CN112110984B - 多肽的制备方法 - Google Patents
多肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112110984B CN112110984B CN202011033408.0A CN202011033408A CN112110984B CN 112110984 B CN112110984 B CN 112110984B CN 202011033408 A CN202011033408 A CN 202011033408A CN 112110984 B CN112110984 B CN 112110984B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- peptide
- preparation
- palmitoyl tetrapeptide
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及多肽合成领域,特别涉及多肽的制备方法。本发明提供的多肽的制备方法包括以下步骤:选择rink amide resin作为起始树脂;按照Fmoc固相多肽合成策略,依次偶联多个Fmoc‑Lys(Boc)‑OH及对氨基苯甲酸;再按照棕榈酰四肽‑7的肽链顺序合成完毕;用TFA将肽链从树脂上裂解下来,反向制备纯化,得到高纯度含有可溶性肽片段的棕榈酰四肽‑7;将肽片段溶解于水中,加入碱将水溶性片段脱除,从而得到高纯度的棕榈酰四肽‑7。本发明的突出优势在于将原来由于难溶解而不易纯化的肽片段通过连接临时性水溶性片段而整体提高肽链的水溶性,从而使纯化制备更高效简便,也使高纯度棕榈酰四肽‑7制备成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域,特别涉及多肽的制备方法。
背景技术
棕榈酰四肽-7(PalmitoylTetrapeptide-7)又称为棕榈酰四肽-3,是一种由四个氨基酸构成的合成胜肽,其氨基酸序列为Pal-Gly-Gln-Pro-Arg,缩写为Pal-GQPR,属于信号类胜肽中棕榈酰寡肽系列多肽中的一种。其用于美容产品和化妆品中抑制过量细胞白介素(interleukins)的生成。这种化学信使会触发身体的急性炎症反应,导致糖基化损伤,即导致葡萄糖和蛋白质交联和结合过程损伤,使组织硬化。对皮肤的支撑系统,如胶原蛋白、弹性蛋白和其他蛋白质造成负面影响,从而形成皱纹、松弛和肤色不均匀。
Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH 式I
目前,棕榈酰四肽-7主要采用的固相合成方法进行制备。李乾,张忠旗等人以二氯树脂为原料,进行逐个Fmoc-保护基保护的氨基酸缩合反应,合成了棕榈酰四肽-7。CN109748948B提供了一种棕榈酰四肽-7的纯化方法,使用聚苯乙烯二乙烯基苯基质的填料可同时作为棕榈酰四肽-7纯化和转盐步骤的固定相,减少了设备投入,可明显降低生产成本,纯度高且收率好,可以实现工业化生产的需求。
但是棕榈酰四肽-7由于含有棕榈酰基(Pal)以及多个疏水性氨基酸,造成其水溶性极差。而多肽在固相合成以后,往往需要采用反向色谱进行制备纯化,才能达到较高的纯度指标。而由于棕榈酰四肽-7水溶性差,造成在反向纯化过程中极易析出或者由于溶解性差,上样浓度低,造成纯化效果差,纯度往往很难提高,这也是CN109748948B专利中上样量很小的原因。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了多肽的制备方法,解决棕榈酰四肽-7由于溶解性差而不易得到高纯度产品的问题。本发明通过在棕榈酰四肽-7上临时增加一个亲水性片段,提高其水溶性,易于纯化分离。然后再将片段脱除,从而得到高纯度的棕榈酰四肽-7。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了多肽的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:偶联多个亲水性的氨基酸,获得可溶性肽片段;
步骤2:基于所述可溶性肽片段,按照所述多肽的序列依次偶联其余氨基酸,获得含可溶性肽片段的多肽树脂;
步骤3:裂解脱除所述多肽树脂得到粗肽,纯化得到精肽;
步骤4:取所述精肽在碱溶液中水解,获得所述多肽。
在本发明的一些具体实施方案中,所述亲水性的氨基酸包括非电离极性侧链氨基酸、酸性侧链氨基酸或碱性侧链氨基酸中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中,所述非电离极性侧链氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或多种;所述酸性侧链氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸中的一种或多种;所述碱性侧链氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或两种。
在本发明的一些具体实施方案中,所述多肽为难溶性多肽,所述多肽包括棕榈酰四肽-7。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤1所述所述亲水性的氨基酸为赖氨酸,所述亲水性的氨基酸的个数为3~6个。
在本发明的一些具体实施方案中,所述亲水性的氨基酸的个数为5个。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤2中所述可溶性肽片段与连接臂对羟基苯甲酸连接后,按照所述多肽的序列依次偶联其余氨基酸,获得含可溶性肽片段的多肽树脂。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤2中所述偶联的条件为:常压、0~35℃偶联1~3小时。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤3所述裂解采用的裂解剂包括TFA、间甲酚、苯甲硫醚和水,TFA:间甲酚:苯甲硫醚:水的体积比为92.5:2.5:2.5:2.5。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤4中所述碱为NaOH,所述碱溶液的浓度为0.1N。
本发明提供的多肽的制备方法包括以下步骤:选择rink amide resin作为起始树脂;按照Fmoc固相多肽合成策略,依次偶联多个Fmoc-Lys(Boc)-OH及对氨基苯甲酸;再按照棕榈酰四肽-7的肽链顺序合成完毕;用TFA将肽链从树脂上裂解下来,反向制备纯化,得到高纯度含有可溶性肽片段的棕榈酰四肽-7;将肽片段溶解于水中,加入碱将水溶性片段脱除,从而得到高纯度的棕榈酰四肽-7。本发明的突出优势在于将原来由于难溶解而不易纯化的肽片段通过连接临时性水溶性片段而整体提高肽链的水溶性,从而使纯化制备更高效简便,也使高纯度棕榈酰四肽-7制备成为可能。
基于上述研究,本发明由于解决了纯化问题,制备规模可以提高,同时最终产品不需要通过冻干的方式进行制备,也有效的降低了生产的能耗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2的HPLC谱图;
图2示实施例3的HPLC谱图;
图3示实施例4的HPLC谱图。
具体实施方式
本发明公开了多肽的制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明的合成路线为首先在氨基树脂上连续偶联多个亲水性的赖氨酸,然后接上一个连接臂对羟基苯甲酸,接着按照棕榈酰四肽-7的肽序偶联剩余氨基酸,得到含可溶性肽片段的棕榈酰四肽-7肽树脂;随后裂解脱除树脂得到粗肽,纯化得到精肽;最后含可溶性肽片段的精肽在碱溶液中水解为目标肽棕榈酰四肽-7。
本发明提供的制备棕榈酰四肽-7的方法包括以下步骤:
1、选择rink amide resin作为起始树脂;
2、按照Fmoc固相多肽合成策略,依次偶联多个Fmoc-Lys(Boc)-OH及对羟基苯甲酸;再按照棕榈酰四肽-7的肽链顺序合成完毕
3、用TFA将肽链从树脂上裂解下来,反向制备纯化,得到高纯度含有可溶性肽片段的棕榈酰四肽-7;
4、将肽片段溶解于水中,加入碱将水溶性片段脱除,从而得到高纯度的棕榈酰四肽-7
步骤2)中所述的肽亲水片段由多个赖氨酸及1个对羟基苯甲酸组成,其中氨基酸的个数为3~6个,其中优选5个
步骤2)每种氨基酸及对羟基苯甲酸进行偶联反应的时间通常为1-3小时,优选2小时;压力优选为常压,也可在适当提高或降低的压力下进行;温度优选为室温(即20±5℃),也可在适当提高或降低的温度(0~35℃)下进行。
步骤3)中裂解液的比例为TFA:间甲酚:苯甲硫醚:水=92.5:2.5:2.5:2.5。
步骤4)中所述的碱为NaOH,其浓度为0.1N。
本发明的关键思路是利用了一种可溶性的片段提高棕榈酰四肽-7的水溶性,从而易于纯化,实现棕榈酰四肽-7的高纯度制备,而且这种思路可扩展到其他难溶性片段的合成。其中可溶性片段有以下特点:1.片段由一定数量的赖氨酸及1个对羟基苯甲酸组成;2.赖氨酸个数为3~6个。也可以采用与Lys具有类似功能的氨基酸或其他能提高肽亲水性的片段。片段脱除的特征:采用的脱除试剂是NaOH,浓度为0.1N。
缩写及英文含义
表1
本发明提供的多肽的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1含有可溶性肽片段树脂的合成
用250g替代度为0.5mmol/g的RinkAmide Resin为起始载体,脱除Fmoc后依次偶联5个赖氨酸(每次偶联赖氨酸的投料量为5eq),然后偶联对羟基苯甲酸(投料量为5eq),最后按照棕榈酰四肽-7的肽序(Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH)进行顺序偶联氨基酸。偶联第一个赖氨酸时,溶剂选用二氯甲烷、偶联剂为DIC、DMAP。偶联其他氨基酸残基时均采用HOBt/DIC为偶联剂、DMF为溶剂;脱Fmoc保护基时都采用20%哌啶/DMF溶液,共脱两次(5min+7min)。偶联结束后,甲醇收缩,氮气吹干,得肽树脂407.5g。
实施例2含可溶性肽片段的粗肽的制备
将407.5g肽树脂加入4000mL裂解液(TFA:间甲酚:苯甲硫醚:水=92.5:2.5:2.5:2.5)中,常温反应2小时。反应结束后,倒入到40L甲基叔丁基醚溶液中,离心,氮气吹干,得粗肽187.7,纯度92.7%,如图1所示。
实施例3含可溶性肽片段的精肽的制备
取含可溶性肽片段的粗肽187.7g,进行HPLC纯化制备,冻干,得精肽153.6g,纯度99.22%,如图2所示。
实施例4棕榈酰四肽-7的制备
取含可溶性肽片段的精肽153.6g,加入0.1N的NaOH溶液2L,反应20小时,溶液中有白色固体沉淀析出,过滤,干燥,得棕榈酰四肽-7固体68.7g。总收率为79.2%,纯度为99.66%,如图3所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.多肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:偶联多个亲水性的氨基酸,获得可溶性肽片段;所述亲水性的氨基酸为赖氨酸;
步骤2:将所述可溶性肽片段与连接臂对羟基苯甲酸连接后,按照所述多肽的序列依次偶联其余氨基酸,获得含可溶性肽片段的多肽树脂;
步骤3:裂解脱除所述多肽树脂得到粗肽,纯化得到精肽;
步骤4:取所述精肽在碱溶液中水解,获得所述多肽;
所述多肽为难溶性多肽,所述多肽包括棕榈酰四肽-7;
步骤3所述裂解采用的裂解剂包括TFA、间甲酚、苯甲硫醚和水,TFA: 间甲酚:苯甲硫醚:水的体积比为92.5:2.5:2.5:2.5;
步骤4中所述碱为NaOH,所述碱溶液的浓度为0.1N;
步骤1所述亲水性的氨基酸的个数为3~6个。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤2中所述偶联的条件为:常压、0~35℃偶联1~3小时。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011033408.0A CN112110984B (zh) | 2020-09-27 | 2020-09-27 | 多肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011033408.0A CN112110984B (zh) | 2020-09-27 | 2020-09-27 | 多肽的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112110984A CN112110984A (zh) | 2020-12-22 |
CN112110984B true CN112110984B (zh) | 2022-06-14 |
Family
ID=73797040
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011033408.0A Active CN112110984B (zh) | 2020-09-27 | 2020-09-27 | 多肽的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112110984B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114874289A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-08-09 | 湖北泓肽生物科技有限公司 | Pal-gqpr的液相合成方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11335396A (ja) * | 1998-03-25 | 1999-12-07 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 新規抗菌性ペプチド |
CN105001298A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-10-28 | 南京斯拜科生化实业有限公司 | 一种难溶多肽的合成-分离纯化方法 |
CN105601718A (zh) * | 2016-01-30 | 2016-05-25 | 济南康和医药科技有限公司 | 一种布美诺肽的固相合成方法 |
CN106589111A (zh) * | 2015-10-16 | 2017-04-26 | 江苏开元医药化工有限公司 | 一种布雷默浪丹的合成方法 |
CN107308020A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-11-03 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种稳定的多肽组合物及其应用 |
-
2020
- 2020-09-27 CN CN202011033408.0A patent/CN112110984B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11335396A (ja) * | 1998-03-25 | 1999-12-07 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 新規抗菌性ペプチド |
CN105001298A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-10-28 | 南京斯拜科生化实业有限公司 | 一种难溶多肽的合成-分离纯化方法 |
CN106589111A (zh) * | 2015-10-16 | 2017-04-26 | 江苏开元医药化工有限公司 | 一种布雷默浪丹的合成方法 |
CN105601718A (zh) * | 2016-01-30 | 2016-05-25 | 济南康和医药科技有限公司 | 一种布美诺肽的固相合成方法 |
CN107308020A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-11-03 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种稳定的多肽组合物及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
棕榈酰四肽-7的固相合成;李乾等;《生物化工》;20181231;第4卷(第01期);第58-60页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112110984A (zh) | 2020-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2873677B1 (en) | Method of producing self-assembling peptide derivative | |
EP3505533A1 (en) | Synthesis method for low-racemization impurity liraglutide | |
KR100634664B1 (ko) | 당사슬 아스파라긴을 갖는 당펩티드의 제조법 및 그당펩티드 | |
JP2001500134A (ja) | 改良型固相ペプチド合成及びかかる合成において利用するための試薬 | |
CN113880935B (zh) | 一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法、一种索马鲁肽制备方法 | |
CN112110984B (zh) | 多肽的制备方法 | |
TWI353989B (zh) | ||
CN110903352A (zh) | 一种西曲瑞克的制备方法 | |
KR20210102362A (ko) | 플레카나타이드의 개선된 제조 방법 | |
CN112585153A (zh) | 一种化合物或其盐及其制备方法与应用 | |
CN112409458A (zh) | 一种卡贝缩宫素的制备方法 | |
CN110642936B (zh) | 一种制备特立帕肽的方法 | |
CN110950933A (zh) | 一种布美诺肽的固液相合成方法 | |
WO2021026800A1 (zh) | 醋酸地加瑞克的合成方法 | |
WO2021103458A1 (zh) | 一种地加瑞克的固相合成方法 | |
WO2006105199A2 (en) | Compositions and methods for synthesis of peptide and related conjugate | |
CN109988062B (zh) | 一种液相球形载体及其制备方法和应用 | |
CN114230653A (zh) | 一种氯毒素的制备方法 | |
CN114478708A (zh) | 一种加尼瑞克的片段固相合成方法 | |
CN112321699A (zh) | 一种司美格鲁肽的合成方法 | |
WO2021007703A1 (en) | A method for preparing liraglutide via a solid phase peptide synthesis | |
WO2017092689A1 (en) | Method for preparation of rada-16 | |
CN101712716A (zh) | 一种制备伐普肽的方法 | |
CN113801199A (zh) | 一种卡贝缩宫素的全固相合成方法 | |
CN116947966B (zh) | 一种伊特卡肽中间体及伊特卡肽的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: 518000 floor 3, building 2, Shenzhen biological incubation base, No. 10, Gaoxin Zhongyi Road, Maling community, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong Applicant after: SHENZHEN READLINE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: Room 101, 1 / F, building 2, Shenzhen biological incubation base, No. 10, Gaoxin Zhongyi Road, Maling community, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen City, Guangdong Province Applicant before: SHENZHEN READLINE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
CB02 | Change of applicant information | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |