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Die
vorliegende Anmeldung bezieht sich auf ein Protein mit Rotamase-Aktivität, welches
ein Cyclophilin ist, für
die Diagnostik und die Therapie von allergischen Erkrankungen.
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Viele
Baumspezies (wie Birke – Betula
verrucosa) stellen große
Mengen an Pollen her, die bei Inhalation Symptome einer Allergie
vom Typ 1 (allergische Rhinitis, Konjunktivitis, Asthma) hervorrufen.
Andere botanisch unterschiedliche Baumspezies können Allergene in ihren Früchten enthalten,
welche mit Pollenallergenen kreuzreagieren und daher eine Nahrungsmittelallergie
bei der Aufnahme durch pollenallergische Individuen hervorrufen.
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Birkenpollen
sind in den nördlichen
Teilen von Europa und Amerika, ebenso wie in einigen Bereichen Australiens
eine häufige
Ursache für
Allergie, deren Symptome im frühen
Frühjahr
auftreten. Aus diesem Grund ist es von äußerster Wichtigkeit, Birkenpollenallergene,
welche Proteine sind, die für
die klinischen Symptome der Birkenpollenallergie verantwortlich
sind, zu charakterisieren und zu analysieren.
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Es
wurde herausgefunden, dass die Kreuzreaktivität, die unter bestimmten Pollenspezies
beobachtet wird, der strukturellen und immonulogischen Ähnlichkeit
der relevanten kreuzreaktiven Allergene zugeordnet werden kann.
Diese Entdeckung legt nahe, dass eine Diagnose und eine Immuntherapie
durchgeführt
werden kann mit einigen wenigen kreuzreaktiven Markerallergenen,
die einen großen
Anteil der kreuzreaktiven Epitope tragen.
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Fünf Birkenpollenallergene
wurden bisher bereits gut beschrieben. Das größte Allergen ist Bet v 1, ein 17-kDa-Protein,
das aus verschiedenen Isoallergenen besteht und von nahezu allen
birkenpollenallergischen Patienten erkannt wird. Die Gene, die Bet
v 1 kodieren, zeigen Ähnlichkeit
mit Genen, die in Pflanzenabwehrmechanismen involviert sind (Breiteneder
et al., EMBO J. 1989; 8; 1935– 1938).
Proteine, die Bet v 1 gleichen, werden in einigen Früchten und
Gemüsen
gefunden und sind für
Nahrungsmittel-Pollen-Kreuzallergien verantwortlich. Das zweite
gut bekannte Allergen ist das Birkenpollen-Profilin, Bet v 2, das
ebenfalls in Kreuzreaktionen zwischen Birkenpollen und Nahrungsmitteln
involviert ist (Ebner et al., J. Allergy Clin Immunol 1995; 95; 962–969). Die
zwei anderen Allergene, nämlich
Bet v 3 und Bet v 4 sind geringere Allergene, bezüglich dessen, dass
sie nur von einem kleinen Prozentanteil an Seren aus birkenpollenallergischen
Patienten erkannt werden. Für
beide wurde gezeigt, dass es calciumbindende Proteine sind (Seiberler
et al., EMBO J. 1994; 13; 3481–3486;
Engel et al., J Biol Chem 1997; 272; 28630–28637). Jüngst wurde gezeigt, dass ein
35-kDa-Protein, das sich auf Isoflavonreduktasen bezieht, an IgE
von Birkenpollenallergikern bindet (Vieths et al., Scand J Immunol
1998; 47; 263–272).
Es kann auch in Pollen-Nahrungsmittel-Kreuzallergien involviert
sein.
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Darüber hinaus
beschrieb Cadot et al. in Allergy 1995; 50; 431–437, dass Birkenpollenextrakte,
die bei pH 7,5 oder 8,5 unter kontinuierlicher pH-Kontrolle hergestellt
wurden, drei zuvor unbekannte Allergene mit pI 9, 9,1 und 9,3 enthielten,
vielleicht Isoformen eines Proteins. Die Molekülmasse konnte nicht bestimmt
werden, da die Seren der Patienten, die positiv für diese
Proteine in IEF-Immunoblots waren, keinerlei neue Bande in SDS-PAGE-Immunoblots
detektierten, was dadurch erklärt
werden kann, dass bei der Erkennung nur Konformationsepitope involviert
sind. Das direkte Sequenzieren auf der Blotting-Membran war nicht
erfolgreich, was einer N-Blockade zugeordnet wurde.
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Die
Rotamase (= Peptidyl-propyl-cis-trans-isomerase) katalysiert die
Rotation der Peptidbindung auf der Aminoseite der Prolinreste in
einem Protein oder Peptid. Die Rotamase wird durch Cyclosporin A
wirksam inhibiert, einem cyclischen Undecapeptid, welches immunosuppressive
Wirkungen hat (Takahashi et al., Nature 1989; 337; 473–475 und
Fischer et al., Nature 1989; 337; 476–478). Das später entdeckte
Protein Cyclophilin wurde als identisch mit einem Typ einer Rotamase
identifiziert.
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Cyclophiline
wurden aus verschiedenen Spezies identifiziert und isoliert und
Genhomologe wurden in Säugetieren
ebenso wie in Drosophila und Prokaryonten identifiziert. Weitere
Cyclophiline werden in verschiedenen Spezies höherer Pflanzen gefunden.
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Gasser
et al. beschreibt in Proc. Natl. Acad. Sci. 1990; 87; 9519–9523, dass
die DNA-Sequenzen der Cyclophiline verschiedener Pflanzenspezies
eine hohe Homologie zueinander haben, ebenso wie zu Cyclophilinen
anderer Spezies, d. h. zu Menschen. Die offenen Leserahmen der Gene
kodieren Proteine mit 171 bis 172 Aminosäuren. Die Cyclophiline verschiedener
Pflanzenspezies haben mehr als 75% Aminosäureidentität und mehr als 85% Aminosäurebeibehaltung.
Darüber
hinaus wurde entdeckt, dass das Cyclophilingen nicht ein einziges
Intron in der kodierenden Sequenz enthält. Rekombinantes Tomatencyclophilin
wurde in E. coli exprimiert und durch die Rotamase-Aktivität identifiziert.
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Horner,
W. E., et al. beschreiben in INT. ARCH. ALLERGY IMMUNOL., 1995;
107; 298–300,
ein rekombinantes Cyclophilin aus Psilocybe cubensis mit einer antigenen
Aktivität
mit Serum aus Patienten, die Atemwegsallergien hatten.
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Cadot,
P., et al. beschreiben in ALLERGY, 53 (Ausgabe 43): 25 (1998) Allergene
aus Birkenpollen, insbesondere ein Protein mit drei Isoformen, welches
durch Seren von Birkenpollenallergen-Patienten als ein Antigen erkannt
wurde.
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Trandinh,
C. C., et al. beschreiben 1992 in THE FASEB JOURNAL 6: 3410–3420 verschiedene
Cyclophiline, wobei die Sequenzen verschiedener Spezies nebeneinander
aufgeführt
und verglichen sind. Auf Basis dieses Vergleiches wird die evolutionäre Beziehung
unter diesen Proteinen diskutiert.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Anmeldung, ein Hilfsmittel oder Heilmittel
für die
Diagnose und die Therapie von allergischen Erkrankungen bereit zu
stellen.
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Dieses
Ziel wird erreicht durch ein Protein, welches die SEQ ID NO. 1 enthält, für eine diagnostische oder
therapeutische Verwendung.
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Bevorzugt
hat das Protein gemäß der Erfindung
eine Rotamase-Aktivität.
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Weiter
bevorzugt ist das Protein gemäß der Erfindung
ein Cyclophilin. Cyclophiline sind stark konservierte Proteine,
insbesondere Pflanzen-Cyclophiline haben zueinander eine hohe Homologie.
Da alle bekannten Cyclophiline dieselbe Enzymaktivität besitzen
und durch dasselbe Molekül
(Cyclosporin A) inhibiert werden, muss die 3D-Struktur dieser Proteine
ebenfalls sehr stark konserviert sein. Lippuner et al. zeigen in
J. Biol. Chem. 1994; 269; 7863–7868,
dass ein Antiserum, das gegen ein cyctosolisches Cyclophilin aus
Mausohrkresse entwickelt wurde, eine Kreuzreaktivität mit einem
breiten Bereich von Cyclophilinen anderer Quellen zeigte. Diese
Ergebnisse legen nahe, dass die Antigenizität der Cyclophiline ebenfalls
sehr ähnlich
ist.
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Niemals
zuvor wurde beschrieben, dass ein Pflanzen-Cyclophilin ein Allergen
ist. Dies ist also das erste Mal, dass es in Pollen beschrieben
wird. Die vorliegende Anmeldung zeigt, dass Pflanzen-Cyclophilin
ein wichtiges neues Allergen ist und für die Diagnose und die Therapie
von allergischen Erkrankungen verwendet werden kann, wie z. B. für allergische
Rhinitis, allergisches Asthma, allergische Konjunktivitis und mit
Pollen assoziierte Nahrungsmittelallergien. Das Durchsuchen mit
Hilfe von IEF-Imunoblots mit 48 birkenpollenallergischen Seren,
zeigte bis zu 20,8% Seren, die mit Cyclophillin reagierten.
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Ein
bevorzugtes Ziel der vorliegenden Anmeldung ist es, ein Hilfsmittel
für die
in vivo- und die in vitro-Diagnostik und eine Therapie von Birkenpollenallergie
bereit zu stellen. Wegen der stark konservierten Struktur und Antigenizität unter
Cyclophilinen stellt die vorliegende Anmeldung außerdem ein
Hilfsmittel für
die Diagnose und die Therapie von Pollenallergie bereit.
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Ein
weiteres bevorzugtes Ziel der vorliegenden Anmeldung ist es, ein
Hilfsmittel für
die in vivo- und die in vitro-Diagnose und die Therapie von pollenassoziierter
Nahrungsmittelallergie bereitzustellen.
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Es
ist bekannt, dass Cyclophiline in einer Vielzahl von Pflanzen enthalten
sind, wobei deren Anwesenheit in nahezu allen Organen, die untersucht
wurden, erwähnt
wurde: Wurzeln, Stämmen,
Knospen, Samen und Staubbeuteln. Aus diesem Grund und wegen ihrer
stark konservierten Struktur und Antigenizität unter den Cyclophillinen,
und insbesondere unter den Pflanzen-Cyclophilinen, erscheint die
Beteiligung von Cyclophilinen bei Nahrungsmittel-Pollen-Kreuzallergien
offensichtlich. Bisher wurde eine Kreuzreaktivität von Nahrungsmittelallergie
niemals in Bezug auf Cyclophiline getestet. In der vorliegenden
Erfindung werden Pflanzen-Cyclophiline,
die die Sequenz SEQ ID NO. 1 enthalten, für die Diagnostik und die Therapie
solcher Kreuzreaktivitäten
verwendet. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden Cyclophiline
verwendet, die aus einer Pflanze isoliert sind, gegen die die nahrungsmittelallergische
Person getestet werden soll. Kombination von Cyclopilinen aus unterschiedlichen
Pflanzen sind insbesondere bevorzugt.
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Das
Protein der vorliegenden Erfindung kann ein natives oder rekombinantes
Protein eines Prokaryonten oder eines Eukaryonten sein, d. h. aus
einer bakteriellen, Hefe-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugetierquelle.
Bevorzugt ist ein Protein eines Eukaryonten, weiter bevorzugt aus
höheren
Pflanzen (d. h. Fingerhut, blühendes
Immergrün,
Tomate und Zwiebel). Das am meisten bevorzugte Protein ist Birkenpollen-Cyclophillin.
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Die
Extraktion von Allergenen ist in irgendeiner wässrigen Lösung möglich. Es kann reines Wasser ebenso
verwendet werden wie jedes wässrige
Puffersystem. Baumpollen-Allergene sind Proteine mit niedrigem Molekulargewicht
(oder Glykoproteine), die nach Kontakt mit wässrigen Lösungen schnell aus den Pollen eluierbar
sind. Die Hydrierung der Pollen transportiert die Allergene aus
der inneren Seite auf die Oberfläche der
Pollenkörner.
Die unterschiedlichen Baumpollen-Allergene
werden nach Hydrierung aus Pollen leicht in großen Mengen extrahiert. Verfahren
zur Extraktion von entsprechenden rekombinanten Proteinen aus Zellen irgendeines
Expressionssystems sind geübten
Fachleuten allgemein bekannt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden Allergenextrakte in Phosphatpuffer mit einem pH-Bereich zwischen
6,5 und 8,5, weiter bevorzugt zwischen 7,5 und 8,5 hergestellt.
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Proteinextrakte
können über irgendein
bekanntes Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden, d. h. Filtration,
hydrophile oder hydrophobe Interaktionschromato graphie, Ionenaustausch,
Molekularfilterchromatographie, Fällungsstrategien oder Kombinationen
davon, um ein Protein gemäß der vorliegenden
Erfindung zu erhalten.
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Proteine
gemäß der Erfindung
enthalten eine Aminosäuresequenz
SEQ ID NO. 1, welche DFTAGNGTGGESIYGAK ist. SEQ ID NO. 1 kann durch
eine Sequenz oder Teile von Sequenzen eines Cyclophilins an einem
oder an beiden Enden flankiert sein. In einer am meisten bevorzugten
Ausführungsform
ist SEQ ID NO. 1 ein interner Teil eines Cyclophilins.
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Das
Protein gemäß der Erfindung
zeigt in einem SDS-Polyacrylamidgel eine einzelne Bande bei ungefähr 18 kDa
und kann in einer Immunoblot-Analyse nach isoelektrischer Fokussierung
(IEF) verschiedene Banden im basischen pI-Bereich haben, welche
verschiedene Isoformen des Proteins darstellen.
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Weiter
bevorzugt besitzt das Protein eine Peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase-Aktivität (Rotamase)
und bindet Cyclosporin A. Weiter bevorzugt wird die Aktivität des Proteins
durch Cyclosporin A inhibiert.
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Das
Protein kann für
die in vivo- und in vitro-Diagnostik und für therapeutische Hilfsmittel
oder Heilmittel in Form von Lösungen,
gebunden an feste Phasen (d. h. an Platten, Beads, Behältnisse),
dispergiert oder gelöst
in Cremes, Pulvern, Salben oder ähnlichen
Präparationen
verwendet werden. Es kann als Protein vollständiger Länge, in Fragmenten, als Epitope,
fusioniert oder konjugiert an andere Proteine oder Substanzen oder
in Clustern angewendet werden. Das Protein kann nativ oder denaturiert
sein. Das Protein kann alleine gereinigt werden, oder mit anderen
gereinigten Allergenen gemischt, oder als Rohextrakte verwendet
werden, für
die in vivo- und in vitro-Diagnostik und die Behandlung von allergischen
Erkrankungen.
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Detaillierte Beschreibung
der Isolierung, Identifizierung und Verwendung des Proteins der
vorliegenden Erfindung:
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Allergenextraktion:
Betula verrucosa-Pollen wurden von Allergon (Engelholm, Schweden)
erworben. Die Extraktion (1/10 w/v) wurde in Phosphatpuffer (PB)
0,01 M, pH 7,5 unter kontinuierlicher pH-Kontrolle und -Einstellung
ausgeführt.
Nach 3 h Extraktion bei Raumtemperatur wurden die Extrakte zentrifugiert
(17.500 g, 30 min), um Pollenteilchen zu entfernen und dann durch
eine 0,45 mm-Membran
filtriert.
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Reinigung
der Allergene: Der Puffer des Birkenpollenextraktes wurde gegen
Tris 0,05 M, pH 8,5 ausgetauscht. Der Extrakt wurde dann 3 × 15 min
mit jeweils frischem DEAE-Sephacel® (Pharmacia
Biotec, Uppsala, Schweden), welches in Tris 0,05 M, pH 8,5 vorequilibriert
wurde, mit einem Verhältnis
von Gesamtgel/Extrakt von 3 inkubiert. Nach jeder Inkubation wurde
das Gel durch Zentrifugation entfernt (600 g, 5 min) und der Überstand
wurde gewonnen.
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Die
sich ergebende Lösung
(Fraktion A) wurde über
Nacht gegen 1,4 M Ammoniumsulfat in 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat,
pH 7,0 dialysiert, bevor es auf eine Phenylsepharose-Chromatographiesäule (Pharmacia
Biotech, Uppsala, Schweden) für
eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie aufgetragen wurde.
Die gebundenen Proteine wurden durch Anwenden eines 20 bis 100%
Gradienten von 0,01 M Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,0, eluiert.
Es wurden Fraktionen gesammelt und durch Membranfiltration aufkonzentriert
(Ausschluss 10 kDa) und der Puffer wurde gegen PB 0,01 M, pH 7,5,
ausgetauscht, bevor die Proben aliquotiert und bei –70°C eingefroren
wurden, bis sie verwendet wurden.
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Die
Schritte zur Reinigung sind in 1 dargestellt.
Die Inkubation des Rohextraktes mit DEAE-Sephacel® bei
pH 8,5 ergab eine Lösung,
die mit dem 18 kDa-Protein
(Fraktion A) angereichert war. Die Proteine dieser Fraktion wurden
weiter durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie getrennt,
für welche
ein typisches Elutionsprofil in 2 gezeigt
ist. Das Durchsuchen der sich ergebenden Fraktionen wurde mit Hilfe des
IEF-Immunoblottings mit Humanseren durchgeführt, die von Cadot et al. in
Allergy 1995; 50; 431–437
gezeigt wurden, um die Banden bei pI 9,0, 9,1 und 9,3 in einem IEF-Muster
zu erkennen. Die basischen Zielproteine wurden in der Fraktion 48–53 gefunden.
Diese Fraktion ergab eine einzelne Bande bei 18 kDa im SDS-PAGE
(1). Ein Serum, das mit einer größeren Anzahl
von Banden reagierte, einschließlich
den basischen, wurde verwendet, um IEF-Immunoblotstreifen der Fraktion
48–53
zu testen. Es konnten nur drei Banden bei pI 9,0, 9,1 und 9,3 dann
voneinander unterschieden werden (3). Alle
drei banden IgE aus Patienten. Typischerweise wurde eine Menge von
250 μg an
gereinigtem Protein aus 30 g Pollen erhalten. Die Konzentration
wurde durch die Absorption bei 280 nm bestimmt, wobei eine OD =
0,6 für
1 mg/ml angenommen wurde, welches die Absorption für Tomaten-Cyclphilin
ist, die aus dessen vollständiger
Sequenz berechnet wurde.
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Elektrophorese
und Immunoblotten: Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde unter
Verwendung einer Multiphor II-Vorrichtung für eine horizontale Elektrophorese
(Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) in 5% dünnen Acrylamidgelen, die 7,5%
Ampholyte mit einem pH-Bereich 3–10 enthielten (Isolab, Acron,
OH, USA), gegossen auf Gelbond® PAG-Film (FMC, Rockland,
ME, USA) durchgeführt.
Die Laufbedingungen waren 1.500 V, 25 mA und 15 W für insgesamt
1.250 Vh. Für
Immunoblot-Experimente wurden die Proteine auf PVDF-Membranen (Immobilon®,
Millipore, Bedford, MA, USA) durch Druckblotten überführt. Nach dem Blockieren in
0,2% trockener Magermilch in phosphatgepufferter Saline (PBS-NFDM
0,2%) wurden die Membranstreifen über Nacht bei 4°C in Patientenseren,
die in PBS-NFDM 0,1% (125 μl
Serum/Streifen) verdünnt
waren, inkubiert. Das gebundene IgE wurde danach durch monoclonare
Maus-Antimensch-IgE-Antikörper detektiert (CLB,
Amsterdam, Niederlande), gefolgt von peroxidasekonjugiertem Ziege-Antimaus-IgE
(CLB, Amsterdam, Niederlande). Die Banden wurden durch Inkubieren
in dem Peroxidasesubstrat TMB (KPL, Gaithersburg, MD, USA) sichtbar
gemacht.
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Die
SDS-PAGE wurde in 13% Polyacrylamidgelen mit 5% Polyacrylamid-Sammelgel
durchgeführt
unter Verwendung des diskontinuierlichen Puffersystems von Laemmli,
Nature 1970, 227; 680–685.
Vor den Läufen
wurden die Proben für
5 min bei 100°C
in Probenpuffer erhitzt, der aus Tris 125 mM, pH 6,8, Glycerin 17,5%,
SDS 4% und β-Mercaptoethanol
1%, und Bromphenolblau 0,002% be stand. Eine Spannung von 350 V wurde
angelegt, bis die Bromphenolblau-Bande die gegenüberliegende Seite des Gels
erreichte.
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Mikrosequenzierung:
Die ersten Versuche zur N-terminalen Aminosäuresequenzierung mit dem gereinigten
Protein waren nicht erfolgreich, was die N-terminale Blockade bestätigte, die
bereits beobachtet worden war. Das Protein wurde dann durch Asp-N
für 16
h bei 37°C
zerschnitten und die sich ergebenden Fragmente wurden durch hydrophobe
Wechselwirkungen in einer HPLC-Säule
getrennt. Das Mikrosequenzieren wurde durch einen Edman-Abbau in
einem automatischen Sequenzierer durchgeführt.
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Das
Schneiden mit der Protease Asp-N ergab verschiedene Fragmente. Die
Analyse eines Peaks aus der HPLC-Säule gab eindeutig die folgende
Sequenz: DFTAGNGTGGESIYGAK. Die Ergebnisse der Ähnlichkeitsrecherchen mit dieser
Sequenz sind in Tabelle I gezeigt.
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Ähnlichkeitsrecherchen: Ähnlichkeitsrecherchen
und Anordnungen der Sequenzen wurden in einem Computer mit Hilfe
von nichtredundanten Recherchen unter Verwendung des Blitz-Servers
und der Swissall-Datenbank durchgeführt.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Proteine, die eine Sequenz
enthalten, die 100% Identität verglichen
mit der SEQ ID NO. 1 zeigt.
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Das
Cyclophilin der vorliegenden Erfindung zeigt eine sehr große Homologie
(bis zu 100% Identität) mit
Cyclophilinen verschiedener anderer Pflanzen. Die Pflanzen-Cyclophiline
haben demgemäß eine Molekülmasse von
ungefähr
18 kDa und einen basischen pI.
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Rotamase-Assay:
Die Rotamases-Aktivität
wurde durch eine Modifikation des ursprünglichen Verfahrens von Fischer
et al., Biochem. Biophys. Acta 1984; 791; 87–97, geprüft. In diesem Assay wurde ein
chromatogenes Peptid, das Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid (sAAPFn;
Sigma, St.-Louis) durch Chymotrypsin geschnitten, jedoch nur, wenn
es in der trans-Ala-Pro-Konformation vorlag. Mehr als 80% des Peptids
liegt im Gleichgewicht in dieser Konformation vor. Diese Fraktion
wird nahezu sofort durch Chymotrypsin geschnitten, jedoch müssen die
verbleibenden 20% ein relativ langsames Isomerisierungsverfahren
von cis zu trans durchlaufen, bevor es geschnitten werden kann.
Die Rotamase-Aktivität,
die die cis-trans-Isomerisierung vereinfacht, kann dann durch Beschleunigung
der Rate des Peptid-Schneidens detektiert werden. In unseren Assays,
ausgeführt
in HEPES-Puffer 35 mM, pH 8,0, war die Endkonzentration an Chymotrypsin
2 μM und
die des sAAPFn war 10 μM.
Die Rotamase-Aktivität
wurde für
gereinigte Proteinkonzentrationen von 3 nM und 30 nM überprüft. Um die
Rotamase-Aktivität
zu inhibieren, wurde Cyclosporin A (CsA) mit 1 μM verwendet. Als Negativkontrolle
für die
Inhibierung der Rotamase-Aktivität
wurde 1 μM
FK506 verwendet, von dem es bekannt ist, dass es spezifisch an eine
andere Gruppe von Peptidyl-prolyl-Isomerasen
(Rotamasen) bindet, den FK506-bindenden Proteinen.
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Die
Rotamase-Aktivität
wurde dann für
Cyclophilin in einer dosisabhängigen
Weise (4) gezeigt. Darüber hinaus band das Allergen
CsA, welches die Rotamase-Aktivität inhibierte (4),
band jedoch nicht FK506.
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Beschreibung der Figuren:
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1:
Coomassie-blue-gefärbtes
SDS-PAGE-Gel, welches zeigt: A, Gesamtbirkenpollenextrakt; B, Fraktion
nach DEAE-Sephacel; C, Fraktion 47–53 (4 μg) aus der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie,
Molekülmassenmarker
sind an der linken Seite gezeigt.
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2:
Reinigung des Birkenpollen-Cyclophilins über Phenylsepharose-HP-Chromatographie.
Fraktion A in Puffer A wurde auf die Säule aufgetragen und dann durch
einen 20 bis 100% Gradienten des Puffers B bei einer Flussrate von
2 ml/min eluiert. Puffer A: 1,4 M (NH4)2SO4; 0,1 M Na2HPO4; pH 7,0. Puffer
B: 0,1 M Na2HPO4;
pH 7,0. Die Absorption (AU) wurde bei 280 nm gemessen.
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3:
IdE-Immunoblot aus einem IEF-Gel. Die Fraktion 47–53 wurde
getestet mit: A, dem Serum eines Patienten, der auf eine hohe Anzahl
von Birkenpollenallergenen reagierte, einschließlich denen im basischen Bereich.
B, Inkubationpuffer als Kontrolle. pI-Marker sind an der linken
Seite angezeigt.
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4:
Rotamase-Assays von gereinigtem Birkenpollen-Cyclophilin, einschl.:
keinem Cyclophilin (Quadrate), 3 nM Cyclophilin (Kreuze), 30 nM
Cyclophilin (schwarze Rauten), 30 nM Cyclophylin + 1 μM CsA (schwarze
Dreiecke), 30 nM Cyclophilin + 1 μM
FK506 (offene Dreiecke). Die Absorption bei 390 nm gibt das Schneiden
des chromogenen Peptids sAAPFn wieder.
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Beispiel:
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Hauttest:
Es wurden Hautpunktationstests mit der Fraktion A (80 μg/ml in 50%
Glycerin) durchgeführt an
dem Unterarm von sieben birkenpollenallergischen Patienten, ausgewählt über eine
deutliche Historie und positive Hauttests auf Birkenpollen. Danach
wurde ein Test mit dem gereinigten 18 kDa-Protein (mit 1, 10 und 100 μg/ml in 50%
Glycerin) an Patienten durchgeführt,
die eine positive Antwort auf die Fraktion A gezeigt hatten. Eine
Lösung
50%-ige Glycerinlösung
wurde als Negativkontrolle verwendet.
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Einer
von den sieben Patienten gab eine klare positive Antwort auf die
Fraktion A und anschließend auf
das gereinigte Birkenpollen-Cyclophilin (eine Reaktion war sehr
klar bei 100 μg/ml).
Die Kontrolle mit 50% Glycerin war negativ. Die Seren der sieben
Patienten, die auf der Haut getestet wurden, wurden in IEF-Immunoblots
mit Gesamt-Birkenpollenextrakt verwendet. Es gab eine Korrelation zwischen
den Hauttests und den Blots, da nur der Patient, der auf das gereinigte
Cyclophilin positiv reagierte, das Binden der drei basischen Banden
zeigte.
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