform wie injizierbare Zubereitungen (Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, vor der Verwendung aufzulösende Feststoffe, etc.), Tabletten, Kapseln, Körnchen, Pulver, Flüssigkeiten, Liposomeinschlüsse, Salben, Gels, äußerlich anzuwendende Puder, Sprays, Inhalationspulver, Augentropfen, Augensalben, Zäpfchen, Pessare und Ähnliche kann geeignet in Abhängigkeit vom Verabreichungsverfahren gewählt werden und das erfindungsgemäße Peptid kann entsprechend formuliert werden.
Die Dosis der erfindungsgemäßen Arzneimittelzusammensetzung sollte individuell festgelegt werden, in Abhängigkeit vom Verabreichungszweck (Vorbeugung, Erhaltung (verhindern von Verschlechterung), Linderung (Verbesserung von Symptomen) oder Heilung); der Art der Krankheit; den Symptomen, Geschlecht und Alter des Patienten; des Verabreichungsverfahrens und Ähnlichem und ist nicht besonders eingeschränkt.
Im Folgenden wird eine repräsentative Arzneimittelzusammensetzung erklärt.
<3-1> Antimikrobiell wirkende Arzneimittelzusammensetzung
Die antimikrobiell wirkende Arzneimittelzusammensetzung ist eine Arzneimittelzusammensetzung, die den erfindungsgemäßen antimikrobiell wirkenden Wirkstoff umfasst (im Folgenden als das erfindungsgemäße Arzneimittel bezeichnet) und enthält das erfindungsgemäße Peptid als einen aktiven Wirkstoff.
Der erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Wirkstoff hat, wie oben angegeben, eine starke antimikrobielle Aktivität auf verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien. Daher kann der erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Wirkstoff bei verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien angewandt werden. Die Bakterien, auf die die Behandlung abzielt, sind nicht besonders eingeschränkt, aber Escherichia coli, Klebsiella, Salmonella und Ähnliche sind als gram-negative Bakterien bevorzugt und Staphylococcus aureus und Ähnliche sind als die gram-positiven Bakterien bevorzugt.
Die erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Arzneimittelzusammensetzung kann auch gegen gram-positive Bakterien mit multipler Arzneimittelresistenz verwendet werden (z.B. methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA), methicillin-empfindlichen Staphylococcus aureus (MSSA), vancomycin-resitente Enterococci, etc.) und gegen gramnegative Bakterien mit multipler Arzneimittelresistenz (Helicobacter, Shigella, Salmonella mit multipler Arzneimittelresistenz, etc.).
Die erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Arzneimittelzusammensetzung hat eine starke antimikrobiell wirkende Aktivität auf Escherichia coli, insbesondere pathogene Echerichia coli O-157, Staphylococcus aureus, insbesondere methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und methicillin-empfindlichen Staphylococcus aureus (MSSA), so dass es bevorzugter ist, dass mit der Behandlung auf diese Bakterien abgezielt wird.
Die erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Arzneimittelzusammensetzung kann aus dem erfindungsgemäßen Peptid alleine bestehen oder sie kann in Form einer Zusammensetzung vorliegen, die das erfindungsgemäße Peptid und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst. Der pharmazeutisch verwendbare Träger, der verwendet werden kann, ist nicht besonders eingeschränkt und schließt einen Arzneistoffträger, ein Bindemittel, einen Schmierstoff, einen Farbstoff, ein Sprengmittel, einen Puffer, einen isotonischen Wirkstoff, einen Konservierungsstoff, ein Narkotikum und Ähnliche ein, die im medizinischen Bereich verwendet werden können. Sie kann auch in Kombination mit einem anderen antimikrobiell wirkenden Arzneimittel wie Lysozym, Antibiotika und Ähnlichem verwendet werden.
Die erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Arzneimittelzusammensetzung kann zur Behandlung von z.B., einem mit Mikroorganismen infizierten Teil außerhalb des Körpers oder zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion innerhalb des Körpers verwendet werden und ein geeignetes Verabreichungsverfahren kann in Abhängigkeit vom Zweck der Behandlung unter Injizieren (subkutan, intrakutan, intravenös, intaperitoneal etc.), in die Augen tropfen, Einträufeln, perkutaner Verabreichung, oraler Verabreichung, Inhalation etc. ausgewählt werden.
Auch die Dosierungsform wie injizierbare Zubereitungen (Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, vor der Verwendung aufzulösende Feststoffe, etc.), Tabletten, Kapseln, Körnchen, Pulver, Flüssigkeiten, Liposomeinschlüsse, Salben, Gels, äußerlich anzuwendende Puder, Sprays, Inhalationspulver, Augentropfen, Augensalben,. Zäpfchen, Pessare und Ähnliche kann geeignet in Abhängigkeit vom Verabreichungsverfahren gewählt werden und die erfindungsgemäße Arzneimittelzusammensetzung kann entsprechend formuliert werden.
Die Dosis der erfindungsgemäßen antimikrobiell wirkenden Arzneimittelzusammensetzung sollte individuell festgelegt werden, in Abhängigkeit von der Bakterienart, dem Stadium der Infektion, den Symptomen, Geschlecht und Alter des Patienten, des Verabreichungsverfahrens und Ähnlichem und ist nicht besonders eingeschränkt.
Die erfindungsgemäße antimikrobiell wirkende Arzneimittelzusammensetzung kann einem Erwachsenen in einer Einzeldosis von etwa 5 bis 15 (mg/kg Körpergewicht) bezogen auf das erfindungsgemäße Peptid verabreicht werden.
Unter den erfindungsgemäßen Peptiden, die in der erfindungsgemäßen antimikrobiell wirkenden Arzneimittelzusammensetzung verwendet werden, haben die Peptide mit irgendeiner der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (f) große antimikrobielle Aktivität, wie aus den unten beschriebenen Beispielen ersichtlich ist, bei denen ihre antimikrobielle Aktivität speziell gezeigt wird, und sie sind somit bevorzugt.

Unter den Peptiden mit den Aminosäuresequenzen (a) bis (f) übt das Peptid mit der Aminosäuresequenz (e) oder (f) eine sehr große antimikrobielle Aktivität sowohl auf grampositive wie auf gram-negative Bakterien aus und ist damit besonders bevorzugt.
<3-2> Erfindungsgemäßer Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen
Der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen ist ein Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen, der das erfindungsgemäße Peptid als einen aktiven Wirkstoff umfasst.
Wegen der starken antimikrobiellen Aktivität des erfindungsgemäßen Peptids, das als ein aktiver Wirkstoff davon dient, auf verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien kann der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung von gram-positiven und von gramnegativen Bakterien verursachten bakteriellen Infektionen angewandt werden. Die Bakterien, die die bakteriellen Infektionen verursachen, sind nicht besonders eingeschränkt, aber von Escherichia coli, Klebsiella, Salmonella und Ähnlichen verursachte bakterielle Infektionen sind bevorzugt als von gram-negativen Bakterien verursachte Infektionen und von Staphylococcus aureus und Ähnlichen verursachte bakterielle Infektionen sind bevorzugt als von gram-positiven Bakterien verursachte Infektionen.
Der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen kann auch gegen gram-positive Bakterien mit multipler Arzneimittelresistenz verwendet werden (z.B. methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA), methicillin-empfindlicher Staphylococcus aureus (MSSA), vancomycin-resitente Enterococci, etc.) und gegen gramnegative Bakterien mit multipler Arzneimittelresistenz (Helicobacter, Shigella, Salmonella mit multipler Arzneimittelresistenz, etc.).
Der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen hat eine starke antimikrobielle Aktivität auf Escherichia coli, insbesondere pathogene Escherichia coli O-157, und Staphylococcus aureus, insbesondere methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und methicillin-empfindlichen Staphylococcus aureus (MSSA), so dass es bevorzugter ist, dass mit der Behandlung auf diese Bakterien abgezielt wird.
Es ist ausreichend, wenn der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen mindestens das erfindungsgemäßen Peptid alleine umfasst. So kann z.B. der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen aus dem erfindungsgemäßen Peptid alleine bestehen, oder er kann in Form einer Zusammensetzung vorliegen, die das erfindungsgemäße Peptid und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst. Das Verabreichungsverfahren des erfindungsgemäßen Wirkstoffs zur Behandlung bakterieller Infektionen kann ebenso wie es für das oben beschriebene erfindungsgemäße Arzneimittel der Fall ist, geeignet ausgewählt werden, und Injektionen (subkutan, intrakutan, intravenös, intaperitoneal etc.) sind bevorzugt Auch die Dosierungsform des erfindungsgemäßen Wirkstoffs zur Behandlung bakterieller Infektionen kann ebenso wie es für das oben beschriebene erfindungsgemäße Arzneimittel der Fall ist, in Abhängigkeit vom Verabreichungsverfahren geeignet ausgewählt werden und der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen wird vorzugsweise zu injizierbaren Zubereitungen formuliert (Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, vor der Verwendung aufzulösende Feststoffe, etc.),
Die Dosis des erfindungsgemäßen Wirkstoffs zur Behandlung bakterieller Infektionen sollte individuell festgelegt werden, in Abhängigkeit von der Bakterienart, dem Stadium der Infektion, den Symptomen, Geschlecht und Alter des Patienten, des Verabreichungsverfahrens und Ähnlichem und ist nicht besonders eingeschränkt. Der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen kann einem Erwachsenen in einer Einzeldosis von etwa 5 bis 15 (mg/kg Körpergewicht) bezogen auf das erfindungsgemäße Peptid für verabreicht werden.
Unter den erfindungsgemäßen Peptiden, die im erfindungsgemäßen Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen verwendet werden, haben die Peptide mit irgendeiner der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (f) große antimikrobielle Aktivität wie aus den unten beschriebenen Beispielen ersichtlich ist, bei denen ihre antimikrobielle Aktivität speziell gezeigt wird und sie sind somit bevorzugt.

Unter den Peptiden mit den Aminosäuresequenzen (a) bis (f) übt das Peptid mit der Aminosäuresequenz (e) oder (f) eine sehr große antimikrobielle Aktivität sowohl auf grampositive wie auf gram-negative Bakterien aus und ist damit besonders bevorzugt.
<3-3> Erfindungsgemäßes Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks
Das erfindungsgemäße Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks ist ein Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks, das das erfindungsgemäße Peptid als einen aktiven Wirkstoff umfasst.
Das erfindungsgemäße Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks hat eine hervorragende Wirkung auf die mit Endotoxinschocks einhergehende Sepsis, mit Endotoxinschocks einhergehende gram-negative Infektionen oder Ähnliches und hat auch eine Wirkung die Sterblichkeit wegen solcher Endotoxinschocks zu unterdrücken.
Es ist ausreichend, wenn das erfindungsgemäße Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks mindestens das erfindungsgemäßen Peptid alleine umfasst. So kann z.B. das erfindungsgemäße Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks aus dem erfindungsgemäßen Peptid alleine bestehen, oder es kann in Form einer Zusammensetzung vorliegen, die das erfindungsgemäße Peptid und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst. Der pharmazeutisch verwendbare Träger, das Verabreichungsverfahren, die Dosierungsform und Ähnliches, die verwendet werden können, sind die selben wie beim oben beschriebenen erfindungsgemäßen Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen.
Unter den erfindungsgemäßen Peptiden, die als erfindungsgemäßes Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks verwendet werden, sind die Peptide mit irgendeiner der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (d) und (f) eingeschlossen.

(a) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 2);
(b) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 3);
(c) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 4);
(d) Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 5) und
(f) Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val (SEQ ID Nr. 7).

Ein bevorzugteres erfindungsgemäßes Peptid als erfindungsgemäßes Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks hat irgendeine der Aminosäuresequenzen (b) bis (d) und (f) und das am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Peptid hat irgendeine der Aminosäuresequenzen (b), (c) und (f).
<4> Erfindungsgemäßer Wirkstoff zur Entfernung von Endotoxin
Der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Entfernung von Endotoxin ist ein Wirkstoff zur Entfernung von Endotoxin, der das erfindungsgemäße Peptid auf einem unlöslichen Träger immobilisiert umfasst. Der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Entfernung von Endotoxin basiert auf der Nutzung der hohen Bindungsneigung des erfindungsgemäßen Peptids bei der Adsorption und Entfernung von Endotoxin.
Die Form des unlöslichen Trägers, auf dem das erfindungsgemäße Peptid immobilisiert ist, ist nicht besonders eingeschränkt, und es können unterschiedliche Formen genannt werden, z.B. Membranformen (Filtermembranen, Hohlmembranen, Röhrenmembranen, flache Membranen, etc.,) Körnchen, Latex, Chips, Pulver und Mikroplatten.
Das Material des unlöslichen Trägers ist ebenfalls nicht besonders eingeschränkt und es können verschiedene Materialien genannt werden, z.B. Materialien aus Polystyrol, Polypropylen, Polyamid, Cellulose, Agarose und Vinylpolymeren.
Das Verfahren zur Immobilisierung des erfindungsgemäßen Peptids ist ebenfalls nicht besonders eingeschränkt und die Immobilisierung des erfindungsgemäßen Peptids kann unter Verwendung allgemeiner Verfahren, die als Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzyme verwendet werden, erfolgen, wie Verfahren der physikalischen Adsorption, ionischer Bindung, kovalenter Bindung und Inklusionsverfahren (KOTEIKA KOSO (Immobilized Enzymes), 1975, Kodansha, S 9-75).
Im Falle der unlöslichen Träger aus Polystyrol oder Polypropylen kann das erfindungsgemäße Peptid physikalisch immobilisiert werden. Im Falle der unlöslichen Träger aus Polyamid-, Cellulose-, Agarose-, Polyacrylamid-, Dextran- oder Polyvinylmaterialien kann das erfindungsgemäße Peptid chemisch immobilisiert werden. Als das chemische immobilisierende (bindende) Verfahren können z.B. genannt werden:
Diazotierungsverfahren, bei dem eine Diazokupplung unter Verwendung einer aromatischen Aminogruppe im unlöslichen Träger verwendet wird, CNBr-Verfahren, bei dem eine Peptidbindung durch Aktivierung einer Hydroxylgruppe im unlöslichen Träger mit CNBr gebildet wird, Säureazidverfahren, bei dem eine Peptidbindung unter Verwendung eines Hydrazinderivates des unlöslichen Trägers gebildet wird, Alkylierungsverfahren, bei dem ein Peptid unter Verwendung einer reaktiven funktionellen Gruppe wie einem Halogen im unlöslichen Träger alkyliert wird, Vernetzungsverfahren, bei dem ein mit einer freien Aminogruppe reagierendes Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd eine Verknüpfung zwischen dem unlöslichen Träger und der freien Aminogruppe im Peptid herstellt, Carbodiimidverfahren, Epoxid-Aktivierungsverfahren und Verfahren, bei denen eine Bindung über einen Spacer unter Verwendung eines der oben beschriebenen Verfahren gebildet wird. Ein geeignetes Verfahren kann in Abhängigkeit von der Art des unlöslichen Trägers zur Ausbildung einer Bildung des erfindungsgemäßen Peptids unter diesen Verfahren ausgewählt werden.
Der unlösliche Träger, an dem das erfindungsgemäße Peptid immobilisiert ist, wird mit einer Lösung in Kontakt gebracht, aus der Endotoxin entfernt werden soll, so dass sich ein Komplex aus dem Endotoxin in der Lösung und dem unlöslichen Träger, an dem das erfindungsgemäße Peptid immobilisiert ist, bildet, und der so gebildete Komplex wird entfernt, wobei das Endotoxin in der Lösung entfernt werden kann.
Das Verfahren, den unlöslichen Träger, an dem das erfindungsgemäße Peptid immobilisiert ist, mit der Lösung, aus der Endotoxin entfernt werden soll, in Kontakt zu bringen, ist nicht besonders eingeschränkt und bekannte Mittel zum in Kontaktbringen von Feststoffen und Flüssigkeiten können verwendet werden. Z.B. ein Verfahren, bei dem eine Lösung durch einen filter- oder hohlfilterförmigen unlöslichen Träger oder über einen unlöslichen Träger in Form einer flachen Membran gegeben wird, ein Verfahren bei dem eine Lösung durch eine mit einem körnerförmigen unlöslichen Träger beladenen Säule gegeben wird, ein Verfahren, bei dem eine Lösung in eine Vertiefung in Form einer Mikroplatte gegeben wird und die Lösung dann gewisse Zeit stehen gelassen wird und dann getrennt wird, ein Verfahren, bei dem eine Lösung auf einen unlöslichen Träger in irgendeiner Form gegeben wird und geschüttelt wird oder eine bestimmte Zeit lang stehen gelassen wird und dann gewöhnliche Mittel zur fest/flüssig-Trennung verwendet werden können (Filtration, Zentrifugation, Absaugen, Dekantieren, etc.), um eine Lösung zu erhalten, die frei von Endotoxin oder Ähnlichem ist.
Die Lösung, aus der Endotoxin entfernt werden soll, ist nicht besonders eingeschränkt, und Beispiele dafür schließen in einer Arzneimittelfabrik, in medizinischen Anlagen und Ähnlichem verwendete Lösungen ein, genauer Dialysatflüssigkeiten, Flüssigkeiten für künstliche Ernährung, Blut, Arzneimittel, ultrareines Wasser und Ähnliches, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der unlösliche Träger, an dem das erfindungsgemäße Peptid immobilisiert ist, ist vorzugsweise endotoxinfrei.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ein partielles Peptid, das einem bekannten partiellen Peptid eines vom Menschen stammenden antimikrobiell wirkenden Proteins (CAP18) entspricht, dessen vorgegebener Aminosäurerest substituiert ist, und es übt Endotoxin bindende Aktivität, antimikrobielle Aktivität, Endotoxin neutralisierende Aktivität aus, die merklich größer sind, als diejenigen der bekannten partiellen Peptide, so dass es als aktiver Bestandteil eines antimikrobiell wirkenden Wirkstoffs, eines Wirkstoffs zur Behandlung bakterieller Infektionen, eines Wirkstoffs zur Unterdrückung von Endotoxinschocks und eines Wirkstoffs zum Entfernen von Endotoxin und Ähnlichem verwendet werden kann.
Weil das erfindungsgemäße Peptid wie oben beschrieben eine hohe pharmakologische Aktivität hat, kann die Menage an aktivem Bestandteil in Arzneimitteln wie dem erfindungsgemäßen antimikrobiell wirkenden Arzneimittel, dem erfindungsgemäßen Mittel zur Behandlung bakterieller Infektionen und dem erfindungsgemäßen Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks, die das erfindungsgemäße Peptid als aktiven Bestandteil enthalten, verringert werden, wobei das erfindungsgemäße sichere und preiswerte Arzneimittel zur Verfügung gestellt werden kann. Auch ist das erfindungsgemäße Arzneimittel äußerst nützlich als besonders für Menschen hochgradig sicheres Arzneimittel, weil es auf dem vom Menschen stammenden partiellen Peptid basiert.
Darüber hinaus können, um die sehr große Endotoxin bindende Aktivität des erfindungsgemäßen Peptids am besten zu nutzen, ein Wirkstoff zur Entfernung von Endotoxin, der das erfindungsgemäße Peptid auf einem unlöslichen Träger immobilisiert umfasst, und ein Mittel zur Bestimmung von Endotoxin, das das erfindungsgemäße Peptid umfasst, zur Verfügung gestellt werden.
Beispiele
Im Folgenden wird die Erfindung mittels Beispielen genauer beschrieben.
Beispiel 1
<1> Herstellung des erfindungsgemäßen Peptids
Die erfindungsgemäßen Peptide mit einer aus den unten dargelegten von (a) bis (f) ausgewählten Aminosäuresequenzen wurden entsprechend eines Festphasensyntheseverfahrens durch Peptide Institute, Inc., hergestellt.

(a) (27-mer, substituiert) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 2);
(b) (27-mer, substituiert) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 3);
(c) (27-mer, substituiert) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 4);
(d) (22-mer, substituiert) Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 5)
(e) (18-mer, substituiert) Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 6), und
(f) (18-mer, substituiert) Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val (SEQ ID Nr. 7).

Zum Vergleich wurden die unten dargelegten Peptide A1, A3, A5, A6 und A7, deren Aminosäuren nicht substituiert waren, entsprechend eines Festphasensyntheseverfahrens durch Peptide Institute, Inc., hergestellt.

(A1) (27-mer, unsubstituiert) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 8);
(A3) (22-mer, unsubstituiert) Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 9)
(A5) (24-mer, unsubstituiert) Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 10)
(A6) (23-mer, unsubstituiert) Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 11)
(f) (18-mer, unsubstituiert) Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 12)

Tabelle 1 zeigt die Beziehungen zwischen den erfindungsgemäßen Peptiden (a) bis (f) zu den bekannten Peptiden A1, A3, A5, A6 und A7. In der Tabelle 1 wurden die Aminosäurereste durch respektive Einbuchstaben-Symbole angegeben. Auch wurden substituierte Aminosäurereste unterstrichen.
Tabelle 1

Für die Peptide A1, (b), A3, (d), A5 und A6 der oben beschriebenen hergestellten Peptide sind (1) die Analysewerte (Hydrolysebedingungen: 6 N HCl, 110 °C, 22 Stunden) und (2) Reinheitsgrad (%, berechnet aus Hochleistungsflüssigkeitschromatographiedaten in Tabelle 2 dargestellt. In jedem Eluierungsprofil dieser Peptide beim der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inversphasenchromatographie) wurde ein einzelner Peak beobachtet. Die Chromatographiebedingungen waren wie folgt:

Säule	YMC Pak ODS-AM (4,6 mm I.D. × 150 mm), (YMC Co, Ltd.)
Eluierungsmittel:	Für A1, 20-70 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure; 25 Minuten
	Für andere, 30-80 % Acetonitril/ 0,1 % Trifluoressigsäure; 25 Minuten
Flussrate:	1,0 mL/Minute
Temperatur:	Für A1, A3, A5 und A6: 25 °C
	Für andere: 50 °C
Nachweiswellenlänge:	220 nm

Tabelle 2

Die hergestellten Peptide waren jeweils weiße gefriergetrocknete Zubereitungen.
Aus den Ergebnissen wird geschlossen, dass jedes hergestellte Peptid eine Reinheit von 97 % oder darüber hat und bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inversphasenchromatographie) einen einzelnen Peak zeigt. Es wurde auch gezeigt, dass die Analysenwerte der Aminosäuren mit den von der Aminosäuresequenz erhaltenen theoretischen Werten gut übereinstimmen, was anzeigt, dass das Peptid richtig hergestellt worden ist.
Die erfindungsgemäßen Peptide (a) bis (f) haben gemeinsam, dass sie mindestens die folgende Aminosäuresequenz enthalten und weiterhin, dass sie LPS-bindende Aktivität, antimikrobielle Aktivität und Endotoxin neutralisierende Aktivität haben, wie später beschrieben wird.
Daher wird das erfindungsgemäße Peptid als ein Peptid verallgemeinert, dass mindestens die folgende Aminosäuresequenz umfasst (SEQ ID Nr. 1):
Lys Xal Phe Lys Arg Ile Val Xa2 Arg Ile Xaa Xa2 Phe Leu Arg Xa2 Leu Val, wobei Xal einen hydrophoben Aminosäurerest repräsentiert, Xa2 jeweils, unabhängig voneinander, einen hydrophilen Aminosäurerest repräsentieren, und Xaa einen beliebigen Aminosäurerest repräsentiert.
<2> LPS-bindende Aktivität
Messverfahren für die LPS-bindende Aktivität: Zu 1,0 mL einer Suspension aus Schafblutkörperchen, wurden 0,2 mL einer Lösung (100 μg/mL) LPS des Re-Typs (Re-LPS, hergestellt von List Lab Co.), das von Salmonella minnesota stammte, zugegeben und das Gemisch wurde bei 37 °C 30 Minuten lang inkubiert und mit mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) unter Zentrifugieren gewaschen, um 1 % LPS-sensibilisierte Blutkörperchen zu erhalten. Zu 50 μL einer Folge zweifach verdünnten Probe (Peptid) wurden 50 μL LPS-sensibilisierte Blutkörperchen gegeben und das Gemisch wurde in einer U-Mikroplatte (Gammastrahlung-sterilisiert; hergestellt von Nunc Co.) bei 37 °C eine Stunde lang inkubiert.
Die maximale Verdünnungsstufe der Probe, bei der eine Agglutinationsreaktion erfolgt, wurde bestimmt und die daraus errechnete Konzentration wurde das die minimale Agglutinationskonzentration (MAC) definiert. Je geringer der MAC-Wert, desto stärker die LPS-bindende Aktivität der Probe.
2.1. Wirkung der Substitution von Aminosäureresten (1)
A1, das erfindungsgemäße Peptid (b), A3 und das erfindungsgemäße Peptid (d) wurden als Proben verwendet und ihre LPS-bindenden Aktivitäten wurden mittels des oben beschriebenen Messverfahrens untersucht. Die Ergebnisse wind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Aus Tabelle 3 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) eine um etwa 15 bis 31 mal größere LPS-bindende Aktivität als die unsubstituierte Form (bekannt) hatte.
2-2. Wirkung der Substitution des Aminosäurerests (2)
A1, die erfindungsgemäßen Peptide (b), (a) und (c) wurden als Proben verwendet und ihre LPS-bindenden Aktivitäten wurden mittels des oben beschriebenen Messverfahrens untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
Aus Tabelle 4 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) eine um etwa 8 bis 16 mal größere LPS-bindende Aktivität als die unsubstituierte Form (bekannt) hatte.
2-3. LPS-bindende Aktivität des modifizierten Peptids
Peptide mit einem acetylierten N-Ende und einem amidierten C-Ende (A7, das erfindungsgemäße Peptid (e) und das erfindungsgemäße Peptid (f) wurden als Proben verwendet und ihre LPS-bindenden Aktivitäten wurden mittels des oben beschriebenen Messverfahrens untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
Aus Tabelle 5 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) eine um etwa 31 bis 125 mal größere LPS-bindende Aktivität als die unsubstituierte Form (bekannt) hatte. Die LPS-bindende Aktivität wurde durch die Modifikation des Peptids nicht beeinflusst.
<Pharmakologische Tests>
3-1. Antimikrobielle Aktivität
Messverfahren für die mikrobielle Aktivität: Für die Messung der mikrobiellen Aktivität wurde E. coli [E. coli O157:H7 (von E. coli O157:H7 Patienten aus den Amtsbezirken Okayama, Kanagawa und Moriola city des Iwate-Amtsbezirks)], Klebsiella oder methicillin-restistener Staphylococcus aureus; MRSA, verwendet.
Diese Bakterien wurden in einem flüssigen Medium kultiviert (Tryptosoy Nährmedium; hergestellt von Eiken Kagaku). Die Bakterien in einer logarithmischen Wachstumsphase wurden gewonnen, mit PBS (pH 7,2) gewaschen und auf eine Endkonzentration von 5 × 10³ bis 1 × 10⁴ Zellen/mL eingestellt. Zu 450 μL der Zellsuspension wurden jeweils 50 μL der Proben (Peptide) in unterschiedlichen Konzentrationen gegeben und die Gemische wurden eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden 100 μL von jedem Reaktionsgemisch auf einem Agarosemedium verteilt (Nährmittel: Agar, hergestellt von Eiken Kagaku). Dieses wurde bei 37 °C 24 Stunden lang inkubiert und die Kolonien bildenden Einheiten (CFU) wurden gezählt, um die 50%-Inhibierungskonzentration (IC₅₀) zu erhalten.
3-1-1 Antimikrobielle Aktivität auf E. coli (E. coli 0157) (1)
Polymyxin B (ein bekannter antimikrobiell wirkender Wirkstoff), A1, das erfindungsgemäße Peptid (b), A3, das erfindungsgemäße Peptid (d), A5 und A6 wurden als Proben verwendet und ihre antimikrobielle Aktivitäten gegenüber E. coli [E. coli O157:H7 (von E. coli O157:H7 Patienten aus dem Amtsbezirk Okayama und Kanagawa und Morioka city des Amtsbezirks Iwate)] wurde mittels des oben beschriebenen Messverfahrens untersucht, Die Ergebnisse wind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6
In der obigen Tabelle bezeichnet NT die Tatsache, dass kein Test durchgeführt worden ist.
Aus Tabelle 6 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) auf E. coli O157:H7 eine etwa 4 bis 15 mal größere antimikrobielle Aktivität hatte als die unsubstituierte Form (bekannt).
Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl die Aktivität derjenigen von Polymyxin B entspricht, das erfindungsgemäße Peptid verglichen mit Polymyxin vorteilhaft ist, weil Polymyxin eine starke Toxizität aufweist.
3-1-2. Antimikrobielle Aktivität auf E. coli (E. coli 0157) (2)
A1, das erfindungsgemäße Peptid (b), das erfindungsgemäße Peptid (a) und das erfindungsgemäße Peptid (c) wurden als Proben verwendet und ihre antimikrobielle Aktivitäten gegenüber E. coli [E. coli O157:H7 (von E. coli O157:H7 Patienten aus dem Amtsbezirk Okayama wurde mittels des oben beschriebenen Messverfahrens untersucht. Die Ergebnisse wind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7
Aus Tabelle 7 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) auf E. coli O157:H7 eine etwa 8 bis 14 mal größere antimikrobielle Aktivität hatte als die unsubstituierte Form (bekannt).
3-1-3 Antimikrobielle Aktivität auf verschiedene gram-negative und gram-positive Bakterien (1)
Polymyxin B (ein bekannter antimikrobiell wirkender Wirkstoff), A1, das erfindungsgemäße Peptid (b), A3, das erfindungsgemäße Peptid (d), (jeweils in einer Konzentration von 20 μg/mL) wurden als Proben verwendet und die Kolonie bildenden Einheiten (CFU) eines gram-negativen Bakteriums E. coli O157:H7 oder Klebsiella) und eines gram-positiven Bakteriums (methicillin-restistener Staphylococcus aureus; MRSA)) wurden mittels des oben beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität bestimmt. Unter Setzen der CFU ohne Zugabe einer Probe (Konzentration 0 μg/mL) auf 100 % wurde ein relativer CFU-Wert erhalten und der Wert von 100 % minus dem relativen CFU-Wert wurde berechnet und als Wert für die antimikrobielle Aktivität definiert. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
In 5 bedeutet das Symbol * einen wesentlichen Unterschied bei p < 0,05 für Ergebnisse, die unter Verwendung von PBS anstelle einer Probe (Peptid) erhalten wurden.
5 zeigt, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) eine signifikant größere antimikrobielle Aktivität hatte als die unsubstituierte Form (bekannt) und die antimikrobielle Aktivität sowohl auf gram-negative wie auf gram-positive Bakterien ausübt. Sie zeigt auch dass die erfindungsgemäßen Peptide (b) und (d) insbesondere auf gramnegative Bakterien eine ausgeprägte antimikrobielle Aktivität ausüben.
3-1-4 Antimikrobielle Aktivität auf verschiedene gram-negative und gram-positive Bakterien (2)
A7, das erfindungsgemäße Peptid (e) und das erfindungsgemäße Peptid (f) (jeweils in einer Konzentration von 20 μg/mL) wurden als Proben verwendet und die Kolonie bildenden Einheiten (CFU) eines gram-negativen Bakteriums (E. coli O157:H7 oder Salmonella typhimurium) und eines gram-positiven Bakteriums (methicillin-restistener Staphylococcus aureus; (MRSA) oder methicillin-sensibler Staphylococcus aureus; (MSSA)) wurde mittels des oben beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität bestimmt. Unter Setzen der CFU ohne Zugabe einer Probe (Konzentration 0 μg/mL) auf 100 % wurde ein relativer CFU-Wert erhalten und der Wert von 100 % minus dem relativen CFU-Wert wurde berechnet und als Wert für die antimikrobielle Aktivität definiert. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
6 zeigt, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) eine signifikant größere antimikrobielle Aktivität hat als die unsubstituierte Form (bekannt) hat und dass die erfindungsgemäßen Peptide (e) und (f) eine ausgeprägte antimikrobielle Aktivität sowohl auf gram-negative wie auf gram-positive Bakterien ausüben.
Es wurden auch unterschiedliche Konzentrationen von A7, des erfindungsgemäßen Peptids (e) und des erfindungsgemäßen Peptids (f) wurden als Proben verwendet und die Kolonie bildenden Einheiten (CFU) wurden gezählt. 7 zeigt die Ergebnisse bei gram-negativen Bakterien und 8 zeigt die Ergebnisse gram-positiven Bakterien. In den 7 und 8 bezeichnet die horizontale Achse die Konzentration einer Probe und die vertikale Achse bezeichnet einen relativen CFU-Wert, der unter Verwendung des CFU-Wertes erhalten wurde, bei dem PBS (Konzentration einer Probe: 0 μg/mL) statt einer Probe (Peptid) als 100-Wert verwendet wurde.
Die 7 und 8 zeigen, dass die antimikrobielle Aktivität des erfindungsgemäßen Peptids (substituierte Form) von der Dosierung abhängig ist und das erfindungsgemäße Peptid eine größere antimikrobielle Aktivität als die unsubstituierte Form (bekannt) hat.
Basierend auf den in den 7 und 8 dargestellten Ergebnissen wurde die antimikrobielle Aktivität (IC₅₀) der Proben (A7, des erfindungsgemäßen Peptids (e) und des erfindungsgemäßen Peptids (f)) erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8
Aus Tabelle 8 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) eine etwa mindestens 3 bis 25 mal größere antimikrobielle Aktivität sowohl auf gram-negative wie auf gram-positive Bakterien hatte als die unsubstituierte Form (bekannt).
3-2. LPS-neutralisierende Aktivität (Aktivität bezüglich der Unterdrückung der Sterblichkeit)
Verfahren zur Messung der LPS-neutralisierenden Aktivität: Jeder Maus wurden 20 μg oder 40 μg einer Probe (Peptid), 0,1 μg LPS und 25 mg Galactosamin intraperitoeal injiziert. Es wurde beobachtet, ob die Mäuse überlebten (30 Tage lang) und die Überlebensrate (%) wurde bestimmt.
3-2-1. LPS-neutralisierende Aktivität (1)
Unter Verwendung von A1, dem erfindungsgemäßen Peptid (b), A3 und dem erfindungsgemäßen Peptid (d) als Proben wurde die LPS-neutralisierende Aktivität mittels des oben beschriebenen Messverfahrens untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgeführt. Die Anzahl an Mäusen ist ebenfalls in Tabelle 9 aufgeführt. Tabelle 9
In der obigen Tabelle bedeutet das Symbol * einen wesentlichen Unterschied bei p < 0,01 (X² – Test) zu den Ergebnissen im Falle der Verabreichung von LPS und Galactosamin alleine.
Aus Tabelle 9 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) eine etwa 8 mal oder darüber größere LPS-neutralisierende Aktivität hatte als die unsubstituierte Form (bekannt) und die von LPS verursachte Sterblichkeit unterdrückte..
3-2-2. LPS-neutralisierende Aktivität (2)
Unter Verwendung von A1, dem erfindungsgemäßen Peptid (b) und dem erfindungsgemäßen Peptid (c) als Proben wurde die LPS-neutralisierende Aktivität mittels des oben beschriebenen Messverfahrens untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt. Die Anzahl an Mäusen ist ebenfalls in Tabelle 10 aufgeführt. Tabelle 10
In der obigen Tabelle bedeutet das Symbol * einen wesentlichen Unterschied bei p < 0,01 (X² – Test) zu den Ergebnissen im Falle der Verabreichung von LPS und Galactosamin alleine.
Aus Tabelle 10 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (substituierte Form) eine etwa 4 bis 8 mal größere LPS-neutraliserende Aktivität hatte als die unsubstituierte Form (bekannt) und die von LPS verursachte Sterblichkeit unterdrückte.
Bei den oben beschriebenen Tests der LPS-neutralisierenden Aktivität (1) und (2) wurde bei den Mäusen kein anderes Symptom beobachtet, als die gewöhnlich nach der Verabreichung von LPS beobachteten. Daher ist anzunehmen, dass das erfindungsgemäße Peptid keine akute Toxizität hat.
3-2-3. LPS-neutralisierende Aktivität modifizierter Peptide
Unter Verwendung von Peptiden mit einem acetylierten N-Ende und einem amidierten C-Ende (A7, das erfindungsgemäße Peptid (e) und das erfindungsgemäße Peptid (f)) als Proben wurden die LPS-neutralisierenden Aktivitäten mittels des oben beschriebenen Messverfahrens untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgeführt. Die Anzahl an Mäusen ist ebenfalls in Tabelle 11 aufgeführt. Tabelle 11
In der obigen Tabelle bedeutet das Symbol einen wesentlichen Unterschied bei p < 0,001 (X² – Test) zu den Ergebnissen im Falle der Verabreichung von LPS und Galactosamin alleine.
Aus Tabelle 11 wird ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Peptid (f) (substituierte Form) eine etwa 2 bis 3 mal größere LPS-neutralisierende Aktivität hatte als die unsubstituierte Form (bekannt) und die von LPS verursachte Sterblichkeit unterdrückte. Die Aktivität wurde durch die Modifikation des Peptids nicht beeinflusst.
<4> Test zur Entfernung von Endotoxin
Ein endotoxin-freier Träger (Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia) (100 mL) wurde in ein Glasfilter überführt (#2) und mit zwei Litern destilliertem, injektionsreinen Wasser unter Saugen gewaschen und dann in ein 1-Liter Becherglas überführt und es wurden 200 mL destilliertes, injektionsreines Wasser zum Becherglas zugegeben. Unter Rühren mit einem Magnetrührer wurde das Gemisch mit 10 M NaOH auf pH 11 bis 12 eingestellt und es wurde eine Lösung von 25 g Cyanbromid (CNBr) in 500 mL destilliertem, injektionsreinem Wasser portionsweise zugegeben, bis keine pH-Wert-Änderung mehr erfolgte und die Reaktion gestoppt. Der CNBr-aktivierte Träger wurde durch ein Glasfilter filtriert und nacheinander mit zwei Litern kaltem Wasser und einem Liter 0,1 M NaHCO3 gewaschen. Zu 10 mL des erhaltenen CNBr-aktivierten Trägers wurde eine gefriergetrocknete Zubereitung des erfindungsgemäßen Peptids (b) zu einer Konzentration von 0,2 mg/mL gegeben und das Gemisch wurde bei 4 °C 24 Stunden lang unter Rühren mit einem Rührstab behandelt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Reaktionsgemisch in 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) fünf Stunden stehen gelassen, um die verbleibenden Verunreinigungen (Imidocarbonate) zu deaktivieren.
Zu 1,0 g des so erhaltenen erfindungsgemäßen immobilisierten Trägers (Träger, auf dem das erfindungsgemäße Peptid immobilisiert worden ist), wurden 5 mL Endotoxin enthaltende Lösung gegeben (0,1, 1,0, 10 oder 100 ng/mL) und weitere 30 Minuten unter Verwendung einer Schütteleinrichtung gerührt. Nach der Behandlung wurde der erfindungsgemäße immobilisierte Träger mittels Zentrifugieren abgesetzt und der Überstand gewonnen. Zu 50 μL des Überstandes wurden 50 μL eines Endotoxin spezifischen synthetischen Substratreaktanden (Endospecy ES-50 M, hergestellt von Seikagaku Corp.) gegeben und die Konzentration des Endotoxins in der Lösung wurde gemessen. Es wurde der Wert „(Endotoxinkonzentration vor der Behandlung – Endotoxinkonzentration nach der Behandlung)/ Endotoxinkonzentration vor der Behandlung × 100" berechnet und als Rate der Endotoxinentfernung (%) definiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 12
Aus Tabelle 12 wird ersichtlich, dass die Behandlung der Endotoxin enthaltenden Lösung mit dem Träger, auf dem das erfindungsgemäße Peptid immobilisiert worden ist, das Endotoxine in der Lösung sehr gut entfernt hat.
Beispiel 2

Im Folgenden werden Formulierungsbeispiele des erfindungsgemäßen antimikrobiell wirkenden Arzneimittels, des erfindungsgemäßen Wirkstoffs zur Behandlung bakterieller Infektionen und des erfindungsgemäßen Mittels zum Unterdrücken von Endotoxinschocks beschrieben. Diese sind jedoch lediglich Beispiele und die Form der respektiven erfindungsgemäßen Wirkstoffe sollte nicht als auf diese beschränkt gesehen werden. (1) Erfindungsgemäßes antimikrobiell wirkendes Arzneimittel (Salbe)

Erfindungsgemäßes Peptid (d)	10 mg
Sorbitan-Monostearat	7 mg
Polyoxiethylensorbitan-Monostearat	7 mg
Isopropylpalmitat	37 mg
Vaseline	37 mg
Flüssiges Paraffin	37 mg
Cetanol	50 mg
Glycerin	70 mg
Magnesiumstearat	2 mg

Zu den oben beschriebenen Bestandteilen wurde gereinigtes Wasser gegeben, so dass 1 g Creme erhalten wurde. (2) Erfindungsgemäßes antimikrobiell wirkendes Arzneimittel (Tablette)

Erfindungsgemäßes Peptid (c) 100 mg

Lactose 670 mg

Kartoffelstärke 150 mg

kristallisierte Cellulose 60 mg

Leiches Kieselsäureanhydrid 50 mg
Die oben beschriebenen Bestandteile wurden vermischt und nach dem Kneten unter Zusatz einer Lösung von 30 mg Hydroxipropylcellulose in Methanol (10 Gew.-% Hydroxipropylcellulose) wurde das Gemisch granuliert. Es wurde durch eine Blende mit 0,8 mm Durchmesser extrudiert, um Körnchen zu bilden. Nach dem Trocknen wurden 15 mg Magnesiumstearat zugegeben und das Gemisch wurde in 200 mg Portionen tablettiert, so dass Tabletten erhalten wurden. (3) Erfindungsgemäßer Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen (Kapseln)

Erfindungsgemäßes Peptid (d) 100 mg

Lactose 80 mg
Die oben beschriebenen Bestandteile wurden einheitlich vermischt und in harte Kapseln gefüllt, so dass Kapseln erhalten wurden. (4) Erfindungsgemäßer Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen (Injektion)

Erfindungsgemäßes Peptid(e) 30 mg
Der oben beschriebene Bestandteil wurde in 2 mL 5% wässriger Mannitol-Lösung gelöst und die Lösung wurde filtersterilisiert und dann in eine Ampulle gefüllt und eingeschweißt. (5) Erfindungsgemäßes Mittel zum Unterdrücken von Endotoxinschocks (Injizierbarer Feststoff, der zur Verwendung gelöst werden muss)

(A) Erfindungsgemäßes Peptid (f), gefriergetrocknet 30 mg (in einer Ampulle eingeschweißt)

(B) Filtersterilisiertes PSB 2 mL (in einer Ampulle eingeschweißt)
Ein injizierbarer Feststoff, der zur Verwendung gelöst werden muss, wurde als ein Set der oben beschriebenen (A) und (B) zur Verfügung gestellt. Zum Gebrauch wird (A) in (B) gelöst. Sequenzauflistung

Claims

Peptid, das aus irgendeiner der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (f) besteht: (a) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 2); (b) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 3); (c) Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 4); (d) Glu Lys Ile Gly Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 5) (e) Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val (SEQ ID Nr. 6), und (f) Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Lys Leu Val (SEQ ID Nr. 7).
Antimikrobiell wirkender Wirkstoff, der das in Anspruch 1 definierte Peptid als einen aktiven Wirkstoff enthält.
Medizinische Zusammensetzung, die das in Anspruch 1 definierte Peptid als einen aktiven Wirkstoff enthält.
Medizinische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, die ein Wirkstoff zur Behandlung bakterieller Infektionen ist.
Medizinische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, die ein Mittel zum Unterdrücken eines Endotoxinschocks ist.
Wirkstoff zum Entfernen von Endotoxin, der das in 1 definierte Peptid auf einem unlöslichen Träger immobilisiert umfasst.
Zusammensetzung, die das in Anspruch 1 definierte Peptid und einen Träger umfasst.