DE19504776A1 - Neues Protein mit thrombinhemmender Wirkung aus der Raubwanze Dipetalogaster maximus - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein mit thrombinhemmender Wirkung aus der Raubwanze Dipetalogaster maximus (UHLER 1894) sowie Verfahren zu dessen Isolierung.

Proteine mit blutgerinnungshemmender Wirkung aus hämatophagen Tieren, zu denen die Raub­ wanze D. maximus zählt, sind seit langem bekannt (Übersichten: MARKWARDT, F., Blutgerin­ nungshemmende Wirkstoffe aus blutsaugenden Tieren, Fischer, Jena 1963; MARKWARDT, F. und LANDMANN, H., in Handbuch der experimentellen Pharmakologie, 27, 76-142, Springer, Berlin, Heidelberg, New York 1971; Bang, N.U. und Clayman, M.D. Trends Cardiovasc Med (1992), 2, 183-188; MARKWARDT, F., Thromb Haemostas (1994), 72, 477-480). Am besten untersucht ist der Blutgerinnungshemmstoff aus dem medizinischen Blutegel, Hirudo medicinalis, der als spezifi­ scher Thrombinhemmstoff charakterisiert wurde und als gentechnisch zugängliches r-Hirudin zur Therapie thromboembolischer Erkrankungen eingesetzt wird (Übersicht: MARKWARDT, F., Thromb Res (1994), 74, 1-23). Ein früher beschriebener Thrombinhemmstoff aus der Raubwanze Rhodnius prolixus (MARKWARDT, F. und SCHULZ, E., Naturwissenschaften (1959) 46, 43) wurde in neuerer Zeit isoliert, in seiner Aminosäuresequenz aufgeklärt, kloniert und in Escherichia coli rekombinant hergestellt (Deutsche Offenlegungsschrift DE 41 36 513 A1; FRIEDRICH, T. et al, J. Biol. Chem. (1993), 268, 16 216-16 222).

Vorteile und Nachteile der verschiedenen tierischen blutgerinnungshemmenden Proteine, die in unterschiedlicher Weise in das System der Blutgerinnung eingreifen, lassen sich im Hinblick auf ihre Anwendung zur Diagnostik, Prophylaxe und Therapie thromboembolischer Erkrankungen heute noch nicht übersehen. Die Gewinnung weiterer Stoffe dieser Art und die Aufklärung ihrer Eigenschaften ist daher nützlich.

Die Erfindung betrifft einen neuen Thrombinhemmstoff aus einer von R. prolixus taxonomisch weit entfernten Gruppe der Raubwanzen (Reduviidae).

Das neue Protein kann aus Larven und Imagines von Individuen der Species D. maximus isoliert werden. Vorzugsweise werden die Tiere hierzu zur Aufnahme von physiologischer Kochsalzlösung gebracht. Der Stoff befindet sich dann in bereits angereicherter Form im Darminhalt, der durch Punktion gewonnen wird. Aus einem Tier lassen sich Punktatvolumina bis zu 1,5 ml gewinnen. Dieses Punktat ist dadurch charakterisiert, daß es ca. 600 NIH-Einheiten Thrombin je ml hemmt.

Ein erstes Verfahren zur Anreicherung des Zielwirkstoffes beinhaltet die Abtrennung von Verun­ reinigungen mittels Trichloressigsäurefällung und die nachfolgende Präzipitation des Wirkstoffes aus dem klaren Überstand mit Aceton, wobei ein Trockenpräparat mit einer spezifischen Aktivität von 500 bis 1000 Antithrombin-Einheiten/mg gewonnen wird. Nach Solubilisierung in Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (Tris-Puffer) erfolgt die weitere Reinigung durch Ionen­ austauschchromatographie. Die fraktionierte Elution der gebundenen Komponenten erfolgt dabei nach Anlegen eines ansteigenden Kochsalz-Gradienten.

Das oben angegebene Aufarbeitungsverfahren ist besonders effizient, wenn die erste Fällung bei einer Trichloressigsäurekonzentration von 1 bis 5% ,vorzugsweise 2%, ausgeführt wird und die Präzipitation des Wirkstoffes mit dem 5- bis 20-fachen Volumen, vorzugsweise dem 10-fachen Volumen, des Überstandes an Aceton erfolgt. Die nachfolgende Chromatographie läßt sich beson­ ders vorteilhaft ausführen, wenn das Acetonpräzipitat in einem Puffer mit Tris-Konzentrationen von 10 bis 100 mM und einem pH-Wert zwischen 7,5 und 9,0 - vorzugsweise 8,0 - gelöst und unter gleichen Bedingungen auf den Ionenaustauscher aufgeladen wird und wenn die NaCl-Konzentra­ tion im Elutionsschritt 350 bis 1000 mM, vorzugsweise 400 bis 600 mM, beträgt.

Der oben beschriebene Aufarbeitungsprozeß erlaubt in besonders kurzer Zeit eine technisch wenig anspruchsvolle und dabei effektive Anreicherung des Zielwirkstoffes in Form eines lagerungsfähi­ gen Trockenpräparates. Die beschriebene Verfahrensweise gestattet eine besonders einfache Maß­ stabserweiterung, vor allem im ersten Verfahrensschritt.

Alternativ dazu wird auf einem zweiten Verfahrensweg eine direkte Aufarbeitung des Punktates ausschließlich mittels chromatographischer Verfahren durchgeführt. Dazu wird das Punktat mit Tris-Puffer verdünnt und auf einen Anionenaustauscher aufgeladen. Die Ablösung der gebundenen Komponenten erfolgt durch Anlegen eines linearen Kochsalzgradienten. Nach einem Entsalzungs­ schritt durch Ultrafiltration ergibt Rechromatographie an einem Ionenaustauscher ein Produkt, dessen Homogenität eine eindeutige Charakterisierung des Wirkstoffes gestattet. Die Anreicherung der Aktivität wird mittels Bestimmung der Thrombinhemmung in Gerinnungstests verfolgt.

Dieser zweite Aufarbeitungsprozeß verläuft besonders effektiv, wenn zum Verdünnen des Punkta­ tes das 2- bis 5-fache Volumen eines 10 bis 100 mM Tris-Puffers mit einem pH-Wert zwischen 7,5 und 9,0 verwendet wird und im ersten Elutionsschritt die NaCl-Konzentration zwischen 350 und 1000 mM, vorzugsweise 400 bis 600 mM, beträgt. Die Ultrafiltration verläuft besonders schnell und schonend, wenn die Ausschlußgrenze der verwendeten Membranen 3000 D bis 10 000 D be­ trägt. Die Rechromatographie ergibt in 10 bis 100 mM Tris-Puffer bei pH-Werten zwischen 7,5 und 9,0 und einer NaCl-Konzentration im Elutionspuffer von 350 bis 1000 mM besonders effiziente Anreicherungen des Zielproteins.

Der zuvor beschriebene Aufarbeitungsprozeß auf ausschließlich chromatographischem Wege er­ laubt eine besonders schonende Anreicherung des Zielproteins, da keine Schritte enthalten sind, die zu einer Denaturierung und einem damit verbundenem Aktivitätsverlust führen können. Die be­ schriebene Verfahrensweise gestattet eine einfache Maßstabserweiterung.

Um das neue Protein bezüglich seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften zu charakterisieren, werden die wirkstoffhaltigen Fraktionen, die aus dem jeweils finalen Ionenaustauschchromatogra­ phieschritt resultieren, einer Gelfiltration unterworfen. Dabei wird in Bezug auf Referenzproteine ein mittleres Molekulargewicht von 35 kD bestimmt. Des weiteren wird in der Polyacrylamidgel­ elektrophorese in SDS-haltigen Puffern (SDS-PAGE) das relative Molekulargewicht des Wirkstof­ fes in Bezug auf das von Referenzproteinen zu 15,3 kD bestimmt. Das so charakterisierte Molekül bindet spezifisch und irreversibel an immobiliisertes Thrombin und hemmt dieses Enzym in Aktivi­ tätstests in vitro.

Aliquote der aus der finalen Ionenaustauschchromatographie resultierenden wirkstoffhaltigen Frak­ tionen werden zum Zwecke der Abtrennung niedermolekularer Verunreinigungen, Entsalzung und Konzentrierung einer Umkehrphasenchromatographie unterzogen. Nach Entfernung des Lösungs­ mittels aus der Umkehrphasenchromatographie wird der Rückstand in wasserfreier Trifluoressig­ säure aufgenommen und nach Bindung an eine Glasfasermembran der automatisierten Bestimmung der Aminosäureabfolge zugeführt. Dabei wird die folgende N-terminale Aminosäuresequenz des auf die beschriebene Weise isolierten koagulationshemmenden Proteinfaktors ermittelt:

FQGNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNXPXM

wobei die an den Positionen 25 und 27 befindlichen, noch nicht eindeutig charakterisierten Reste mit X bezeichnet sind.

In den gemäß dem obigen Verfahren bis zur Homogenität gereinigten und hinsichtlich der physika­ lisch-chemischen Eigenschaften des Proteins charakterisierten Proben werden mittels der Bradford- Methode die vorliegenden Proteinkonzentration festgestellt. Der hierbei ermittelte Wert ergibt in in vitro-Untersuchungen zur Thrombinhemmung eine spezifische Aktivität des erfindungsgemäßen neuartigen Proteinwirkstoffes von 200 000 ± 1500 Antithrombin-Einheiten pro mg Protein. Eine Antithrombin-Einheit ist dabei als diejenige Wirkstoffmenge charakterisiert, die eine NIH-Einheit Thrombin hemmt.

Das erfindungsgemäß isolierte und charakterisierte Protein ist aufgrund seiner Thrombininhibitor- Eigenschaften ein ausgezeichneter Wirkstoff zur Verwendung in pharmazeutischen Zusammen­ setzungen zur Prophylaxe und Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen und zum Ein­ satz bei der Entwicklung und Herstellung biokompatibler Implatatwerkstoffe. Insbesondere kom­ men für diesen Zweck solche pharmazeutischen Zusammensetzungen in Frage, in denen das erfin­ dungsgemäße Protein in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Ad­ juvantien und/oder Trägerstoffen enthalten ist. Vorzugsweise sind die Formulierungen für die pa­ renterale, in besonders bevorzugter Weise für die intravenöse Injektion vorgesehen. Darüber hinaus kann der Wirkstoff vorteilhaft in der Blutgerinnungsdiagnostik verwendet werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand einer detaillierten Beschreibung von bevorzugten Ausfüh­ rungsformen zur Isolation und Charakterisierung des erfindungsgemäßen Proteinwirkstoffes sowie anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Ablauf der Chromatographie des resolubilisierten Trockenpräparates an MonoQ. (Die aktivitätshaltigen Fraktionen sind schraffiert dargestellt).

Fig. 2 Chromatographie des Punktates von D. maximus an ResourceQ. (Die aktivitätshaltigen Fraktionen sind schraffiert dargestellt).

Fig. 3 Chromatographie der entsalzten aktivitätshaltigen Fraktionen aus dem ResourceQ- Schritt an MonoQ. (Die aktivitätshaltigen Fraktionen sind schraffiert dargestellt).

Fig. 4 Gel aus der SDS-PAGE zur Verdeutlichung der Produkthomogenität und -zusammen­ setzung nach ResourceQ- und nachfolgender MonoQ-Chromatographie.

Bahnen 1-5: Plasminpräparationen
Bahn 6: Staphylokinase Sak42D (MG 15600 D)
Bahn 7: Koagulationshemmender Wirkstoff aus D. maximus nach ResourceQ- und nachfolgender MonoQ-Chromatographie
Bahn 8: Molekulargewichtsstandard mit den Komponenten α-Lactalbumin (14400 D), Trypsininhibitor (20100 D), Carbonsäureanhydrase (30000 D), Ovalbumin (43000 D), Albuminabbauprodukt (58000 D), AIbumin (67000) und Phophorylase B (94000 D)
Fig. 5 Entsalzung und Homogenitätsprüfung der aktivitätshaltigen Fraktionen mittels Reverse- Phase-Chromatographie an Vydac RP-18. (Die aktivitätshaltigen Fraktionen sind schraffiert dargestellt).

Fig. 6 Gelfiltration der aktivitätshaltigen Fraktionen aus der MonoQ-Chromatographie des Trockenpräparates an TSK Gel 3000SW-XL. (Die aktivitätshaltigen Fraktionen sind schraffiert dargestellt).

Gemäß der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird in nachfolgend angegebenen Teil­ schritten vorgegangen:

Teilschritt A Gewinnung einer wirkstoffhaltigen Lösung (Punktat) aus Tieren der Spezies D. maximus

Individuen der Spezies D. maximus werden in einer geeigneten Versuchsanordnung, die eine Senk­ rechtstellung der Körperachse der Tiere ermöglicht, auf eine gequollene Silikonmembran aufge­ setzt, die über NaCl-Lösung ausgespannt ist. Die Gewinnung des wirkstoffhaltigen Darminhaltes erfolgt durch Punktierung mittels Spritzen, die mit Kanülen geeigneter Größe ausgestattet sind.

Teilschritt B1 Herstellung eines wirkstoffhaltigen Trockenpräparates aus dem Punktat von D. maximus

Zum Zweck der Abtrennung eines beträchtlichen Anteils von Beimengungen aus dem Punktat wird dieses mit einer wäßrigen Trichloressigsäurelösung versetzt. Die dabei als Niederschlag ausfallen­ den Bestandteile werden durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Der nach Versetzen des klaren Überstandes mit Aceton erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt und ergibt nach Trocknung das wirkstoffhaltige Trockenpräparat.

Teilschritt B2 Gewinnung einer wirkstoffhaltigen Rohlösung aus dem Punktat von D. maximus durch Ionenaustauschchromatographie

Das Punktat wird mit einem geeigneten Puffer verdünnt und auf einen Anionenaustauscher aufge­ bracht. Die Freisetzung des Wirkstoffes erfolgt durch Elution mit einem Kochsalzgradienten.

Teilschritt C Gewinnung einer Wirkstofflösung durch Anionenaustauschchromatographie der mit dem Wirkstoff angereicherten Rohpräparationen

Das wirkstoffhaltige Trockenpräparat aus Teilschritt B1 bzw. die zuvor entsalzte wirkstoffhaltige Rohlösung aus Teilschritt B2 werden in einem geeigneten Puffer aufgenommen und an einen Anionenaustauscher gebunden. Die Elution des Wirkstoffes wird durch Anlegen eines Kochsalz­ gradienten bewirkt. Die spezifische Aktivität der Präparation wird nach Feststellung der Protein­ konzentration in einem in vitro-Aktivitätstest bestimmt.

Teilschritt D Gewinnung einer salzfreien und homogen Wirkstoffpräparation durch Umkehrphasenchromatographie

Aliquote der Wirkstofflösung aus Teilschritt C werden über eine Umkehrphase chromatographiert. Die Freisetzung des Wirkstoffes erfolgt durch Erhöhung des Anteiles der hydrophoben Kompo­ nente des Laufgemisches.

Teilschritt E Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Wirkstoffes

Das Molekulargewicht des Wirkstoffes wird durch 2 unabhängige Methoden bestimmt. Dabei han­ delt es sich um Gelfiltration und denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese.

Teilschritt F Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz des Wirkstoffes

Zu diesem Zweck wird die wirkstoffhaltige Fraktion aus Teilschritt D zur Trockne eingedampft und dann in einem geeigneten Medium gelöst und auf eine geeignete Membran aufgebracht. Der so fixierte Wirkstoff wird der automatisierten Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz zu­ geführt.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Ausführungen sollen an Beispielen die einzelnen Schritte der Verfahren zur Isola­ tion, Anreicherung und Charakterisierung veranschaulichen. Sie enthalten jedoch keine detaillierten Angaben zu standardisierten biochemischen Einzelverfahren (wie Packung und Äquilibrierung von Chromatographiesäulen, Pufferwechsel und Ultrafiltration sowie denaturierende Elektrophorese und isoelektrische Fokussierung in Polyacrylamidgelen). Solche Verfahren sind in einer Reihe von Veröffentlichungen (z. B. in "Methods of Enzymology, 182 - Guide to Protein Purification", Ed. DEUTSCHER, M.P., Academic Press, New York, London 1990) ausführlich beschrieben und dem Fachmann als Stand der Technik bekannt.

Beispiel 1 Gewinnung eines Punktates aus Dipetalogaster maximus

Über einen Zeitraum von 6 bis 8 Wochen bei 27°C und 60 bis 70% relativer Luftfeuchtigkeit ohne Nahrungsaufnahme gehaltene Individuen (letztes Larvenstadium oder Imagines beider Geschlech­ ter) werden in einer geeigneten Versuchsanordnung, die eine Senkrechtstellung der Körperachse der Tiere ermöglicht, auf eine Silikonmembran (Dicke 0,14 mm) aufgesetzt, die luftblasenfrei über auf 37°C erwärmte 0,9%-ige NaCl-Lösung, welche 0,00026% Diphosphoglycerol als Saugstimula­ tor enthält, ausgespannt ist. Die Punktatgewinnung erfolgt, bevor die Tiere sich eines Teiles der aufgenommenen Flüssigkeit durch Kotabgabe entledigen, mittels Spritzen mit Kanülen geeigneter Größe. Das Punktat wird in ein mit Trockeneis-Aceton-Mischungen tiefgekühltes Gefäß entleert. Die Tiere werden anschließend durch Dekapitation getötet.

Beispiel 2 Gewinnung eines Trockenpräparates aus dem Punktat von D. maximus mittels Trichloressigsäure- und Acetonfällung

Zur Gewinnung eines lagerfähigen Trockenpräparates werden 50 ml des Punktates bei 4°C unter Rühren solange mit wäßriger 20%iger Trichloressigsäure versetzt, bis eine Trichloressigsäure- Endkonzentration von 2% erreicht ist. Die Lösung wird noch 30 min bei 4°C weitergerührt und dann der ausgefallene Niederschlag durch Zentrifugation bei 4°C und 5000 rpm entfernt. Das Se­ diment wird in 20 ml Wasser resuspendiert und mit 1 M Tris-HCl (pH 8,0) bis zum Erreichen einer Pufferkonzentration von 50 mM versetzt. Die bei Pufferzugabe einsetzende Trübung wird durch Inkubation bei 0°C innerhalb von 30 min vervollständigt und das Präzipitat danach durch Zentrifu­ gation abgetrennt und verworfen. Der resultierende Überstand wird mit dem Überstand aus der TCA-Fällung vereinigt.

Die so erhaltene klare Lösung wird unter Rühren mit 9 Teilen Aceton versetzt und 1 h bei 0°C in­ kubiert. Der sich bildende Niederschlag wird bei 4°C und 5000 rpm innerhalb von 30 min abzentri­ fugiert, 3 mal mit je 10 ml Aceton gewaschen und getrocknet.

Beispiel 3 Testung auf koagulationshemmende Aktivität durch Bestimmung der Thrombinzeit

Die Testung erfolgt durch Überprüfung der Fähigkeit wirkstoffhaltiger Lösungen, die Ausbildung eines Fibringerinsels in Testplasma nach Thrombinzugabe zu inhibieren (Thrombinzeit). Dazu werden 10 µl der zu testenden Lösung (bzw. 10 µl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, als Negativkontrolle) mit 100 µl Control Plasma N human (Behringwerke AG, Marburg) versetzt und 2 min bei 37°C in­ kubiert. Dann werden 100 µl Thrombin-Reagenz (Boehringer Mannheim) zugefügt. Unter Mischen mit einer sterilen Impföse wird die Zeit bis zur Ausbildung eines Fibringerinsels festgestellt. Die Aktivität der wirkstoffhaltigen Präparate wird in Antithrombin-Einheiten gemessen, wobei eine Antithrombin-Einheit derjenigen Wirkstoffmenge entspricht, die eine NIH-Einheit Thrombin neu­ tralisiert (MARKWARDT, F., Meth Enzym (1970), L9, 924-932). Hierzu werden mittels der ge­ schilderten Verfahrensweise unter Verwendung serieller Verdünnungen eines nach NIH-Einheiten standardisierten Humanthrombin-Präparates (National Institute for Biological Standard and Control, London, UK) in 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 Eichkurven aufgestellt. Aus der Verlängerung der Thrombinzeit im Vergleich zur Negativkontrolle läßt sich mit Hilfe dieser Eichbeziehungen die Thrombinhemmung quantifizieren und diejenige Hemmstoffmenge bestimmen, welche eine NIH- Einheit Thrombin neutralisiert und somit eine Antithrombin-Einheit darstellt.

Beispiel 4 Aufreinigung des Trockenpräparates durch Anionenaustauschchromatographie

Die Isolierung des Wirkstoffes aus dem Trockenpräparat erfolgt durch Anionenaustauschchromato­ graphie an MonoQ (Pharmacia, Freiburg). Dazu werden 53 mg des Pulvers in 2 ml 20 mM Tris- HCl (pH 8,0) suspendiert und 10 min bei 14 000 rpm zentrifugiert. Die Extinktion bei 280 nm und 1 cm Schichtdicke (E) des resultierenden Überstandes beträgt 0,912. Dieser Überstand wird mit einer Flußrate von 0,5 ml/min auf eine mit 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) äquilibrierte MonoQ-Säule (HR 5/5) aufgegeben und nach Waschen des Geles unter gleichen Bedingungen mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) innerhalb von 20 min eluiert (siehe Fig. 1). Bei der Beladung und beim Waschen passiert ein großer Teil des UV-absorbierenden Materials die Säule ungebunden. Beim Anlegen des Gradienten wird eine Vielzahl UV-absorbie­ render Komponenten von der Säule eluiert. Im Verlauf der gesamten Prozedur werden 42 Fraktio­ nen von jeweils 0.5 ml erhalten, die durch Bestimmung der Thrombinzeit auf koagulationshem­ mende Aktivität getestet werden. Dabei wird die Antithrombinaktivität in den Fraktionen festge­ stellt, die bei einem Kochsalzgehalt von ca. 0,5 M im Eluenten von der Säule freigesetzt werden.

Beispiel 5 Direkte Gewinnung einer wirkstoffhaltigen Rohlösung aus dem Punktat von D. maximus

Alternativ zur oben beschriebenen Methodik wird die direkte chromatographische Anreicherung des Wirkstoffes aus dem Punktat durch Chromatographie über eine ResourceQ-Säule (Pharmacia, Freiburg) durchgeführt. Dazu werden 24 ml des Punktates mit 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) auf ein Volumen von 50 ml aufgefüllt. Die Extinktion (E) beträgt 0,286. Diese Lösung wird 10 min bei 10 000 rpm zentrifugiert und bei Raumtemperatur mit einem Fluß von 1 ml/min auf eine mit 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) äquilibrierte ResourceQ-Säule mit einem Gelvolumen von 3 ml aufgepumpt. Beim Beladen und beim Waschen der Säule mit Äquilibrierungspuffer passieren große Mengen an Material die Säule ungebunden (siehe Fig. 2). Die fraktionierte Ablösung der gebundenen Kom­ ponenten von der Säule wird durch Anlegen eines linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) innerhalb von 40 min bei einem Fluß von 1 ml/min erreicht. Bei der Testung der erhaltenen Fraktionen durch Bestimmung der Thrombinzeit wird festgestellt, daß sich die koagulationshemmende Aktivität in einem Minoritätspeak befindet, der bei einem Gehalt von ca. 0,4 M NaCl im Laufgemisch von der Säule eluiert wird. Die wirkstoffhaltigen Fraktionen werden durch Intrafiltration in einer mit einer PM10-Membran (Amicon, Witten) ausgestatteten Rührzelle Modell 8050 (Amicon, Witten) in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) umgepuffert und auf ein Volumen von 10 ml konzentriert. Die resultierende Lösung wird als Wirkstoffrohlösung bezeich­ net.

Beispiel 6 Rechromatographie der Wirkstoffrohlösung an MonoQ

Die durch Chromatographie des Punktates an ResourceQ erhaltene Wirkstoffrohlösung (10 ml nach Umpufferung) wird mit einer Flußrate von 0,5 ml/min auf eine mit 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) äqui­ librierte MonoQ-Säule (HR 5/5) aufgegeben und nach Waschen unter gleichen Bedingungen mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) innerhalb von 20 min eluiert. Es wird das in Fig. 3 dargestellte Chromatogramm erhalten. Die Aktivitätstestung durch Bestimmung der Thrombinzeit ergibt thrombinhemmende Aktivität in dem bei ca. 0,45 M NaCl- Gehalt eluierten Peak. Die aktivitätshaltigen Fraktionen werden in Centricon-10-Einheiten (Amicon, Witten) in 0,05 M NaCl/0,05 M Natriumphosphat (pH 8,0) umgepuffert und auf ein Vo­ lumen von jeweils 500 µl konzentriert. Die so erhaltene Lösung wird als Wirkstoffkonzentrat be­ zeichnet. Bei der Bestimmung der spezifischen Aktivität dieses Wirkstoffkonzentrates wird ein Wert von ca. 6000 Antithrombin-Einheiten/ml ermittelt.

Zur Prüfung der Homogenität des erhaltenen Produktes und zur Ermittlung der Molmassen der ent­ haltenen Komponenten wird ein Aliquot von 5 µl auf eine Bahn eines Polyacrylamidgeles (high density, Pharmacia, Freiburg) aufgetragen und in einem PHAST-System (Pharmacia, Freiburg) unter Verwendung SDS-haltiger Puffer der Elektrophorese unterworfen. Wie in Fig. 4 dargestellt ist, werden nach Anfärbung 2 Proteinbanden gefunden, die im Vergleich mit Standardproteinen Molmassen von 15 300 (Hauptkomponente) und 13 700 (Minoritätskomponente) aufweisen.

Beispiel 7 Umkehrphasenchromatographie des Wirkstoffkonzentrates

Zur genaueren Charakterisierung des Wirkstoffes bezüglich der Aminosäuresequenz ist die Fest­ stellung der Produkthomogenität und eine Entsalzung erforderlich. Beide Effekte können durch Umkehrphasenchromatographie der aus der MonoQ-Chromatographie resultierenden wirkstoff­ haltigen Fraktionen erreicht werden. Zu diesem Zweck werden 45 µl der Wirkstofflösung auf eine Vydac-C18-Säule (The Separation Group, Hesperia, USA) der Dimension 4,6 × 250 mm aufge­ bracht. Als Laufmittel dient 5% Acetonitril in 0,1% wäßriger Trifluoressigsäure bei einem Fluß von 1 ml/min. Die fraktionierte Elution der Komponenten wird durch das Anlegen eines 3-stufigen Gradienten von Acetonitril in 0,1% wäßriger Trifluoressigsäure mit folgender Gestalt erreicht:

0-10 min 5-20%
10-40 min 20-30%
40-55 min 30-50%.

Im resultierenden Chromatogramm (Fig. 5) sind deutlich 2 Peakgruppen zu unterscheiden. Es werden 20 µl-Aliquote der entsprechenden Fraktionen lyophil getrocknet. Unmittelbar vor Aus­ führung der Thrombinzeitbestimmung werden die Rückstände in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) gelöst. Die Testung ergibt keinerlei Aktivität in der ersten Peakgruppe. Innerhalb der zweiten Peakgruppe wird in allen 3 Peaks koagulationshemmende Aktivität nachgewiesen, wobei die Aktivität aller­ dings im ersten Peak am größten ist, so daß eine Verunreinigung der folgenden Komponenten durch die zuerst eluierte nicht auszuschließen ist.

Beispiel 8 Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz des Wirkstoffes

Zur Aufklärung der N-terminalen Aminosäureabfolge werden die lyophil getrockneten Rückstände der aktivitätshaltigen Fraktionen aus der Umkehrphasenchromatographie in jeweils 20 µl wasser­ freier Trifluoressigsäure aufgenommen und in 5 µl Portionen auf Glasfasermembranen aufgebracht. Die Membranen werden nachfolgend im Argonstrom getrocknet und dem schrittweisen Edman- Abbau in einem automatischen Aminosäuresequenator (Model 472A, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt) unterworfen.

Dabei wird in allen aktivitätshaltigen Fraktionen die gleiche im nachfolgenden aufgeführte N-ter­ minale Aminosäureabfolge gefunden, wobei auch geringere Mengen eines am N-Terminus um eine Aminosäure verkürzten Produktes nachweisbar sind:

FQGNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNXPXM

Die mit X bezeichneten und unterstrichenen Reste konnten bisher nicht eindeutig identifiziert wer­ den.

Beispiel 9 Analytische Gelfiltration wirkstoffhaltiger Fraktionen aus der Umkehrphasenchromatographie

Zur Überprüfung der Molmassenhomogenität der koagulationshemmenden Fraktionen aus der Um­ kehrphasenchromatographie wird die analytische Gelfiltration an einer TSKGel 3000SW-XL-Säule (7,5 × 300 mm, Tosoh Corp., Japan) ausgeführt. Als Laufmittel dient 0,1 M NaCl in 0,05 M Natriumphosphat (pH 6,8) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min. Die wirkstoffhaltigen lyophilisierten Fraktionen werden zu diesem Zweck jeweils in 50 µl Laufgemisch gelöst und nach Zentrifugation auf die Säule aufgegeben. Bei Weiterführung des Laufmittelflusses wird ein deutli­ cher Hauptpeak eluiert, dessen Maximum gemäß der Eichgeraden einer Molmasse von ca. 35 000 entspricht. Desweiteren werden 2 niedermolekulare Komponenten eluiert (Fig. 6). Die Bestim­ mung der Thrombinzeit ergibt eine Korrelation der koagulationshemmenden Aktivität mit dem Hauptpeak.

Beispiel 10 Bindung des Proteinwirkstoffes an immobilisiertes Thrombin

Zur Überprüfung der Thrombinbindung des Wirkstoffes wird 1 ml Thrombin-Agarose (Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden) in einer Einwegsäule mit 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,5) äquilibriert. Es wird dann ein 50 µl-Aliquotes des Wirkstoffkonzentrates (6000 Antithrombin-Ein­ heiten/ml) auf das Gel aufgebracht. Danach wird das Gel mit 2 ml 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,5) ge­ waschen, wobei 20 Fraktionen zu je 100 µl gesammelt werden. Im Anschluß daran erfolgt die Elu­ tion reversibel gebundener Komponenten durch Erhöhung der Salzkonzentration auf 1 M NaCl. Bei der Elution mit 2,5 ml 1 M NaCl in 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,5) werden 25 Fraktionen zu je 100 µl gesammelt. Die im Verlauf der Chromatographie gesammelten Fraktionen werden im Thrombin­ zeit-Assay auf Antithrombin-Aktivität geprüft. Dabei wird weder in den NaCl-freien noch in den kochsalzhaltigen Fraktionen eine Verlängerung der Thrombinzeit festgestellt, so daß die Bindung an Thrombin bei den gewählten Bedingungen sehr wahrscheinlich irreversibel ist.

Claims (14)

1. Protein mit thrombinhemmender Wirkung aus Raubwanzen (Reduviidae) der Spezies D. maximus, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Molekulargewicht von 12 000 bis 35 000 kD besitzt und die Aminosäuresequenz FQGNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNXPXMenthält.

2. Protein mit thrombinhemmender Wirkung aus Raubwanzen der Species D. maximus, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Molekulargewicht von 12 000 bis 16 000 kD, bestimmt durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese besitzt und die N-terminale Aminosäuresequenz FQGNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNXPXMaufweist.

3. Verfahren zur Isolierung einer Körperflüssigkeit aus Individuen der Species D. maximus, da­ durch gekennzeichnet, daß sie ein Protein gemäß den Ansprüchen 1 und 2 enthält, durch Punktierung von Individuen nach Zuführung einer Kochsalzlösung, die Diphosphoglycerol enthält.

4. Verfahren durch aufeinanderfolgende Fällungen mit Trichloressigsäure und Aceton zur Ge­ winnung eines Trockenpräparates aus Punktaten von D. maximus, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Protein gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 in angereicherter Form enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im ersten Fällungsschritt eine Trichloressigsäure-Konzentration von 1 bis 5% verwendet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Fällungsschritt ein 6- bis 20-facher Acetonüberschuß zur Fällung verwendet wird.

7. Verfahren zur Isolierung von Proteinen gemäß den Ansprüchen 1 und 2 aus dem gemäß An­ spruch 4 gewonnenen Pulver, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung des Ziel-Poly­ peptides

• a) das Pulver in Lösung bringt und unlösliche Bestandteile entfernt,
• b) die löslichen Anteile direkt auf einen Ionenaustauscher leitet und
• c) das Ziel-Polypeptid selektiv mit einer wäßrigen NaCl-Lösung von dem Ionenaustauscher eluiert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der in allen Stufen verwendeten Lösungen 7,5 bis 9,0 beträgt und in Stufe c) NaCl-Konzentrationen von 10 bis 500 mM zur Anwendung kommen.

9. Verfahren zur Isolierung von Polypeptiden gemäß der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die gemäß Anspruch 3 gewonnene Körperflüssigkeit

• a) nach Abtrennung fester Rückstände direkt auf einen Ionenaustauscher leitet,
• b) das Zielprotein selektiv mit einer wäßrigen NaCl-Lösung von dem Ionenaustauscher eluiert,
• c) das Eluat entsalzt,
• d) die das Zielprotein enthaltende, entsalzte Lösung erneut auf einen Ionenaustauscher leitet und
• e) das Zielprotein selektiv mit einer wäßrigen NaCl-Lösung von dem Ionenaustauscher freisetzt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die in allen Stufen verwendeten Lösungen pH-Werte von 7,5 bis 9,0 aufweisen und die NaCl-Konzentration in den Stufen

• b) 10 bis 1000 mM und
• e) 10 bis 1000 mM beträgt.

11. Pharmazeutische Zusammensetzungen oder Implantatmaterialien, dadurch gekennzeichnet, daß sie koagulationshemmende Proteine gemäß der Ansprüche 1 und 2, gegebenenfalls in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Adjuvantien oder Träger­ stoffen enthalten.

12. Pharmazeutische Zusammensetzungen oder Implantatmaterialien, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach den Verfahren 4 bis 10 isolierte koagulationshemmende Proteine, gegebenenfalls in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Adjuvantien oder Trä­ gerstoffen, enthalten.

13. Testkombinationen, dadurch gekennzeichnet, daß sie koagulationshemmende Proteine gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Blutgerinnungsdiagnostik verwenden.

14. Biokompatible Implantatwerkstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß sie koagulationshemmende Proteine gemäß den Ansprüchen 1 und 2 als antikoagulativ wirkendes Prinzip chemisch oder absorptiv gebunden enthalten oder es in vivo freisetzen.